ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS

Paula Christiane SoubhiaLaboratório de ToxicologiaCentro de Controle de Intoxicações

INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISESINTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES

NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

Laboratório de Análises Toxicológicas – LATLaboratório de Análises Toxicológicas – LATAuxílio ao diagnóstico de intoxicaçõesAuxílio ao diagnóstico de intoxicações

Análises quali/quanti

Administração de antídotos

Diagnóstico diferencial

Prognóstico – nomogramas

Biomonitorização

Pesquisas: toxinologia, toxicocinética, analíticas

InformaçõesInformações

História

Indivíduo: anamnese

Síndrome tóxica

Agente tóxico suspeito

Quantidade

Circunstância

Horário da intoxicação

PESQUISA DO AGENTE

PESQUISA DO AGENTE

TÓXICOTÓXICO

1) Direcionamento – o que pesquisar e onde? 2) Tipos de matrizes biológicas3) Preparação da amostra

- Liberação dos analitos da matriz- Remoção de interferentes endógenos- Técnicas de extração- Aumento da seletividade e sensibilidade

4) TécnicasCCDCromatografia em fase gasosaCromatografia líquida

Planejamento da análise Planejamento da análise AMOSTRAAMOSTRA

MÉTODOMÉTODO

Tipos de Amostras Tipos de Amostras UrgênciaUrgência Controle Controle

terapêuticoterapêuticoForenseForense OcupacionOcupacion

alalDopingDoping Amostras Amostras

alternativasalternativasSangueSangue SangueSangue VíscerasVísceras SangueSangue SangueSangue SuorSuor

UrinaUrina SalivaSaliva Produtos Produtos diversosdiversos

UrinaUrina UrinaUrina MecônioMecônio

Lav. GástricoLav. Gástrico Humor Humor vítreovítreo

SalivaSaliva UnhaUnha

ProdutoProduto CabeloCabelo

MedicamentMedicamentosos

Ar Ar exaladoexalado

SalivaSaliva

SangueSangue

Sangue total, soro e/ou plasmaSangue total, soro e/ou plasma Matriz complexaMatriz complexa AnticoagulanteAnticoagulante HemóliseHemólise Volume: menor disponibilidadeVolume: menor disponibilidade Correlação com o efeito Correlação com o efeito Período de detecção:Período de detecção: Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.

UrinaUrinaTriagens qualitativas Triagens qualitativas

Disponível em grandes volumesDisponível em grandes volumesColeta não invasivaColeta não invasiva> Chance de encontrar a substância> Chance de encontrar a substânciaPresença de produtos de biotransformação Presença de produtos de biotransformação DulteraçãoDulteraçãoTriagemTriagemSó indicativo de uso Só indicativo de uso

Quantificação Quantificação correção com creatininacorreção com creatinina

Conteúdo gástricoConteúdo gástrico

Análises qualitativas Análises qualitativas Coletar a 1ª porçãoColetar a 1ª porção Grande volume disponívelGrande volume disponível Agente tóxico em grandes Agente tóxico em grandes

concentrações e não concentrações e não biotransformadobiotransformado

Amostra Amostra

ESTABILIDADEESTABILIDADE

MatrizMatriz

Tipo de agente tóxico: medicamentos, metais, praguicidasTipo de agente tóxico: medicamentos, metais, praguicidas

ARMAZENAMENTOARMAZENAMENTO

PeríodoPeríodoTubos especiais: mTubos especiais: metais (HNOetais (HNO33 10%, água deionizada) - 10%, água deionizada) - complexaçãocomplexaçãoPraguicidas (acetona) - resíduosPraguicidas (acetona) - resíduos

ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS

APLICAÇÃOAPLICAÇÃO ÁREASDiagnóstico clínico

Forense

Doping

Controle terapêutico

Biomonitorização

O QUE SE ESPERA ENCONTRARO QUE SE ESPERA ENCONTRAR

PROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADOPROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADO

QUALIQUALI

TRIAGEMTRIAGEM

QUANTIQUANTI

sensibilidadesensibilidade

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS

A preparação de amostras pode ser A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de operações considerada como uma série de operações unitárias necessárias para que determinada unitárias necessárias para que determinada substância (analito) possa ser detectada substância (analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.pela técnica analítica de escolha.

ANÁLISES TOXICOLÓGICAS ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Técnicas analíticasTécnicas analíticas

CromatográficasCromatográficasEspectrométricasEspectrométricasImunoensaiosImunoensaiosEspectrotométricasEspectrotométricasColorimétricasColorimétricas

EQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIAEQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIA

Técnicas analíticas FinalidadeCCD/HPTLC Triagem medicamentos, drogas abuso,

praguicidasCG Medicamentos, drogas, praguicidas,

solventesHPLC Medicamentos, drogas, praguicidas,

solventes

Espectrometria de Absorção Atômica (EAA)

Metais (Pb, Cd, As, Hg)

ICP TraçosEspectrometria de massas Peso molecular e características

estruturais da amostraEspectrofotometria Substância inalterada, produtos de

biotransformação e indicadores biológicos

Colorimetria MedicamentosImunoensaios Triagem e confirmaçãoEletroforese capilar Praguidas – glifosato, paraquat, drogas

de abuso

Típicas operações em preparação de Típicas operações em preparação de amostras:amostras:

A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra

B) Remoção de interferentes endógenosB) Remoção de interferentes endógenos

C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração

D) Aumento da seletividade e sensibilidadeD) Aumento da seletividade e sensibilidade

A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra

Analito na matrizAnalito na matriz

- conjugado- conjugado

- livre- livre

BIOTRANSFORMAÇÃOMaconha - 9THC

CH3

OCH3

CH3

OH

C5H11

Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC)

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OO ácido glicurônico

Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS

HidróliseHidrólise

- Alcalina- Alcalina

- Ácida- Ácida

- Enzimática- Enzimática

HIDRÓLISE ALCALINA HIDRÓLISE ALCALINA

Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

3CH

nicoC

OCH3

OH

C5H11

OO ácido glicurô

Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

60°C

NaOH

-Vantagens:-processo mais rápido-custo baixo

- Desvantagens:-degradação de analitos

não estáveisp.ex. benzodiazepínicos

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA Esteróides Anabólicosconjugados Esteróides Anabólicos

livres55°C/1 hora

Beta glucuronidase

-Vantagens:Vantagens:-não degrada os analitos

- Desvantagens:- Desvantagens:-custo mais alto-maior tempo de reação-controle mais rigoroso das condições-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas

amostras

B) B) Remoção de interferentes endógenosRemoção de interferentes endógenos

Uma matriz biológica consiste de muitos Uma matriz biológica consiste de muitos

componentes, como proteínas, lipídios, componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.carboidratos que podem interferir na análise.

B) B) Remoção de interferentes endógenos Remoção de interferentes endógenos - - PROTEÍNAS -PROTEÍNAS -

Matriz: sangue total/plasmaMatriz: sangue total/plasma

Determinação: fármacos (ligado/livre)Determinação: fármacos (ligado/livre)

Método: precipitação/desnaturaçãoMétodo: precipitação/desnaturação

Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel e Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel e obstruir a coluna cromatográficaobstruir a coluna cromatográfica

AgentesAgentes precipitantes- alteração da precipitantes- alteração da solubilidade na solução aquosasolubilidade na solução aquosa

Ácidos: formação de sais insolúveis com a forma catiônica ormação de sais insolúveis com a forma catiônica das proteínasdas proteínas Ácido tricloroacético e ácido perclórico

Solventes orgânicos: Solventes orgânicos: solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a solubilidade de proteínas.

Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da solubilidade das proteínas – efeito salting-out : solubilidade das proteínas – efeito salting-out : ssulfato de amônio

C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração

1) Extração líquido-líquido (LLE)

2) Extração em fase sólida (SPE)

3) Extração por head space (HS)

4) Micro extração em fase sólida (SPME)

5) Derivação

C) Técnicas de extração C) Técnicas de extração

Transferir os analitos (matriz original) de forma adequada para análise em instrumentação cromatográfica

ExtraçãoExtração

Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e matriz)matriz)

PolaridadePolaridade

SolubilidadeSolubilidade

Estabilidade química e térmicaEstabilidade química e térmica

Clean-up – interferentes endógenos ou exógenosClean-up – interferentes endógenos ou exógenos

Concentração – sensibilidadeConcentração – sensibilidade

Tempo: 80% da análiseTempo: 80% da análise

1) Extração líquido-líquido (LLE)1) Extração líquido-líquido (LLE)Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.

Fenômeno: partiçãoFenômeno: partição

Coeficiente de partição/distribuição: Coeficiente de partição/distribuição: K= CK= C22/C/C11

pH fase aquosapH fase aquosa

proporção vol. das fasesproporção vol. das fases

↑↑ da fase extratorada fase extratora

2 ou mais extrações2 ou mais extrações

ELLELL

urina

Solvente orgânicourina

Drogas/ metabólitos

Agitação

Centrifugação Separação da fase orgânica

Extrato

Solvente extratorSolvente extrator Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série

eluotrópica)eluotrópica) Baixa viscosidade – interação com a matrizBaixa viscosidade – interação com a matriz Baixo ponto de ebuliçãoBaixo ponto de ebulição Corrosão em equipamentosCorrosão em equipamentos ToxicidadeToxicidade Menos polares: matrizes biológicasMenos polares: matrizes biológicas CustoCusto Aditivos e estabilizadores de solventesAditivos e estabilizadores de solventes

ESCOLHA DOS SOLVENTES ESCOLHA DOS SOLVENTES Drogas ácidas e neutras

acetato de etila, diclorometano, éter-isopropanol 7:3, n-hexano-éter 1:1, entre outros.

Drogas básicas e neutras álcool isoamílico 1 ou 2% em n-hexano, éter etílico,

diclorometano, n-hexano-acetato de etila 7:3, etcPraguicidas

n-hexano, éter de petróleoMetais

metil-isobutilcetona (Pb-pirrolidina ditiocarbamato de amônia)

INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE

Substâncias de caráter básico – extração básicaEx. anfetaminas

Matriz

Anfetamina

CH2 CHCH3

NH

H

OH --Forma ionizada

neutro

CH2 CHCH3

NH

H

Ajuste do pHAjuste do pHNaOH 2%NaOH 2%

Impurezas ácidasConvertidos em ânions

INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE

Substâncias de caráter ácido – Extração ácidaEx. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

NeutroC

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

H+

Ajuste do pHAjuste do pHHCl 5%HCl 5%

Impurezas Impurezas básicas cátionsbásicas cátions

AJUSTE DE pHAJUSTE DE pH

Drogas ácidas e neutras Soluções ácidas (HCl diluido, NH4Cl saturado, tampão

acetato, tampão fosfato) Tampões sólidos (fosfato)

Drogas básicas e neutras Soluções alcalinas (NaOH diluído, NH4OH diluido,

Na2CO3, Na3BO3, tampão fosfato, tampão borato) Tampões sólidos (carbonato/bicarbonato)

ELLELL

= molécula de água

+ NaCl

Na+ Cl-

CH2 CHCH3

NHH

+

Efeito Salting-outEfeito Salting-out

Melhora do coeficiente de Melhora do coeficiente de partição/distribuição entre um solv. partição/distribuição entre um solv. orgânico e a aquosaorgânico e a aquosa

Diminui a formação de emulsõesDiminui a formação de emulsões Aumenta a recuperação do analitoAumenta a recuperação do analito

Vantagens - ELLVantagens - ELL

Fácil execuçãoFácil execuçãoNão requer instrumentação Não requer instrumentação

especialespecialBoa seletividadeBoa seletividadeGrande variedade de sistemas Grande variedade de sistemas

de extraçãode extração

Desvantagens - ELLDesvantagens - ELL

Amostras com alta afinidade com a fase aquosaAmostras com alta afinidade com a fase aquosa Impurezas do solventeImpurezas do solventeFormação de emulsõesFormação de emulsõesToxicidade do solvente extratorToxicidade do solvente extratorGrandes volumes de amostra e solvente – resíduosGrandes volumes de amostra e solvente – resíduosProcedimento trabalhoso e demoradoProcedimento trabalhoso e demoradoDifícil automaçãoDifícil automação

2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAExtração em Fase Sólida (SPE) A técnica de SPE é a mais utilizadas no preparo de amostras, tanto quando se quer pré-concentrar compostos de interesse, quanto em casos em que se pretende simplesmente separá-los de constituintes que possam interferir na análise.

Fluído biológico é misturado com um adsorvente e Fluído biológico é misturado com um adsorvente e posteriormente eluido com solvente apropriado.posteriormente eluido com solvente apropriado.

Mecanismo de retenção das substânciasMecanismo de retenção das substâncias AdsorçãoAdsorção PartiçãoPartição

Mecanismos de dessorçãoMecanismos de dessorção Solvente orgânicoSolvente orgânico Dessorção térmicaDessorção térmica

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

ETAPASETAPAS1.1.Condicionamento:Condicionamento: Umidificação e ativação dos Umidificação e ativação dos2.2.Adição da amostraAdição da amostra: Retenção quantitativa do : Retenção quantitativa do

composto de interesse e remoção de parte da matrizcomposto de interesse e remoção de parte da matriz3.3.LavagemLavagem: Remoção da maioria dos componentes : Remoção da maioria dos componentes

da matriz, o que aumenta a seletividadeda matriz, o que aumenta a seletividade4.4.EluiçãoEluição: Eluição quantitativa do composto de : Eluição quantitativa do composto de

interesse na colunainteresse na coluna

Metanol +tampão fosfato

1

Amostra + água + PI + tampão

fosfato

BEPIInterf.COC

2

Água + HCl 0,1M + metanol

3

Diclorometano/ isopropanol / NH3

(80:20:2)

4

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

EFS aparatoEFS aparato

PREENCHIMENTOPREENCHIMENTOFase sólida - Fase sólida -

empacotada em coluna (cartuchos)empacotada em coluna (cartuchos)

NaturezaNaturezaPolímeros porososPolímeros porosos

Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)

APOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenilAPOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenil

INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)

SiC8

Octil

SiPH

Fenil

SiCHCiclohexil

Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)

Si C N

H O

CNCianopropil

Si NH

H

H

O

NH2

Aminopropil

Si O

OH

O

HH

NH

2OHDiol

POLARES/fase normal: cianopropil, diolPOLARES/fase normal: cianopropil, diol

INTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes HINTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes H

Tipos de colunas (SPE)

- TROCA IÔNICA- INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostáticas)

SiC

O

O- +NH3 RCBA

Ácido carboxílico

Si

SO3- +NH3

SCXÁcido

benzenosulfônico

Si N+(CH3)3-SO3 R

SAXTrimetil

aminopropil

FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAFASE SÓLIDA

pHpHTipo de amostraTipo de amostraVolume de amostraVolume de amostraTratamento do adsorventeTratamento do adsorvente

CondicionamentoCondicionamentoLavagemLavagemDessorção (eluição)Dessorção (eluição)

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAVANTAGENS / VANTAGENS / DESVANTAGENSDESVANTAGENS

Redução do volume da amostra e do solvente extratorRedução do volume da amostra e do solvente extrator Maior rapidez na análiseMaior rapidez na análise Aumento de eficiência da extração (recuperação)Aumento de eficiência da extração (recuperação) Não formação de emulsõesNão formação de emulsões Volume de evaporação diminuídoVolume de evaporação diminuído Maior facilidade de automaçãoMaior facilidade de automação Maior seletividadeMaior seletividade Boa reprodutibilidadeBoa reprodutibilidade Várias possibilidades de adsorventes e solventesVárias possibilidades de adsorventes e solventes Alto custo, importaçãoAlto custo, importação Viscosidade da amostra afeta o fluxoViscosidade da amostra afeta o fluxo

3) EXTRAÇÃO POR 3) EXTRAÇÃO POR HEAD SPACEHEAD SPACE

DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS

Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI

ESTUFA 70°C 30 min GC

seringa

4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA 4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME(SPME)-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)

61 2 3 4 5

SPMESPME

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) Fibras comercialmente disponíveis Fibras comercialmente disponíveis

Fase estacionária (espessura do filme)

Abreviação Aplicação geral

Polidimetilsiloxano (100 m) PDMS Compostos não-polares, voláteis

Polidimetilsiloxano (30um) PDMS Não-polares, voláteis e semi-voláteis

Polidimetilsiloxano (7um) PDMS Não-polares, semi e não voláteis

Polidimetilsiloxano divinilbenzeno (65um)

PDMS-DVB Polar

Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral, voláteis

Carboxeno-polidimetilsiloxano (75um, 85um)

CAR-PDMS Voláteis

Carbowax- divinilbenzeno (65um, 75um)

CW-DVB Polar, voláteis

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)SÓLIDA (SPME)

Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME: Dimensões da fibra (comprimento, espessura);Dimensões da fibra (comprimento, espessura); Temperatura de extração;Temperatura de extração; Efeito da matriz (presença de sal, pH);Efeito da matriz (presença de sal, pH); Velocidade de agitação;Velocidade de agitação; Tempo de extração.Tempo de extração.

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

Vantagens da SPME sobre a SPE e extração Vantagens da SPME sobre a SPE e extração líquido-líquido:líquido-líquido:

SimplicidadeSimplicidade PráticoPrático RápidoRápido Extração sem utilização de solventesExtração sem utilização de solventes Pode ser automatizado.Pode ser automatizado.

5) Derivação5) DerivaçãoObjetivos:Objetivos:

- CG- CG

- Aumento da volatilidade e diminuição da - Aumento da volatilidade e diminuição da polaridadepolaridade

- Redução da degradação térmica- Redução da degradação térmica

- Aumento da resposta do detector – adição de - Aumento da resposta do detector – adição de grupamentos funcionaisgrupamentos funcionais

- Melhora da separação e a sensibilidade- Melhora da separação e a sensibilidade

DERIVAÇÃODERIVAÇÃO

N

C

CH3

OO H

O CO

N

C

CH3

OO CH2CF2CF3

O CO

PFP/PFPA

70°C 20 min

PFP: PentafluoropropanolPFPA: Anidrido pentafluoropropiônico

Ex. Benzoilecgonina: Aumento da sensibilidade para detectores detector

de captura eletrônica

REFERÊNCIASREFERÊNCIAS1) MCDOWALL, R.D. Sample preparation for

biomedical analysis. J. Chromatogr. B, 492, p.3-58, 1989.

2) WONG, S.H., SUNSHINE, I. Handbook of Analytical therapeutic drug monitoring and toxicology. CRC Press, 1997.

3) THEODORIDIS, G., KOSTER, E.H.M., JONG, G.J. Solid phase microextraction for the analysis of biological samples. J. Chromatogr. B, 745, 49-82, 2000.