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Andressa Andressa SpradaSprada
DIAGNDIAGNÓÓSTICO LABORATORIAL DE STICO LABORATORIAL DE MICOBACTMICOBACTÉÉRIAS RIAS
LacenLacen/PR/PR
29 DE MAIO DE 201429 DE MAIO DE 2014
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POR QUE POR QUE MICObactMICObactéériasrias??*** Além de membrana citoplasmática, cromossomo, ribossomos, grânulos de
polifosfato, vacúolos lipídicos e mesossomos, as micobactérias tem uma
parede celular rica em lipídeos, entre eles os ácidos micólicos.
Ácidos micólicos + Fucsina = NÃO se descoram com o álcool-ácido e, por isso,
são chamados de BAAR!!!!
Parede celular de micobacteria: 1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos(arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manósido, 8-esqueleto da parede celular
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
• Realizada apenas para o Hospital Oswaldo Cruz!!!!
• BACILOSCOPIA (S = 40 – 60 %)
Coloração de Ziehl-Neelsen
Amostras – Escarro, Secreções, Biópsia,
LBA (???), Líquidos (???), Urina (???),
Líquor (???),......
- + de 5000 bacilos/mL de escarro
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
• Leitura da baciloscopia segundo Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras micobactérias:
NEGATIVO: Não são encontrados BAAR em 100 campos
QUANTIFICA: 1 a 9 BAAR em 100 campos
+ : 10 a 99 BAAR em 100 campos
++ : 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos
+++ : mais de 10 BAAR em 20 campos
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
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BACILOSCOPIABACILOSCOPIA
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CULTURA DE BAARCULTURA DE BAAR- Amostras = Escarro, LBA, Líquidos,
LCR, Secreções, Biópsia, LG, Sangue
-Descontaminação pelo Petroff/
Semeadura em Lowenstein Jensen
(V= 2 mL)
- Ogawa-Kudoh (V= 1 mL) - Feita no Lacen/PR
- MGIT (V= 2mL)
* 10 a 100 bacilos/mL de escarro
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(a) Sol. De sais minerais(a) Sol. De sais minerais LJLJ OKOK
Fosfato Fosfato monopotmonopotáássicossico 2,4 g2,4 g 12,0 g12,0 g
Sulfato de magnSulfato de magnéésiosio 0,24 g0,24 g --
CitratoCitrato de magnde magnéésiosio 0,6 g0,6 g 0,6 g 0,6 g
GlutamatoGlutamato de sde sóódiodio -- 3,0 g3,0 g
AsparaginaAsparagina 3,6 g3,6 g --
GlicerolGlicerol 12 mL12 mL 24 mL24 mL
ÁÁgua Destiladagua Destilada 600 mL600 mL 600 mL600 mL
DIFERENDIFERENÇÇAS NA COMPOSIAS NA COMPOSIÇÇÃO ÃO DODO LJLJ E DO E DO OKOK
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MMéétodo de todo de PetroffPetroff -- LJLJ
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Cultura pelo MCultura pelo Méétodo de todo de OgawaOgawa KudohKudoh** DESCENTRALIZA** DESCENTRALIZAÇÇÃO JÃO JÁÁ!!!! **!!!! **
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VANTAGENS DO OGAWA KUDOHVANTAGENS DO OGAWA KUDOH
• Técnica rápida e simples;
• Não há necessidade de Cabine de Segurança Biológica;
• Importantíssimo o uso de EPI’s (Máscara N95/PFF2, jaleco mangas longas com punho, óculos de proteção, luvas);
• A sala do ambiente laboratorial deve ser bem ventilada e ter umbico de Bunsen;
• O laboratório deve ter acesso ao GAL para liberação dos resultados que já chegarão cadastrados!!!
• O Lacen/PR oferece o treinamento e fornece os meios mensalmente de acordo com a rotina de cada laboratório.
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VANTAGENS DO OGAWA KUDOHVANTAGENS DO OGAWA KUDOH• Enviar ao Lacen/PR para fazer a tipificação e TST (realizar Ziehl- Neelsen das colônias para confirmar se é BAAR);
• Se for para realizar TST: Solicitar no GAL “Tuberculose, teste de sensibilidade”; SÓ É FEITO TST SE FOR Mycobacteriumtuberculosis;
•Se for para tipificar: Solicitar no GAL “Micobacteriose” (O Serviço de Micobactérias encaminhará à Seção de Biologia Molecular do Lacen/PR ou ao CRPHF, dependendo do aspecto das colônias). *** Lembrando de que se for MNT há a necessidade de 3 isolados com crescimento de mais de 10 colônias;
OBS.: Lembrar de que se for enviado “isolado” deve ser preenchido no campo do GAL que é IS (Isolado Bacteriano) e não IN (Amostra “In Natura”).
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CULTURA DE BAAR CULTURA DE BAAR –– Em Em meio smeio sóólidolido* Leitura da cultura (Escala semiquantitativa) segundo Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras micobactérias:
- Quantifica: Menos de 20 colônias
-+ : 20 a 100 colônias
- ++ : Mais de 100 colônias separadas
- +++ : Colônias confluentes (tapete)
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BACTECBACTECTMTM MGITMGITTMTM 960960
• Cultura : Meio líquido (MGIT 960 - BD®)
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TST TST –– MMÉÉTODO DAS PROPORTODO DAS PROPORÇÇÕES ÕES –– 42 dias42 dias
* TESTE DE SENSIBILIDADE (RMP, INH, EMB, SM)- + DE 20 COLÔNIAS
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TST TST –– MMÉÉTODO DAS PROPORTODO DAS PROPORÇÇÕES ÕES –– 42 dias42 dias
- Leitura do TST segundo Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras micobactérias:
Ex: Tubo controle = 50 colônias
LJ+RMP = 3 colônias
3 X 100/ 50 = 6 % de bacilos resistentes
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TST TST –– MMÉÉTODO DAS PROPORTODO DAS PROPORÇÇÕESÕES
CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DA DROGA E PROPORÇÃO CRÍTICA
-
DROGASDROGAS CONCENTRACONCENTRAÇÇÃO ÃO CRCRÍÍTICA (TICA (g/mL)g/mL)
PROPORPROPORÇÇÃO ÃO CRCRííTICATICA (%)(%)
IsoniazidaIsoniazida 0,20,2 11
RifampicinaRifampicina 4040 11
EtambutolEtambutol 22 11
EstreptomicinaEstreptomicina 44 11
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM
MGITMGITTMTM 960 960 –– 10/14 dias10/14 dias
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM
MGITMGITTMTM 960960
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO QUIDO BACTECBACTECTMTM MGITMGITTMTM 960960
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM
MGITMGITTMTM 960960
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM
MGITMGITTMTM 960960
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM
MGITMGITTMTM 960960
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TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM
MGITMGITTMTM 960960
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TST TST –– Procedimento no Procedimento no LacenLacen/PR /PR apapóós leituras leitura
* Se for SENSÍVEL a todas as drogas: Liberar no GAL!!!
* Se apresentar MONORESISTÊNCIA: Liberar no GAL!!!
* Se apresentar POLIRESISTÊNCIA ouMULTIRESISTÊNCIA ou for um isolado XDR: Liberar no GAL e encaminhar ao CRPHF/RJ para confirmar a resistência e testar frente às drogas de segunda linha; Após liberação do resultado pela Referência, liberamosno GAL.
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IdentificaIdentificaçção/Tipificaão/Tipificaçção: ão: RECOMENDADO PELA RECOMENDADO PELA REFERÊNCIAREFERÊNCIA
- Se for MNT : Solicitar mais 2 amostras para confirmar a infecção.
Exceto: Líquor e sangue
Ex.: Crescimento de MNT na amostra de escarro: Liberamos no GAL “MNT” e solicitamos mais 2 amostras para confirmar a infecção.
*** Só enviamos ao CRPHF quando tivermos as 3 amostras com crescimento de mais de 10 colônias em cada meio.
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Complexo MTB ou MNT???Complexo MTB ou MNT???
* Cultura de BAAR * Cultura de BAAR →→ CMTB ou MNT??? AnCMTB ou MNT??? Anáálise macrosclise macroscóópica da cultura, anpica da cultura, anáálise lise microscmicroscóópica das colônias, niacina, crescimento em PNB:pica das colônias, niacina, crescimento em PNB:
1. Colônia 1. Colônia acromacromóógenagena, rugosa, forma, rugosa, formaçção de corda positiva, PNB negativo, niacina ão de corda positiva, PNB negativo, niacina positiva positiva →→ CMTB (CMTB (M. M. tuberculosistuberculosis, M. , M. bovisbovis, M. , M. africanumafricanum, M. , M. microtimicroti, M. , M. canetticanetti, M. , M. capraecaprae, M. , M. pinnipediipinnipedii))→→ Testes fenotTestes fenotíípicos e/ou molecularespicos e/ou moleculares
2. Colônia 2. Colônia acromacromóógenagena ou ou fotocromfotocromóógenasgenas ou ou escotocromescotocromóógenasgenas, pigmentada, lisa ou , pigmentada, lisa ou rugosa, formarugosa, formaçção de corda negativa, PNB positivo, niacina geralmente negativa ão de corda negativa, PNB positivo, niacina geralmente negativa →→ MNT MNT →→ Testes fenotTestes fenotíípicos e/ou molecularespicos e/ou moleculares
OBS.: * FOTOCROMOBS.: * FOTOCROMÓÓGENAS (GENAS (M. M. kansasiikansasii), ESCOTOCROM), ESCOTOCROMÓÓGENAS (GENAS (M. M. gordonaegordonae) OU ) OU ACROMACROMÓÓGENAS (GENAS (M. M. aviumavium).).
* As MNT podem ser de crescimento r* As MNT podem ser de crescimento ráápido (pido (M. M. fortuitumfortuitum, M. , M. chelonaechelonae) ou lento.) ou lento.
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Complexo MTB ou MNT???Complexo MTB ou MNT???
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Quando mandamos para biologia Quando mandamos para biologia molecular / PCR???molecular / PCR???
*** A biologia molecular do Lacen/PR faz a identificação do Mycobacterium tuberculosis e do Mycobacteriumavium.
*** Nós, do Serviço de diagnóstico de micobactérias, mandamos tipificar quando as colônias são acromógenas, mas não parecem de TB...Aguardamos a tipificação para realizar o TST.
*** Há a possibilidade de solicitação pelo GAL de “Tuberculose, Biologia Molecular” e “Mycobacteriumavium, Biologia Molecular” nas seguintes amostras: Líquidos, biópsia, secreções, LBA, LCR, urina.
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Quando mandamos para biologia Quando mandamos para biologia molecular / PCR???molecular / PCR???
*** Só NÃO é possível fazer PCR direto da amostra de ESCARRO!!!!
Quando é solicitado, apenas realiza-se o exame, se houver crescimento no meio de cultura!!!!
*** Enviamos o isolado para ser tipificado!!!
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O FUTURO DA TIPIFICAO FUTURO DA TIPIFICAÇÇÃO NO ÃO NO LACEN/PRLACEN/PR
*** O próprio Serviço de diagnóstico de Micobactériasrealizará as tipificações!!!
*** Será possível identificar um número maior de espécies.....
*** Desejamos realizar as tipificações no próprio Lacen/PR!!!!
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OBRIGADA!!!