an electrophoretic study of vitamin e status and expression of heat shock proteins in alveolar type...

6
An electrophoretic study of vitamin E status and expression of heat shock proteins in alveolar type II and liver cells Vitamin E is the most important lipophilic antioxidant. Oxidative injuries are prevented or minimized by vitamin E supplementation. Various physiological and pathological sit- uations are accompanied by vitamin E deficiency. However, it is not clear whether ali- mentary vitamin E deficiency in itself constitutes oxidant stress that induces appropri- ate responses, which, in turn, can be avoided by adequate vitamin E supplies, or whether the remaining cellular antioxidants compensate a temporary vitamin E defi- ciency. We studied effects of the dietary vitamin E status on cellular vitamin E levels and on the expression of heat shock proteins (HSPs) in alveolar type II cells and liver. The expression of HSPs, representing an early and very sensitive marker of cellular stress, was compared with the activity of antioxidative enzymes. Vitamin E depletion caused a substantial increase in HSP32 in alveolar type II cells, whereas in liver there was a marked increase in HSP70. The activity of the antioxidant enzymes, however, did not change significantly. A reversal of HSP expression to almost normal levels was seen after vitamin E resupplementation. These results indicate that, under normal con- ditions, a suboptimal supply of vitamin E to rats exposes the alveolar type II cells and the liver to reversible cellular stress. Keywords: Vitamin E / Heat shock proteins / Lung / Alveolar type II cells / Liver EL 4055 Ömer Faruk Topbas 1 Roswitha Jehle 1 Pranav Sinha 2 Bernd Rüstow 1 1 Department of Neonatology 2 Institute of Laboratory Medicine and Pathobiochemistry, University Hospital CharitØ, Humboldt University, Berlin, Germany 1 Introduction Vitamin E is a radical scavenger that prevents lipid peroxi- dation and oxidative injury to most tissues [1]. It is the most important lipophilic antioxidant of cells and thus a major element in their antioxidative potential. Therefore, it might be postulated that a suboptimal supply of vitamin E to animals could facilitate oxidative damage, including the initiation and propagation of inflammation and/or morpho- logical and functional damage of cells. Many animal and human studies indicate that supplementing with vitamin E represents a safe and effective possibility for prophylactic or therapeutic treatment of oxidant-caused injuries [2, 3]. Although the beneficial effect of vitamin E supplements against different forms of oxidative stress is well docu- mented [2, 4±8], it has not been shown whether alimen- tary vitamin E deficiency (without any additional oxidative stress as in some physiological and pathological situa- tions [3, 9, 10]), represents an oxidative load that induces appropriate responses, or whether this vitamin E defi- ciency can be compensated by the remaining antioxidant potential without deleterious consequences. The answer to this question has clinical implications. It would be inter- esting to know whether the suboptimal supply of vitamin E in itself constitutes cellular stress that may have to be compensated for, or whether vitamin E supplements are only relevant as a prophylactic or therapeutic response to oxidant burdening in animals and humans. Heat shock proteins (HSPs) are highly conserved mole- cules and physiologically expressed in most cell types on a low level. HSPs are essential for folding of de novo syn- thesized proteins, their translocation through intracellular membranes, for the formation of protein oligomers, and for their degradation [11, 12]. Different stress conditions, which generally cause damage of proteins and other cel- lular components, induce an increase (sometimes dra- matic) in the expression rate of the cytoprotective HSPs. Consequently, an increase in the expression rates of indi- vidual HSPs is an early and sensitive marker of cellular stress in many cell types [13, 14]. This study was de- signed to test whether a temporarily suboptimal supply of vitamin E to rats provokes cellular stress under normal conditions, in alveolar type II cells and liver tissue, which can be recognized by an increased expression of HSPs, and whether, in turn, this cellular stress in reversible by refeeding vitamin E. Correspondence: Prof. Dr. Bernd Rüstow, Humboldt Universität zu Berlin, Universitätsklinikum CharitØ, Klinik für Neonatologie, Schumannstraûe 20/21, 10098 Berlin, Germany E-mail: [email protected] Fax:+49-30-2802-4963 Abbreviations: CAT, catalase; HSP, heat shock protein; O.D., optical density; SOD, superoxide dismutase 3552 Electrophoresis 2000, 21, 3552±3557 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/1717-3552 $17.50+.50/0

Upload: oemer-faruk-topbas

Post on 06-Jun-2016

214 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

�� ������������� �� �� �� ������� � ���� � ������������ �� ��� ���� ������� �� �������� ��� ����� ����� �����

������� � �� � ���� ���� ���� ��������� ������������ �������� ���� �� � � ����� �������� �� ������� � �������������� �� ���� ������������ ��� ����������� ����������� � ���������� �� ������� � ��������� ���� � �� �� ��� ��� �� �������� � ������� � �������� �� ����� ���������� ������� �� �� ��� ������ ��� �� ���� ������� ���� �� �� �� ��� � ������ �� �� ��� ������� � �������� � �� � ������� ������ ������������ �������� � ���� � � ������� � ���������� ! ������ ����� �� � ���� � ������� � ������ �� ������ ������� � ������� �� � �� ����� �� �� ���" � ����� #�$%�& �� ������ ��� '' ���� ��� ��� �( �� ����� �� �$%�� � ������ �� � �� ��� � � ������� �� " �� ������ �� ��� ��� ����� � ��� � �������� �� ������������ ������ ������� � ������������ � ����������� ��� �� �� �$%)* �� ������ ��� '' ����� � �� �� ��� � ��� � �� "� ��� �� �� �$%+,� ( �������� �� � ����������� ������ ��� ���� ��� ���� �������������� - � ��� �� �$% �� ����� �� ������ �� ��� ���� ����� ��� ������� � �������������� (� ����� ������� ���� ��� �� ��� ������������ � ���������� ������ �� ������� � �� ��� ����� � ������ ��� '' ���� ���� ��� �� � ���� ������ �� ���

��������� ������� � . ��� ���" � ����� . /��� . -����� ��� '' ���� . /�� �/ 0,11

���� ��� � ������

������ !����

"����� #���$

%���� &�����

23�� ���� �� 4���������*'������� �� /��� ��� �5����� ���%����������� ��6��� ���� �������� 7� ��8��������� 6��� �����9 ���� : ����

� ������ �����

������� � �� � ������ ������ ��� � ���� ����� � ���������� ��� �������� ���� � �� ���� ������ ;2<� '� �� ����� ���� ���� ��������� ����������� �� ���� ��� ��� ����� ���� �� �� ������������ ��������� ( �� � ������ � ��������� ��� � ���������� ������ �� ������� ��� ������� ����� ��������� �������� ������ ��������� ����������� ��� � ��������� �� ������������ ���.� �� ���������� ��� ���������� ����� �� ����� 5��� ������ ������� ������ ������� ��� ����������� ��� ������� � � ���� � ��� ��� ������ ����������� �� � ���������� � ������ � ����� �� ������������� ���� �� ;*� )<�-����� � �������� ���� �� ������� � ���������������� ���� �� �� �� �� �������� �� �� �� ��� ��������� ;*� 0=><� �� �� ��� �� ���� �� �������� � ������� � �������� #������ ��� ���������� ���������� �� �� �� ��� ������������ ��� ����������� ����������� ;)� ?� 2,<&� � ���� �� �������� ���� ��� ������

��� �� ��� ������� � �� ��� ������� � ��������� ��� � ��������� �� � ������� ������������������� ������ ��� ���� ���� ����� ( ���� �� ��� ������ �� �������� ������������� '� ����� � ��� ������ �� "��� �� � ���������� ������ �� �������� �� ����� ���������� ������ �� �� ��� ��� �� �� ���������� �� � � �� ������� � ��������� � ���� ����� �� � � ��������� � � ������ ����� ��������� �� ����� �� ������� ��� ������

��� ���" � ����� #�$%�& � ���� ���� �� �������� ��� �������������� �� ��� �� ���� ��� ���� ��� ��� ���� �$%� � ������� �� ������� �� �� ���� ��������� � ������ �� � ����������� � ��� ��� ������� ��� ���� �� � �� ������ �� � ���� ������ �� ����� �� �� ������� ;22� 2*<� 3��� �� �� �� �������������� �� ���� ���� ����� �� � ����� ��� �� ������� ���������� ����� �� ��� �� #������� � �������& �� � �� ����� �� �� � ����� ������ �$%��7��� ������ �� ��� �� �� � �� ����� ��� �� ����������� �$%� �� �� � �� ��� ������� �� " �� ������ �� �� �� ���� ��� ���� ;2)� 20<� (�� ����� ��� ������� �� ��� �� � ���� � ��� ���������� ������ ��������� � �� ��� � ���"� ������ �� �� ��� �� �������������� �� ������ ��� '' ���� ��� ��� ������ ������ � ������� �� �� ��� ��� �� ����� �� �$%����� �� � �� �� �� ��� ������ �� �� �� � ���� �� ����� ������� ��

'������������� % ��� 3 � 9 �� @A����� �������� 6��� ���B��� 9 ���� 6��� ���B��"����"�� 7� ��8� C����" �A 4����������$�������� �D *,.*2� 2,,?> 9 ���� : �����(����� � ��� �����E�� ��������F0?�),�*>,*�0?G)

�������������� '��� �������H )#"� �� ���" � ����H *+,+�������� ������H #*,� ��� ���� ��������

)11* ��������� � *,,,� ��� )11*=)11+

I !'/�J��7� � ��� :���� G?012 !����� *,,, ,2+)�,>)1.,,.2+2+�)11* K2+�1,F�1,.,

$ -�������� ��� ������

$+� -��������

( ������� ������� ��� #���� * �� ������� �� � "�& ��� � ������� ��� ��� ��� #0,, �� ������� ��� "�& � �� ���� � �� -�� ���� #/��� : ����&�% ��� � ���������� ���� ������$%+, ���������� ��������� #'�:2&� ���� ������$%G, ���������� ��������#'�:2&� ��� ���� ������$%)* #���2& ���������� ��������� #'�:*�&� � ������� � �� $� ���� #����� ���97� 7�����&� $����� � ��������� � � ���� � ����������������� ���� ��������� '�:� ��� ������� � ��3�"� #:���� ��� 3��� "&� ( ��� ���� �7/ #���� ��� ���� ������������ ����& ��� � ����������������� "�� � �� ���� � �� -� ���#9��"������� � �������&� -�� �� ������� � �� ���� � �� $���� #3������� : ����&� ������� ��� ������

$+$ -�����

$+$+� ������. ��.���

!���� ��� #���� ����� >,=?, �& � �� � ����� �������������� ���� � ������� ������� ��� �� ������ �� ��� �"�� ( ��� � ��� � ����� �� *0 ��������� ����� �� � ������� ��� ��� ��� #0,, �� ������� ��."�& �� ������ �� 0> �

$+$+$ �������� ��� �� ���� ���������

-����� ��� '' ���� � ������� �� ������ ����������� L�������M ���� �� '�:������ ���� ��������� ����������� �� ��� ��� �� 3���� � ��� ;21<� ( ������������� ��� '' ���� � ������� �� 3�������� �������� ������� ����� #:���� 9@/� /�� (���������%������ $�������& ��� ��� ���� � ��� �� � ����� ��� ���������

$+$+/ "��������� �� ����� ���.�����

( ��� ��� ����� ��� ��� ������� � ������� ���������� �� ��� �� ������ #�� ��& �������� �� ), �� ������ ������� '� � ��� �� � ���� ������� �� #* �5 %5$N�*�1 ��.�/ �������� 1 ��.�/ �� ������� *�1 �5 �3(-H@���9� ��� � 5������ : ����&� ��� �������� ��� ���� ����� ���� ��� �� �������� �� ������� ,�*1 5 ��� ��� 2, �5 ��%�$ ���� � �� +�1 #2O1�.�& ����� � �����.(���� %��� ������� #9 ����5������� : ����&�

$+$+0 ,������������ �� ������� � ��� ������� �(������

������� � ��� ��� ��������� � ����� �� ������� ��� ��������� ������ ��� '' ���� � �� ���� �� ���� �

�� ���� �� ��� � ������ ��� #�%/7& �� � ����� ���� ���� ���� �� 7�������� ��� 9� � ;2G<�

$+$+1 #���� ���������2 �������������2�������.2 ��� ������ ��� ���3�������������

-����� ��� '' ���� � ���� �� �� ������� ���� ����������� 2, �5 ( ����7� ���� � �� +�1� 20, �5 4�7�� ���2P ( ���� Q�2,,� -� ��� ��� �� ), �/ ��� ��� �� � � ����� �� �������� ����� � ������������ ���� #97-&���� #$����&� % ���� ������� � #1 �5 �3(-� 2 �5

%5$N&� ��� 2 �5 3(( � ���� ��� � ����� ������ � �� =>,�7� ( ��� ������� ��� ��� ����� ��2, ,,, � � �� 2, ���� ( ��� ������ ��� ��������� ���� ��� �� ��� ����� �� * � ������ ��� ������� ����� ���� #*, �5 ( ����7�� �� +�1� *>, �5 4�7����� *P ( ���� Q�2,,&� -� ��� ��� �� *1 �/ ��� ��� �� � � ���� �� ��������� % ���� ������� � #1 �5

�3(-� 2 �5 %5$N&� ��� 2 �5 3(( � ���� ��� ������ ��� ��� � �� =>,�7� 9�� ��� ��� ���� ������� � ���� ��� �� ��� ����� �� * � ������� ��� /����� ����� ���� #*1, �5 ( ����7�� �� G�>�>P $3$� *,P ���� ��� 0, �5 3((� ��� ,�,*P � �������� ���& ��� ������� �������� �� ?1�7 �� 1 ��� ;2+<����� ��� ��� ��� � �� �� �� 2*P ( ��������� $3$������� ������ ��� #4���� N ��"�� �.5�� : ����&��� ����� ��� ��� ������ ���������� ��� � 4���Q7�� '' ������ ����� �� ), �- � �� �� ��� ��� ��� ��������� �� N� � !�� � ���� �������� �� ���'' ����� 2,, ��� 0 ��� � 2�1 �� �� � ���� � ��� � ����� �� �$%+,� �$%G,� � �$%)* �� ��������� ���������� N� � !�� � ���� �������� �� ��� ���������� 2,, ��� 1 ��� � 2, �� �� � ���� � ��� � ����� �� � �� �������� �� �$%+,� �$%G,� � �$%)*� ��������� ( � ����� � ��� �� ����� � �� � %�3N ��� �� #5������ � 9��� �� 5-�6$-& �� � (� $ �� ( ����� 6��� #��� $��������'��� ������ $�� N �������� 7-� 6$-& �� *1 � ��� ����"�� �� ���� �� 0�7 �� ( ������� � ����� #(9$& ���,�2P ������������� ����� ������� �� #(���*,H(9$�(& ���������� 1P ������� � �� ���"� ( ������������� � ��� ��� � ���� � ���� �� ), ����� (9$�( �� ��� ��� ��� � '��������� ��� � ��� ���������� #,�1 ��.�/ �� �$%+,� ,�1 ��.�/ �� �$%G,���� * ��.�/ �� �$%)*& ��� � �� �� �� 2 �� ������ ��� �� (9$�( ��� 1P ������� ���"� -�� ������� ���� �� (9$�(� � ��� ��� � �������� �� 2 ��� � ������ � �������� �� � 2O*,,, �������� ��(9$�( ��� 1P ������� ���"� (� � ��� ��� � ���� ��� ���� �� (9$�( �� ), ���� ��� � ��������� ����� �� � ��� ���� �7/ ��� � ����������������� "���

��������� � *,,,� ��� )11*=)11+ ������� � �������� ��� �� ���" � ����� )11)

4������

$+$+5 *��� ������

$�� ���� �������� #$�3& ��� �� ���� ���� ������ ����� � ��� ;2>< ��� ������� #7-(& ���� ���� �� -��;2?<�

/ �� ���

/+� ������ �� �� ������. ��.��� �� �� ������� �������������� �� �����2 �������� ��� �������2 ��� ����� ���� �

(��� 2 ���� ��� ����� ��� � ������� ���������� ���� � ������� � ������ ����� �� ������� ������� ��� '' ����� ��� ��� �� ����� 21=*1P �� ���� �� ������� @����� � ������� ��� ��� ��� ��� ��� �������� � ������ �� �� � ������� �� ���� �� ������ �������� �� *)>P� �� ������ ��� '' ���� �� 22,P� ��� ����� ����� �� ),G1P �� ���� ��� ������� � ������������ �� ��� �� �� � ����� � ��� ����� �� �������� ����� �� ������ #����� ����� *&� ��� ����� #���������� +&� ��� ������ ��� '' ���� #����� ����� )&� ����������� ���� �� ���� �� �������� ���� �� � � ������������

/+$ ������ �� �� ������� � ���� � �� ������������������. ��������� ����

(��� * ���� ��� 7-( ��� $�3� �� ���� ��� �� ��������� � �� �������� �� ��� ����� �� ����������� ������� � ���� �� ������� � �������� '�� ����� � ��� ��������� � �� ����� � ������� ��� ��� ��� ��� ���

����� �� ���� ���������� R������ �� �� �� ���� �� ������� � ������� ��� ��� ����� �������� �� ���� �� � �����

/+/ ������ �� �� ������� � ���� � �� ����������� �� )#"�

N��� � 2=G ��� � �� ����� �� � ���������� �$%��� � ��� ������� ������ ��� '' ���� ��� ��� ����� �� ������ �� � ������� � ������� � ������ �� ���� 9��

)110 S� N� (����� � ��� ��������� � *,,,� ��� )11*=)11+

����� �+ 7����� ����� �� ������� � ����� �� ���������� ������ ��� ������ ��� '' ����

N ������ ������� � ������� � �����#��& #��& #P �� �����&

%����� #��.�/&7��� �� +�0 T 2�G ,�,> T ,�,) 2�* T ,�>������� ������� 2�G T ,�* ,�,0 T ,�,2 *�2 T ,�G������� � �� 2+�G T *�1 ,�*) T ,�2* 2�) T ,�0

/�� ����� #��.�/ � ����&7��� �� 0�G T ,�> ,�)) T ,�,* 2�? T ,�*������� ������� 2�* T ,�2 ,�22 T ,�,) +�1 T 2�G������� � �� 202�) T 2, 2�?, T ,�20 2�G T ,�)

-����� ��� '' ���� #��. 1 � 2,G&7��� �� ,�*2 T ,�,G ,�,20 T ,�,,) G�) T ,�0������� ������� ,�,) T ,�,,0 ,�,,G T ,�,,2 21�> T *�1������� � �� ,�*) T ,�,* ,�,*, T ,�,,* >�, T ,�+

( ����� �� � U 0 ��� � ���� �� ��� T ������ ���������

����� $+ ����� �� � ������� � ������� � ������ �� ����� � �������� �� $�3 ��� 7-(

N ������ $�3 7-(#�6.�� � ����& #P& #�6.�� � ����& #P&

/�� �����7��� �� +�* T 2�, 2,, )?, T 1? 2,,������� ������� +�) T ,�G 2,2 0,G T )* 2,0������� � �� +�* T 2�0 2,2 ))1 T 01 >G-����� ��� '' ����7��� �� ?�0 T *�1 2,, ?G T 2+ 2,,������� ������� ?�? T )�* 2,1 22* T *, 22>������� � �� >�0 T 0�0 >? 222 T 2G 22G

( ����� � U G ��� � ���� �� ��� T ������ � ���������� �6� ����� �����

��. �� �+ !�� � ���� �������� �� �$%+, �� ����� �������� ��� '' ����� #-& 2,, �� �� ����� � ���� � ����� � ���� /�� 2� ���� �� ���H *� ������� ������� ���H )� ������� ������� ��� �� � ��� ����������� ������� ��� #9& 9������" ���� �� � ��������� � ��� T $3 �� � U ��� �� ������ � �� ��� �� ������� ������ #��3& � ��* �� ������������

������ ��� '' ���� �� ��� �� ��� ����� ��������������� �� �$%?,� +,� G,� ��� )*� ( ����� �� �������� ������� ���� � ����� � ���������� �$%� ��� ��������� ������ ��� '' ���� ��� ��� ������ '� ������ ��� '' ���� � ��� �� �$%)* ��� ��� �� ����� ������� ���� �� �� ��� ��� ����� ��� � �� ����� ����� �� #11P �� ���� �� �����& ��� �� �� ���� � �$%+, ��� ��� �� ��� ����� �� � ����� �� ����� �� ��� �� ������ ��� '' ���� �� ����� 0,P ������ ��� �$%G, ���� � ��� �� �� �� �� ������ ��� '' ���� #�� ����� +1P �� ���� ��& ��� � ������������� �� �� ��� ����� #�� ����� *1P �� ���� ��&� !�������� � �� ������ ���� �� "��� �� �$% ��� ��� ����� � ������ ��� '' ����� � �� � �� ����� ����� � �� �$% ���� �������� �� ���� �� ������� ������ � ������� � ������ ��� ��� ����� � �� ����� ���$%?, �� ��� '' ���� ��� � ��� # ����� ��� ����&�

0 ,��� �����

( ���� ���� ���� ����� �� ��� ����� ��� � ����� ���� �� �������O #�& $��������� ������� �� ������� � �� ��������� � �� "� ��� �� �� �$%)* �� ������ ��� ''���� ��� �� �$%+, �� ��� ������ � �� � ����������� ����������� ����� ��� ��� ���� �������������� #��&@����� � ������� �� � ������� ���� �� ������� ��������� ��� � ����� �� ���� ������ �� � ��� ��

��������� � *,,,� ��� )11*=)11+ ������� � �������� ��� �� ���" � ����� )111

��. �� $+ !�� � ���� �������� �� �$%G, �� ����� �������� ��� '' ����� #-& N�� �� �� ����� � ���� � ����� � ���� /�� 2� *� ���� �� ���H )� 0� ������� ������� ���H 1� G� ������� ������� ��� �� � ������������� ������� ��� #9& 9������" ���� �� � ������� ��� � ��� T $3 �� � U > �� ������ � �� ��� �� ��3� ���* �� ������ ������

��. �� /+ !�� � ���� �������� �� �$%)* �� ����� �������� ��� '' ����� #-& 2�1 �� �� ����� � ���� � ����� � ���� /��� 2=G �� �� N��� *� #9& -� �� N��� *�

��. �� 0+ !�� � ���� �������� �� �$%+, �� ����� ����� ������ #-& 2,, �� �� ����� � ���� � ����� � ���� /��� 2=G �� �� N��� *� #9& -� �� N��� *�

���� ��� ( ���� � �� �$% �� ����� ��� �� ����� ������ �� � �������� ��� �� � ��� ���� '��� �� ���� ��� �$%)* �� �������� �� ���������� �� �� � ��� �� ��� �� ��������� ���� ;*,� *2<� ��������� �� �� ������ � �� ����� �� �$%)*� ��� ��� ���$%+,� �� ����� � ���� ���� ;2*� **<� -���� ��������������� �� ���� ���� � ����� �$%+, �� �� �������� ���� ��� �� ����� � ���� ���� ;2*� *)<� '� ���� ����� �$%+,�� ����� �� ������������� ��� ��� �� ����� ;*0<� ������ ��� ��� �� ����� �� � ���� ������ ������ ������ #-10?& � ����� ������� �� ���� ;*1<� �$%+, ������� � � ��� ���� �� �� ����� ������ � �� ���� '��� ��� �� ����� �� �$%+, � ����� ������ �� � ���� ;*G<� �������� ;*+<� ��� ������ ;*><�

3��� � ������� � ������� ����� ������� � ������ ������ �� �� �� �� ������ � ��� ���� �� ������ ��� '' ���� ��� �� ��� ����� #(��� 2&� ( �� � ������� ��� � ���� ����� �� ����� �� �$%)* �� ���'' ����� ��� �� �$%+, �� ��� � ������ �� ������� � ��������� ����� ����������� ������ �� � �$% �� ������� �� ��� ���� �� ���� �� �� �� #��� ����� ���" �� ��� �� �� ���� �� �$% ����&� ������� ���������� �� ����� #����� ������ ��� ���������� ���������� �����& � ���� ������ �� ��� ��� �� ������ �� ��� �� �� �$%)* �� ������ ��� '' ���� �

�� �$%+, �� ��� � N �� � ��� �� �� � ����� � ��� ����� �� ������� � ����� #(��� 2& ��� �$%)* �� ���� ��������� ��� ������� � ������� � ����� �� ���� ����� '' ����� �� �������� ����� ������ � �������� ������������� ����� ��� ��� ���� #(��� *&� 4�� ������ �� �� �� � ����� � �� ����� �� ���� �� �$%��� �� ��� �� �� ��� ��� ������ ��� '' ����� � ��� �� �$% ���� #��� � ������� �� �$%?,&�� ���� ( ������� ��� � ������������ ������������ �� ��� �� �� � ��"�����

( ���� �� �� ������ �� � ���� �� �� � ��� �� ����������� �� $��� ������ #�������� � � � ������& ������ ������� � �������� ;*?<� �� ������ �� ������� �� �������� �� ������ �� ��� ��� ��� �� ������� � � ������� � �������� �� � ���� ���� �� �� ������������� ��� ��� ��" �� �������� ������������� ���� �� ;),=))<�

�� ����� ��� ��� � ���������� ������� � ������ ��������� � ������ � ��������� �� �� ������ �������������� ������� � ��������� �� ������ � ���� � ������ �� �� ��� ��� �� �� � ��������� �� � ����� ����� �� ��� ������� ���� �� ������� ������ (�� ������� �� �� ��� � ������ ��� �� ��� ��������� ��������� � ��� ��� ��� � � ���� �� � � �������������� �� ������� � ������� �������� �� �� �� ���������� ������

)11G S� N� (����� � ��� ��������� � *,,,� ��� )11*=)11+

��. �� 5+ !�� � ���� �������� �� �$%)* �� ����� ����� ������ #-& (� �� �� ����� � ���� � ����� � ���� /��� 2=G �� �� N��� *� #9& -� �� N��� *�

��. �� 1+ !�� � ���� �������� �� �$%G, �� ����� ����� ������ #-& N�� �� �� ����� � ���� � ����� � ���� /��� 2=G �� �� N��� *� #9& -� �� N��� *�

��� ��� �� ������ �� ����� ���� ���� �� �������� ��� � ������ ��� !�""#$��� ��� %�� ��� �� ����� ������ ����� ��� &� $�' ( $���

@���� -� �� 1� *,,,

1 ���������

;2< 7������ ��� ��O -���� $� #���&� )*������ +� ��� ,����*������ %���� � �� �������� 7����� ��� ����� 4�J� "� ��� 2=0G�

;*< $����� 4� :�� %� ����� -�� $������� %� 5�� C���� N��7����� C�� 5��������� 5� R�� -���� 2??G� ./'�+>2=+>G�

;)< ( �� � 5�:�� �� &����� ����� 0��� 2??0� �1� **?=*)?�

;0< 7��� 7� C�� �� &����� ����� 0��� 2??2� ��� *21=*)*�

;1< : ��� C� ��� :��� � �� /�� 2�� 3���� 2??)� �#�2*1=2))�

;G< �� �� ��� C���� ��� C��� � C�� ���� &� � 2??,� $�!�))1=))>�

;+< C��� R �� R� N�� $����� 3� '�� N ����� R� ��� ,+�� 4�2???� �.� ?G1=?+1�

;>< ( �� � 5� :�� $��� ��� ,���� &��� 2�� 2??G� �1�)*2=)0+�

;?< C����"�� 9�� 3���� (�� $�����"�� :�� 5�� 4� 6���� 2��&� � 2??1� 1$� 2,2=2,0�

;2,< $�"��� @� R�� ��O %��" � /�� N���� R� #����&� 6����� � ��7���� ��� %� �� �� 3"" � 4� J� "� 9���� ���� C���2??)� ��� >21=>0?�

;22< !��� !� R�� 8�� ���� &��� 2??*� '�� 2,G)=2,>2�

;2*< !���� �� @�� 5����� '� J�� @���� 5� -�� 3��� �� -�:�� !���� R� @�� ,�� 4� 8�� ��� 2??>� �'$� />)G=/>02�

;2)< ������ � /� ��� 3��� 2??2� 11� 2?2=2?+�

;20< R������� 5�� !������� 3�� ,��� 0��� 2??*� �/� *0?=*1>�

;21< 3����� /� :�� :������� @�� !�������� 5� 7�� ,�� &���&� ��� %� � 2?>G� �./� 202=201�

;2G< 7��������� :� /�� 9� �� R� :�� 3���� 3���� 2?>)� �#�+,>=+2*�

;2+< /������ 6� C�� 2��� 2?+,� ��'� G>,=G>1�

;2>< ����� � �� N�� J������� @� R�� �������� !�� ��O 9 ���� � �� 6� #���&� 0���� �� ��"����� ,���� � � 6����3������ 9������� 2?>+� ��� *?)=),*�

;2?< -��� �� :�� ��O 9 ��� � �� 6� #���&� 0���� �� ��"������ ,���� � � � ��� 7��� !���� 2?>+���� *+)=*>1�

;*,< -������� /� -�� /��� � %�� (� ��� @� 5�� 3���� &� �2??2� $�� ?+0=?+>�

;*2< 7��� -� 5�� -���� R�� ,�� 4� &� ��� 3��� 0��� ����� 2??G��$� ?=2?�

;**< 7��� 3� $�� %��� � ��� !��� !� R�� $��� �� 3�� ,��4� &� ��� 3��� 0��� ����� 2??2� $� 2))=20)�

;*)< R� ���� /�� 5� ����� 5� ��� R����� -� N�� ,�� 4� &� ��� 3���0��� ����� 2??2� $� *G1=*+1�

;*0< �������� -� 5�� 7���� %�� %����� 9� $�� ���� %�� :��� �� %��9��� ��� R�� ,�� 4� &� ��� 3��� 0��� ����� 2??1� �.�G>)=G?2�

;*1< !���� �� @�� !���� R� @�� ,�� 4� 8�� ���� 2??+� �'.�/2=/?�

;*G< /�� :� 7�� /�� /� :�� /��� J� C�� 5�"� R� J�� 7�� /� /�� /�!� 5�� 8��� 2��� ,���� +��� :+, 2??*� ;;� 2G>2=2G>1�

;*+< !���� �� @�� @���� 5�� 5����� '� J�� 3��� �� -��!���� R� @�� +���� 2??+� ;� *2)=*2>�

;*>< 5� � � 5� $�� 5�� ��� @�� 7�� $� ��� $���� 5� @�� J�����3� 5�� 3�������� !� ��� 4� 3���� 5��� � 2??1� #$�200G=201G�

;*?< $���� $�� 3����� R�� (�� � 4�� 9���� $�� 7�����"� 5��-���� 2?>+� �� 0GG=0+2�

;),< N ��"� /�� $���"�� '� @�� 8����� &� � 2??2� �#� *?*=*?G�

;)2< $�������� R� /�� ,�� 4� %� � 3���� 2?>>� �/�� 2)02=2)00�

;)*< C� �� !� 9�� @�� ����� -� N�� ,��� 8����� 2?>G� ..�2*+=20+�

;))< $���� $�� 7�����"� 5�� ��O %��" � /�� N���� R� #����&�6����� � �� 7���� ��� %� �� �� 3"" � 4� J� "� 9�������� C��� 2??*� ��� >G2=>+,�

��������� � *,,,� ��� )11*=)11+ ������� � �������� ��� �� ���" � ����� )11+