André P. Gerber, Daniel Herschlag, Patrick O. André P. Gerber, Daniel Herschlag, Patrick O. Brown.Brown.

PLos Biology Março 2004 vol2 (3) 342-354PLos Biology Março 2004 vol2 (3) 342-354

Extensive Association of FunctionallyExtensive Association of Functionallyand Cytotopically Related mRNAsand Cytotopically Related mRNAs

with Puf Family RNA-Binding Proteins in Yeastwith Puf Family RNA-Binding Proteins in Yeast

Dinâmica celularDinâmica celular: : síntese e localização das macromoléculassíntese e localização das macromoléculas

Fatores de transcriçãoFatores de transcrição: : regulam o início da transcrição ao se ligar a regulam o início da transcrição ao se ligar a

seqüências de DNA próximas aos genes que seqüências de DNA próximas aos genes que serão reguladosserão regulados

E a regulação Pós-transcricionalE a regulação Pós-transcricional??

Quem são as proteinas Puf?Quem são as proteinas Puf?

Estrutura do mRNAEstrutura do mRNA

os mRNA são controlados por elementos os mRNA são controlados por elementos regulatórios associados às suas regiões 5’ regulatórios associados às suas regiões 5’ UTR e 3’ UTR. UTR e 3’ UTR.

Proteínas ligadoras de RNA (RBP) podem Proteínas ligadoras de RNA (RBP) podem identificar sequencias específicas no mRNA.identificar sequencias específicas no mRNA.

As proteínas Puf pertecem ao grupo As proteínas Puf pertecem ao grupo de proteínas ligadoras de mRNAde proteínas ligadoras de mRNA..

Proteínas PufProteínas Puf

Histórico:Histórico:

PumilioPumilio Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster

FBF FBF Caernorhabiditis elegansCaernorhabiditis elegans

Ligação ao mRNA:Ligação ao mRNA:

As pPuf ou Pum- HD se ligam ao mRNA As pPuf ou Pum- HD se ligam ao mRNA através de um domínio clássico de ligação através de um domínio clássico de ligação ao RNA (RBP) e por repetições do domínio ao RNA (RBP) e por repetições do domínio PufPuf ( (PuPumilio- milio- fem3fem3- binding- - binding- FFactor).actor).

Estrutura da molécula pPufEstrutura da molécula pPuf:: domínio RBP (domínio RBP (RNA binding proteinRNA binding protein).). domínio Puf ou Pum-HD:domínio Puf ou Pum-HD: 8 repetições Puf (3 8 repetições Puf (3 αα-hélices)-hélices) molécula curvadamolécula curvada toda molécula interage com mRNatoda molécula interage com mRNa mólecula bastante conservada em mólecula bastante conservada em

eucariotoseucariotos múltiplas famílias em uma mesma múltiplas famílias em uma mesma

espécieespécie

Estrutura de um domínio Puf ou Pum-HD

pPuf em leveduraspPuf em leveduras

Saccharomyces cerevisae:Saccharomyces cerevisae:

muitas proteínas Puf citoplasmáticas.muitas proteínas Puf citoplasmáticas. 5 famílias pPUF: pPuf1 a pPuf5.5 famílias pPUF: pPuf1 a pPuf5. implicação nos processos de regulação pós-implicação nos processos de regulação pós-

transcricional de expressão de diversos transcricional de expressão de diversos genes.genes.

a pPuf atua nas regiões não traduzidas a pPuf atua nas regiões não traduzidas (UTR) do mRNA 5’ e 3’.(UTR) do mRNA 5’ e 3’.

Domínios estruturais das pPuf de levedura

Objetivo:Objetivo: Identificar os específicos mRNA que Identificar os específicos mRNA que

interagem com as pPuf do interagem com as pPuf do S. cerevisaeS. cerevisae e as e as

características destas interações.características destas interações.

Experimentos:Experimentos: Isolar os mRNA ligados às pPUf específicas, Isolar os mRNA ligados às pPUf específicas,

pelo método TAP-Tag.pelo método TAP-Tag. DNA microarrays das sequencias DNA microarrays das sequencias

purificadas.purificadas. Analisar a interação mRNA-protéina PuF Analisar a interação mRNA-protéina PuF

utilizando o sistema de TRI-Hibrido.utilizando o sistema de TRI-Hibrido.

Método TAP-Tag (Tandem affinity purification)

Método TAP-tag acoplado ao DNA microarray

Definindo mRNA-alvos das pPuf

Alterações nos genes PUFs Alterações nos genes PUFs

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

PUF4 e PUF5: diminuição da longevidadePUF4 e PUF5: diminuição da longevidade

PUF1: supressor de mutação em PUF1: supressor de mutação em microtúbulosmicrotúbulos

PUF2 null: aumento de resistência a PUF2 null: aumento de resistência a cicloheximida e paramomicinacicloheximida e paramomicina

Todos PUFs ausentes= células viáveisTodos PUFs ausentes= células viáveis

pPuf1 e pPuf2pPuf1 e pPuf2

18 % dos genes codificam proteínas 18 % dos genes codificam proteínas associadas à membrana em associadas à membrana em S. cerevisae.S. cerevisae.

A maior parte dos pPuf 1 e 2 associam- se a A maior parte dos pPuf 1 e 2 associam- se a mRNAs para proteínas associadas à mRNAs para proteínas associadas à membrana.membrana.

Proteínas associadas à membrana: funções Proteínas associadas à membrana: funções de transporte transmembrana e transporte de transporte transmembrana e transporte vesicular de proteínas.vesicular de proteínas.

pPuf3pPuf3

Está associado à produtos gênicos Está associado à produtos gênicos mitocondrias.mitocondrias.

80% biossíntese de proteínas que apresenta 80% biossíntese de proteínas que apresenta função estruturais em ribossomos.função estruturais em ribossomos.

Entre as 22 pPuf associadas a mRNAs Entre as 22 pPuf associadas a mRNAs transcritos de mitocondrias ; 17 estão transcritos de mitocondrias ; 17 estão envolvidos na respiração e 12 na envolvidos na respiração e 12 na translocação mitocondrial.translocação mitocondrial.

pPuf4pPuf4

Associa-se ao mRNA envolvidos na síntese , Associa-se ao mRNA envolvidos na síntese , processamento e maturação dos processamento e maturação dos ribossomos. ribossomos.

pPuf5pPuf5

Liga-se a frações de mRNA que codificam Liga-se a frações de mRNA que codificam proteínas que participam da modificação proteínas que participam da modificação covalente de histonas.covalente de histonas.

Liga-se a frações que codificam proteínas Liga-se a frações que codificam proteínas envolvidas na regulação da mitose.envolvidas na regulação da mitose.

Descrição das interações das pPuf com os mRNAs de levedura

Localização das pPuf nas células de levedura

Motivos consenso detectados na 3’UTR do mRNA pelas pPuf

Número de motivos consenso encontrados no genoma e em pPuf-alvos

Sistema TRI-híbrido para análise de força de interação

Motivos comuns detectados na 3’UTR do mRNA pelas pPuf

ConclusõesConclusões

A ligação das RBPs (A ligação das RBPs (pPufpPuf) a mRNA permite ) a mRNA permite maior flexibilidade regulatória que o maior flexibilidade regulatória que o operon.operon.

As RBPs demonstraram a possibilidade de As RBPs demonstraram a possibilidade de se regular especificamente a localização, se regular especificamente a localização, tradução, estabilidade e a sobrevivência do tradução, estabilidade e a sobrevivência do mRNA.mRNA.

Muitos dos mRNAs que se ligam a RBPs Muitos dos mRNAs que se ligam a RBPs codificam proteínas que são ativas em codificam proteínas que são ativas em locais celulares específicos, que formam locais celulares específicos, que formam complexos e participam de vias celulares.complexos e participam de vias celulares.