analisi genetiche di accertamento parentale · • dichiarazione giudiziale di paternità: azione...

Analisi genetiche di

accertamento parentale

Gruppo di Lavoro SIGU

Genetica Forense

Chiara Barone, Sebastiano Bianca, Francesco Binni, Irene Caliendo, Piera Carta, Alessandro Civolani,

Anna D'Ambrosio, Franca Dagna Bricarelli, Francesca Delvecchio Blanco, Manuela Di Natale, Cristina Di

Stefano, Francesca Forzano, Alessio Fronduti, Emiliano Giardina, Paola Grammatico, Sara Iozzi, Ilaria

Longo, Alvaro Mesoraca, Giuseppe Novelli, Anna Lucia Nutini, Giulio Piluso, Ilenia Pietrangeli, Nunzia

Piumelli, Barbara Raso, Nicoletta Resta, Carlo Sepe, Katharina Steindl, Isabella Torrente, Francesca

Torricelli, Sara Zanchetti, Stefania Zampatti

Analisi genetiche di accertamento parentale

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Premessa al documento

Il presente documento intende dichiarare la posizione della SIGU in

merito agli accertamenti genetici della parentela. Questo testo si è reso

necessario per il mutato contesto scientifico-tecnologico, economico e

sociale, per la domanda crescente di questo tipo di accertamenti e per

l’eterogeneità tecnica e qualitativa che caratterizza l’offerta. Si intende in

tal modo offrire un testo condiviso utile per uniformare l’accettazione, le

procedure, l’interpretazione e la refertazione di tali test genetici.


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Glossario

• Marcatore genetico: una qualsiasi sequenza di DNA a localizzazione nota in grado di

discriminare i cromosomi (e quindi gli individui) gli uni dagli altri.

• Aplotipo: la combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento

cromosomico.

• Mutazione de novo: evento mutazionale avvenuto durante la meiosi considerata. Può essere

di derivazione materna o paterna.

• Dichiarazione giudiziale di paternità: azione giudiziale con la quale si vuole ottenere un

provvedimento giurisdizionale che abbia gli effetti del riconoscimento di paternità

• Accertamento di parentela: analisi di segregazione mediante marcatori genetici

ipervariabili che permette di stabilire rapporti di parentela tra due o più soggetti;

• Conferma/Esclusione di paternità/maternità: risultato analitico del test di accertamento

di parentela, quando il rapporto indagato è padre/figlio o madre/figlio.

• Rapporto di verosimiglianza: rapporto tra due probabilità condizionate, calcolate a partire

da due ipotesi mutualmente esclusive. In particolare, nel test di accertamento di parentela, il

rapporto di verosimiglianza è il rapporto tra la probabilità che il soggetto indice (es. figlio)

consegua il profilo osservato, posto che il soggetto in esame (es: presunto padre) abbia il

rapporto di parentela richiesto (es: paternità)(H1), e la stessa probabilità calcolata

nell'ipotesi che il rapporto di parentela non sussista (H0).

• Indice di paternità: è il rapporto di verosimiglianza applicato al test di paternità, viene

calcolato per ogni marcatore analizzato

• Identificazione dei soggetti: verifica l’identità dichiarata dal soggetto, viene effettuata

mediante controllo e registrazione di un documento di identità in corso di validità (carta di

identità o equipollenti secondo il DPR 445/2000 art.35 comma2)

• Potestà genitoriale: è la facoltà giuridica di agire per la tutela di interessi non direttamente

propri; è l’autorità che possiedono i genitori sui figli legittimi, legittimati, adottati e naturali

(definita e regolata dagli artt. 316 e 155 c.c.).


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1. Accettazione dei campioni

I laboratori devono acquisire il prelievo e garantire che l’utilizzo dei campioni biologici e il

trattamento dei dati genetici si svolgano secondo modalità volte a prevenire la violazione dei diritti,

delle libertà fondamentali e della dignità degli interessati. In particolare il campione è prelevato da

un incaricato del laboratorio o da un responsabile da esso designato ovvero, in caso di

ricongiungimento familiare, da esercenti le professioni sanitarie appositamente incaricati dalle

rappresentanze diplomatiche o consolari o da organismi internazionali ritenuti idonei dal Ministero

degli affari esteri. I campioni biologici prelevati ai medesimi fini possono essere trasferiti

unicamente al laboratorio designato per l'effettuazione del test sulla variabilità individuale o

all'organismo internazionale ritenuto idoneo dal Ministero degli affari esteri (aut.8/2012).

L’identificazione dei soggetti interessati deve essere garantita dall’esibizione di un documento di

identità in corso di validità. Copia di tale documentazione deve rimanere al laboratorio unitamente

al consenso informato e al referto.

Informativa e consenso informato

I trattamenti per lo svolgimento delle investigazioni difensive o per l'esercizio di un diritto in sede

giudiziaria possono essere effettuati mediante l'esecuzione di test genetici soltanto previa

informativa all'interessato.

I dati genetici trattati e i campioni biologici prelevati per l'esecuzione di test sulla variabilità

individuale ai fini dello svolgimento delle investigazioni difensive o per l'esercizio di un diritto in

un procedimento penale non possono essere utilizzati per altri fini. I dati trattati e i campioni

biologici prelevati per l'esecuzione di test genetici a fini di prevenzione, di diagnosi o di terapia nei

confronti dell'interessato o per finalità di ricerca scientifica e statistica possono essere utilizzati per

lo svolgimento delle investigazioni difensive o per l'esercizio di un diritto in un procedimento

penale, nel rispetto delle pertinenti disposizioni di legge (Autorizzazione al trattamento dei dati

genetici – GU n.3 del 4 gennaio 2013 -Gazzetta Ufficiale n. 65 del 19 marzo 2007).

Per quanto sopraesposto e normato dal Garante per la Protezione dei Dati Personali si ribadisce che

acquisire campioni anonimi, o all’insaputa dei soggetti coinvolti, per la esecuzione di test di

paternità/maternità, per quanto definiti di compatibilità genetica, è un reato penale e non vi è alcuna

modalità che renda tale comportamento legittimo [Rif. Autorizzazione al trattamento dei dati

genetici – G.U. n.3 del 4 gennaio 2013]. Allo stesso modo costituisce reato penale acquisire

campioni da minori ed eseguire test genetici per l’accertamento della parentela all’insaputa di

http://www.garanteprivacy.it/garante/doc.jsp?ID=1776159


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soggetti che ne esercitano la potestà genitoriale. Da quanto sopraesposto il Gruppo di Lavoro ritiene

priva di significato la distinzione tra test legali e test informativi. Qualsiasi test di accertamento di

parentela deve essere eseguito in conformità alle leggi vigenti e pertanto, per definizione, ha valore

legale, come qualsiasi altro referto di laboratorio. Il GdL suggerisce un modello di consenso

informato per uniformare anche questo tipo di documento, disponibile in allegato 1. Nel caso i

genitori esercitino la potestà genitoriale, entrambi devono autorizzare il test sul minore.

Accettazione di campioni biologici per la determinazione prenatale di rapporti di parentela

Sebbene vi sia un orientamento generale che tende a scoraggiare le richieste di

accertamento/disconoscimento di paternità in gravidanza, tale richiesta rientra nei diritti della

coppia. E’ ovviamente necessario il consenso sia della madre sia del coniuge, se in costanza di

matrimonio, o di chi ne esercita la potestà. L’orientamento generale comunque, anche in

considerazione dei tempi brevi con i quali è possibile ottenere i risultati, dovrebbe essere quello di

invitare la coppia a posticipare l’esecuzione di questi test alla nascita.


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2. Modalità di esecuzione dell’indagine

Analisi di marcatori autosomici L’esclusione o la conferma di rapporti di parentela deve sempre avvenire utilizzando tecniche

validate per l’uso forense (approvate dall’International Society of Forensic Genetics-ISFG). In

particolare devono essere tipizzati i marcatori genetici accettati dalla comunità scientifica in campo

forense e utilizzati nell’ambito del trattato di Prüm (ESS - European Standard Set, CODIS).

La tipizzazione dei marcatori deve avvenire mediante l’uso di kit e strumentazioni validati per tali

indagini. Si rappresenta che, sebbene esistano numerose tecniche e marcatori utili ad escludere la

relazione di parentela, allo stato attuale si ritiene indispensabile utilizzare i sistemi validati per l’uso

forense.

In accordo con quanto previsto dalla società internazionale di genetica forense, la qualità del dato

strumentale deve essere garantita dall’esecuzione obbligatoria di controlli positivi di PCR, controlli

negativi di PCR e controlli negativi di estrazione. Il Gruppo di Lavoro ritiene utile, corretto e quindi

necessario includere i risultati analitici di questi controlli nelle consulenze tecniche.

Analisi di marcatori localizzati sul cromosoma Y L’analisi di marcatori localizzati sul cromosoma Y è consigliata a supporto dei risultati ottenuti

mediante analisi di marcatori presenti su cromosomi autosomici. Analogamente a quanto espresso

per i marcatori dei cromosomi autosomici per eseguire l’analisi dell’aplotipo del cromosoma Y,

devono essere utilizzati marcatori, strumentazioni e kit validati per l’uso forense. Resta inteso che

l’aplotipo Y non rappresenta un sistema identificativo e che pertanto non può essere utilizzato quale

esclusivo mezzo di accertamento di parentela. Particolare rilevanza assume l’analisi dell’aplotipo

del cromosoma Y nei casi di paternità deficitari e nei casi di analisi di fratellanza che verranno

discussi in seguito in apposite sezioni.

L’analisi del cromosoma Y genera, per ogni marcatore, un genotipo costituito da un singolo allele,

ad eccezione dei marcatori multicopia. L’insieme ordinato degli alleli, osservati su uno specifico

cromosoma, è definito aplotipo. In particolare, un numero di marcatori superiore o uguale a 18

definisce un aplogruppo, un numero minore di marcatori definisce un aplotipo: in conclusione, un

aplotipo di 18 marcatori costituisce un aplogruppo. Nel 1997 è stata definita una serie di marcatori

necessari per garantire “l’aplotipo minimo” per la tipizzazione del cromosoma Y (Kayser et al.

1997) che è definito dai loci: DYS19; DYS389I; DYS389II, DYS390; DYS391; DYS392; DYS393

e DYS385a/b. Nel 2003, lo U.S. Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM)


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ha raccomandato l’utilizzo di due marcatori addizionali (DYS438 e DYS439) per definire in modo

più preciso l’aplotipo minimo. In accordo con quanto previsto dalla Società Internazionale di

Genetica Forense (ISFG), la qualità del dato strumentale deve essere garantita dall’esecuzione

obbligatoria di controlli positivi di PCR, controlli negativi di PCR e controlli negativi di estrazione.

Per quanto riguarda l’esclusione, se l’aplotipo ottenuto dall’analisi del cromosoma Y del presunto

padre non coincide con quello del figlio la diagnosi di esclusione è certa (analogamente nei casi di

STRs autosomici). Si ribadisce in ogni caso l’importanza della tipizzazione dei marcatori

autosomici anche in questi casi.

Qualora venga determinata la compatibilità a tutti i loci analizzati tra l’aplotipo del cromosoma Y

del presunto padre e quello del figlio occorre considerare, oltre alla frequenza dell’aplotipo nella

popolazione di riferimento, anche la possibilità di un comune antenato di sesso maschile.

Sono disponibili in rete una serie di database che raccolgono un elevato numero di aplotipi Y e che

pertanto consentono una stima della frequenza. Il database più esteso ed utilizzato è il Y-STR

haplotype Reference Database (YHRD) (http://www.yhrd.org).

Analisi di marcatori del cromosoma X L’analisi di marcatori localizzati sul cromosoma X può fornire indicazioni utili a supporto

dei risultati ottenuti mediante analisi di marcatori autosomici, pertanto per eseguire l’analisi del

cromosoma X devono essere utilizzati marcatori, strumentazioni e kit validati per l’uso forense.

Analogamente a quanto osservato per i marcatori localizzati sul cromosoma Y, anche i marcatori X-

linked non sono tra loro indipendenti e devono essere considerati come aplotipo. Sono noti 4 gruppi

di linkage sul cromosoma X: i marcatori all’interno dello stesso gruppo di linkage non sono

indipendenti, i marcatori appartenenti a gruppi di linkage diversi possono essere considerati

indipendenti. Per determinare la frequenza di un aplotipo del cromosoma X è pertanto necessario

moltiplicare la frequenza degli aplotipi rilevati ai diversi gruppi di linkage.

Analisi statistica

Nel caso di compatibilità tra presunto padre e figlio occorre calcolare il peso statistico di questa

osservazione. I referti privi del calcolo biostatistico sono da considerarsi incompleti. Devono

pertanto essere calcolate le probabilità dei profili genotipici osservati nelle due ipotesi alternative:

- la probabilità nell’ipotesi che il presunto padre in esame sia il padre biologico del figlio

analizzato (H1);

http://www.yhrd.org/


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- la probabilità nell' ipotesi che il padre presunto non sia il padre biologico, e che quindi detta

compatibilità sia solo casuale (H0).

Il rapporto tra i due termini sopra detti, rappresenta il rapporto di verosimiglianza o Likelihood

Ratio (LR), il cui valore sarà tanto più elevato quanto più verosimile è l'ipotesi H1, cioè che il

presunto padre sia davvero il padre biologico del figlio analizzato. Questo rapporto di

verosimiglianza prende il nome di “indice di paternità” (PI – Paternity Index). L’indice di paternità

è calcolato per ogni locus sottoposto ad indagine (tabella 1). L’indice di paternità può essere inoltre

utilizzato per calcolare la probabilità complessiva di paternità (W), definita dal rapporto tra eventi

favorevoli ed eventi possibili. Assumendo per ciascuna delle due ipotesi una probabilità a priori del

50% , la probabilità di paternità è espressa da:

Dove:

• X = (probabilità di osservare la combinazione dei profili rilevati nel caso in oggetto,

se l’uomo tipizzato è il vero padre e corrisponde alla probabilità che il presunto

padre abbia trasmesso l’allele compatibile per il locus in esame, pari a 0.5 nel caso

che l’allele compatibile nel padre sia in stato di eterozigosi o 1 nel caso di

omozigosi; a tali valori vanno apportate le opportune correzioni in base all’assetto

genotipico materno ai loci esaminati)

• Y = (probabilità di osservare la stessa combinazione se l’uomo tipizzato non è il

vero padre e corrisponde alla probabilità che l’allele compatibile sia stato trasmesso

da un soggetto preso a caso nella popolazione ed in termini numerici è pari alla

frequenza di quel determinato allele nella popolazione)

La formula può essere semplificata come segue:

Il rapporto Y/X viene calcolato per ogni marcatore analizzato ed i risultati sono moltiplicati fra di

loro per ottenere il rapporto complessivo.

W= ____ X X+Y

W= ____ 1

1+ Y _ X


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Il calcolo biostatistico dell’indice di paternità è effettuato come riportato da Brenner (Brenner et al.

1994) e utilizzando i dati di frequenza relativi alla popolazione di riferimento per i soggetti

sottoposti ad indagine.

Interpretazione dei risultati

I risultati della tipizzazione di marcatori polimorfici sono riassumibili in tre scenari:

1. esclusione

2. attribuzione

3. inconclusività

1. Esclusione

Il Gruppo di Lavoro, per addivenire all’esclusione di compatibilità biologica, suggerisce un valore

di rapporto di verosimiglianza inferiore a 1:10.000 (Brenner C, 2004).

2. Attribuzione

Il Gruppo di Lavoro, per definire l’attribuzione, suggerisce un valore di rapporto di verosimiglianza

superiore a 10.000:1.

3. Inconclusività

Conseguentemente si definisce inconclusivo qualsiasi risultato che generi un rapporto di

verosimiglianza compreso tra 1:10.000 e 10.000:1.

Ove possibile si raccomanda sempre l’esecuzione dell’analisi anche sulla madre. In tal modo,

potendo identificare e quindi escludere dal calcolo l’allele di certa origine materna, è possibile

ottenere sufficienti valori di indice di paternità e disporre di un elemento di controllo addizionale.

Nei casi in cui sia impossibile disporre del DNA materno, si raccomanda di calcolare con attenzione

il valore di LR (rapporto di verosimiglianza) e valutare la necessità di estendere l’analisi ad un

numero maggiore di marcatori.

In caso di incompatibilità biologica è preferibile ripetere le analisi su un nuovo estratto.

Evento mutazionale

Il tasso di mutazione dei microsatelliti è stimato all’incirca tra 10-3 e 10-4 per locus per generazione.

L’analisi dei diversi loci utilizzati nei test di paternità suggerisce un tasso mediamente ancora più


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elevato di circa 2 × 10-3 per meiosi (Weber and Wong, 1993; Kayser et al., 2000). Tra i fattori che

possono influenzare il tasso di mutazione ricordiamo la lunghezza delle unità ripetute, il sesso, con

un tasso di mutazione circa 5 volte più elevato nella linea germinale maschile rispetto a quella

femminile, e l’età (Brinkmann et al., 1998; Ellegren, 2000).

Mutazioni che si verificano durante la meiosi possono influenzare l'interpretazione del test di

paternità, determinando risultati discordanti per un determinato locus. Ad esempio, l’aggiunta per

slittamento di un’unità ripetuta per un dato locus determinerebbe la non corrispondenza, per quel

marcatore, tra presunto padre e figlio/a.

Per i marcatori validati per uso forense è nota la frequenza di mutazione, i cui dati sono consultabili

online come parte del Short Tandem Repeat DNA Internet DataBase (STRbase);

http://www.cstl.nist.gov/strbase/mutation.htm e riportati in Tabella 2 (accesso 04/02/2013).

Pertanto, è importante la valutazione della possibilità di un tale evento e la disponibilità di

procedure per gestire tale evenienza nei casi di paternità. Come suggerito nelle raccomandazioni

dell’International Society of Forensic Genetics (ISFG), la possibilità di una mutazione deve essere

presa in considerazione ogni volta che un’inconsistenza genetica è osservata (Gjertson et al., 2007).

Più in generale, il Paternity Index (PI) deve tener conto della possibilità che l’inconsistenza

genetica osservata sia giustificabile con un evento mutazionale che, generalmente, determina una

variazione di 1-2 unità ripetute rispetto all’atteso. Sono stati proposti diversi sistemi di calcolo

semplificati per una valutazione quantitativa della probabilità delle due ipotesi: paternità vs non-

paternità (Dawid et al., 2001; Brenner, 2012). A volte, si tende ad escludere la paternità se

l’inconsistenza genetica interessa almeno due loci indipendenti (criterio della cosiddetta “two

exclusion rule”), partendo dal presupposto che sia poco probabile che mutazioni in 2 loci

indipendenti si verifichino durante una meiosi. Tale criterio appare tuttavia non adeguato al numero

attuale di marcatori analizzati. In letteratura sono riportati infatti differenti casi di paternità

controversa riconducibili a mutazioni in due o più loci STR (Jacewicz et al., 2004; Balloch et al.,

2008; Sun et al., 2012), a contributo paterno, materno o di entrambi. Come precedentemente

riportato, l’esclusione della compatibilità biologica deve essere basata su calcolo biostatistico, che

tenga in considerazione anche la probabilità che possa essersi verificato un evento mutazionale.

Occorre ancora considerare la possibilità che i loci STR, utilizzati in indagini genetiche finalizzate

all’identificazione personale, possano andare incontro a mutazioni somatiche. Durante lo sviluppo

embrionale, tale evento potrebbe determinare il riconoscimento nel figlio/a di 3 distinti alleli per

http://www.cstl.nist.gov/strbase/mutation.htm


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uno stesso locus STR (Huel et al., 2007). I profili tri-allelici da mutazioni somatiche sono raramente

osservati, ma agevolmente distinguibili da profili analoghi, dipendenti da duplicazioni che

coinvolgono uno specifico locus STR, in cui l’allele soprannumerario è comunque ereditato da uno

dei due genitori (Lukka et al., 2006; Vidal and Cassar, 2008).

Infine, occorre ricordare che mutazioni puntiformi, in particolare nella regione 3’ di un primer,

possono inibirne il corretto appaiamento alla sequenza complementare durante la reazione di

amplificazione, determinando un allele nullo (allele dropout), cioè l’assenza di amplificazione di

uno dei due alleli per uno specifico locus STR che si traduce in una falsa omozigosità. Tale

evenienza è estremamente rara ma deve essere considerata e verificata. È utile estendere l’indagine

ad un pannello più ampio di marcatori STR. (Kersbergen et al., 2008; Robino et al., 2008; Mertens

et al., 2009; Deucher et al., 2010)

Analisi del DNA mitocondriale

L’analisi del DNA mitocondriale è di utilità nei casi di accertamento di maternità, per escludere i

rapporti di parentela e quale sistema alternativo nel caso in cui le indagini tradizionali non abbiano

fornito risultati accettabili e/o utili. Resta inteso che in nessun caso l’analisi del DNA mitocondriale

può essere considerata un sistema identificativo. In assenza di kit validati per la tipizzazione del

DNA mitocondriale, la qualità del dato è garantita dall’esecuzione delle analisi in accordo con le

indicazioni della Società Internazionale di Genetica Forense.

Il DNA mitocondriale presenta, in alcune regioni, un tasso di mutazione circa 10 volte superiore di

quello nucleare a causa della minore affidabilità della mtDNA polimerasi e all’assenza di

meccanismi di riparazione del DNA (particolarmente efficienti per il DNA nucleare). Queste

regioni del DNA mitocondriale sono di enorme interesse in ambito forense poiché si dimostrano

ipervariabili. La maggior parte delle variazioni di sequenza tra gli individui risiede all’interno di

due specifici segmenti contenuti all’interno di una regione chiamata D-LOOP (displacement loop)

che rappresenta una zona di controllo, non codificante. Verosimilmente la maggior parte delle

variazioni è rilevabile all’interno di questa regione poiché, non essendo codificante, non è soggetta

a pressione selettiva. I due segmenti ipervariabili e quindi di maggiore interesse forense, compresi

nella regione di controllo sono: la regione ipervariabile 1 (HV1) e la regione ipervariabile 2 (HV2).

Occasionalmente è tipizzata una terza regione (HV3) a conferma e integrazione dei risultati di HV1

e HV2. Questi segmenti mostrano una variabilità tra individui non correlati valutata tra 1 ed il 3%: 3

basi diverse ogni 100 analizzate. Tipicamente, la regione HV1 si estende dal nucleotide 16.024 al

nucleotide 16.365; HV2 si estende dal nucleotide 73 al nucleotide 340, la regione HV3 si estende

dal nucleotide 438 al nucleotide 574 (Butler J, 2012). L’analisi di queste regioni mostra, in media, 8


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nucleotidi di differenza tra individui di origine europea e 15 nucleotidi di differenza tra individui di

origine africana (o discendenti). I laboratori che eseguono l’analisi del DNA mitocondriale devono

possedere delle strutture indipendenti dedicate a questo tipo di tipizzazione per assicurare l’assenza

di contaminazioni che, in questo caso, sono particolarmente frequenti. In letteratura sono disponibili

le sequenze degli oligonucleotidi utilizzati per l’amplificazione dei segmenti HV1, HV2 e HV3

(Butler J, 2012). In termini generali è sempre preferibile confermare i risultati in almeno due

amplificazioni indipendenti ed effettuare la lettura di entrambi i filamenti. Analogamente a quanto

osservato nel caso dei marcatori STR di cromosomi autosomici, nei casi di DNA particolarmente

degradato o in presenza di artefatti di sequenza, è consigliabile utilizzare ampliconi di piccole

dimensioni (la regione HV1, ad esempio, può essere divisa in due ampliconi).

Una volta ottenuta la sequenza del DNA mitocondriale si procede alla comparazione con la

sequenza di riferimento (CRS). Tutte le differenze osservate devono essere riportate citando la

posizione esatta del nucleotide variante seguita dalla lettera riscontrata a quel sito: per esempio

16129A indica che rispetto alla sequenza di riferimento nel nostro campione di DNA il nucleotide

in posizione 16129 è una A in luogo di una G (presente nella sequenza di Anderson). Tuttavia, può

capitare che l’analisi di sequenza dia risultati ambigui per alcuni specifici nucleotidi rendendo

impossibile stabilire la natura della base in quella specifica posizione. In tali casi, il nucleotide

ambiguo si riporta con la lettera N.

Le inserzioni di nucleotidi rispetto alla sequenza di riferimento sono riportate come segue: il

numero del nucleotide immediatamente al 5’ dell’inserzione, seguito da un punto, da un numero

corrispondente al numero di nucleotidi inseriti e dalla lettera corrispondente al/i nucleotide/i inseriti.

Ad esempio 385.1T indica l’inserzione di una T immediatamente dopo il nucleotide numero 385,

rispetto alla sequenza di riferimento (Butler J. 2012).

Le delezioni di nucleotidi sono segnate con il simbolo “D”, “d” , “del” oppure “-“seguito da un

numero corrispondente al nucleotide oggetto della delezione.

Analogamente a quanto osservato nel caso della tipizzazione del cromosoma Y, anche l’analisi del

DNA mitocondriale si avvale di specifici database per stabilire la frequenza di un aplotipo in una

determinata popolazione. Ne esistono diversi, disponibili in rete. Uno dei più diffusi è l’EMPOP

(www.empop.org).

L’interpretazione dei risultati delle sequenze mitocondriali è suggerita da specifiche

raccomandazioni SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods- 2003) e deve

tenere in considerazione l’eventuale presenza di eteroplasmia e la possibilità di risultati non

attendibili. In particolare, possiamo distinguere vari casi:

http://www.empop.org/


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- I caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano

identiche in ogni nucleotide. In tal caso non possiamo escludere che i due campioni

appartengano alla stessa persona o a persone imparentate in linea materna.

- II caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 mostrano due o più

differenze nucleotidiche. In tal caso possiamo escludere che i due campioni appartengano

alla stessa persona o a persone imparentate in linea materna.

- III caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 mostrano soltanto

una differenza nucleotidica. In tal caso il risultato sarà inconclusivo.

- IV caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano

identiche in ogni nucleotide eccetto per una base che risulta ambigua in una delle due

sequenze. In tal caso non possiamo escludere che i due campioni appartengano alla stessa

persona o a persone imparentate in linea materna.

- V caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano

identiche in ogni nucleotide eccetto per alcune basi che, in siti differenti nelle due sequenze,

abbiamo dato risultati ambigui o non-interpretabili. In tal caso non possiamo escludere che i

due campioni appartengano alla stessa persona o a persone imparentate in linea materna.

- VI caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano

identiche in ogni nucleotide ma è rilevata eteroplasmia in una specifica base in una delle due

sequenze. Se una delle due basi eteroplasmiche è presente nell’altra sequenza, non possiamo

escludere che i due campioni appartengano alla stessa persona o a persone imparentate in

linea materna.

- VII caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano

identiche in ogni nucleotide ed è rilevata eteroplasmia allo stesso sito, in entrambe le

sequenze. In tal caso non possiamo escludere che i due campioni appartengano alla stessa

persona o a persone imparentate in linea materna.


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Analisi indirette

Laddove possibile, è sempre meglio prevedere l’analisi del DNA dei soggetti coinvolti. Tuttavia è

possibile definire alcuni rapporti di parentela anche mediante analisi indirette. Analogamente a

quanto osservato per le analisi dirette, si suggerisce che la conferma o esclusione del rapporto di

parentela debba essere definito attraverso i valori di LR pari a 10000: 1 o 1:10000 rispettivamente.

Refertazione

Il GdL suggerisce un modello unico di referto, disponibile in allegato 2. In ogni caso, le

informazioni minime da includere nel referto sono:

1. denominazione dell’indagine;

2. identificazione completa del laboratorio che ha eseguito l’analisi (ospedale/istituto, direttore

o responsabile del servizio, indirizzo, telefono, fax, e-mail, sito web, certificazioni);

3. Anagrafica dell’utente e tracciabilità

3.1 Identificazione delle persone che si sono sottoposte ad indagine: nome, cognome, data e

luogo di nascita, tipo e numero di documento utilizzato per l’identificazione

3.2 Materiale biologico analizzato: sangue periferico, tampone buccale, ecc.

3.3 Data di prelievo

3.4 Data di arrivo e di accettazione del campione in laboratorio (se diverse dalla data di

prelievo)

4. Descrizione del test eseguito:

4.1 Analisi eseguita e marcatori analizzati

4.2 Indicazione dei kit commerciali utilizzati

4.3 Popolazione assunta quale riferimento se utilizzata

5. Risultato:

5.1 Elenco dei genotipi a tutti i loci analizzati

5.2 Copia degli elettroferogrammi (suggerito)

6. Interpretazione:

6.1 Risultato del test in termini di compatibilità o esclusione di compatibilità.

6.2 In caso di compatibilità riportare l’indice di paternità e la probabilità di paternità

corredato di analisi statistica specifica ed eventuali limiti dell’analisi

7. Validazione:

7.1 Nome, funzione e firma o una forma di identificazione equivalente della persona che

valida il referto

7.2 la data in cui è stato redatto il referto


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8. Certificazioni del laboratorio, partecipazione e superamento dei Controlli Esterni di Qualità

(CEQ).

9. È possibile inoltre prevedere, ove necessario, un commento descrittivo dei risultati.

Test ottenuti da strutture terze

Quando il referto contiene risultati analitici ottenuti da altre strutture, questi risultati devono essere

indicati chiaramente. La struttura terza deve comunicare i risultati alla struttura refertante con

metodi documentati e che ne permettano la tracciabilità.

Metodi di consegna del referto

Secondo quanto definito dal Garante della Privacy (aut. 8/2012), fermo restando quanto previsto

dall'art. 84 del Codice, i dati genetici devono essere resi noti di regola direttamente all'interessato o

a persone diverse dal diretto interessato sulla base di una delega scritta di quest'ultimo, adottando

ogni mezzo idoneo a prevenire la conoscenza non autorizzata da parte di soggetti anche

compresenti. La comunicazione nelle mani di un delegato dell'interessato è eseguita in plico chiuso.

Devono essere informati del risultato tutti i soggetti che hanno fornito il consenso all’analisi e

devono essere fornite esaurienti informazioni relative ai risultati e alle conseguenze derivanti dal

test.

I dati genetici raccolti a fini di ricongiungimento familiare possono essere comunicati unicamente

alle rappresentanze diplomatiche o consolari competenti all'esame della documentazione prodotta

dall'interessato o all'organismo internazionale ritenuto idoneo dal Ministero degli affari esteri cui

questi si sia rivolto.

Materiali supplementari

Gli allegati 1 e 2 rappresentano rispettivamente il consenso informato e il referto unificato, che il

gruppo di lavoro suggerisce di adottare al fine di uniformare i laboratori che conducono indagini di

accertamento parentale.


16

Tabella 1

Analisi di paternità: Paternity Index

Figlio Madre Presunto padre Sistema co-dominante

q pq q 1/q

q p q impossibile

pq p o pr q 1/q

q q q 1/q

pq p o pr o ps qr (o pq) 1/(2q)

q p qr impossibile

q pq qr (o pq) 1/(2q)

q q qr 1/(2q)

pq pq pq 1/(p+q)

pq pq q 1/(p+q)

pq pq qr 1/(2p+2q)

q pq r 0

q q r 0

q p r impossibile

q Madre non testata q 1/q

pq Madre non testata q 1/(2q)

q Madre non testata qr 1/(2q)

pq Madre non testata pq (p+q)/(4pq)

pq Madre non testata qr 1/(4q)

q Madre non testata r 0


17

Tabella 2

Mutazioni osservate nei loci STR nel corso di test di paternità*

Sistemi STR

Meiosi Materne (%)

Meiosi Paterne

(%)

Entrambe le mutazioni

Numero totale di mutazioni

Tasso di mutazione

CSF1PO 95/304,307 (0.03) 982/643,118 (0.15)

410 1,487/947,425 0.16%

FGA 205/408,230 (0.05)

2,210/692,776 (0.32)

710 3,125/1,101,006 0.28%

TH01 31/327,172 (0.009)

41/452,382 (0.009)

28 100/779,554 0.01%

TPOX 18/400,061 (0.004)

54/457,420 (0.012)

28 100/857,481 0.01%

VWA 184/564,398 (0.03)

1,482/873,547 (0.17)

814 2,480/1,437,945 0.17%

D3S1358 60/405,452 (0.015)

713/558,836 (0.13)

379 1,152/964,288 0.12%

D5S818 111/451,736 (0.025)

763/655,603 (0.12)

385 1,259/1,107,339 0.11%

D7S820 59/440,562 (0.013)

745/644,743 (0.12)

285 1,089/1,085,305 0.10%

D8S1179 96/409,869 (0.02) 779/489,968 (0.16)

364 1,239/899,837 0.14%

D13S317 192/482,136 (0.04)

881/621,146 (0.14)

485 1,558/1,103,282 0.14%

D16S539 129/467,774 (0.03)

540/494,465 (0.11)

372 1,041/962,239 0.11%

D18S51 186/296,244 (0.06)

1,094/494,098 (0.22)

466 1,746/790,342 0.22%

D21S11 464/435,388 (0.11)

772/526,708 (0.15)

580 1,816/962,096 0.19%

Penta D 12/18,701 (0.06) 21/22,501 (0.09)

24 57/41,202 0.14%

Penta E 29/44,311 (0.065) 75/55,719 (0.135)

59 163/100,030 0.16%

D2S1338 15/72,830 (0.021) 157/152,310 (0.10)

90 262/225,140 0.12%

D19S433 38/70,001 (0.05) 78/103,489 (0.075)

71 187/173,490 0.11%

SE33 0/330 (<0.30) 330/51,610 (0.64)

Non riportato 330/51,940 0.64%

*dati estratti da http://www.cstl.nist.gov/strbase/ (accesso febbraio 2013)

http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_FGA.htm

http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_TH01.htm

http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_TPOX.htm

http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_VWA.htm

http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_D3S1358.htm








http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_Penta_D.htm

http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_Penta_E.htm



http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_SE33.htm

http://www.cstl.nist.gov/strbase/


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SPAZIO PER INTESTAZIONE

Riempiere il modulo in tutte le sue parti in maniera chiara e leggibile (SCRIVERE IN STAMPATELLO). Pagina 1 di 3

INFORMATIVA AI SENSI DELL'ART. 13 DEL D. LGS. 196/2003

Ai sensi dell'art. 13 del d. lgs. 196/03, ed in relazione ai dati personali che La riguardano, La informiamo: 1. Che il trattamento dei suoi dati personali ha lo scopo di consentire al (denominazione ente/struttura) di svolgere indagini genetiche su campioni e materiale biologico. 2. Il trattamento è effettuato anche con l'ausilio di mezzi elettronici o comunque automatizzati e adottando misure idonee a garantire la sicurezza e la riservatezza dei dati personali. E’ svolto direttamente dal (nominativo e qualifica del responsabile del laboratorio/struttura) quale “titolare” del trattamento dei dati personali. 3. Il conferimento dei dati personali è facoltativo. Il mancato conferimento degli stessi comporta l'impossibilità di svolgere la predetta attività. 4. I dati personali non sono soggetti a diffusione e trasferimento all'esterno. 5. I dati personali possono essere comunicati al solo soggetto interessato. 6. Le precisiamo che oltre ai dati definiti dalla legge “comuni”, Lei ci fornisce anche dati che l’art. 37 del d. lgs. 196/03 definisce “sensibili” e, in particolare, “dati genetici” (autorizzazione al trattamento dei dati genetici GU n.3 del 4 Gennaio 2013) 7. L'art. 7 d. lgs. 196/03 conferisce all'interessato l'esercizio di specifici diritti, tra cui quelli di ottenere dal titolare la conferma dell'esistenza o meno di propri dati personali e la loro messa a disposizione in forma intellegibile; di avere conoscenza dell'origine dei dati, nonché della logica e della finalità su cui si basa il trattamento; di ottenere la cancellazione, la trasformazione in forma anonima o il blocco dei dati trattati in violazione di legge, nonché l'aggiornamento, la rettificazione o, se vi è interesse, l'integrazione dei dati; di opporsi, per motivi legittimi, al trattamento stesso. 8. Titolare del trattamento è (denominazione ente/struttura). Responsabile del trattamento dei dati personali è il (nominativo e qualifica del responsabile del laboratorio/struttura). Firma dell’interessato : _____________________________ (per presa visione) Data: ___/___/______



CONSENSO INFORMATO AL TRATTAMENTO DEI DATI, ALLA RACCOLTA E CONSERVAZIONE DI MATERIALE BIOLOGICO ED AUTORIZZAZIONE ALL’INDAGINE PER L’ACCERTAMENTO DI PARENTELA

Il/la sottoscritto/a .................................………………............................................…….………..................

nato/a a .....................................…….…………….………...... Prov .......... il :....... /....../..…….......

residente in: ...........................................……….…................................ Prov …...... CAP.……….....

Via: ............……………........................…………….…....................... n°…….

Tel (...............) ……........................... Codice Fiscale …………………………………………………….

identificato mediante il documento � carta d’identità � passaporto � patente di guida n:………………...

rilasciato da � comune �questura � prefettura di …………………………….. il :....... /....../..…….......

la cui fotocopia si allega al presente documento (allegato n: ….)

Padre legale di ……………………………………………………………………………………………

Padre presunto di …………………………………………………………………………………………

Madre di ………………………………………………………………………………………………….

Figlio/a di ………………………………………………………………………………………………...

Altro (specificare) ...……………………………………………………………………………………...

• Dopo aver letto e sottoscritto l’informativa sulla privacy, liberamente decide di: � DARE il consenso � NEGARE il consenso al trattamento dei dati “comuni” e “sensibili” che ritiene di fornire.

• Dichiara inoltre, di essere stato adeguatamente informato da parte del personale sanitario del Laboratorio e di aver compreso le finalità del test che si accinge ad eseguire ed il significato dei risultati ottenibili per se stesso e per la sua famiglia.

• Dichiara inoltre, sotto la sua responsabilità di � NON AVER � AVER ricevuto trasfusioni negli ultimi 3 mesi o trapianti di midollo.

• Dopo essere stato/a informato/a che: - saranno garantiti l’anonimato e la riservatezza sulla provenienza del campione e sulle relative

indagini; - il materiale biologico non verrà utilizzato a fini di lucro; - la (denominazione ente/struttura) non si ritiene responsabile per eventuali danni e incidenti che

possono verificarsi sui campioni conservati;

DICHIARA di: AUTORIZZARE NON AUTORIZZARE

il prelievo e la conservazione, limitatamente all’esecuzione dell’indagine, presso il (denominazione laboratorio/struttura) del seguente materiale biologico: prelievo ematico tampone buccale altro (……………………………) appartenente a se stesso (documentazione di provenienza allegata: ...................................................................). All’uopo fornisco il consenso al suddetto laboratorio per l’espletamento dell’esame. Data .................................... Firma.......................................................................



AUTORIZZAZIONE ALL’INDAGINE SU MINORE PER L’ACCERTAMENTO DI PARENTELA (DEVE ESSERE COMPILATO DA TUTTI COLORO CHE ESERCITANO LA POTESTÀ GENITORIALE)

Autorizzo inoltre, in qualità di esercente la patria potestà, il (denominazione laboratorio/struttura) al prelievo ed alla conservazione, limitatamente all’esecuzione dell’indagine, del seguente materiale biologico: prelievo ematico tampone buccale altro (……………………………) appartenente al minore (documentazione di provenienza allegata: ...................................................................).

Cognome: .................................………………. Nome: ..........................................…….………..................

nato/a a .....................................…….…………….………...... Prov .......... il :....... /....../..…….......

di cui il sottoscritto/a _Nome - Cognome____è padre madre tutore legale. All’uopo fornisco il consenso al suddetto laboratorio per l’espletamento dell’esame. Data .................................... Firma....................................................................... Ai fini dell’identificazione del minore viene presentato ed allegato in copia al presente documento (allegato n: ....): � carta d’identità � passaporto n:………………... rilasciato da � comune �questura di ……………….

il :....... /....../..…….......

� Certificato di nascita

� Stato di famiglia

� Atto notorio

Informato/a sui diritti e sui limiti di cui al D.lgs 196/2003 (codice in materia di protezione dei dati personali) esprimo il mio consenso ed autorizzo il (denominazione laboratorio/struttura) ad acquisire, ai soli fini identificativi, una foto del minore che si allega al presente documento (allegato n: ….). Data .................................... Firma.......................................................................

Pagina 1 di 2

LOGO LABORATORIO

Direttore Indirizzo, telefono, fax, e-mail, sito WEB

Certificazioni

Il Laboratorio ha partecipato ai Controlli Esterni di Qualità (____inserire specifica_____) superando il test per l’anno _________

INDAGINE DI ACCERTAMENTO DI PARENTELA

ANAGRAFICA E TRACCIABILITA’

Soggetto 1: presunto padre

Cognome ____________________________________ Nome _____________________________________

Data di Nascita ___________________Luogo di nascita __________________________________________

Documento di identità: tipo _________________ Numero ________________________________________

Data di accettazione ______________ Codice Lab: ______________________________________________

Materiale biologico prelevato _______________________________________________________________

Soggetto 2: madre

Cognome ____________________________________ Nome _____________________________________





Soggetto 3: figlio

Cognome ____________________________________ Nome _____________________________________





ANALISI ESEGUITE

Tipizzazione di polimorfismi STRs (Short Tandem Repeats) mediante amplificazione ed elettroforesi

capillare

Kit utilizzati: _____________________________________________________________________________

Elenco marcatori analizzati: _________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________

Popolazione assunta quale riferimento: ________________________________________________________

Algoritmo e/o software utilizzato per l’analisi statistica: ___________________________________________

Pagina 2 di 2

LOGO LABORATORIO

Direttore Indirizzo, telefono, fax, e-mail, sito WEB

Certificazioni

Il Laboratorio ha partecipato ai Controlli Esterni di Qualità (____inserire specifica_____) superando il test per l’anno _________

(Luogo e data)

Il Dirigente Il Direttore

(nome e cognome) (nome e cognome)

RISULTATO DELL’ANALISI

Marcatore (codice Lab presunto padre) (codice Lab figlio) (codice Lab madre)

D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358

THO1 D13S317 D16S539 D2S1338

D19S433 vWA TPOX

D18S51

Amel. D5S818

FGA

INTERPRETAZIONE

(risposta negativa) Le analisi molecolari effettuate attraverso lo studio dei polimorfismi del DNA

estratto da ___(tipo materiale biologico)___ di ____(nome presunto padre)_____, di ____(nome

madre)_____ e da __(tipo materiale biologico)___ di ____(nome figlio)_____ hanno consentito di

rilevare che ____(nome figlio)_____ non è figlio biologico di ____(nome presunto padre)_____.

(risposta positiva) Le analisi molecolari effettuate attraverso lo studio dei polimorfismi del DNA estratto

da ___(tipo materiale biologico)___ di ____(nome presunto padre)_____, di ____(nome madre)_____ e

da __(tipo materiale biologico)___ di ____(nome figlio)_____ hanno consentito di rilevare che

____(nome figlio)_____ è figlio biologico di ____(nome presunto padre)_____ con una probabilità del

___________% .

analisi genetiche di accertamento parentale · • dichiarazione giudiziale di paternità: azione...

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