analisi a due fotoni dellaccumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto candidato:...
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Analisi a due fotonidell’accumulo di ioni divalentiin colture cerebellari di ratto
Candidato: Alessandro Esposito
INFMIstituto Nazionale per laFisica della Materia
IBF - CNRIstituto di Biofisica Consiglio Nazionale delle Ricerche
Università degli Studi di Genova
Relatori: Prof.Mauro RobelloDott.sa Carla Marchetti Correlatore: Prof.Maurizio Canepa
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica
Importanza degli ioni divalenti Ca2+ e Pb2+
Ca2+
Pb2+
Ca2+ Il calcio, secondo messaggero
Pb2+ Il piombo, interferisce con alcune funzioni del calcio
Meccanismi di permeazione
Azione del piombo
Pb2+
Pb2+
Ca2+
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
2H.A.Godwin, “The Biological Chemisrty of Lead”, Current Opinion in Chemical Biology 5, 223-227 (2001)
M.Mazzolini,S.Traverso,C.Marchetti, “Multiple pathways of Pb(2+) […]”, J.Neurochem.2001 Oct;79(2):407-16
Modello biologico
neuroni cerebellari di ratto
Caratterizzazione:
- Microscopia in fluorescenza con eccitazione a due fotoni (TPM)- sonda fluorescente permeabile alla membrana: Indo-1
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Ca2+
Ca2+
Ca2+
3A.Periasamy, “Methods in Cellular Imaging”, Oxford University Press (2001)
A.Takahashi […] and B.Herman, “Mesurement of Intracellular Calcium”, Physiol.Review Vol.79 No4 (1999)
Eccitazione a singolo fotone
Microscopia a due fotoni
Microscopia in fluorescenza a scansione laser
TPLSM
CLSM
J.J. Sakurai, “Modern Quantum Mechanics”, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1985) Max Born and Emil Wolf, “Principles of Optics”, Pergamon Press (1970)
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Microscopia a due fotoni
Iw SPE1
0
20
40
60
80
100
120
290 340 390
Lunghezza d'onda (nm)
Sezi
one d
'urt
o a
sin
golo
foto
ne (
a.u
.) ~350nm
(Teoria perturbativa al second’ordine)
22 Iw TPE
i
f
E0
E1
P1 m
P2
P2
422
0
22
1
4,,0
z
w
tPtzIn
Rzz
e
Selezione del piano focale durante l’eccitazioneUtilizzo di radiazione rossa e nel vicino infrarosso anziché Vis-UV
4
Caratteristiche rilevanti della TPM
Luce IR-NIR per eccitare sonde Vis-UV
Minore fototossicità e fotodanneggiamento
Confocalità
Lunghezza d’onda: 700nm (680-1050nm)Potenza media sul campione: 5-7mW (0-70mW)Laser pulsato: 80MHz ; 100-200fs
RisoluzioneAssiale: 700nm Laterale: 250nm Temporale: 3s/pxl
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Sezioni ottiche
2m
Analisi delle distribuzioni di fluorescenzanello spazio (3D) e nel tempo
superfici
volumi
5A.Diaspro, “Confocal and Two-Photon Microscopy”, Wiley-Liss (New York, 2002)
F.M. Wahl, “Digital Image Signal Processing”, Artech House (1987)
TPM: apparato sperimentale
A.Diaspro […] and M.Robello (1999b), “Adapting a compact confocal […]”, Microsc. Res. Tech. 47, 196-205 A.Diaspro […] M.Robello and F.Olivini (2001), “Two-photon microscopy […]”, J.Biomed.Opt.
TsunamiMillennia
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Filtro neutro
MicroscopioTE300Eclipse
(Nikon)
Testa diScansione (PCM2000)
PMT1
PMT2
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Perfusione e soluzioni
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Misure di calcio intracellulare:Depolarizzazione (KCl75mM)Acido N-metil-D-aspartico 100M (NMDA)
Misure di accumulo di piombo:Piombo (20M)Lantanio (25M)
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Proprietà spettrali dell’Indo-1: misure raziometriche
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Ca2+
HQ405/30 HQ485/30
30/485
30/405
HQ
HQ
F
FR
Fotodanneggiamento e perdita di sonda
Disomogeneità della marcatura
RRRR
QKCaMAX
MINCa
][
nMKCa 230
Concentrazioni assolute di calcio8
G.Grynkiewicz, M.Poenie and R.Y.Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, The Journal of Biological Chemistry Vol.260 No.6 25th March 1985 3440-3450
Immagini raziometriche
1m
controllo
Indo-1 libero (485nm)
0 Intensità (a.u.) 183
Indo-1 legato (405nm)
0 Intensità (a.u.) 250
NMDA (100M)
0 Rapporto (a.u.) 2.0
Rapporto 405nm/485nm
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Misure raziometriche
Sonda legata (405nm)Sonda libera (485nm)Rapporto
NMDA(100M)KCl (75mM)
Intensità di fluorescenza (a.u.) Rapporto 405nm/485nm
Tempo (s)
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
10
Proprietà spettrali dell’Indo-1: quenching
HQ460/50
Pb2+
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
pMKPb 35
FF
fPb legato
0][
FFF
F
Pblibero KPb
1][
Non è più una sonda raziometrica
Stimare la concentrazione di sonda
Stimare il fotodanneggiamento della sonda
11M.E.Legare, R.Barhoumi, E.Hebert, G.R.Bratton, R.C.Burghardt and E.Tiffany-Castiglioni, “Analysis of Pb2+
Entry into Cultured Astroglia”, Toxicological Sciences 46, 90-100 (1998)
Marcatura tramite micropipetta
La sonda diffonde piuttosto velocemente nel citoplasma. Indo-1 100M fornisce misure di intensità di fluorescenza prossime a quelle osservate con la la marcatura tramite diffusione da membrana
12
Micropipetta con Indo-1 100M
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Brust-Mascher and Webb, “Calcium Induced by Large Voltage Pulses in Fish Keratocytes”,Biophy.J. Vol75 1998
Ricostruzione 3D e sezionamento virtuale di un neurone marcato tramite micropipetta.
5m
0 255Intensità (a.u.)
-75%
-60%
-45%
-30%
-15%
0%
0 2 4 6 8
Tempo (min)va
riazi
oni d
i flu
ores
cenz
a (%
)
Variazioni di fluorescenza
Fotodanneggiamento della sonda
Pb20µM Pb20µM
Permeazione del piombo
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
-5
5
15
25
35
45
55
65
75
0 2 4tempo (min)
Con
cent
razi
one
(M
)
Statistica sulle concentrazioni stimate
Pb20µM Pb20µM6115M
5411M
13
Inibizione del lantanio
Pb2+
La3+
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
14
-5
5
15
25
35
45
55
0 2 4tempo (min)
Con
cent
razi
one
(pM
)Pb20µM Pb20µM
+La25µM
Analisi dell’accumulo di piombo
4411pMPiombo legato:6115Me probabile saturazione del trasporto
Piombo libero: 4411pM
Parziale inibizione del lantanio
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
15R.H.S.Westerink and Henk P.M.Vijverberg, “Ca2+-indipendent vesicular catecholamine release in PC12
cells by nanomolar concentrations of Pb2+”, Journal of Neurochemistry, 2002 Vol.80 861-873
Conclusioni
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM
Caratterizzazione dell’autofluorescenza, fotodanneggiamento e spettri dell’Indo-1
Elaborazione di codici (Matlab – VisualBasic) per l’elaborazione ed analisi (3D-t) delle immagini, l’assistenza all’acquisizione
Studio delle tecniche raziometrica e del quenchingAnalisi delle variazioni di concentrazioni di calcioProbabile saturazione del trasporto del piomboInibizione del lantanio
16Per approfondimenti: http://www.fantagp.net/alessandro/research/