Análisis de compuestos traza en muestras ambientales

Contaminación Ambiental

Presencia de compuestos químicos específicos, naturales o antropogénicos, que provocan efectos nocivos sobre la salud o los ecosistemas

Químicos Biológicos Sanitarios Legislativos, etc...

Análisis AmbientalOrigen (Caracterización de fuentes)Transporte y distribuciónProcesos de degradación biótica o/y abiótica (¿nuevos contaminantes tóxicos?)Destino final (bioacumulación, etc)Efectos Límites legales

Identificación y Análisis de compuestosquímicos en el medio ambiente

Límites exigidos por la normativaNo Título Compuestos orgánicos Límites (ug/L) 75/440/EEC Aguas superficiales Cyfluthrin 0.001 Hidrocarburos 50-1000

Permerthrin 0.01 Plaguicidas 1-5.0

Fenoles 1-100

Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) 0.2-1.0

80/778/EEC Agua para consumo humano Plaguicidas individuales 0.1 Plaguicidas totales 0.5 Benzo-3,4-pireno 0.01 Tetracloruro de carbono 3.0 Tricloroetano 30.0 Tetracloroetano 10.0 Trihalometanos 100.0 Fenoles 0.5 PAHs 0.2 76/659/EEC Aguas con peces Cyfluthrin 0.001

Flucofuron 1.0

PCSDs i PAD 0.05

Permethrin 0.01

Sulcofuron 25.0

76/464/EEC Substancias peligrosas Lista 1 Tetracloruro de carbono 12.0

Cloroformo 12.0

DDT 0.01 Endrin 0.005 Aldrin 0.01 Dieldrin 0.01 Isodrin 0.005 Hexaclorobenceno 0.03 Hexaclorobutadieno 0.01 Lindano 0.11 Pentaclorofenol 2.0 1,2-dicloroetano 10.0

Percloroetileno 10.0

Triclorobenceno 0.1

Tricloroetileno 10.0

ppb

Análisis Ambiental

Selectividad

Universalidad

Sensibilidad

Matrices complejasCompuestos con

un gran intervalo de propiedades fisico-químicas.

Analitos a nivel de traza (ppb, ppt)

Análisis específicos vs multiresiduos

• Determinación de un solo compuesto o grupo de compuestos en una matriz ambiental específica

• Determinación del máximo número de contaminantes con propiedades físico-químicas diferentes– Metabolitos– Contaminación

global– Efectos sinérgicos o

antagónicos

EPA Priority PollutantsProtocols

Determinación de compuestos orgánicos traza

Hidrocarburos alifáticos Hidrocarburos aromáticos Aldehidos Alcoholes y fenoles Anilinas y benzidinas VOCs (Disolventes clorados) SOCs (PCBs, dioxinas) Plaguicidas apolares y polares Ftalatos i adipatos Tensioactivos ...y muchos más

Análisis Ambiental

Cuant ifi cación

A nális is I ns t r ument al

GC

H PLC

GC- M S ; H PLC- M S

Pur ifi cación

(Clean- up)

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

Compartimentos medioambientales

Análisis Ambiental

Cuant ifi cación

A nális is I ns t r ument al

GC

H PLC

GC- M S ; H PLC- M S

Pur ifi cación

(Clean- up)

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

Análisis Ambiental

E liminación agua

E liminación mat er ial gr ueso

T amiz ado (> 2 5 0 µm, 6 3 µm)

H omogeneiz ar

S ediment os , suelos

Par t iculado

E liminación agua

A gua

Par t iculado

E liminación agua

A ir e

E liminación agua

D iges t ión ácida o alcalina

H omogeneiz ar

O r ganismos

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

Eliminación de agua Liofilización Secado en horno (35-40 oC) Tratamiento con desecantes Pre-extracción con disolventes

orgánicos miscibles en agua

Análisis Ambiental

L íquido- L íquido

E x t r acción en f ase sól ida (S PE )

M at r ices acuosas

U lt r asonidos

S ox hlet

E x t r acción as is t ida con M icr oondas (M A E )

E x t r acción con d isolvent es aceler ada (A S E )

E x t r acción con fl uidos super cr ít icos (S F E )

M at r ices sól idas

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de mues t r a

Matrices acuosas. Extracción líquido-líquido

Se extrae el total de componentes (particulado+disuelto)

Consumo de grandes cantidades de disolvente– Problema medioambiental

– Problema de blancos

– Paso de eliminación del disolvente pérdidas

Protocolos largos

Extracción en fase sólida (SPE) Paso a través de un adsorbente de sílica modificada

químicamenteo Cadenas hidrocarbonadas (C8 y C18)

Se extraen solo los componentes disueltos (filtrar previamente)

Muy versátil Rápida y sencilla (automatización) Relativamente barata Bajo consumo de disolventes A considerar :

o Volumen de rupturao Capacidado Limpieza

Extracción en Soxhlet

Calor

Refrigerante

100-200 ml disolvente

Muestra(Cartucho deCelulosa)1-200 gr

Diagrama de fases

LíquidoSólido

Gas

FS

Pc

TcTemperatura

Presión

CSFE

Sonicación

Soxhlet

ASEMAE

ASE, accelerated solvent extractionMAE, Microwave assisted extractionSFE, supercritical fluid extractionPc, presión críticaTc, temperatura críticaC, punto crítico

Técnicas de extracción de compuestos orgánicos en matrices

sólidasSoxhlet Sonicación SFE MAE ASE

Tiempo + + + + + + + + +

Disolventes + + + + + + + + + +

Costes + + + + + + + + + + + + + +

Automatización + + + + + + + + + + + +

Dificultad de optimización

+ + + + + + + + +

Robustez + + + + + + + + + + + + + + + +

Análisis Ambiental

Cuant ifi cación

A nális is I ns t r ument al

GC

H PLC

GC- M S ; H PLC- M S

Pur ifi cación

(Clean- up)

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

Análisis Ambiental

Cr omat ogr afi a de adsor ción en columna

A t aque ácido o b ás ico

E x t r acción en f ase sólida (S PE )

Pur ifi cación

(Clean- up)

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

Interferencias más importantes:

• Lípidos• Azufre• Carotenoides• Pigmentos...

Clean up del extracto

Cromatografía de columna líquido-sólido

– Adsorbentes más comunes:• Sílice (uso general)

• Alúmina

• Florisil (Clean-up de plaguicidas organoclorados)

• Poliestireno, poliacrilamida

• Geles para GPC (Por ej.: Sephadex LH-20, Bio-Beads SX) (Clean-up de muestras con alto contenido lipídico)

apolar

Fase estacionaria polarFase móvilPolaridad creciente

Eliminación de azufre

Reacción con mercurio Sulfuro de mercurio

Reacción con cobre Sulfuro de cobre

Reacción con sulfito de sodio en hidróxido de tetrabutilamonio

Concentración del analito

Evaporación del disolvente a presión reducida (rotavapor)

Kuderna-Danish Corriente de nitrógeno

Análisis Ambiental

A nális is I nt r ument al

GC

H PLC

GC- M S ; H PLC- M S

Pur ifi cación

(Clean- up)

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

CromatografíaLíquida (HPLC)

Sistemas de Cromatografía

Cromatografíade gases (GC)

Volatilidad

Polaridad(Solubilidad en agua)

Baja Alta

Cromatografía de gases

1-2 µl

250-300 oC

Inyector

Horno + columna

Detector

RegistradorIntegradorOrdenador

Gas portador

Cromatografía de gases

Los analitos se evaporan a temperatura alta (250-300oC), y se hacen pasar por una columna cromatográfica. Separación isoterma o por gradiente de temperatura.

Fase móvil gas inerte: He, H (gas portador, carrier) Columnas capilares de sílice fundida (0,25 mm d.i. x 25-50 m; espesor

de capa 0.25 µm) Normalmente con la fase líquida (WCOT) Fases más utilizadas: silicones

OV-1: Metilsilicones OV-17:metilfenilsilicones OV-210: trifluoropropilsilicones

Detectores universales (FID) y selectivos: ECD, FPD, NPD.

Cromatografía de gases. Detectores Detector Universal

Detector de ionización de llama (FID)o Universalo Destructivoo Estable y lineal

Detectores Selectivos Detector de captura de electrones.

o Para compuestos con grupos electronegativos (halogenados,..)o No destructivoo Rango lineal estrecho

Detector de nitrógeno-fósforoo Para compuestos con N y Po Destructivoo Moderadamente lineal

Detector fotométrico de llama.o Compuestos con S y Sn (diferentes filtros)o No linealo Destructivo

Mezcla de PCBs. GC-ECD

HPLC. Cromatografía líquida de alta resolución

• Generalmente en fase inversa: fase estacionaria de C8-C18; fase móvil acuosa con acetonitrilo o etanol

– Útil para substancias:• alto peso molecular

• baja volatilidad

• Lábiles, degradaciones térmicas

• polares Si son muy polares: cromatografía de par iónico o en fase normal (aminopropil, fases móviles con disolventes orgánicos)

HPLC. Detectores

Detector de ultravioleta-visibleDetector de fluorescenciaDetector de fotodiodos (Diode-array)

Espectrometría de Masas

Identificación inequívoca de sustancias en matrices complejas (CG,CL...)

Análisis de sustancias con propiedades fisico-químicas distintas (átomos a biopolímeros)

Análisis cuantitativos (límites de detección ppb,ppt)

Selectividad

Universalidad

Sensibilidad

Espectrómetro de Masas

Fuente de iones (Ionización)

Analizador (Separación)

Detector de iones(Detección)

Introducciónmuestra

+ +

+

++

++

+ ++100 %

M/Z

Presión ~ 10-6-10-8 Torr

++

Separación cromatográfica

Ionización

Acoplamiento GC/LC-MS

t (min)2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00rt0

100

%

Análisis espectral

masa/carga100 150 200 250 300

0

100

%

218

162

83

1548412398

164

165177 216

220

222

284223 256 288

Sistemas de Introducción

GASES

LIQUIDOS

SOLIDOS

CROMATOGRAFIA GASES CAPILAR

LC, EC

MEMBRANA

SONDA DIRECTA

Interfases especialesDLI

TSP

ESP (ionspray)

APcI

PB

CF-FAB

Conexión directa

Interfases CL-EM

INTRODUCEN MUESTRA

Haz de partículas (Particle beam PB)

Cinta móvil (moving belt)

INTRODUCEN E IONIZAN

Introducción directa (DLI) Termospray (TSP) Bombardeo con átomos

rápidos a flujo continuo (CF-FAB)

Ionización a presión atmosférica (API)

Electrospray (ESP) Ionspray Ionización química a presión atmosférica (APcI)

Sistemas de Introducción

ElectrosprayIonspray

CG/EMParticleBeam

APCITermospray

CF-FAB

Peso Mol.

Polaridad(Solubilidad en agua)

Baja Alta

CL-EM. Aplicaciones descritas en la literatura

0

50

100

150

200

79-80 81-82 83-84 85-86 87-88 89-90 91-92 93-94 95-96

Años

Nº

Pu

blic

ac

ion

es

MBL

TSP

PB

ESP

APcI

W.M.A. Niessen, en: D. Barceló (Ed.), Applications of LC-MS in Environmental Chemistry. J. Chromatography Lib. Vol 59, Elsevier Sc. Amsterdam, Holanda (1996).

Sistemas de Ionización

Ionización por Impacto Electrónico (IE)Ionización Química

Ionización Química Positiva Ionización Química Negativa Ionización Negativa por Captura de Electrones

Ionización/Desorción de CampoIonización/Desorción por PlasmaIonización por Bombardeo de Atomos Rápidos (FAB)Ionización MultifotónicaIonización Laser Asistida por Matriz (MALDI)Ionización por Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP)

Métodos de ionización en EM

Impacto de electrones (70 eV). o Mucha energía, muchas fragmentacioneso Universal

Ionización química negativa Ionización química positiva

o Técnicas de ionización suaves, poca fragmentación (ión molecular)

o Selectivas, compuestos electronegativos o electropositivos

o Método de ionización en HPLC-EM

Dioxinas. Cuantificación por EM(IE)

M+.

(M-COCl)+

2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina

O

O Cl

Cl

Cl

Cl

Análisis Ambiental

Cuant ifi cación

A nális is I ns t r ument al

GC

H PLC

GC- M S ; H PLC- M S

Pur ifi cación

(Clean- up)

E x t r acción

T r at amient o pr evio

T oma de muest r a

Cuantificación

• Calibración con patrones externos e internos (identificación por tiempo de retención)

• Blancos del procedimiento• Determinación de

– sensibilidad– límite de detección– intervalo de linealidad– precisión– exactitud– robusteza – interferencias del método

• Confirmación por GC-MS o HPLC-MS

Validación del método

Control de calidad Objetivo

Comprobar: eficiencia de la extracción pérdidas en las etapas de clean up pureza de los blancos Separación cromatográfica

Procedimiento Añadir un “surrogate”: por ejemplo ,trans-heptacloroepoxido, decaclorobifenilo Como mínimo una muestra del batch por duplicado Muestra certificada o repetida “Muestra ciega” Blancos: por ejemplo en casos de muestras de agua, agua milli-Q Calibrado del aparato con 4 puntos mínimo y comprobación periódica

Criterios de calidad: Recuperación entre 50-130% Diferencia entre los dos duplicados <25% Blanco no tendría que dar niveles detectables del analito límite de cuantificación.

Falsos positivos : Interferencias de la muestra o contaminación externaFalsos negativos: Se concluye que un contaminante no aparece cuando en realidad si está en cantidades detectables: Bajas recuperacionesInterferencias que enmascaran

Ejemplo 1Análisis de HAP y PCBs en sedimento

TCN, OCN, naf-d8, per-d12

PCB30,PCB209,an-d10, pi-d10, b[ghi]per-d12

Fase metanólica Fase hexánica

FRACCIÓN I FRACCIÓN II

FracciónÁCIDA

CG-EMSIM

Tratamiento Cu

OCs

CG-EMSIM

Cromatografía de adsorción alúmina

FracciónNEUTRA

Extracciónn-hexano

SaponificaciónKOH/MeOH

6%

ExtracciónDCM:MeOH

(2:1)

ExtracciónMeOH

Sedimento húmedo

HAPs

TCN, OCN, naf-d8, per-d12.

HAP. Análisis por CG-EM (SIM)

Rango lineal :250-10.000 ng/ml (ppb)LDD (S/N =3) : 2,5 - 10,5 pg

tR (min)

TIC (SIM) +

+

Ejemplo 2. Análisis de OCs y HAP en muestras de aire

Fase gas:

Evaporación a presión reducida

TCN, OCN, per-d12

OCs y HAPs, CG-EM/SIM

1 ml

Extracción Soxhlet400 ml hexano, 24 h

Espumas

PCB30, PCB209naf-d8, pi-d10

Vial tarado

Fase particulada:

an-d10, pi-d10, per-d12, b[ghi]per-d12

TCN, OCN, naf-d8

OCs y HAPs, CG-EM/SIM

1 ml

10 ml de extracto

Extracción por sonicación3 x 30 ml DCM:MeOH

(2:1)

Filtro

PCB30, PCB209Na2SO4

Ejemplo 3. Análisis de OCs y HAP en agua

Na2SO4

PCB 30, PCB 209an-d10, pi-d10, per-d12, b[ghi]per-d12

Elución fase disuelta:

OCs y HAPs, CG-EM /SIM

10 ml de extracto

Extracción líquido-líquido3 x 30 ml hexano

50 ml de azeótropo

200 ml MeOH

50 ml de extracto

200 ml DCM

1º 2ª

TCN, OCN, naf-d8

PCB30,PCB209,an-d10, pi-d10, b[ghi]per-d12

SIM

Fase particulada:

FRACCIÓN II

Fracción

Fase metanólica

ÁCIDA

Fase hexánica

FRACCIÓN I

OCs

CG-EM

Cromatografía de adsorción alúmina

FracciónNEUTRA

Extracciónn-hexano

Saponificación

KOH/MeOH 6%

ExtracciónDCM:MeOH (2:1)

MeOH Filtro

HAPsTCN, OCN, naf-d8, per-d12

Liofilización

Ejemplo 4. Análisis de HAP y OCs en muestras de deposición total

ExtracciónDCM:MeOH

(2:1)

MeOHFiltro congelado

PCB30,PCB209,an-d10, pi-d10, b[ghi]per-d12

Liofilización

10 ml de extracto

Fracción

Fase metanólica

ÁCIDA

Fase hexánica

OCs y HAPs

CG-EMSIM

Cromatografía de adsorción alúmina

FracciónNEUTRA

TCN, OCN, naf-d8, per-d12

Na2SO4

Fase particulada:

PCB30,PCB209,an-d10, pi-d10, b[ghi]per-d12

SIM

Extractos

Extracción l-l2 ml hexano

Elución 5 ml MeOH

Elución 5 ml DCM

Elución 5 ml ciclohexano

Fracción

Fase metanólica

ÁCIDA

Fase hexánica

OCs y HAPs

CG-EM

Cromatografía de adsorción alúmina

FracciónNEUTRA

TCN, OCN, naf-d8, per-d12

Na2SO4

Fase disuelta:

Carrera et al., J. Chromatogr .1998

Ejemplo 5. Análisis de OCs en muestras de peces

se trituran y secan con Na2SO4

TBB y PCB 209

se desecha la fase ácida

Lípidos

20 ml

OCs, CG-ECD

2 ml, clean-up H2SO4

o GPC

80 ml

Extracción Soxhlet

Hex:DCM (4:1), 18 h

4,5 g de músculo dorsolateral

Ejemplo 6. Análisis multiresiduos

C G / F ID

H exanoA lcanos

C G / E C DC G / F ID

T ratamiento C u

H exano:D C M (90:10)PC B s, L AB s

C G / E M

G PC

H exano:D C M (80:20)H AP, esteres céridos

C G / N PDC G / F ID

H exano:D C M (50:50)A lqu iln itr ilos , aldeh idos

C G / F ID

D C MC etona esteroidales

C G / F IDC G / N PD

D erivatizacióntrim etils ilil

D C M :M eO H (80:20)F osfatos alqu ilo

E steroles , alcoholes

C G / N PD

E ter dietílicoT rialqu ilam inas

C romatografía adsorciónS ilica:A lú m ina

(5% agu a)

E xtracciónSoxh let

D C M :M eO H(2:1)

Anális is elem ental% C orgán ico

T ratamiento H C l

T am izado (250 µm)

L iofilización

Sedimento marino

Tensioactivos. Análisis

Sustancias iónicas, no volátiles y solubles en agua

CG-EM Necesidad de derivatización previa

CL-UV o fluorescencia Mezclas complejas

No existen apenas sustancias purasMuchos no tienen grupo cromóforo

Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas

Residuo

Fase Orgánica0.4 ml/min

Válvula

ReactivoNaranja de metilo/H2O0.4 ml/min

Mezcla limpiezaMeOH/ NH3

CROMATOGRAFIA LIQUIDAALTA EFICACIACHCl3 / MeOH / HAc1.2 ml/min

UV/VISDetector420 nm

Residuo

Restrictor de flujo

Separador deFases

Bucle de extracciónColumna de Fase NormalNucleosil- NH2

NR4+

(CH3)2N SO3N=N NR4+

+(CH3)2N N=N SO3

Tensioactivos Catiónicos. Electrospray-EM

Voltaje aceleración 4kV Voltaje capilar 8.7 kV Gas nebulizador N2 a 12

L/h Gas envolvente N2 a 200

L/h 20 ng/l DTDMAC en

metanol a 10 ul/min Barrido de m/z 50 a 1500 (2 s/decade)

Condiciones experimentales :PATRON

LODO DEPURADORA

Plaguicidas. Técnicas “on-line”

Plaguicida Técnica CL-EM

Extracción LDD (S/ N=3) (ng/ L)

Referencia

Ac. Clorofenoxicarb. ISP (+) Cartuchos C18 10-100 (SIM, 50 ml) Chiron et al., 1995

Multiresiduos TSP(+) Cartucho C18 Polímero EVB

1-100 (SIM, 100 ml) Sennert et al., 1995

Organofosforados APcI (+) APcI (-)

Cartucho C18 2-15 (SIM, 100ml) 2-25

Lacorte y Barceló, 1996

Clorofenoles APcI (-) ISP (-)

Polímeros con grupos Sulfónicos

0,5-40 (SIM, 50 ml) 25-100

Puig et al., 1997

Triazina, Fenilurea APcI (+) Immunoabsorb. 1-5 (SIM, 20 ml) Ferrer et al., 1997

ANÁLISIS DE COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES (VOCs)

Técnicas principales

Headspace (espacio de cabeza)

Purge and Trap (Purga y Trampa)

Microextracción en fase sólida

Extracción térmica directa

Purga y Trampa

Purga del cartucho

Captación del aire

Primera desorción:desorción térmica de los cartuchos

Refocalización de los analitos en una trampa criogénica

Segunda desorción: desorción térmica de la trampa y transferencia -inyección de los analitos a la columna cromatográfica

Separación, identificación y quantificación de los analitos

DESORCIÓN TÉRMICA

Primera desorción: desorción térmica de los compuestos retenidos en el adsorbente del cartucho a una T de 300ºC durante 5 minutos y refocalizados hacia una trampa criogénica que contiene Tenax TA a T de -30ºC

Segunda desorción: desorción térmica de los compuestos retenidos en el adsorbente de la trampa a una T de 300ºC y transferidos a la columna cromatográfica

Mercurio Simazina

Cadmio Atrazina

Cobre Tributil estaño

Zinc Trifenil estaño

Plomo Etil azinfos

Arsenico Metil azinfos

Cromo Fenitrotion

Niquel Fention

‘drins (Aldrin, dieldrin, endrin) Malation

Lindano Paration

DDT Metil paration

Pentaclorofenol Diclorvos

Hexaclorobenceno Tricloroetileno

Hexaclorobutadieno Tetracloroetileno

Tetracloruro de carbono Triclorobenceno

Cloroformo 1,2-Dicloroetano

Trifluralin Tricloroetano

Endosulfan Dioxinas

Demeton O Cloruro cianurico

Dimetoato 1,1-Dicloroetileno

Mevinfos 1,3-Dicloropropan-2-ol

2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) 2-cloroetanol

Linuron Etilbenceno

Pirazon Bifenil

2-amino-4-clorofenol 1,4-diclorobenceno

Antraceno 1,3-dicloropropeno

Àcido cloroacético Hexacloroetano

4-cloro-2-nitrotolueno 1,1,1-Tricloroetano

Lista negra de contaminantes(Introducción al medio ambiente se tiene que reducir)

Candidatos a la lista negra