análises microbiológicas
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IV. 1 - ENUMERAÇÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS, PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS
1.1.- Material necessário
Meio de cultura: Ágar para contagem padrão
Vidraria esterilizada:Placas de PetriPipetasAlças de Drigalski
Estufas a 35-37ºC e a 55CGeladeira a 5-7ºCBanho-maria a 45-50ºCContador de colônias
1.2 - Metodologia
1.2.1 - Preparar a quantidade necessária do ágar para contagem padrão (PCA), conforme instruções no frasco, calculando 15 a 20ml para cada placa de Petri.
1.2.2 – Efetuar a pesagem, homogeneização e diluição seriada do alimento.
1.2.3 – Procedimento
1.2.3.1- Bactérias aeróbias mesófilas e termófilas:
a) De cada diluição do alimento transferir 1ml para placas de Petri esterilizadas.
b) Adicionar cerca de 20ml de PCA, esfriado a 45ºC, em cada placa semeada e homogeneizar girando suavemente as placas no sentido horário e anti-horário, alternadamente.
c) Uma vez solidificado o ágar, inverter as placas e incubá-las a 35-37ºC durante 48 horas, para as bactérias aeróbias mesófilas e a 55ºC durante 48 horas, para as bactérias aeróbias termófilas.
1.2.3.2- Bactérias aeróbias psicrotróficas:
a) De cada diluição do alimento semear 0,1ml na superfície de placas contendo PCA. Espalhar com a alça de Drigalski. Incubar a 5-7ºC durante 7-10 dias.
1.2.4- Enumeração:
a) Decorrido o tempo de incubação, selecionar as placas contendo 25 a 250 colônias e contá-las com o auxílio de contador.
b) Calcular o número de unidades formadoras de colônias de bactérias aeróbias mesófilas / psicrotróficas / termófilas por grama de amostra (UFC/g ou mL), multiplicando o número de colônias encontradas pelo inverso do fator de diluição. No caso de bactérias psicrotróficas, considerar ainda o volume semeado.
1.3 – Esquema
Página 11.
1.4 - Preparo dos Meios de Cultura
Ágar Padrão para Contagem (PCA)
Preparar conforme instruções no frasco.
PCA (Pour Plate)
Termófilos55ºC/48h
10-210-3
9mL de diluente
1mL 1mL
PCA (Pour Plate)
PCA (Superfície)
Mesófilos 35-37ºC/48h
1mL1mL 0,1mL
Psicrotróficos5-7ºC/7-10dias
9mL de diluente
PCA (Pour Plate)
PCA (Pour Plate)
PCA (Superfície)
Mesófilos 35-37ºC/48h
1mL1mL
Termófilos55ºC/48h
0,1mL
Psicrotróficos5-7ºC/7-10dias
25g amostra
10-1
225mL de diluente
Homogeneização
PCA (Pour Plate)
PCA (Pour Plate)
PCA (Superfície)
Mesófilos 35-37ºC/48h
1mL1mL
Termófilos55ºC/48h
0,1mL
Psicrotróficos5-7ºC/7-10dias
IV.2 - ENUMERAÇÃO DE FUNGOS
2.1.- Material necessário
Meio de cultura: Ágar batata dextrose
Reagente:Ácido tartárico a 10% (solução esterilizada)
Vidraria esterilizada:Placas de PetriPipetas de 1mlPipetas de 5mlBastão de vidro Alças de Drigalski
Papel indicador de pHBanho-maria a 45ºCContador de colônias
2.2 - Metodologia
2.2.1 - Preparar a quantidade necessária de ágar batata dextrose, conforme instruções do frasco, e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 min.. No instante do uso, estando o meio a 45ºC, acidificá-lo com ácido tartárico a 10% até pH 4,0. Uma vez acidificado, o PDA não pode mais ser aquecido. Distribuir o meio de cultura em placas de Petri esterilizadas.
2.2.2 - Efetuar a pesagem, homogeneização e a diluição seriada adequada da amostra.
2.2.3 - Procedimento
a) De cada diluição do alimento, transferir 0,1ml para a superfície das placas de ágar batata dextrose.
b) Espalhar com a alça de Drigalski.
c) Incubá-las a 25ºC, sem inverter, durante 3-5 dias.
d) Decorrido o período de incubação, selecionar as placas contendo entre 25 e 250 colônias e contar as colônias.
e) Determinar o número de colônias de fungos por grama ou mL de alimento, conforme o item 1.2.4 (página 10). Expressar os resultados em UFC/g ou mL.
2.3 – Esquema
Página 14.
2.4 - Preparo dos Meios de Cultura
Ágar Batata Dextrose acidificado (PDA)
Preparar conforme instruções no frasco.
PDA (Superfície) PDA (Superfície)
Contagem totalContagem total
10-2 10-3
9mL de diluente 9mL de diluente
1mL 1mL
PDA (Superfície)
0,1mL0,1mL
25ºC/3-5dias
Contagem total
0,1mL
25ºC/3-5dias25ºC/3-5dias
25g amostra
10-1
225mL de diluente
Homogeneização
IV.3 - ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES A 45ºC E DE Escherichia coli
3.1 - Método dos tubos múltiplos
3.1.1 - Material necessário:
Meios de cultura:Caldo lauril sulfato triptose Caldo verde brilhante bile 2%Caldo ECÁgar eosina azul de metileno - LevineCaldo indolCaldo MR-VPÁgar citrato de Simmons
Reagentes:Reagente de KovacsReagente VMReagente VP
Banho-maria a 45 + 0,2ºC (alimento)Banho-maria a 44,5±0,2ºC (água)Estufa a 35ºC
3.1.2. - Metodologia
3.1.2.1 - Preparo do alimento para análise
Efetuar a pesagem, homogeneização e a diluição seriada do alimento. Preparar, no mínimo, 3 diluições decimais subsequentes.
3.1.2.2 – Procedimento
Teste presuntivo para coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli
a) De cada diluição do alimento, transferir 1ml para 3 tubos contendo o meio Lauril Sulfato Triptose (LST). Homogeneizar através de agitação cuidadosa.
b) Incubar a 35ºC durante 48 horas.
c) Decorrido o tempo de incubação, separar os tubos positivos, ou seja, os que apresentarem turvação do meio e gás no interior do tubo de Durham; dispensar os demais. Prosseguir como em 3.1.3 para pesquisa de coliformes totais e como em 3.1.4 para pesquisa de coliformes termotolerante e E.coli.
Teste confirmatório para coliformes totais
a) Transferir, com o auxílio de alça, um inóculo de cada tubo positivo de LST para outro tubo contendo Caldo Bile Lactose Verde Brilhante (BLVB).b) Incubar a 35ºC durante 48 horas.
c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gás no interior dos tubos de Durham) e anotar os resultados.
d) Utilizar a Tabela NMP adequada para calcular o "Número Mais Provável" (NMP) de coliformes totais por grama ou mL de alimento.
Teste confirmatório para coliformes termotolerantes e E. coli
Obs.: A legislação em vigor (Resolução RDC 12 de janeiro de 2001) estabelece limites para “coliformes a 45ºC”, sinônimo de coliformes fecais ou termotolerantes.
a) Transferir um inóculo com o auxílio de alça de cada tubo positivo de caldo LST para outro tubo contendo caldo EC.
b) Incluir, para controle da temperatura do banho-maria, um tubo de caldo EC inoculado com uma cultura de E. coli (controle positivo) e um tubo de caldo EC inoculado com cultura de Enterobacter aerogenes (controle negativo).
c) Incubar a 45ºC + 0,2 (alimento) ou 44,5ºC±0,2 (água) durante 24 horas.
d) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gás no interior dos tubos de Durham) e anotar os resultados.
e) Utilizar a tabela NMP adequada para calcular o "Número Mais Provável" de coliformes a 45ºC por grama de alimento.
Teste confirmatório para E. coli
a) Semear, por estrias, os tubos positivos de caldo EC em ágar Levine, de modo a obter colônias isoladas.
b) Incubar a 35ºC durante 24 horas.
c) Observar o surgimento de colônias típicas de E.coli, isto é, de coloração negra, com brilho metálico esverdeado (este brilho pode estar ausente ou pouco visível). Fazer a confirmação bioquímica das colônias suspeitas, através da série IMViC (prova do indol, do vermelho de metila, de Voges-Proskauer e do citrato):
Prova do Indol: Inocular com o auxílio de alça uma colônia suspeita no caldo indol. Incubar a 35ºC durante 24 horas. Adicionar 0,3ml do reativo de Kovács e observar a coloração da fase alcoólica.Prova +: fase alcoólica de cor púrpuraProva -: fase alcoólica de cor amarela
Prova do VP: Inocular a colônia suspeita no caldo MR-VP, incubar a 35ºC durante 48 horas. Adicionar a 1,0ml de cultura 0,6ml do reagente "A" e 0,2ml do reagente "B" e agitar vigorosamente o tubo. Se necessário, aquecer.Prova +: coloração vermelhaProva -: coloração amarela
Prova do VM: Inocular a colônia suspeita no caldo MR-VP e incubar a 35ºC durante 4 dias. Adicionar algumas gotas do reagente VM, e observar a coloração do meio.Prova +: coloração vermelhaProva -: coloração amarela
Prova do citrato: Inocular a colônia suspeita na superfície do ágar citrato e incubar a 35ºC por até 4 dias. Observar a mudança da coloração do meio verde para azul.Prova +: meio azulProva -: meio verde
d) Resultados positivos para as provas do indol e do VM e negativos para as provas do VP e citrato confirmam a presença de E.coli.
e) Expressar os resultados em NMP de E.coli/g ou mL do alimento consultando a tabela do NMP.
3.1.3 – Esquema
Página 21.
3.1.4- Tabelas
Tabela 1: Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probalidade, para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 10 porções de 10mL da amostra por tubo (APHA, 1985)
Intervalo de confiança (95%) (valores aproximados)Nº de tubos positivos NMP/100mL Mínimo Máximo
0 <1,1 0 3,01 1,1 0,03 5,92 2,2 0,26 8,13 3,6 0,69 10,64 5,1 1,3 13,45 6,9 2,1 16,86 9,2 3,1 21,17 12,0 4,3 27,18 16,1 5,9 36,89 23,0 8,1 59,510 >23,0 13,5 Infinito
Tabela 2: NMP por grama e intervalo de confiança (95%), para séries de
3 tubos com 0,1, 0,01 e 0,001 g/mL de inóculo.
Pos. tubesMPN/
g
Conf.
lim.Pos. tubes
MPN/
g
Conf. lim.
0.1
0
0.0
1
0.00
1
Lo
w
Hig
h
0.1
0
0.0
1
0.00
1
Lo
w
Hig
h
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.00.1
59.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.00.1
511 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.60.1
718 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 901,00
0
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 421,00
0
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 902,00
0
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 1804,10
0
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tables
3.1.5 - Preparo dos Meios de Cultura
Ágar Eosina Azul de Metileno (EMBA) - Levine
Preparar conforme instruções no frasco.
Ágar Citrato de Simmons
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 2ml por tubo de ensaio antes de autoclavar. Após a autoclavação inclinar os tubos.
Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10ml por tubo, introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10ml por tubo, introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Caldo EC
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10ml por tubo, introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Caldo Indol
Ingredientes g
Triptona 10
NaCl 5.0
Dissolver os ingredientes em 1 litro de água destilada e acertar o pH para 7,0.
Dividir 5ml por tubo de ensaio. Autoclavar a 121oC durante 15 minutos.
Caldo MR-VP
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 5 ml por tubo antes de autoclavar.
Reagente de Kovacs
Ingrediente g
p-dimetilaminobenzaldeído 5
Dissolver completamente o aldeido em 75ml de álcool amílico, aquecendo levemente em banho-maria (50-60ºC), se necessário. Adicionar cuidadosamente 25mL de HCL concentrado, deixando escorrer lentamente pela parede do frasco sem provocar respingos.
Reagente VP
Solução de 5% de alfa-naftol
Ingrediente g
Alfa-naftol 5,0
Dissolver o alfa-naftol em meno de 100mL de etanol, transferir para um balão volumétrico e adicionar o etanol restante (volume de 100mL).
Solução 40% hidróxido de potássio
Ingrediente g
KOH 40,0
Pesar o KOH rapidamente e dissolver em menos de 100mL de água, em um béquer colocado em banho de água fria (controle da elevação da temperatura). Aguardar resfriar e transferir para um balão volumétrico, completar com o volume final de 100mL com água destilada.
Reagente VM
Ingrediente g
vermelho de metila 0,02
Dissolver o corante em 60,0mL de etanol 95% e completar o volume para 100mL com água destilada em um balão volumétrico.
Multiplicação e produção de gás
NMP coliformes a 45ºC
Ágar EMBA(Teste confirmativo
para E. coli)
9mL de diluente
1mL
10-2 10-3
9mL de diluente
1mL
35-37ºC/48h
Caldo LST(Teste
Presuntivo)
Multiplicação e produção de gás
1 alçada
Caldo EC(Teste confirmativo para Coliformes a
45ºC)
Caldo VB(Teste confirmativo
para Coliformes Totais)
E. coli E. aerogenes
45º/24h
35-37ºC/48h
1 alça
35-37ºC/24h
Multiplicação e produção de gásNMP coliformes
totais
Citrato de Simmons
CaldoMR-VP
Caldo Triptona
VP (-) e VM (+)
35-37ºC/24h
35-37ºC/96h
35-37ºC/48h (VP)
35-37ºC/96h (VM)
Citrato (-)
Indol (-) ou (+)
25g amostra
10-1
225mL de diluente
1 alça
Homogeneização
IV.4 - PESQUISA DE Salmonella
4.1 - Material necessário
Meios de cultura: Caldo LactosadoCaldo Rappaport-Vassiliadis (RV) Caldo tetrationato Ágar bismuto sulfito (SB) Ágar entérico de Hektoen (HE) Ágar Rambach (RAM)Meio EPMMeio MILiÁgar citrato de SimmonsÁgar lisina ferroÁgar tríplice açúcar ferro
Vidraria esterilizada:Placas de PetriPipetas de 1ml
Estufa a 35ºCContador de colôniasFiltro esterilizante
Soros polivalentes somático e flagelar
4.2 - Metodologia
4.2.1 - Pré-enriquecimento
Homogeneizar 25g ou 25ml do alimento com 225ml de Caldo Lactosado. Incubar a 35-37ºC, por 18-24 horas.
4.2.2 - Enriquecimento
Transferir 1ml da água peptonada tamponada para um tubo contendo 10ml de caldo tetrationato e 0,1ml para um tubo contendo 10ml de caldo Rappaport-Vassiliadis. Incubar o primeiro a 35ºC e o segundo a 43ºC em banho-maria por 24 horas. Obs: Para amostras de carnes cruas ou rações, incubar ambos a 43ºC.
4.2.3 - Semeadura em ágar seletivo
Semear superficialmente por esgotamento os caldos de enriquecimento em placas de ágar sulfito de bismuto (SB), ágar Hektoen-enteric (HE) e ágar Rambach (RAM), de modo a obter colônias isoladas. Incubar a 35-37ºC por 24 horas.4.2.4 - Identificação de colônias suspeitas
Ágar SB: as colônias podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas apresentam-se com brilho metálico. Ágar HE: colônias verde-azuladas a azuis com ou sem centro negro. Muitas culturas de Salmonella podem produzir colônias totalmente negras.
Ágar Rambach: colônias “pink”, arredondadas, brilhantes.
4.2.5- Identificação bioquímica
Semear uma colônia em tubo contendo tríplice açúcar ferro (TSI), inclinado, e ágar lisina ferro (LIA). Incubar a 37C/24h.
TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Reação atípica em TSI que não deve ser descartada se as demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S.
LIA: fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H2S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA que não deve ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S
Colônias características de Salmonella: proceder à incubação no sistema Enterokit B (Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda.), que emprega os meios EPM, MILi e Citrato de Simmons.
Tocar o centro da colônia suspeita com a agulha de níquel-cromo e semear: o meio EPM em toda a superfície e por picada até o fundo do tubo; o meio MILi, por picada, até o fundo e o meio de citrato em toda a superfície. Incubar os 3 tubos a 37ºC durante 24 horas.
O meio EPM permite observar:1) produção de gás: desenvolvimento de bolhas.2) produção de H2S: enegrecimento do meio.
3) produção de urease: a base do meio fica azul.4) produção de L-triptofano desaminase: a superfície do meio fica verde escuro.
O meio MILi permite observar:
1) motilidade: o meio fica todo turvo.2) produção de lisina descarboxilase: o meio fica todo roxo.3) produção de indol: desenvolvimento de anel vermelho, após adição do reativo de Kovacs.
O meio citrato de Simmons permite observar utilização de citrato por mudança de cor do meio para azul.
Os resultados destes testes para Salmonella são:
Salmonella sp S. typhi S.paratyphi A
EPM
produção de gás + - Vprodução de H2S + +f -produção de urease - - -produção de LTD - - -
MILimotilidade + + +Indol - - -Lisina + + -
Citrato + - -V = variável+f = positivo fraco
4.2.6 - Identificação sorológica
Deverá ser feita após a identificação bioquímica, utilizando-se inicialmente o soro polivalente somático (contém anticorpos contra os antigenos somáticos das salmonelas dos grupos A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3, E4 e contra o antigeno Vi) e, posteriormente, o soro polivalente anti-Salmonella flagelar (contém anticorpos contra os antigenos flagelares a, b, c, d, i, 1, 2, 5) (Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda.). A metodologia para a identificação sorológica é a de aglutinação em lâmina.
4.3– Esquema
Página 31.
4.4 - Preparo dos Meios de Cultura
Caldo Lactosado
Extrato de carne 3,0gPeptona 5,0gLactose 5,0gÁgua Destilada 1000mL
Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 6,9±0,2. Autoclavar a 121ºC por 15min e distribuir 225mL.
Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 ml por tubo
Ágar Rambach (RAM)
Preparar conforme instruções no frasco.
Caldo Tetrationato (TT)
Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10ml por tubo de ensaio. Não autoclavar. No momento do uso, adicionar 0,1ml de uma solução de verde brilhante 1:1000 e 0,2ml da seguinte solução de lugol:
Iodo 6 gIodeto de potássio 5 gÁgua destilada 20 ml
Ágar Bismuto Sulfito (BSA)
Preparar conforme instruções no frasco.
Ágar Entérico de Hektoen (HE)
Preparar conforme instruções no frasco.
Meio EPM
a) Solução A
Triptona 10 gExtrato de carne 2 gCloreto de sódio 5 gFosfato de sódio dibásico anidro 1,22 gL-triptofano 1 gÁgar 11 gÁgua destilada 1 litro
Dissolver os ingredientes, exceto o ágar, acertar o pH para 7,0 (crítico).
Adicionar o ágar e autoclavar a 121oC durante 15 minutos.
b) Solução B
Citrato de ferro amoniacal 2 gTiossulfato de sódio 2 gGlicose 10 gUréia 40 gÁgua destilada 85 ml
Dissolver os ingredientes e aquecer em banho-maria a 65oC com agitação constante, durante 1 hora.
c) Solução CAzul de bromotimol 1.5 gHidróxido de sódio 0.05N 48 mlEtanol 50 mlÁgua destilada 2 mlEstocar protegida da luz
d) Preparo final do meio
Solução A 100 mlSolução B 1,75 mlSolução C 0,20 ml
Após resfriar a solução A a 65oC, adicionar a solução B e a solução C. Distribuir 5ml em tubos de ensaio 12 x 120mm, previamente esterilizados e deixar solidificar em posição inclinada.
Meio MILi
Extrato de levedura 3 gPeptona 10 gTriptona 10 gL-lisina 10 gGlicose 1 gÁgar 2 gSolução de purpura de bromocresol 0.2% 25 mlÁgua destilada 1 litro
Dissolver os ingredientes, exceto ágar. Ajustar o pH para 6.5, adicionar o ágar e aquecer para dissolução completa. Distribuir 4ml em tubos 12 X 120mm e autoclavar a 121oC durante 15 minutos. Deixar solidificar na posição vertical.
Solução de púrpura bromocresol a 0,2%Púrpura de bromocresol 0,2gNaOH 0,05N 74,0mlEtanol 13mlÁgua destilada 13ml
Estocar protegido da luz.
Obs.: Os meios EPM e MILi podem ser adquiridos prontos no comércio (Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda).
Ágar Lisina Ferro (LIA)
Preparar conforme instruções do fabricante.
Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)
Preparar de acordo com as instruções do fabricante.
Ágar Citrato de Simmons
Vide item 3.1.5 de Enumeração de coliformes, página 19.
Homogeneização
25g amostra
225mL de caldo de pré-enriquecimento
Enriquecimento seletivo
Incubação 35-37ºC/18-24h
1mL 0,1mL
Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) 10mL
Caldo Tetrationato (TT) 10mL
35ºC/24h 42ºC/24h
Ágar BS Ágar RAM Ágar HE Ágar BS Ágar RAM Ágar HE
35-37ºC/24h
Citrato de Simmons
Identificação
Ágar TSI
Ágar LIA
35-37ºC/24h
EPM MILi
Série bioquímica positiva para Salmonella
35-37ºC/24h
Sorologia