ankara Üniversitesi fen bilimleri enstitÜsÜ doktora tezi nohutlarda kÖk...

ANKARA ÜNIVERSITESI

FEN BILIMLERI ENSTITÜSÜ

DOKTORA TEZI

NOHUTLARDA KÖK ÇÜRÜKLÜGÜNE SEBEP OLAN FUNGUSLAR ARASINDAKI

GENETIK FARKLILIGIN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE INCELENMESI

Harun BAYRAKTAR

BITKI KORUMA ANABILIM DALI

ANKARA

2006

Her hakki saklidir

i

ÖZET

Doktora Tezi

NOHUTLARDA KÖK ÇÜRÜKLÜGÜNE SEBEP OLAN FUNGUSLAR ARASINDAKI GENETIK FARKLILIGIN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE INCELENMESI

Harun BAYRAKTAR

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Bitki Koruma Anabilim Dali

Danisman: Prof. Dr. F. Sara DOLAR

Ülkemizdeki nohut üretimi farkli biotik ve abiotik streslerden dolayi istenilen düzeyde olmamaktadir. Biotik hastalik etmenleri arasinda ise basta Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in sebep oldugu Fusarium solgunlugu olmak üzere diger kök patojenleri önemli bir yer tutmaktadir. Bu sebeple Türkiye’nin 15 farkli ilinde 2001-2002 yillarinda yapilan survey sonucunda, nohutlarda solgunluk ve kök çürüklügüne sebep oldugu tespit edilen fungus izolatlari patojenisite testi, Random amplified polymorphic DNA (RAPD) ve Inter simple sequence repeats (ISSR) yöntemleri kullanilarak karakterize edilmistir. Yapilan survey sonucunda Fusarium oxysporum, F. solani, F. equiseti, F. semitectum, F. acuminatum, Macrophomina phaseolina ve Rhizoctonia solani nohutlarda solgunluk ve kök çürüklügüne neden olan hastalik etmenleri olarak saptanmistir. Elde edilen kök patojenleri arasinda en yaygin patojenin F. oxysporum oldugu ve bunu F. solani ve M. phaseolina’ nin takip ettigi görülmüstür. Hassas nohut çesitleri kullanilarak toplam 144 izolatin virulenslikleri belirlenmis ve bu fungus türlerindeki intra ve inter spesifik polimorfizimler 30 RAPD ve 20 ISSR primeri kullanilarak incelenmistir. Elde edilen verilerin Dice’ in benzerlik katsayisi kullanilarak yapilan UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) cluster analizi sonucunda 74 F. oxysporum izolati arasinda genel olarak 3 ana grubun bulundugu 25 F. solani izolatinin ise 2 farkli gruba ayrildigi tespit edilmistir. Ayrica nohutlarda hastaliga sebep olan diger patojenler arasindaki genetik varyasyon her iki yöntem kullanilarak arastirilmis ve cluster analizi ile birbirlerinden ayri olarak gruplandirilmislardir. Moleküler yöntemler kullanilarak yapilan analizler sonucunda morfolojik kriterler kullanilarak ayirt edilemeyen izolatlar dendogramdaki dagilimlarina göre yeniden siniflandirilmislardir. RAPD, ISSR ve RAPD+ISSR verilerinin kombine edilmesiyle elde edilen dendogramlar arasinda ise yüksek bir korelasyonun oldugu ve her iki yöntemin fungus populasyonlari arasindaki genetik varyasyonu incelemek için oldukça faydali oldugu tespit edilmistir. 2006, 90 sayfa Anahtar Kelimeler: Nohut, genetik farklilik, kök çürüklügü, RAPD, ISSR

ii

ABSTRACT

Ph.D. Thesis

INVESTIGATION OF GENETIC DIVERSITY BETWEEN THE FUNGI CAUSING ROOT ROT IN CHICKPEA BY MOLECULAR TECHNIQUES

Harun BAYRAKTAR

Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Plant Protection

Supervisor: Prof. Dr. F. Sara DOLAR

Chickpea production is not at the desired level because of biotic and abiotic factors in Turkey. Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. ciceris and other root rot pathogens are important biotic disease agents. In this study, fifteen provinces of Turkey were surveyed for fungal pathogens, causing wilt and root rot on chickpea in 2001 and 2002. The fungal species obtained were characterized with pathogenicity test, Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and Inter simple sequence repeats (ISSR) assays. As a result of the survey, Fusarium oxysporum, F. solani, F. semitectum, F. acuminatum, F. equiseti, Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani were detected as pathogens, causing wilt and root rot on chickpea. F. oxysporum was the most widespread pathogen among root rot pathogens, followed by F. solani and M. phaseolina. The virulence spectrum of a total 144 isolates was determined on susceptible chickpea cultivars, and intra and inter specific polymorphisms among these fungal species were investigated using 30 RAPD and 20 ISSR primers. UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) cluster analysis of the data from DNA amplification of RAPD and ISSR using Dice’s coefficient showed 3 major groups among 74 isolates of F. oxysporum and also, clustered 25 isolates of F. solani into 2 different groups. In addition, genetic variation among other pathogens causing disease on chickpea plants was analyzed using both techniques and grouped separately from each other with cluster analysis. The isolates that were not easily separable using morphological characteristics were classified again according to their branching in dendrograms. The results showed that there was a high correlation between dendrograms obtained from the data of RAPD, ISSR and combined RAPD+ISSR and both techniques were useful to study genetic variation among fungal populations. 2006, 90 pages Key Words: Chickpea, genetic diversity, root rot, RAPD, ISSR

iii

TESEKKÜR

Nohutlarda kök çürüklügüne sebep olan funguslar arasindaki genetik farkliligin

incelenmesi amaciyla gerçeklestirilen bu çalismanin her safhasinda yakin ilgi ve destegini

benden esirgemeyerek benim bu alanda yetismem ve gelismemde büyük katkisi olan basta

danisman hocam sayin Prof. Dr. F. Sara DOLAR’ a, fungus izolatlarinin teshisinde büyük

emegi olan ve beni degerli bilgileriyle yönlendiren Prof. Dr. Salih MADEN’ e ve moleküler

teknikler konusunda bilgilerini benimle paylasan Prof. Dr. Mahinur AKKAYA’ ya,

tesekkürlerimi sunarim.

Ayrica moleküler teknikler ile ilgili çalismalara baslamamda büyük katkisi olan ve degerli

bilgilerini benimle paylasan sayin Teresa MILAN ve Juan GIL-LIGERO’ a (Cordoba

Üniversitesi, Ispanya), fungus izolatlarinin temininde yardimci olan Prof. Dr. Gülay

TURHAN (Ege Üniversitesi), Dr. Steiner STENZEL (Bonn Üniversitesi, Almanya) ve

Prof. Dr. Çetin SENGONCA’ ya (Bonn Üniversitesi, Almanya), tezim sirasindaki

çalismalarda beni destekleyen ve yardim eden Dr. Fikret DEMIRCI, Aras. Gör. Muharrem

TÜRKKAN ve Göksel ÖZER’ e, birlikte çalistigim tüm arkadaslarima ve çalismalarim

süresince her zaman yakin ilgi ve desteklerini benden esirgemeyerek bana sabir gösteren

degerli aileme tesekkürlerimi bir borç biliyorum.

Bu tez çalismasi Ankara Üniversitesi Bilimsel Arastirma Projeleri (Proje no: 20030711072)

ve Devlet Planlama Teskilati (DPT-YUUP GENPRO DP2004K120657) tarafindan

saglanan finansal kaynaklar ile desteklenmistir.

Harun BAYRAKTAR

Ankara, Temmuz 2006

iv

IÇINDEKILER

ÖZET.................................................................................................................................. i

ABSTRACT....................................................................................................................... ii

TESEKKÜR ...................................................................................................................... iii

SIMGELER DIZINI ......................................................................................................... iv

SEKILLER DIZINI .......................................................................................................... v

ÇIZELGELER DIZINI .................................................................................................... vi

1. GIRIS ............................................................................................................................. 1

2. KAYNAK ÖZETLERI ................................................................................................. 6

2.1 Nohut Kök ve Kök Bogazi Hastaliklari Üzerine Yapilan Çalismalar.................... 6

2.2 Kök Patojenleri Arasindaki Genetik Farkliligin Incelenmesi Için

Yapilan Moleküler Çalismalar .................................................................................. 10

2.2.1 Kök patojenleri arasindaki genetik farkliligin RAPD

yöntemi ile incelenmesi............................................................................................ 10

2.2.2 ISSR ile ilgili moleküler çalismalar ........................................................................ 21

3. MATERYAL ve YÖNTEM.......................................................................................... 27

3.1 Hastalikli Bitki Materyalinin Temini ........................................................................ 27

3.2 Funguslarin Elde Edilmesi ve Saklanmasi................................................................ 28

3.3 Funguslarin Teshisi..................................................................................................... 29

3.4 Elde Edilen Kök Patojenlerinin Patojenisite Testleri .............................................. 29

3.5 Hastalik Reaksiyonlarinin Degerlendirilmesi ......................................................... 30

3.6 DNA Izolasyonu........................................................................................................... 31

3.7 Fungus Izolatlarinin Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Yöntemi ile analizi ...................................................................................................... 32

3.8 Fungus Izolatlarinin Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) Polymorphism

Yöntemi ile Analizi...................................................................................................... 33

3.9 Agaroz Jel Elektroforezi............................................................................................. 34

3.10 Verilerin Analizi ve Degerlendirilmesi.................................................................... 35

4. ARASTIRMA BULGULARI....................................................................................... 36

v

4.1 Türkiye’ deki Nohut Kök Hastaliklarinin Durumu ve Patojenisite Testleri......... 36

4.2 Nohut Kök Patojenleri Arasindaki Genetik Farkliligin Moleküler

Yöntemlerle Tespiti..................................................................................................... 43

4.2.1 Ön denemeler............................................................................................................ 43

4.2.2 Moleküler yöntemlerle Fusarium oxysporum izolatlari arasindaki

genetik farkliligin tespit edilmesi ........................................................................... 45

4.2.2.1 F. oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD ile analizi ......... 45

4.2.2.2 F. oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin ISSR ile analizi ........... 49

4.2.2.3 F. oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin

RAPD+ISSR ile analizi ........................................................................................ 53

4.2.2.4 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim

seviyelerinin karsilastirilmasi .............................................................................. 55

4.2.3 Moleküler yöntemlerle Fusarium solani izolatlari arasindaki genetik

farkliligin tespit edilmesi ......................................................................................... 55

4.2.3.1 F. solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD ile analizi.................. 55

4.2.3.2 F. solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin ISSR ile analizi.................... 59

4.2.3.3 F. solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD+ISSR ile analizi ...... 62



4.2.4 Moleküler yöntemlerle farkli kök patojenleri arasindaki genetik

farkliligin tespit edilmesi ......................................................................................... 64

4.2.4.1 Nohut kök patojenleri arasindaki iliskinin RAPD analizi ile incelenmesi....... 64

4.2.4.2 Nohut kök patojenleri arasindaki iliskinin ISSR analizi ile incelenmesi ......... 68



5. TARTISMA ve SONUÇ ............................................................................................... 73

KAYNAKLAR .................................................................................................................. 81

ÖZGEÇMIS....................................................................................................................... 90

vi

SIMGELER DIZINI AG Anostomosis Grubu AFLP Amplified fragment length polymorphism bp Baz çifti (base pair) °C santigrat derece CTAB hexadecyl-trimethyl-ammonium bromide DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxynucleotide 5’ triphosphate EDTA ethylene diamine tetra acetic acid IGS Intergenic spacer ISSR Inter-simple sequence repeat ITS Internal transcribed spacer kb kilo baz KCl Potasyum klorür KH2PO4 Potasyum dihidrojen fosfat KNO3 Potasyum nitrat M molar mg miligram MgCl2 Magnezyum klorür MgSO4 Magnezyum sülfat ml mililitre mM milimolar µg mikrogram µl mikrolitre µM mikromolar MP-PCR Microsatellite-primed PCR mt DNA mitochondrial DNA NaCl Sodyum klorür ng nanogram NTSYS Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis PCR Polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase chain reaction) PDA Patates Dekstroz Agar PDB Patates Dekstroz Broth PSA Patates Sakkaroz Agar RAMS Random amplified microsatellite-technique RAPD Random amplified polymorphic DNA rDNA ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism rpm dakikada devir SDS Sodium dodecyl sulphate SNA Sentetik Nutrient Agar SSR Simple sequence repeat TAE Tris-acetate-EDTA Ta annealing temperature Tm melting temperature Tris-HCl Tris-hydroxymethyl amino methane U Ünite UPGMA Unweighted pair group method using arithmetic averages V Volt VCG Vegetative compatibility group

vii

SEKILLER DIZINI

Sekil 3.1 2001 ve 2002 yillarinda hastalikli nohut bitkilerinin toplanmasi

için survey yapilan iller ……………. ................................................................. 27 Sekil 4.1 Kök patojenlerinin nohut bitkilerinde sebep oldugu simptomlar ........................ 42 Sekil 4.2 Farkli dNTPs (a: mM), MgCl2 (b: mM) ve annealing sicakliklarinin

(c: °C) Fusarium oxysporum izolatlarinin PCR amplifikasyonuna etkisi ........... 44 Sekil 4.3 Fusarium oxysporum izolatlarinin a, OPK-12 b, OPA-9 ve c, OPA-4

primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri..................... 46 Sekil 4.4 Fusarium oxysporum izolatlarindan elde edilen RAPD verisinin

UPGMA analizi ile olusturulan dendogram ........................................................ 48 Sekil 4.5 Fusarium oxysporum izolatlarinin a, (GA)8T b, (AC)9RY ve c, (AG)8T

primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri....................... 50 Sekil 4.6 Fusarium oxysporum izolatlarindan elde edilen ISSR verisinin

UPGMA analizi ile olusturulan dendogram ........................................................ 52 Sekil 4.7 Fusarium oxysporum izolatlarindan elde edilen RAPD+ISSR verilerinin

UPGMA analizi ile olusturulan dendogram ........................................................ 54 Sekil 4.8 Fusarium solani izolatlarinin a, OPK-12 b, OPA-9 ve c, OPK-4

primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri..................... 57 Sekil 4.9 Fusarium solani izolatlarindan elde edilen RAPD verisinin

UPGMA analizi ile olusturulan dendogram ........................................................ 58 Sekil 4.10 Fusarium solani izolatlarinin a, (AG)8G b, (GA)8C ve c, (AC)8YA

primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri..................... 60 Sekil 4.11 Fusarium solani izolatlarindan elde edilen ISSR verisinin

UPGMA analizi ile olusturulan dendogram....................................................... 61 Sekil 4.12 Fusarium solani izolatlarindan elde edilen RAPD+ISSR verilerinin

UPGMA analizi ile olusturulan dendogram....................................................... 63 Sekil 4.13 Farkli kök patojenlerinin a, OPK-7 b, OPK-19 ve c, OPA-18

primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri................... 66 Sekil 4.14 Onbir farkli fungus türüne ait RAPD verisinin UPGMA analizi

ile olusturulan dendogram ................................................................................. 67 Sekil 4.15 Farkli kök patojenlerinin a, (GA)8T b, (AG)8G ve c, (AC)8T

primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri..................... 70 Sekil 4.16 Onbir farkli fungus türüne ait ISSR verisinin UPGMA analizi

ile olusturulan dendogram ................................................................................. 71 Sekil 4.17 Onbir farkli fungus türünün RAPD ve ISSR analizlerine ait kofenetik

matriks degerleri arasindaki korelasyon egrisi .................................................. 72

viii

ÇIZELGELER DIZINI Çizelge 1.1 Türkiye’ de 2000-2004 yillari arasindaki toplam nohut ekim alani,

üretim ve verim degerleri ................................................................................. 2 Çizelge 3.1 Moleküler çalismalarda kullanilmak amaciyla farkli arastiricilardan

temin edilen fungus izolatlari ........................................................................... 28 Çizelge 3.2 RAPD analizinde kullanilan primerler............................................................. 33 Çizelge 3.3 ISSR analizinde kullanilan primerler ve annealing (Ta) sicakliklari............... 34 Çizelge 4.1 Nohut surveyi yapilan iller, bu illerden elde edilen kök çürüklügü ve

solgunluk etmenleri ve bu etmenlerden elde edilen izolat sayilari ................. 37 Çizelge 4.2 Nohutlarda hastaliga sebep olan fungus izolatlarinin toplandigi

iller ve virulenslik dereceleri ...................................................................... 38-41

1

1. GİRİŞ

Nohut (Cicer arietinum L.) Güney ve Batı Asya, Hindistan, Etiyopya ve Kuzey Afrika

ülkelerinde yaygın olarak kullanılan bir besin maddesi olup leucine, histidine, iso-leucine,

lysine, fenilalanin, threonine ve valine gibi aminoasitlerce oldukça zengindir. (Eser ve

Soran 1978, Muehlbauer 1993, Akem 1999). İnsan beslenmesinde yaygın olarak kullanılan

nohut bitkisi tanelerinde yüksek oranda protein (% 18-31) içermesinden dolayı özellikle

gelişmiş ülkelerde hayvan beslenmesinde ve yeşil gübre olarak da kullanılmaktadır. Ayrıca

nohut baklagillerin genel bir özelliği olarak köklerinde bulunan Rhizobium spp. bakterileri

ile ortak yaşam sürerek havanın azotunu tespit etmekte ve bulunduğu toprağı azot

bakımından zenginleştirmektedir. Nohut, bu özelliği sebebiyle özellikle gelişmekte olan

ülkelerdeki geleneksel ürün yetiştirme sistemlerinde oldukça önemli bir yer tutmakta ve

toprak koşullarında oluşturduğu bu fiziksel, kimyasal ve biyolojik iyileşmeler nedeniyle

ekim nöbetinde kendisinden sonra gelen kültür bitkileri için daha iyi bir gelişme ortamı

sağlamaktadır (Eser ve Soran 1978). Ayrıca ülkemizde yemeklik olarak kullanılmasının

yanısıra kuruyemiş sanayisinde önemli bir yer tutmaktadır.

Türkiye gibi sıcak iklime sahip bölgelerde Kabuli olarak bilinen büyük taneli ve bej renkli

nohutlar üretilmekte iken yarı kurak tropik bölgelerde Desi olarak isimlendirilen küçük,

köşeli, siyah, kahverengi, sarı veya yeşil renkli nohutlar yetiştirilmektedir (Muehlbauer and

Singh 1987). Dünyadaki nohut üretiminin % 97’ si gelişmekte olan ülkelerde

gerçekleşmekte olup 2004’ de dünyada 10.380.739 hektar alanda nohut ekimi yapılarak

8.572.356 ton ürün elde edilmiştir. Ülkemiz ise dünyada nohut üretimi açısından yılda

5.770.000 ton üretim yapan Hindistan’ ın arkasından ikinci sırada yer almaktadır

(Anonymous 2005).

Ülkemizde 2004 yılı verilerine göre toplam nohut ekim alanı 630.000 ha, üretim 650.000

ton verim ise 1031 kg/ha dır (Çizelge 1.1). Ayrıca 2003 yılında 189.600 ton nohut ihraç

edilerek ekonomiye 82.552.000 dolarlık bir katkı sağlamıştır. Bununla birlikte 2003 yılında

2

41 ton nohut ithal edilmiştir. Nohut ülkemizde 2004 yılı kayıtlarına göre ekim alanı ve

üretim miktarı olarak da baklagiller arasında birinci sırayı almakta ve onu sırasıyla kırmızı

mercimek ve kuru fasulye takip etmektedir (Anonymous 2005).

Çizelge 1.1 Türkiye’ de 2000-2004 yılları arasındaki toplam nohut ekim alanı, üretim ve

..verim değerleri (Anonymous 2005)

Yıllar 2004 2003 2002 2001 2000 Hasat Edilen Alan (Ha) 630.000 630.000 660.000 645.000 636.000

Üretim Miktarı (Ton) 650.000 600.000 650.000 535.000 548.000

Verim(kg/ha) 1031 952 984 829 861 İnsan beslenmesinde önemli bir bitkisel protein kaynağı olan nohut (Cicer arietinum L)

ülkemizde geniş ekim alanına sahip olmasına rağmen verim düzeyi istenilen miktarlarda

değildir. Üretimdeki başlıca azalış nedenleri ise bölgesel çeşitlerin hastalıklara hassasiyeti,

çevresel stres, kuraklık, hastalıklar, zararlılar ve hatalı ürün yönetimidir. Bu güne kadar 55

farklı ülkeden 67 fungus, 3 bakteri, 22 virus ve mikoplazma ve 80 nematod olmak üzere

172 patojenin nohutta hastalığa sebep olduğu ancak bunlardan bir kısmının ekonomik

öneme sahip olduğu bildirilmiştir (Nene et al. 1996). Üretim azalışındaki en önemli

nedenlerin başında Ascochyta yanıklığı, solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıkları

gelmektedir (Soran 1977, Haware et al. 1986, Maden 1987, Dolar 1996, Nene et al. 1996).

Bu hastalıklardan özellikle toprak kökenli olan patojenler ile mücadelenin oldukça zor

olması nedeniyle büyük ekonomik kayıplar meydana gelmektedir.

Dünyada nohut ekimi yapılan tüm alanlarda özellikle Fusarium oxysporum f. sp. ciceris,

Fusarium solani ve Rhizoctonia solani’ nin neden olduğu solgunluk ve kök çürüklüğü

hastalıkları önemli problemlere sebep olmaktadır (Trapero-Casas and Jimenez-Diaz 1985,

Haware et al. 1986, Jimenez-Diaz et al. 1991). Ayrıca bölgelere bağlı olarak Fusarium

moniliforme, Sclerotinia sclerotiorum, Macrophomina phaseolina’ nın (Syn: Rhizoctonia

bataticola) nohutta önemli zararlara sebep olduğu bildirilmiştir (Abou-Zeid and Hallila

3

2003, Singh et al. 2003). Ülkemizde de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, F. solani,

F. acuminatum, F. moniliforme, F. sambucinum, F. equiseti, Rhizoctonia solani,

Macrophomina phaseolina ve Cylindrocarpon tonkinense nohutlarda solgunluk ve kök

çürüklüğüne neden olan etmenler olarak saptanmıştır (Soran 1977, Dolar 1996, Dolar and

Nirenberg 1998).

Tüm dünyada bu patojenlerle mücadele yöntemi olarak dayanıklı nohut çeşitlerinin

geliştirilmesi önerilmektedir. Ancak dayanıklılık bölgesel olarak değişkenlik göstermekte

bu sebeple ıslah materyallerinin farklı üretim bölgelerinde test edilmesi gerekmektedir.

Dayanıklı nohut çeşitlerinin mevcut olmamasının yanısıra önerilen tohum ilaçlamaları da

hastalıkları engellemede yetersiz kalmaktadır. Ayrıca bu kimyasalların maliyetinin yüksek

olması bunların yaygın kullanımını engellemektedir (Nene and Haware 1980, Jimenez-Diaz

et al. 1989, Bhaduoria et al. 2003).

Bitki patojeni fungusların teşhisleri onların kültürel ve morfolojik özellikleri dikkate

alınarak yapılmaktadır. Bu klasik tekniklerle bazı hastalıkların teşhisi yüksek oranda doğru

bir şekilde yapılabilmesine karşın birçok hastalık etmeninin tanısı ya çok zaman almakta

yada şüpheli sonuçlar vermektedir. Özellikle saf kültürlerde incelenen fungal yapıların

morfolojisine dayanan teşhis oldukça yorucu ve çok fazla zaman alıcı olmasının yanı sıra

bu özellikler kullanılarak teşhislerin yapılmasında uzman kişilere ihtiyaç duyulmaktadır

(Niessen and Vogel 1997). Ayrıca patojenlerin kültürel özelliklerinin substrat tipi, kültür

aktarmaları ve inkübasyon koşullarından çok fazla etkilenmesinden dolayı teşhiste

güçlüklerle karşılaşılmaktadır (Rutherford et al. 1995, Yoder and Christianson 1998).

Özellikle Fusarium türlerinin kültürel ve morfolojik özelliklerinin kültür koşullarına bağlı

olarak yüksek derecede değişkenlik göstermesinden ve bu cinsin sınıflandırılmasında farklı

taksonomik sistemlerin kullanılması nedeniyle teşhiste büyük zorluklarla

karşılaşılmaktadır. Taksonomik sınıflandırmada görülen bu farklılık Fusarium cinsinin

Nelson et al. (1983) 30, Booth (1971) 51, Gerlach and Nirenberg (1982) ise 101 tür ve

varyete altında sınıflandırılmasıyla da açıkça ortaya konmaktadır. Ayrıca Fusarium’ ların

4

ırk ve formae speciales ayırımı için kullanılan vejetatif uyum grupları, mikotoksin profili,

spesifik ikincil metabolitleri üretme kabiliyeti ve patojenisite testleri gibi morfolojik

olmayan parametreler ise her zaman güvenilir olmamaktadır (Edel et al. 1995, Voigt et al.

1995). Çünkü böyle testler izolatların seçimi (tipi, virulentliği, sporodochium tipi),

kültürlerin saklanma koşulları, ürün tipi, inokulum konsantrasyonu, inokulasyon teknikleri,

test edilecek çeşitlerin seçimi, bitkinin yaşı ve çevresel koşullar (sıcaklık, ışık, nem) gibi

çeşitli faktörlerden etkilenmektedir (Armstrong and Armstrong 1981). Hastalıkların skala

kullanılarak değerlendirilmesi ise değerlendirme yapan kişiye göre değişmekte ve

sonuçların elde edilmesi için haftalarca beklenmesi gerekmektedir. Özellikle farklı

araştırıcılar tarafından kullanılan skalaların ayırım sınırlarında görülen farklılıklar ise ırk

ayırımında karmaşaya neden olmaktadır (Moricca et al. 1998, Sharma et al. 2004). Ayrıca

toprakta, tohumda ve aynı bitki köklerinde birden fazla patojen bir arada bulunabilmekte bu

ise hastalıktan sorumlu esas patojenin tespitini zorlaştırmaktadır. Bu sebeple hastalıktan

sorumlu olan esas patojenlerin diğerlerinden hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırımının

yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır.

Klasik yöntemlerle yapılan teşhislerin hem zaman alıcı olması hem de bazı fungus

teşhislerinde zorluklarla karşılaşılmasından dolayı morfolojik karakterler kullanılmadan

patojenlerin tespit ve ayırımını sağlayan basit, hızlı ve güvenilir metotlar için sürekli bir

talep olmuştur. Bu güne kadar fungus genomundaki moleküler farklılığı araştırmak

amacıyla DNA fingerprinting, Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), nüklear

veya mitokondrial DNA’ nın Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analizi,

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), farklı ribozomal spacer bölgelerinin DNA

sekans analizi gibi birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Ancak bu yöntemlerin bir kısmında

sekans bilgisine ihtiyaç duyulması bir kısmının ise çok fazla emek ve iş gücü gerektirmesi

sebebiyle çok yaygın bir kullanım alanı bulamamışlardır.

Moleküler yöntemler kullanılarak fungal hastalık etmenlerinin belirlenmesi ile ilgili

çalışmalara ise ülkemizde yeni yeni başlanmaktadır. Patojenlerin populasyon biyolojilerinin

5

araştırılmasında moleküler tekniklerin kullanılabilirliğinin tespit edilmesi patojenlerin

tanısını pratikleştirdiği gibi bu patojenlerin genetik yapılarındaki varyasyonun belirlenmesi

ileride konukçuda bulunan dayanıklılık genlerinin belirlenerek etkili bir ıslah programının

hazırlanmasında ve hastalık kayıplarının azaltılmasında önemli rol oynayacağını

göstermektedir.

Bu çalışmada Türkiye’ nin önemli nohut ekim alanlarında görülen solgunluk ve kök

çürüklüğü etmenlerinin coğrafik dağılımı ve virulenslikleri klasik yöntemler kullanılarak

tespit edilmiştir. Ayrıca nohut ekimi yapılan alanlarda yaygın olan ve ekonomik kayıplara

neden olan başta solgunluk etmeni Fusarium oxysporum olmak üzere yine nohutlardaki

diğer kök çürüklüğü etmenlerinin genetik yapısındaki intra ve interspesifik

polimorfizimlerin ortaya konulmasında RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ve

ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) tekniklerinin kullanılabilirliği araştırılmıştır.

6

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1 Nohut Kök ve Kök Boğazı Hastalıkları Üzerine Yapılan Çalışmalar

Nohutlarda görülen kök ve kök boğazı hastalıkları genelde düşük rakımlı bölgelerde sıcak

ve kuru sezonlarda önemli zararlara sebep olmakta ve tek bir bitki birden fazla patojen

tarafından enfekte edilebilmektedir. Bu güne kadar dünyanın farklı yerlerinde 50 den fazla

patojenin nohutlarda hastalığa sebep olduğunun bildirilmesine rağmen ekonomik önemde

zarar yapan birkaç önemli toprak patojeni bulunmaktadır. Bunlar arasında Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris’ in sebep olduğu Fusarium solgunluğu, Verticillium solgunluğu

(Verticillium dahliae), kuru kök çürüklüğü (Macrophomina phaseolina, Syn: Rhizoctonia

bataticola), kök boğazı çürüklüğü (Sclerotium rolfsii), ıslak kök çürüklüğü (Rhizoctonia

solani), siyah kök çürüklüğü (F. solani), Phytophthora kök çürüklüğü (Phytophthora

megasperma), Pythium kök ve tohum çürüklüğü (Pythium ultimum), kök dibi çürüklüğü

(Operculella padwickii) ve Sclerotinia sclerotiorum’ un sebep olduğu gövde çürüklüğü

hastalıkları yer almaktadır (Nene and Reddy 1987).

Nohutlarda solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ilk kez Hindistan’da

1940 yılında Padwick tarafından tanımlanmıştır. Daha sonra Burma, Kaliforniya, Etiyopya,

Malavi, Meksika, Pakistan, Bangladeş, Peru, Tunus, İran, Suriye, Türkiye ve Sovyetler

Birliğindeki nohut ekim alanlarında da görülmüştür (Westerlund et al. 1974, Trapero-Casas

and Jimenez-Diaz 1985, Nene et al. 1996).

Kuru kök çürüklüğüne sebep olan Macrophomina phaseolina ilk kez Hindistan’da Mitra

(1931) tarafından bildirilmiş ve bu tarihten itibaren Hindistan, İran, Lübnan, Meksika,

Suriye, Türkiye, USA, Avustralya, Etiyopya ve Pakistan’ nın farklı bölgelerinden bu

hastalık rapor edilmiştir (Westerlund et al. 1974, Nene and Reddy 1987).

7

Westerlund et al. (1974) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve Rhizoctonia solani’ nin

Kaliforniya’daki ekim alanlarında solgunluk ve kök çürüklüğüne neden olan önemli

patojenler olduğunu bildirmişlerdir.

Soran (1977) solgunluk ve kök çürüklüğü belirtileri gösteren nohut bitkilerinden yaptığı

izolasyonlar sonucunda bu belirtilere neden olan etmenlerin Fusarium oxysporum,

F. acuminatum ve Pythium ultimum olduğunu bulmuştur.

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in neden olduğu solgunluğun Hindistan, İran, Pakistan,

Nepal, Burma, İspanya ve Tunus’ta nohutlarda % 10-40 arasında ürün kaybına neden olan

önemli bir hastalık olduğu tespit edilmiştir ( Nene et al. 1984, Kaiser et al. 1994).

Haware and Nene (1982) Hindistan’ın farklı bölgelerindeki nohut alanlarından izole

ettikleri Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarını 10 farklı nohut çeşidiyle test ederek

bunların hastalığa karşı gösterdikleri reaksiyonlarda farklılık olduğunu tespit etmişlerdir.

Ayrıca yapılan bu reaksiyon testi sonucunda Hindistan’ da patojenin 1, 2, 3 ve 4 olmak

üzere en az 4 farklı ırkının bulunduğunu bildirmişlerdir.

Cabrera de la Colina et al. (1985) İspanya’ nın Andalucia bölgesinden elde edilen 54

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatı ile 8 farklı kabuli tipi nohut çeşidi kullanarak

yaptıkları reaksiyon denemesi sonucunda bu bölgede 0, 1 ve 5 nolu ırkların bulunduğunu

bildirmişlerdir.

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatları solgunluk veya sararmaya sebep olmalarına

göre iki grup içine alınmakta ve her iki hastalıkta vasküler enfeksiyonlar sonucu meydana

gelmektedir. Bu patotiplerin nohut bitkisindeki patojenisite derecelerinde de farklılık

görülmekte olup solgunluğa sebep olan patotiplerin sararmaya sebep olan patotiplerden çok

daha önemli epidemilere sebep olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca Kuzey İspanya’ da kök ve

8

kök boğazı çürüklüğü nedeniyle oluşan sararmaların F. eumartii, F. solani ve bazen de

nonvasküler F. oxysporum patojenleri ile oluştuğu bildirilmiştir (Trapero-Casas and

Jimenez-Diaz 1985).

Maden (1987) Türkiye’nin farklı illerinden temin edilen nohut tohumlarında yaptığı

incelemeler sonucunda tohumların Ascochyta rabiei, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani,

Fusarium oxysporum, F. moniliforme, F. solani, F. equiseti, F. sambucinum,

Macrophomina phaseolina ve Verticillium dahliae ile bulaşık olduğunu bulmuştur. Bu

funguslardan F. oxysporum tohumlarda % 50 oranında tespit edilmiştir.

Phillips (1988) California’da nohut ekimi yapılan alanlardan alınan hastalıklı bitki

örneklerinde Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in yeni bir ırkını bulmuş ve buna ırk 6

adını vermiştir.

Jimenez-Diaz et al. (1989) Kuzey İspanya bölgesindeki önemli nohut alanlarında 1979 -

1981 yıllarında yaptıkları surveylerde bu bölgede Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in 0, 5

ve 6 nolu ırkı ile F. eumartii ve F. solani’ nin önemli olduğunu ve bunların % 32-54

oranında enfeksiyon yaptıklarını bildirmişlerdir. Ayrıca bu hastalıklarla en uygun mücadele

yönteminin dayanıklı çeşitlerin kullanımı olduğunu belirtmişlerdir.

Rhizoctonia solani’ nin Arjantin, Şili, Hindistan, İran, Meksika, Pakistan, ABD ve

Türkiye’de nohutlarda kök boğazında koyu kahverengi kök çürüklüğüne ve üst

kısımlarında sararma ve solgunluğa neden olduğu araştırıcılar tarafından saptanmıştır.

(Nene and Reddy 1987, Dolar 1996).

Etiyopya’da nohudun önemli solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıkları olan Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris, Rhizoctonia bataticola, R. solani, F. solani, Sclerotium rolfsii

9

arasında en fazla ürün kaybını Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in meydana getirdiği

tespit edilmiştir (Beniwal et al. 1992).

Dolar (1996) Ankara ilindeki nohut ekim alanlarında Ascochyta yanıklığının yanısıra

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in oldukça yaygın olduğunu saptamıştır. Bunlara

ilaveten Rhizoctonia solani, F. acuminatum, F. moniliforme, F. solani, F. equiseti,

F. sambucinum ve Macrophomina phaseolina’ nın da bu alanlarda kök çürüklüğü ve

solgunluğa sebep olduğunu gözlemlemiştir.

Ülkemizde Ankara’ daki farklı nohut ekim alanlarından toplanan enfekteli bitkilerden izole

edilen 31 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatı 10 farklı nohut çeşidinde test edilmiş ve

bu bölgede patojenin 0, 2 ve 3 nolu ırklarının bulunduğu belirlenmiştir (Dolar 1997).

Demirci vd. (1999) Doğu Anadolu’da geliştirilen Aziziye–94 nohut çeşidinde, solgunluk

ve kök çürüklüğü etmenleri olarak Fusarium solani f. sp. pisi, F. oxysporum f. sp. ciceris,

F. acuminatum, F. avenaceum, F. equiseti, F. proliferatum, Macrophomina phaseolina ve

Rhizoctonia solani’ yi (AG-5) tespit etmişlerdir. Bu izolatlar içerisinde Fusarium solani

f. sp. pisi ve Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in diğer etmenlerden daha yaygın

olduğunu da saptamışlardır.

Mısır’ da farklı bölgelerde yetiştirilen nohut bitkilerinde görülen en önemli kök çürüklüğü

ve solgunluk patojenlerinin Sclerotinia sclerotiorum, F. solani, F. oxysporum f. sp. ciceris,

F. moniliforme ve R. solani olduğu ve bunların tarla koşullarında % 3.3-10.2 arasında

enfeksiyon yaptığı Abou-Zeid and Hallila (2003) tarafından bildirilmiştir. Aynı araştırıcılar

Mısırda Fusarium solani’ nin sebep olduğu siyah kök çürüklüğünün ve S. sclerotiorum’ un

neden olduğu gövde çürüklüğünün Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ den daha önemli

olduğunu belirtmişlerdir.

10

Shrivastava and Agrawal (2003) Hindistan’ ın Madhya Pradesh bölgesinde nohutlarda

görülen en önemli hastalığın F. oxysporum f. sp. ciceris olduğunu ve % 10-20 oranında

enfeksiyon yaptığını saptamışlardır. Sulama yapılan yerlerde ise S. rolfsii’ nin fidelerde

% 90’ a kadar varan ölümlere neden olduğu bildirilmiştir (Gupta and Babbar 2003).

Singh et al. (2003) Hindistan’ ın Punjab bölgesinde nohudun en önemli hastalığının

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve Rhizoctonia bataticola olduğunu ve bu patojenlerin

her yıl büyük ürün kayıplarına sebep olduğunu bildirmişlerdir.

Sreekar et al. (2003) fide dönemindeki nohut bitkilerinin genelde Sclerotium rolfsii’ ye

karşı yüksek derecede hassas olduğunu ancak ileriki dönemlerde Fusarium oxysporum

f. sp. ciceris ve Rhizoctonia spp.’ in daha önemli hale geldiğini bildirmişlerdir.

2.2 Kök Patojenleri Arasındaki Genetik Farklılığın İncelenmesi İçin Yapılan

..Moleküler Çalışmalar

2.2.1 Kök patojenleri arasındaki genetik farklılığın RAPD yöntemi ile incelenmesi

Genetik marker olarak kullanılabilen amplifikasyon ürünleri oluşturmak için kısa, rasgele

sentezlenen 9-10 bp lik oligonükleotit primerler ile gerçekleştirilen RAPD yöntemi ilk kez

1990 yılında Williams et al. tarafından bulunmuş olup bu tarihten itibaren birçok canlıdaki

genetik farklılığı ortaya koymak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu yöntemde

amplifikasyonlar total genomik DNA üzerinde gerçekleştiği için RAPD analizi tek bir

genetik bölge içindeki varyasyondan ziyade tüm genomdaki genetik varyasyonun

değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Amplifikasyon koşullarına bağlı olarak farklı

DNA ürünleri meydana gelmekte ve her amplifikasyon ürünü genomik DNA ile kullanılan

primerler arasındaki kısmi sekans benzerliklerini göstermektedir (Welsh and McClelland

1990, Williams et al. 1990).

11

Crowhurst et al. (1991) Fusarium solani’ ye ait izolatların mating type karakterlerine bağlı

olarak ayrılmasının bu türe ait izolatların genom organizasyonunu yansıtıp yansıtmadığını

belirlemek amacıyla RAPD yöntemini kullanmışlardır. 14 primer ile gerçekleştirilen bu

RAPD analizi sonucunda F. solani f. sp. cucurbitae ırk 1 ve 2’ ye ait 21 izolat mating type

ayırımına benzer şekilde iki gruba ayrılmıştır. Klasik yöntemlerle ayrılamayan 4 izolat ise

RAPD tekniği ile mating type olarak ayrılabilmiştir. Ayrıca bu araştırıcılar RAPD

tekniğinin izolatların mating type olarak ayrılmasının yanısıra türe veya ırka spesifik

hibridizasyon probu oluşturmak için kullanılabileceğini belirtmişlerdir.

Fusarium oxysporum f. sp. pisi’ nin 4 ırkı arasındaki genetik değişkenliği RAPD yöntemi

ile araştıran Grajal-Martin et al. (1993) seçilen 14 primer ile ırk 2’ yi temsil eden izolatları

ırk 1, 5 ve 6 izolatlarından ayırmayı başarmışlardır.

Duncan et al. (1993) RAPD analizinin Avustralya’ daki farklı konukçulardan elde edilen

Rhizoctonia solani izolatlarının hem pektik zymogram gruplarına göre ayrılmasında hem de

farklı coğrafik bölgelerden elde edilen bu gruplar içerisindeki varyasyonun ortaya

konulmasında oldukça etkili olduğunu bildirmişlerdir.

Pamuklarda solgunluğa neden olan Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum’ un 46

izolatının 5 farklı pamuk çeşidinde yapılan patojenisite testi sonucunda 3 ırka ayrıldığını

belirten Assigbetse et al. (1994) 11 farklı primer ile yapılan RAPD analizi sonuçlarının

patojenisite sonuçlarına benzediğini bildirmişlerdir.

Kelly et al. (1994) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve diğer Fusarium türleri arasındaki

ilişkiyi RAPD analizi ile incelemişler ve Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in 0, 1B, 1C

ırklarını sararma 1A, 2, 3, 4, 5 ve 6 nolu ırklarını ise solgunluğa sebep olmalarına göre iki

gruba ayırmışlardır. Yapılan RAPD analizleri sonucunda Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

izolatlarını diğer nohut patojenlerinden ayırmayı da başarmışlardır. Aynı araştırıcılar 1998

yılında yaptıkları bir diğer çalışmada ırk 5’ e spesifik olan 1.6 kb büyüklüğünde bir RAPD

12

fragmentini klonlayarak sekans analizi yapmışlardır. Elde edilen bu primer (wilt 1/2) ile

yapılan PCR analizi sonucunda amplifiye edilen 1.5 kb büyüklüğündeki bir fragmentin

enfekteli ancak belirti göstermeyen nohut bitkilerinde solgunluğa sebep olan Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris izolatlarının sararmaya sebep olan Fusarium oxysporum f. sp.

ciceris izolatlarından ve diğer fungus türlerinden ayırımını mümkün kıldığını

bildirmişlerdir. Ancak bu primerin, kök ve gövde dokularından elde edilen DNA’ da

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris tespitini sağladığı halde aynı enfekteli bitkilerin yaprak

dokularında fungusun varlığını tespit etmekte yetersiz olduğunu belirtmişlerdir.

Manulis et al. (1994) karanfillerde solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp.

dianthi’ nin patojenik ve non patojenik izolatlarını ayırmak için yaptıkları RAPD analizinde

kullanılan 30 primerden 22’ sinin bu izolatların ayırımını sağladığını bildirmişlerdir. Ayrıca

bu primerlerden bazılarının 1.4 kb büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek ırk 2 ve ırk

4 izolatlarının birbirinden ayırmasını sağladığını tespit etmişlerdir.

İspanya ve Hindistan’ daki nohut ekim alanlarından elde edilen Fusarium oxysporum f. sp.

ciceris’ in 7 farklı ırkını ayırmak için mitokondrial DNA (mt DNA)’ daki RFLP

polimorfizimlerinden yaralanan Perez-Artes et al. (1995) 40.5 kb büyüklüğündeki mt

DNA’ nın 8 farklı restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilmesi sonucu elde edilen RFLP

polimorfiziminin Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in ırklarını ayırmak için yeterli

olmadığını bu sebeple mt DNA’ nın patojenik farklılıktan sorumlu olamayabileceğini

bildirmişlerdir.

Yang et al. (1995) RAPD analizi ile Rhizoctonia solani izolatlarının pektik zymogram

gruplarına göre ayrılabildiğini ancak patojenisite ve coğrafik dağılım açısından herhangi bir

ilişkinin bulunamadığını bildirmişlerdir.

Farklı coğrafik bölgelerden elde edilen F. moniliforme izolatlarını gibberellin üretimi ve

genetik akrabalık bakımından inceleyen Voight et al. (1995) gibberellin üreten tüm

13

izolatların ayni RAPD profili gösterdiğini tespit etmişlerdir. 51 primer kullanılarak yapılan

RAPD analizi ile gibberellin üreten tüm izolatlar grup C (mating populasyonu) içerisinde

yer alırken gibberellin üretmeyen izolatlar (A, B, D, E, F) arasında büyük polimorfik

farklılıkların olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca RAPD verilerine dayanılarak yapılan

filogenetik analiz ile test edilen tüm Fusarium izolatlarının birbirinden ayrılması

sağlanmıştır.

Finlandiya ve Norveç’ deki hastalıklı conifer fidelerinden elde edilen Rhizoctonia solani’

nin tek nükleuslu izolatları, RAPD analizi sonucunda elde edilen verinin UPGMA analizi

ile bir gruba (% 75 benzerlik) ayrılır iken iki nükleuslu izolatları farklı bir grubu (%10-25

benzerlik) oluşturmuştur (Lilja et al. 1996).

Schilling et al. (1996) başak yanıklığına sebep olan Fusarium culmorum ve

F. graminearum’ un ITS sekanslarının türe özgü primerler hazırlamak için yeterince

polimorfik olmaması sebebiyle bu izolatların spesifik tespiti için SCARs’ a dayalı bir PCR

denemesi geliştirmiştir. RAPD analizi ile F. graminearum ve F. culmorum izolatlarından

elde edilen 410 bp ve 470 bp büyüklüğündeki fragmentlerin klonlanmasıyla hazırlanan

SCARs primerleri bu fungusların test edilen diğer fungus türlerinden ayırımını sağlamıştır.

Achenbach et al. (1997) soya fasulyesinde ani ölüme sebep olan Fusarium solani f. sp.

phaseoli izolatları arasındaki genetik ilişkiyi araştırdıkları çalışmalarında 28 S ribozomal

DNA’ sı üzerinde bulunan D2 bölgesinin bu formae speciales içindeki izolatların ayırımı

için yeterli sekans varyasyonu içermediğini ancak tür seviyesinde ayırımı sağladığını

bildirmişlerdir. Buna karşın aynı araştırıcılar tüm genomun incelenmesine olanak sağlayan

RAPD yöntemi ile ani ölüm sendromuna sebep olan F. solani f. sp. phaseoli izolatlarını

non patojenlerden ayırmayı başarmışlardır.

Fusarium acuminatum, F. sporotrichioides ve F. tricinctum arasındaki taksonomik ilişkiyi

araştırmak için yapılan isozyme ve RAPD analizi sonucunda klasik yöntemlerle yapılan

14

sınıflandırmada bazı hataların olduğu ve bu sebeple Fusarium’ un Gibbosum ve

Sporotrichiella seksiyonlarının yeniden revize edilerek F. acuminatum izolatlarının iki

farklı türe ayrılması gerektiği bildirilmiştir (Altomare et al. 1997).

Huang et al. (1997) İsrail ve USA’ da mısır bitkisinde önemli bir hastalık olan Fusarium

moniliforme’ nin 43 izolatından 10 primer kullanılarak elde edilen 48 polimorfik bandın

değerlendirilmesi ile 32 RAPD haplotipinin ortaya çıktığını bildirmişlerdir. Ayrıca 2

vejetatif uyum grubunun (VCG) aynı haplotipi paylaşması dışında RAPD ve VCG

ayırımının uyum içerisinde olduğu görülmüştür. Aynı tarladaki 6 mısır hattından elde

edilen 63 izolatın 42 VCG ve 37 RAPD haplotipine ayrıldığı ve mısır hatlarındaki genetik

farklılığın % 81 olduğu yine bu çalışma ile tespit edilmiştir. Ayrıca RAPD analizinin VCG

testine göre daha basit olduğunu ve aynı VCG’ na giren bazı izolatlar arasındaki moleküler

varyasyonu belirlemek için daha faydalı olduğu bu araştırıcılar tarafından bildirilmiştir.

Fernandez et al. (1997) Fransa’ nın Algeria bölgesinde Bayound hastalığı olarak

isimlendirilen ve palmiye bitkisinde vasküler solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum

f. sp. albedinis izolatları arasındaki genetik ilişkiyi araştırmak için vejetatif uyum testi,

mtDNA RFLP ve RAPD yöntemlerini kullanmışlardır. Farklı coğrafik bölgelerden elde

edilen 98 izolatın vejetatif olarak uyumlu olduğu ve tek bir gruba ayrıldığı tespit edilmiştir.

Ayrıca bu izolatlardan 73 tanesinin mtDNA’ sında genetik varyasyon tespit edilememiş ve

tüm izolatlar aynı mtDNA RFLP grubuna ayrılmıştır. RAPD analizi ile elde edilen 43

bandın değerlendirilmesi ise bu izolatların genetik olarak yakından ilişkili olduğunu (0.032)

ancak izolatlar arasında coğrafik olarak bazı faklılıkların bulunduğunu göstermiştir.

Yoder and Christianson (1998), Discolor seksiyonunda bulunan altı Fusarium türüne ait 67

izolat üzerinde yaptıkları RAPD ve PCR çalışmasında farklı türe ait olan bu izolatlardan

altısının birbirine çok fazla benzediğini ve bunlardan elde edilen RAPD bantlarının aynı

türün farklı izolatları ile elde edilen bantlardan farklı olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca

farklı kültür koleksiyonlarında F. graminearum olarak saklanan ve farklı taksonomistler

15

tarafından F. sulphureum, F. crookwellense ve F. venenatum olarak teşhis edilen ATCC

20334 izolatı üzerinde yaptıkları moleküler ve morfolojik çalışmalar ile bunun aslında

F. venenatum olduğunu bildirmişlerdir.

Migheli et al. (1998) farklı coğrafik bölgelerdeki hastalıklı karanfil bitkilerinden elde edilen

72 Fusarium spp. izolatını RAPD ve patojenisite testleri ile incelemişlerdir. Patojenisite

testlerinde Fusarium oxysporum f. sp. dianthi olarak tespit edilen izolatlar üzerinde 10

primer ile yapılan RAPD analizinde 0.3-4.0 kb arasında değişen büyüklerde toplam 72

polimorfik band değerlendirilmiş ve 60 F. oxysporum f. sp. dianthi izolatı üç gruba

ayrılmıştır. Patojenisite testinde ırk 4 olarak ayrılan izolatlar birinci grubu oluştururken ırk

2, 5 ve 6 ikinci grubu, ırk 1 ve 8 ise üçüncü grubu oluşturmuştur. Ayrıca RAPD analizi ile

patojen F. oxysporum f. sp. dianthi izolatlarının patojen olmayan izolatlardan ve diğer

Fusarium türlerinden ayırt edilebildiğini ancak RAPD verileri ile izolatların coğrafik

dağılımı arasında bir ilişki bulunamadığını belirtmişlerdir.

PDA ortamında benzer koloni morfolojisi gösteren Fusarium avenaceum ile F. tricinctum’

un nüklear 5.8S ITS bölgelerindeki RFLP farklılıklarının bu iki türün izolatlarını ayırmak

için yeterli polimorfizim oluşturmadığı belirten Turner et al. (1998) RAPD profillerinin bu

iki türün birbirinden ayrılmasını sağladığını bildirmişlerdir. Elde edilen bu RAPD profiline

dayanılarak hazırlanan primer çifti (JIAf,r) ile yapılan PCR analizi sonucunda test edilen

bütün F. avenaceum izolatlarından 220 bp büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek

çapraz reaksiyonlar olmadan F. avenaceum’ un, F. tricinctum ve incelenen diğer buğday

patojenlerinden ayrılması sağlanmıştır

Chiocchetti et al. (1999) enfekteli fesleğen bitkilerinden izole edilen 52 Fusarium

oxysporum izolatını patojenisite ve RAPD analizine tabii tuttukları çalışmaları sonucunda

patojenisite testinde Fusarium oxysporum f. sp. basilici olarak teşhis edilen izolatların

RAPD analizi ile patojen olmayan Fusarium oxysporum izolatları ve diğer Fusarium

türlerinden ayrılabildiğini bildirmişlerdir.

16

Hernandez et al. (1999) 15 farklı primer ile farklı coğrafik bölgelerden elde edilen 35

Fusarium oxysporum izolatı üzerinde RAPD tekniği ile çalışmalar yapmışlardır. Bu

çalışmalarında kullanılan primerlerden hiçbirinin tüm F. oxysporum f. sp. dianthi

izolatlarında ortak olan bir amplifikasyon bandı oluşturmadığını bildirmişlerdir. Ancak bu

primerlerden sadece OPA-17 primerinin F. oxysporum f. sp. dianthi izolatlarının kendi

içinde 4 farklı gruba ayrılmasını ve ayrıca bu izolatların F. oxysporum’ un diğer formae

speciales’ lerinden ve yakın olarak ilişkili diğer türlerden ayırımını sağladığını tespit

etmişlerdir.

Farklı konukçulardan elde edilen 27 F. oxysporum ve dört farklı türe (F. avenaceum,

F. equiseti, F. graminearum ve F. redolens ) ait olan 9 Fusarium izolatını RAPD, rDNA

RFLP ve isozyme analizi ile inceleyen Huhtala et al. (1999) 3 primerle gerçekleştirilen

RAPD analizi sonucunda her izolattan 300-2000 bp arasında 2-10 fragmentin amplifiye

olduğunu bildirmişlerdir. Bu fragmentlerden elde edilen parsimony ağacı ile tüm izolatlar

birbirinden ayrılmış ve F. oxysporum izolatları kendi arasında 7 farklı grup içerisinde

toplanmıştır. Ayrıca F. oxysporum izolatlarının gruplandırılmasında konukçu ve coğrafik

orjin bakımından bazı ilişkilerin bulunduğu ve isozyme analizi sonuçlarının RAPD analizi

sonuçlarına benzediği görülmüştür. Araştırıcılar ITS bölgesinin RFLP analizi ile

F. oxysporum, F. avenaceum, F. equiseti, F. graminearum ve F. redolens türlerinin

birbirinden ayrılabildiğini ancak bu yöntemin intraspesifik polimorfizimlerin

incelenmesinde yetersiz olduğunu bildirmişlerdir.

Garcia-Pedrajas et al. (1999) hastalık ile bulaşık topraklardan Fusarium oxysporum f. sp.

ciceris’ in solgunluğa sebep olan patotiplerinin direkt olarak tespitini sağlayan bir Nested-

PCR metodu geliştirmek amacıyla Kelly et al. (1994, 1998) tarafından tespit edilen 1.618

bp büyüklüğündeki bir RAPD fragmentinin sekansından yararlanmışlardır. Bu araştırıcılar

WiltNF-1/WiltNR-1 ve WiltNF-2/WiltNR-2 primerleri ile yaptıkları PCR analizi

sonucunda oluşan 605 bp büyüklüğündeki bir fragmentin toprak örneklerinde bulunan

17

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in solgunluğa sebep olan izolatlarının spesifik olarak

belirlenmesini sağladığını bulmuşlardır.

RAPD, ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus) ve REP-PCR (Repetitive

extragenic palindromic) yöntemlerini kullanarak 11 farklı AG’ ye ait Rhizoctonia solani

izolatları arasındaki genetik farklılığı araştırdıkları çalışmalarında Toda et al. (1999) 0.2-

5.56 kb arasında değişen büyüklüklerde ortalama 23 fragment amplifiye etmiş ve 41 Japon

izolatı arasında 7 farklı grup tespit etmişlerdir.

Vakalounakis and Fragkiadakis (1999) solgunluk belirtisi gösteren hıyar bitkilerinden izole

edilen 106 Fusarium oxysporum izolatını patojenisite, VCG ve genetik farklılıkları

bakımından incelemişlerdir. Patojenisite testleri ile bu izolatlardan 68 tanesi F. oxysporum

f. sp. radicis-cucumerinum, 32 tanesi F.oxysporum f. sp. cucumerinum, 6 tanesi ise

avirulent olarak belirlenmiştir. RAPD analizi ile bu izolatlar Fusarium oxysporum’ un diğer

formae specialeslerinden ve avirulent izolatlarından ayrılırken F. oxysporum f. sp. radicis-

cucumerinum izolatları tek, F.oxysporum f. sp. cucumerinum izolatları ise iki farklı RAPD

grubuna ayrılmıştır. Ayrıca daha önceki çalışmalarda F. oxysporum f. sp. cucumerinum

olarak teşhis edilen 4 izolatın F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum olarak

sınıflandırılması gerektiğini bildirmişlerdir.

Chakrabarti et al. (2001) Hindistan’ da bulunan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in

ırklarını ayırmak için basit bir metot geliştirmişler ve bunun için nüklear ribozomal DNA

üzerinde bulunan ITS1-5.8S-ITS2 ve IGS bölgelerini farklı restriksiyon enzimleri ile

kesmişlerdir. Yapılan enzim kesimi sonucunda ITS bölgelerinin Fusarium oxysporum f. sp.

ciceris izolatları içerisinde yüksek derecede korunmuş olduğunun buna karşın IGS

bölgesinin bu patojenin 1, 2, 3 ve 4 nolu ırklarının üç farklı gruba ayrılmasını sağladığını

tespit etmişlerdir. Ayrıca IGS bölgesinin EcoRI enzimi ile kesimi sonucunda ırk 1 ve 4

benzer profiller oluşturur iken ırk 2 ve 3’ ün birbirlerinden oldukça farklı profiller verdiği

gözlemlenmiştir.

18

De Haan et al. (2000) 10 mer’ lik oligonükleotit primerlerini kullandıkları RAPD analizde

609 ve 1169 bp büyüklüğünde iki fragmenti amplifiye ederek Fusarium oxysporum f. sp.

gladioli ırk 1 izolatlarını ırk 2 ve diğer test edilen Fusarium türlerinden ayırmayı

başarmışlar ve bu RAPD profillerini kullanarak ırka spesifik primerler hazırlamışlardır.

Soya fasulyesinde hipokotil çürüklüğü ve yaprak yanıklığına sebep olan Rhizoctonia solani

izolatlarını ayırmak için 35 polimorfik markerı değerlendiren Fenille et al. (2002) RAPD

analizi ile AG-1 IA, AG-2-2 IIIB, ve AG-4 HGI anastomosis gruplarını sebep oldukları

hastalık simptomlarına göre 3 farklı gruba ayırmıştır. ITS 1 ve 2 bölgelerinin nükleotit

sekansı ve uzunluklarından yararlanılan bir diğer çalışmada ise Fenille et al. (2003) % 84.3-

100 benzerlik ile hipokotil çürüklüğü ve yaprak yanıklığına sebep olan anastomosis

gruplarını birbirinden ayırmayı başarmıştır.

Freeman and Maymon (2000) karantina listesinde olan Fusarium oxysporum f. sp.

albedinis’ in patojen ve patojen olmayan farklı F. oxysporum izolatları ile diğer Fusarium

spp. türlerinden ayrılmasında RAPD ve türe spesifik PCR yöntemlerinin güvenilirliğini

karşılaştırmışlardır. Spesifik PCR yöntemi ile elde edilen 400 ve 204 bp büyülüğündeki

fragmentler F. oxysporum f. sp. albedinis izolatlarının diğer izolatlardan kesin olarak

ayrılmasını sağlamıştır. RAPD analizinde ise bazı patojen ve saprofit Fusarium türleri ile

F. oxysporum f. sp. albedinis izolatlarının benzer bir genomik yapıya sahip olduğu

görülmüştür.

Hindistan’ da yaygın olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in 4 ırkı arasındaki genetik

farklılığı araştırmak için microsatellit markerlar (Barve et al. 2001) kullanılmıştır.

Microsatellit lokuslarına komplemantar olan 13 oligonükleotit prob ve 11 restriksiyon

enzimi ile gerçekleştirilen DNA fingerprinting analizinde ırk 1 ve 4 izolatları arasında

% 76.6 oranında bir genetik benzerliğin olduğu görülmüştür. Bu grup ile ırk 2 izolatları

arasında % 67.3, ırk 3 izolatları arasında ise % 26.7 oranında bir genetik benzerlik olduğu

tespit edilmiştir. Farklı enzim-prob kombinasyonlarında yapılan bu hibridizasyon analizi

19

sonucunda ırk 1, 2 ve 3 izolatlarına spesifik olan hibridizasyon bantları tespit edildiği halde

ırk 4’ e spesifik bir bant tespit edilememiştir. Ayrıca bu araştırıcılar genetik farklılığın

tespit edilmesinde düşük G+C içeriğine sahip olan [(AGT)5, (ATC)5 ve (GATA)4]

problarının daha faydalı olduğunu ve enzim kesiminde 4 baz kesici enzimlerin 5 ve 6 baz

kesici enzimlere göre daha fazla polimorfizim oluşturduğunu bildirmişlerdir.

Jimenez-Gasco et al. (2001) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in ırklarını ayırmak için 60

izolat ve 40 primer kullanarak gerçekleştirdikleri çalışmalarında 0, 1B/C, 5 ve 6 nolu

ırklara karşı spesifik RAPD markerlarını tespit etmişlerdir. Bunun yanı sıra elde edilen 160

bandın cluster analizi ile Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarını 3 gruba

ayırmışlardır. Sararmayı teşvik eden izolatlar (ırk 0 ve ırk 1B/C) kendi arasında iki gruba

ayrılmış, solgunluğu teşvik eden izolatlar (ırk 1A, 2, 3, 4, 5 ve 6) ise üçüncü grubu

oluşturmuştur. Bu çalışmada elde edilen ırka spesifik RAPD markerları, bu fungusun direkt

olarak tespitini sağlayan spesifik primerler oluşturmak için kullanılmıştır. SCAR analizi ile

elde edilen bu primerlerden Foc0-12f/ Foc0-12r primeri 1.5 kb büyüklüğünde bir fragmenti

amplifiye ederek Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in patojen izolatlarının patojen

olmayan izolatlardan ve diğer formae speciales’ lerden ayrılmasını sağlamıştır. Ayrıca bu

araştırıcılar SCAR analizi ile oluşturulan diğer klonlardan elde edilen primerlerin 0, 1A, 5

ve 6 nolu ırkların spesifik olarak tespitini mümkün kıldığını bildirmişlerdir (Jimenez-Gasco

et al. 2003).

İspanya’ da fasulyelerde solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli’ nin 43

izolatı RAPD analizi ile 4 farklı gruba ayrılarak patojenin yüksek derecede virulent olan

izolatları için spesifik olan bir RAPD markerı tespit edilmiştir (Alves-Santos et al. 2002).

Araştırıcılar bu RAPD markerını klonlayarak hazırladıkları SCAR primerlerinin 609 bp

büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek yüksek derecede virulent olan izolatların

patojenlerden olmayan izolatlardan ayrılmasını ve simptom göstermeyen bitki dokusundan

patojenin direkt olarak tespitini mümkün kıldığını bildirmişlerdir.

20

RAPD ve AFLP teknikleri ile 4 ırkı temsil eden 43 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

izolatları arasındaki genetik farklılığı araştıran Sivaramakrishnan et al. (2002) 20 farklı

primer ile gerçekleştirilen RAPD analizinde her bir izolat için 0.5-3 kb arasında değişen

büyüklüklerde 3-6 fragmentin amplifiye olduğunu tespit etmişlerdir. Elde edilen benzerlik

indeksine göre bu izolatlar 4 gruba ayrılmıştır. Buna göre ırk 1 ve ırk 2 izolatları tek

başlarına iki farklı gruba ayrılırken ırk 3 ve ırk 4 birlikte üçüncü grubu oluşturmuştur.

Patojenin bilinen ırklarına benzerlik göstermeyen 6 izolat ise dördüncü grubu

oluşturmuştur. Aynı araştırıcılar AFLP analizi ile izolatlar arasında benzer bir dağılımın

olduğunu tespit etmişlerdir. Her iki yöntem ile ırk 1 ve ırk 2 izolatları kesin olarak

birbirinden ayrıldığı halde ırk 3 ve 4 nolu izolatların birbirinden ayrılamadığını ancak

AFLP yönteminin izolatlar arasındaki polimorfizimin ortaya çıkarılmasında daha etkili

olduğunu bildirmişlerdir.

Brezilya’ da soya fasulyesinin en önemli patojenlerinden olan Macrophomina phaseolina

izolatları arasındaki ilişkiyi incelemek için RAPD ve PCR-RFLP yöntemlerini kullanan

Almeida et al. (2003) tarafından UPGMA analizi ile 55 izolat, % 70 benzerlik seviyesinde

üç farklı gruba ayrılmıştır. Aynı çalışmada farklı konukçulardan elde edilen diğer

M. phaseolina izolatları % 55 benzerlik ile 6 farklı gruba ayrılmıştır. ITS bölgesinin PCR-

RFLP’ si ile elde edilen 260 bp büyüklüğündeki fragmentin enzim kesimi ise izolatlar

arasında herhangi bir polimorfizim oluşturmamıştır.

Cramer et al. (2003) fasulye ve şeker pancarı bitkilerinde solgunluğa sebep olan Fusarium

oxysporum izolatlarını patojenisite testi ve RAPD analizi ile incelemişlerdir. 12 primer ile

elde edilen 105 polimorfik markerın UPGMA analizi kullanılarak değerlendirilmesi

sonucunda kofenetik korelasyon katsayısını r=0.98 olarak bulmuşlar ve incelenen tüm

izolatlar arasında yüksek bir genetik varyasyonun olduğunu tespit etmişlerdir. Ancak

izolatların patojenisite sonuçları ile dendogramdaki dağılımları arasında ilişki kurmak için

RAPD analizinin çok fazla uygun olmadığını belirtmişlerdir.

21

Jana et al. (2003) aralarında nohutun da bulunduğu farklı konukçulardan elde edilen 43

Macrophomina phaseolina izolatı ile farklı formae speciales ve ırka ait 22 Fusarium

izolatını 210 RAPD markerı kullanarak incelemişlerdir. Yapılan bu çalışma ile

M. phaseolina izolatlarından 0.3-3.5 kb büyüklüğünde değişen 2-8 band amplifiye edilmiş

ve bu izolatlar 5 farklı gruba ayrılmıştır. Nohuttan elde edilen izolatlar ise 3 farklı grupta

yer almıştır. Ayrıca tek bir RAPD primeri ile M. phaseolina izolatlarının tüm Fusarium

izolatlarından ayrılabildiğini ve bu tek primer metodunun en azından cins seviyesinde

spesifik markerlar geliştirilmesi için faydalı olacağını bildirmişlerdir. Üniversal çeltik

primerleri kullanılarak yapılan bir diğer çalışmada ise nohuttan elde edilen M. phaseolina

izolatları, soya fasulyesi ve pamuktan elde edilen izolatlardan tamamen ayrı olarak

gruplanmış ancak bu izolatlar arasında spesifik bir gruplanmanın olmadığı gözlemlenmiştir

(Jana et al. 2005).

Justesen et al. (2003) farklı tarla ve çeşit farklılığı ile ürün rotasyonunun patates gövde ve

yumrularındaki R. solani populasyonuna etkisini RAPD ve ITS sekansı ile incelemişlerdir.

Yapılan bu çalışma ile elde edilen tüm izolatların AG-3 grubuna ait olduğu ve populasyon

gen akışında yumruların gövdeden daha önemli rol oynadığı tespit edilmiştir. Ayrıca ürün

rotasyonu veya patates çeşidinin populasyon yapısında etkili olmadığı görülmüştür.

2.2.2 ISSR ile ilgili moleküler çalışmalar

Inter simple sequence repeats (ISSR) tekniği genomik DNA üzerinde bulunan microsatellit

tekrarlanma bölgelerinin amplifikasyonuna dayanan bir PCR yöntemidir. DNA’ ın farklı

uçlarındaki iki microsatellit tekrar bölgesi arasında bulunan ve amplifikasyon mesafesinde

olan DNA segmentinin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Bu teknikte farklı

büyüklüklerdeki ISSR sekanslarının amplifikasyonu için çok sayıda genomik lokusu hedef

alan 16-25 bp büyüklüğündeki primerler kullanılmaktadır. 2, 3, 4 veya 5’ li microsatellit

tekrarlarından oluşan bu primerler, 5’ veya 3’ uçlarına 1-4 adet çapa eklenerek (anchored)

veya eklenmeden de (unanchored) kullanılabilmektedir. Enzim kesimi ve ligasyon gibi

22

işlemlere gerek olmayan ISSR yönteminde, RAPD primerlerine (10 bp) göre daha uzun

olan (16-25 bp) ve bu sebeple daha yüksek annealing sıcaklıklarının (45-60 °C)

kullanımına olanak sağlayan microsatellit primerler daha fazla polimorfizimin oluşmasına

olanak sağlamaktadır. RAMS (Random amplified microsatellite-technique), MP-PCR

(Microsatellite-primed PCR) gibi farklı isimlerde verilen bu yöntemde elde edilen PCR

ürünleri elektroforetik olarak agaroz jelde ayırıma tabii tutulmaktadır (Meyer et al. 1993,

Zietkiewicz et al. 1994, Hantula et al. 1996).

Coniferler’ de kansere neden olan Gremmeniella abietina var. abietina populasyonları

arasındaki genetik varyasyonu RAMS tekniği ile inceleyen Hantula and Muller (1997) üç

primer ile dört farklı amplifikasyon ürününün oluştuğunu ve bu polimorfik bantların

Gremmeniella izolatlarının Kuzey Amerika, Asya, Avrupa ve Kuzey Amerika-Avrupa

grupları olarak farklı gruplara ayrılmasını sağladığını bildirmişlerdir. Aynı teknik

kullanılarak yapılan başka bir çalışmada ise Hantula et al. (2000) çilek bitkisinde meyve ve

taç çürüklüğüne sebep olan Phytophthora cactorum izolatları arasında genetik olarak fark

bulunmadığını tespit etmişlerdir. Ayrıca RAMS markerları ile bu fungusun Kuzey Amerika

ve Avrupa’ dan elde edilen çilek izolatları arasında genetik varyasyon tespit edilmesine

karşın farklı konukçulardan elde edilen izolatları arasında kesin bir genetik ayırımın

bulunmadığı bu çalışma ile tespit edilmiştir.

Tuber ve Glomales’e ait türler arasındaki intra ve interspesifik farklılıkları inceleyen

Longato and Bonfante (1997) microsatellit primerlerin yakın olarak ilişkili olan türlerin

ayrılması için oldukça faydalı olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca microsatellit primerlerin

türe spesifik markerlar elde etmek için PCR-RFLP ve RAPD yöntemlerine kıyasla daha

basit, hızlı ve kullanılabilir oldukları bu çalışmada tespit edilmiştir.

Barnes et al. (2001) farklı konukçularda solgunluk ve kansere sebep olan Ceratocystis

fimbriata izolatlarına spesifik primerler oluşturmak için ISSR-PCR yöntemini

kullanmışlardır. Bu amaçla CMW 4822 ve CMW4835 izolatları 7 ISSR primeri

23

kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplifikasyon sonucu oluşan bantlar (200-2600 bp)

klonlanarak microsatellit bölgelerine bitişik sekansları hedef alan primer çiftlerini

hazırlamak için kullanılmıştır. Bu primer çiftleri ile elde edilen verilerin cluster analizi

sonucunda coğrafik bölge ve konukçu bakımından Ceratocystis fimbriata izolatları

birbirinden ayrılabilmiştir.

RAM-PCR ve RAPD analizleri ile elde edilen verilerin bireysel olarak veya

birleştirilmesiyle oluşturulan dendogramların 57 Geotrichum candidum izolatının

ayrılmasını sağladığını ve izolatlar arasında yüksek bir genetik farklılığın olduğu Gente et

al. (2002) tarafından bildirilmiştir.

Grunig et al. (2001) ağaç köklerinde endofitik olarak bulunan Phialocephala fortinii ve

spor vermeyen Tip 1 izolatlarını ISSR analizi ile incelemişlerdir. Bu izolatlardan 0.32-4.1

kb arasında değişen büyüklüklerde 92 fragment amplifiye edilmiş ve bunların % 92.4’ ünün

polimorfik olduğu tespit edilmiştir. Bu araştırıcılar P. fortinii izolatlarında yüksek bir

intraspesifik varyasyonun olduğunu ve ISSR analizinin tür veya taksona spesifik markerlar

geliştirmek ve populasyon genetiğinin incelenmesi için oldukça faydalı olabileceğini

bildirmişlerdir.

Soya fasulyesinde kahverengi gövde çürüklüğüne sebep olan Phialophora gregata

izolatları ile yapılan ISSR ve AFLP analizlerinde elde edilen toplam 121 fragmentten % 54’

nün polimorfik olduğu ve ISSR analizinin genetik farklılığı tespit etmede AFLP

yönteminden daha hassas olduğu Meng and Chen (2001) tarafından bildirilmiştir.

Shukla et al. (2001) insanlarda ve hayvanlarda hastalığa sebep olan Leptospira’ nın

serovarlarını ayırmak için gerçekleştirdikleri ISSR analizinde kullanılan 6 primerden

sadece (AG)8T primerinin iki patojen olmayan Leptospira türünde 1000 bp büyüklüğündeki

fragmentin amplifikasyonunu sağladığını tespit etmişlerdir. Ayrıca patojen ve patojen

24

olmayan Leptospira türlerinin ayırımında primerin 3’ uçunda bulunan Timin bazının

önemli bir rol oynadığını bildirmişlerdir.

Botryosphaeria’ nin Hyala ve Brunnea seksiyonlarına ait 10 farklı türü ISSR yöntemi ile

inceleyen Zhou et al. (2001), beş primer ile bu izolatlardan 0.2-1.65 kb arasında değişen

büyüklüklerde toplam 171 fragmentin amplifiye olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca elde

edilen verinin cluster analizi sonucunda benzer morfolojik yapıya veya ITS sekansına sahip

olan fungusların ayrımında ISSR analizinin faydalı olduğu belirtilmiştir.

Entomopatojen bir fungus olan Nomuraea rileyi izolatları arasındaki filogenetik ilişkiyi

araştırmak için ISSR analizinden yararlanılmıştır (Han et al. 2002). Oniki microsatellit

primer kullanılarak 83 polimorfik bandın değerlendirildiği bu çalışmada farklı bölgelerden

elde edilen N. rileyi izolatları diğer Nomuraea türlerinden ayrılarak birkaç farklı grup

içerisinde toplanmıştır. Ancak coğrafik bölge ve konukçu dağılımı bakımından izolatlar

arasında bir ilişki gözlenmemiştir.

Rastık fungusları olarak bilinen 7 Ustilago spp. (U. avenae, U. bullata, U. hordei,

U. kolleri, U. nigra, U. nuda ve U. tritici) arasındaki filogenetik akrabalığı ISSR ve AFLP

yöntemlerini kullanarak araştıran Menzies et al. (2003) U. bullata’ ya ait izolatlar dışındaki

diğer türlere ait izolatlar arasındaki moleküler farklılığın çok düşük düzeyde olduğunu

tespit etmişlerdir. ISSR ve AFLP yöntemleri ile U. bullata, U. nuda ve U. tritici

izolatlarının kesin olarak ayırımı sağlandığı halde U. avenae ve U. kolleri izolatları arasında

herhangi bir moleküler farklılık tespit edilememiştir. Ayrıca U. hordei ve U. nigra türleri

arasında önemli bir genetik varyasyon gözlenmemiştir. Bu sebeple Menzies et al. (2003)

U. avenae ve U. kolleri’ nin monofiletik olduğunu ve U. hordei ve U. nigra gibi tek bir tür

olarak sınıflandırılmaları gerektiğini bildirmişlerdir.

Mishra et al. (2003) farklı coğrafik bölgelerden elde edilen Fusarium culmorum

populasyonlarındaki genetik yapıyı incelemek için ISSR markerlarından faydalanmışlardır.

25

ISSR analizi ile elde edilen 30 polimorfik (% 80) bandın değerlendirilmesi sonucu 75

F. culmorum izolatı 7 farklı grup içerisinde 59 genotipe ayrılmıştır. Ayrıca ISSR analizi ile

F. culmorum izolatlarında görülen farklılığın klonal olmayıp rekombinasyon sonucu

oluşmuş olabileceğini bildirmişlerdir. Bir başka çalışmada ise Mishra et al. (2004) Kanada’

nın farklı bölgelerinden elde edilen F. graminearum populasyonlarındaki genetik yapıyı

incelemiştir. Sekiz ISSR primerinden elde edilen 158 polimorfik bandın değerlendirildiği

bu çalışmada 70 F. graminearum izolatı arasında 4 farklı grubun bulunduğu tespit

edilmiştir. Ayrıca bu gruplandırma ile populasyonların coğrafik dağılımı arasında kısmen

de olsa bir benzerlik olduğu ve populasyonlar arasındaki varyansın % 2.77, populasyonlar

içindeki varyansın ise % 97.23 arasında değiştiği tespit edilmiştir.

Coniferler’ de filiz yanıklığına sebep olan Sirococcus conigenus izolatları arasındaki

genetik farklılığı ISSR ve ITS bölgelerinin sekans analizi ile inceleyen Smith et al. (2003)

test edilen izolatları % 10 benzerlikle 2 farklı gruba ayırmıştır. Yedi ISSR primeri ile elde

edilen 78 fragmentin UPGMA analizi sonucunda çam ve ladin ağaçlarından elde edilen

izolatlar bir grupta yer alır iken köknardan izole edilen izolatlar diğer grupta yer almıştır.

Lu et al. (2004) 12 farklı ağaç türünde endofitik olarak bulunan farklı Colletotrichum ve

Glomerella izolatlarını ISSR ve RAPD analizi ile karşılaştırmışlardır. BBD(AAC)5 ve

BDB(ACA)5 primerleri kullanılarak yapılan ISSR analizinde 0.15-4.08 kb büyüklüğünde,

RAPD analizinde ise 0.1-2 kb büyüklüğünde fragmentler amplifiye edilerek her iki

yöntemde de test edilen izolatlar 8 farklı gruba ayrılmıştır. Ancak konukçu spesifikliği ile

izolatların dağılımı arasında bir ilişki tespit edilememiştir.

Endofitik Guignardia mangiferae izolatları arasındaki fenotipik ve genotipik varyasyonu

araştıran Rodrigues et al. (2004), ISSR yöntemiyle elde edilen gruplanma ile konukçu

spesifitesi ve coğrafik dağılımı arasında bir ilişki tespit edememişlerdir. Ancak araştırıcılar

ISSR yönteminin fungus izolatlarının ayırımı ve populasyon yapısının incelenmesi için

oldukça faydalı olduğunu bildirmişlerdir.

26

Fusarium oxysporum f. sp radicis-lycopersici ve f. sp. lycopersici’ nin vejetatif uyum

grupları arasındaki genetik farklılığı ortaya koymak için RAPD ve microsatellit

primerlerinden yararlanan Balmas et al. (2005a) her iki yöntem arasındaki korelasyon

katsayısını r=0.77 olarak bulmuşlardır.

Citrus türlerinde hastalığa sebep olan Phoma tracheiphila’ nın 36 İtalyan izolatını 12

RAPD (92 marker) ve 7 microsatellit primeri (56 marker) kullanarak inceleyen Balmas et

al. (2005b) bu izolatların genetik olarak homojen olduğunu ve test edilen tüm primerlerle

aynı amplifikasyon ürününü oluşturduklarını belirtmişlerdir. Ancak bu izolatların diğer

Phoma türlerinden ayrımı bu yöntemlerle sağlanabilmiştir.

Hindistan ve ABD’ de yetiştirilen soya fasulyesi ve pamuk bitkilerinde kömür çürüklüğüne

sebep olan Macrophomina phaseolina populasyonlarındaki genetik farklılığı incelemek için

basit sekans tekrarlarından (microsatellit marker) yararlanan Jana et al. (2005) böyle

microsatellitlerin populasyon araştırmalarında ve spesifik markerların tespit edilmesinde

oldukça faydalı olduğunu bildirmişlerdir. (ACTG)4, (GACAC)4 ve (CAC)5 primerleri

kullanılarak yapılan ISSR analizi ile test edilen izolatlar arasında 250-3500 bp arasında

değişen büyüklüklerde polimorfizim görülmüştür. Bu çalışma ile soya fasulyesi izolatları

iki gruba ayrılmış pamuktan elde edilen izolatlar ise tek grup içerisinde toplanmıştır.

27

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1 Hastalıklı Bitki Materyalinin Temini

Çalışmalarda materyal olarak 2001-2002 yıllarında Türkiye’ de nohut ekiminin yoğun

olduğu farklı illerden toplanan ve hastalık belirtisi gösteren nohut bitkilerinden elde edilen

fungus izolatları kullanılmıştır (Şekil 3.1). Ayrıca farklı araştırıcılar tarafından temin edilen

ve patojenisiteleri belirlenen bazı izolatlar referans olarak bu çalışmaya dâhil edilmiştir

(Çizelge 3.1).

Şekil 3.1 2001 ve 2002 yıllarında hastalıklı nohut bitkilerinin toplanması için survey ..yapılan iller

Nohutun farklı vejetasyon dönemlerinde Ankara, Eskişehir, Kırşehir, Konya, Kayseri,

Burdur, Denizli, Kütahya, Uşak, Antalya, K. Maraş, Adıyaman, Diyarbakır, Amasya ve

Tokat olmak üzere 15 ilde surveyler yapılmıştır. Bu surveyler esnasında her ilde en az 10

km aralıkla farklı tarlalardan 5-10 adet bitki örneği alınmıştır. Gezilen tarlalarda sararmış,

solgun, ölü görülen bitkiler toplanmış ve izolasyon amacıyla kese kağıtlarına konularak

laboratuara getirilmiştir.

28

Çizelge 3.1 Moleküler çalışmalarda kullanılmak amacıyla farklı araştırıcılardan temin edilen .fungus izolatları

İzolat ismi Fungus Türü Temin Edilen Kişi ve Kurum

Ref-1 F. solani Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi

Ref-2 F. moniliforme Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi

Ref-3 F. moniliforme Prof. Dr. Gülay Turhan Ege Üniversitesi

Ref-4 F. equiseti Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi

Ref-5 F. equiseti Prof. Dr. Gülay Turhan Ege Üniversitesi

Ref-6 F. sambucinum Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi

Ref-7 F. subglutinans Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi

KA1 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

KC7 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

A4 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

A6 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

HAY5 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi



Ka2 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Ka4 F. solani Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Ka8 F. solani Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Hay6 F. solani Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Ank-35 F. equiseti Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Ank-37 F. moniliforme Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Ank-38 F. acuminatum Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

Ank-39 C. tonkinense Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi

3.2 Fungusların Elde Edilmesi ve Saklanması

Nohutlarda hastalığa sebep olan fungal patojenlerin tespiti için farklı illerden toplanan

hastalıklı nohut bitkilerinin kök ve kök boğazından 0.2-0.5 cm boyunda bitki parçaları

kesilerek izolasyon yapılmıştır. Kesilen bu bitki parçaları yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla

% 1’ lik sodyumhipoklorür’ de (NaOCl) 2 dakika tutulmuş ve bunu takiben 3 seri steril saf

sudan geçirilmiştir. Daha sonra steril filtre kağıtları arasında kurutularak PDA (Potato

29

Dextose Agar, Merck) ortamı içeren petri kaplarına 5’ er adet olacak şekilde konulmuştur.

Fusarium türlerinin izolasyonu için ise PCNB ortamı kullanılmıştır. Bu petri kapları 23±1

°C’ de 12 saat aydınlık (yakın ultraviole ışık) 12 saat karanlık periyot içeren inkübasyon

odasında 7 gün süreyle geliştirilmiştir. Daha sonra gelişen fungusların her biri tek spor

izolasyonu yapılarak saflaştırılmıştır. Elde edilen fungus izolatları Microbank tüplere (Pro-

Lab, Diagnostics, Canada) alınarak -80 °C’ de, ve kum kültürlere alınarak oda sıcaklığında

saklanmıştır.

3.3 Fungusların Teşhisi

Teşhisi yapılacak Fusarium spp. izolatları PSA (Patates Sakkaroz Agar: 500 ml Patates

ekstraktı, 20 g Sakkaroz, 20 g Agar, 500 ml su) ve SNA (Sentetik Nutrient Agar: 1 g

KH2PO4, 1 g KNO3, 0.5 g MgSO4.7 H2O, 0.5 g KCl, 0.2 g Sakkaroz, 20 g Agar, 1000 ml

su) ortamına aşılanmıştır. SNA ortamında 1 cm2 lik steril filtre kağıtları aşılama yerinin her

iki tarafına konularak sporulasyonun teşvik edilmesi sağlanmıştır. İzolatlar 23±1 °C’ de 12

saat aydınlık (yakın ultraviole ışık) 12 saat karanlık periyot içeren inkübasyon odasında

7-15 gün süreyle geliştirilmiştir. Daha sonra Booth (1971), Anonymous (1996) teşhis

anahtarlarına göre Fusarium türlerinin teşhisi yapılmıştır. Macrophomina ve Rhizoctonia

türlerinin teşhisi ise PDA ortamı kullanılarak Sneh et al. (1991) ve Singleton et al. (1992)’

e göre yapılmıştır.

3.4 Elde Edilen Kök Patojenlerinin Patojenisite Testleri

Patojenisite testleri 144 izolat ile hassas nohut çeşitleri (JG-62, ILC 482) kullanılarak Nene

and Haware (1980)’ nin toprak inokulasyon metodu ile yapılmıştır. İnokulum için 45 g

elenmiş kum ve 5 g nohut unu karışımı içeren 200 ml şişeler steril edildikten sonra PDA’

da geliştirilen 10 günlük fungus kültürlerinden alınan 0.7 cm çapındaki 5 adet disk ile

inokule edilmişlerdir. Bu şekilde hazırlanan şişeler 12 saat aydınlık (ışık şiddeti 297

µmolesec-1m-2) periyot ve 25±1 °C sıcaklık içeren kontrollü koşullara sahip iklim odasına

30

yerleştirilmiştir. Şişelerde 14 gün süre ile geliştirilen fungus kültürleri, 600 g steril toprak

harçı (bahçe toprağı: yıkanmış dere kumu: yanmış çiftlik gübresi, 1: 1: 1, v/v/v) içeren 13

cm çapındaki toprak saksıların her birine 50 g olacak şekilde karıştırılmış ve hafifçe

sulandıktan sonra saksılar yukarıda belirtilen koşullara sahip iklim odasına yerleştirilmiştir.

İnokulumun toprağı sarması için 5-6 gün beklenmiş ve % 1’ lik sodyumhipoklorür (NaOCl)

çözeltisinde 3 dakika süre ile tutularak yüzeysel dezenfeksiyon yapılan tohumlar her

saksıya 5 adet olacak şekilde ekilmiştir. Kontrol saksılarına ise inokulum içermeyen 50 g

nohut unu - kum karışımı ilave edilmiş ve aynı şekilde 5 adet tohum ekilmiştir. Denemeler

3 tekerrürlü olarak yürütülmüştür

3.5 Hastalık Reaksiyonlarının Değerlendirilmesi

Hastalık değerlendirmesi inokulasyondan 3 hafta sonra başlanarak 6 hafta süreyle

yapılmıştır. Değerlendirmede akropetal sararma ve nekrozun esas alındığı 0-4 skalası

kullanılmıştır (Trapera-Casas and Jimenez-Diaz 1985).

0-4 Skalası

0 = % 0

1 = % 1 – 33

2 = % 34 – 66

3 = % 67 – 100

4 = Ölü Bitki

Hassas nohut çeşidinde 3.1-4.0 skala değerine neden olan izolatlar yüksek virulant (YV),

1.1-3.0 skala değerine neden olan izolatlar orta derecede virülant (OV) ve 0.0-1.0 değerine

neden olan izolatlar ise düşük virülant (DV) veya non patojen olarak değerlendirilmiştir.

31

3.6 DNA İzolasyonu

Bu amaçla modifiye edilerek iki farklı DNA izolasyon yöntemi kullanılmıştır. DNA

izolasyonu için fungus izolatları 100 ml PDB (Potato Dextrose Broth, Difco) ortamı içeren

250 ml’ lik erlenmayerlerde inkübatörlü orbital shaker (150 rpm) üzerinde (25±1 °C) 7 gün

süreyle geliştirilmiştir. PDB ortamında geliştirilen funguslar miracloth bezi kullanılarak

süzülmüş ve sıvı nitrojen içeren porselen havanlarda iyice ezilerek 1.5 ml’ lik eppendorf

tüplere aktarılmıştır. Sonra her tüpe 500 µl ekstraksiyon bufferı (200 mM Tris-HCl pH:8.5,

25 mM NaCl, 25 mM EDTA, % 0.5 SDS) konularak süspanse oluncaya kadar

karıştırılmıştır. Daha sonra elde edilen ekstrakt nükleik asitleri parçalamak amacıyla 65 °C’

de 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu inkübasyon periyodundan sonra eppendorf tüplere

eşit hacimde fenol:kloroform (25:24 v/v, AppliChem Darmstadt, Germany) eklenerek

13.000 g’ de 1 saat santrifügasyona (Sigma 3K30) bırakılmıştır. Üstte toplanan sıvının 400

µl’ si yeni eppendorf tüplere aktarılarak üzerine 25 µl RNase A (10 mg/ml, AppliChem

Darmstadt, Germany) ilave edilmiştir. 37 °C’ de yarım saat inkübasyondan sonra 250 µl

kloroform:isoamilalkol (24:1 v/v, AppliChem Darmstadt, Germany) eklenerek 15 dakika

santrifüj edilmiştir. Üstte toplanan sıvı yeniden temiz eppendorf tüplere alınarak üzerine

eşit hacim isopropanol eklenmiştir. Bir saat veya tüm gece -20 °C’ de inkübasyondan sonra

5 dakika santrifüj uygulanarak tüpün dip kısmında toplanan DNA pelleti 100 µl % 70’ lik

ethanol ile yıkanarak ortam koşullarında kurutulmuştur (Reader and Broda 1985).

Diğer DNA izolasyon yönteminde ise % 2’ lik CTAB ekstraksiyon bufferı (CTAB: 2 g, 200

mM Tris-HCl pH:8.0, 0.7 M NaCl, 25 mM EDTA) kullanılmıştır. Yukarıdaki yöntemde

belirtildiği gibi hazırlanan eppendorf tüplerine 500 µl ekstraksiyon bufferı konularak iyice

süspanse oluncaya kadar karıştırılmış ve 30 dakika aynı sıcaklıkta inkübasyona

bırakılmıştır. Santrifügasyon işlemlerinin 10000 g’ de 15 dakika yapılması dışında tüm

işlemler yukarıdaki gibi gerçekleştirilmiştir (Anonymous 2003). Daha sonra elde edilen

DNA pelleti 25-50 µl steril bi-destile (d2H2O) su ile süspanse edilerek -20 °C’ de

saklanmıştır.

32

Konsantrasyon tayininde elde edilen genomik DNA (2 µl DNA örneği, 2 µl yükleme

bufferı, 6 µl d2H2O) % 0.8’ lik agaroz jelde 100 V’ da 1 saat elektroforez yapılarak farklı

konsantrasyonlarda seyreltilen λ DNA (MBI Fermentas GmbH, Germany) ile

karşılaştırılmıştır. Daha sonra örnek DNA’ ları steril bi-d2H2O ile 25-50 ng / µl olacak

şekilde seyreltilmiştir.

3.7 Fungus İzolatlarının Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Yöntemi ile

Analizi

Nohutlarda hastalığa sebep olan kök patojenleri arasındaki farklılığı araştırmak için yapılan

RAPD analizinde OPK ve OPA primer (Operon Technologies, Alameda, CA, USA)

setlerinden 30 farklı oligonükleotit primer kullanılmıştır (Çizelge 3.2). PCR

amplifikasyonları için farklı dNTPs, Taq DNA polimeraz ve MgCl2 konsantrasyonları

denenerek uygun yoğunluklar belirlenmiştir.

Bu çalışmada izolatların RAPD analizi modifiye edilerek Williams et al. (1990) yöntemine

göre yapılmıştır. PCR reaksiyonları; 0.125 mM dNTPs, 0.32 µM primer, 1.5 mM MgCl2,

10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 0.8 % Nonident P40, 0.6 U Taq DNA polimeraz

(MBI Fermentas GmbH, Germany) içeren 25 µl’ lik hacimlerde gerçekleştirilmiştir. DNA

amplifikasyonu ise 94 °C’ de 20 saniye, 36 °C’ de 1 dakika, 72 °C’ de 1 dakika 40 döngü

ve en son döngüden sonra 72 °C’ de 8 dakika olacak şekilde programlanan thermocyclerda

(Techne Progene) gerçekleştirilmiştir.

33

Çizelge 3.2 RAPD analizinde kullanılan primerler

Primer Kodu Primer sekansı 5’→→→→3’ Primer Kodu Primer sekansı 5’→→→→3’ OPA-1 CAGGCCCTTC OPK-2 GTCTCCGCAA

OPA-2 TGCCGAGCTG OPK-3 CCAGCTTAGG

OPA-3 AGTCAGCCAC OPK-4 CCGCCCAAAC

OPA-4 AATCGGGCTG OPK-5 TCTGTCGAGG

OPA-5 AGGGGTCTTG OPK-7 AGCGAGCAAG

OPA-6 GGTCCCTGAC OPK-8 GAACACTGGG

OPA-7 GAAACGGGTG OPK-9 CCCTACCGAC

OPA-8 GTGACGTAGG OPK-10 GTGCAACGTG

OPA-9 GGGTAACGCC OPK-11 AATGCCCCAG

OPA-12 TCGGCGATAG OPK-12 TGGCCCTCAC

OPA-16 AGCCAGCGAA OPK-14 CCCGCTACAC

OPA-17 GACCGCTTGT OPK-15 CTCCTGCCAA

OPA-18 AGGTGACCGT OPK-16 GAGCGTCGAA

OPA-19 CAAACGTCGG OPK-17 CCCAGCTGTG

OPK-19 CACAGGCGGA

OPK-20 GTGTCGCGAG

3.8 Fungus İzolatlarının Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) Polymorphism

.Yöntemi ile Analizi

ISSR analizi ise modifiye edilerek Rathaparkhe et al. (1998) yöntemine göre

gerçekleştirilmiştir. Amplifikasyon için farklı uzunluklarda (15-23 bp) tekrarlanan sekans

dizilişlerine sahip olan ve 5’ veya 3’ çapalı primerler kullanılmıştır. Ayrıca her primer için

uygun annealing sıcaklıkları tespit edilmiştir (Çizelge 3.3).

PCR amplifikasyonları ise 0.2 mM dNTPs, 0.24 µM primer, 2.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-

HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 0.8 % Nonident P40, 1 U Taq DNA polimeraz (MBI Fermentas

GmbH, Germany) içeren 25 µl’ lik hacimlerde 94 °C’ de 30 saniye, primerlerin G+C

34

içeriğine bağlı olarak belirlenen annealing sıcaklığında (Ta) 30 saniye, 72 °C’ de 2 dakika

35 döngü ve sonra 72 °C’ de 10 dakika olacak şekilde gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 3.3 ISSR analizinde kullanılan primerler ve annealing (Ta) sıcaklıkları

ISSR primerleri Primerlerin baz dizileri (Ta) % G+C

(AG)8G 5’-AGA GAG AGA GAG AGA GG-3’ 52 °C 52.9

(GA)8T 5’-GAG AGA GAG AGA GAG AT-3’ 50 °C 47.1

(GA)8C 5’-GAG AGA GAG AGA GAG AC-3’ 50 °C 52.9

(AC)8T 5’-ACA CAC ACA CAC ACA CT-3’ 50 °C 47.1

(AG)8YT 5’-AGA GAG AGA GAG AGA GYT-3’ 52 °C 47.2

(AG)8YC 5’-AGA GAG AGA GAG AGA GYC-3’ 55 °C 52.8

(GA)8YT 5’-GAG AGA GAG AGA GAG AYT-3’ 53 °C 47.2

(GA)8YC 5’-GAG AGA GAG AGA GAG AYC-3’ 54 °C 52.8

(CA)8RT 5’-CAC ACA CAC ACA CAC ART-3’ 52 °C 47.2

(AC)8YT 5’-ACA CAC ACA CAC ACA CYT-3’ 52 °C 47.2

(AC)8YA 5’-ACA CAC ACA CAC ACA CYA-3’ 53 °C 47.2

(ATG)6 5’-ATG ATG ATG ATG ATG ATG-3’ 50 °C 33.3

BHB(GA)7 5’-BHB GAG AGA GAG AGA GA-3’ 53 °C 51

(GC)9YR 5’-GCG CGC GCG CGC GCG CGC YR-3’ 55 °C 95

(AC)9RY 5’-ACA CAC ACA CAC ACA CAC RY-3’ 54 °C 50

(GA)9RY 5’-GAG AGA GAG AGA GAG AGA RY-3’ 54 °C 50

(AT)9YR 5’-ATA TAT ATA TAT ATA TAT YR-3’ 36 °C 5

(TG)8RT 5’-TGT GTG TGT GTG TGT GRT-3’ 53 °C 47.2

(AG)8T 5’-AGA GAG AGA GAG AGA GT-3’ 50 °C 47.1

(CT)8RG 5’-CTC TCT CTC TCT CTC TRG-3’ 54 °C 52.8

Y=Primidin, R=Purin, B=C, G veya T H=A, C, veya T

3.9 Agaroz Jel Elektroforezi

PCR ürünlerinin görsel hale getirilmesi amacıyla, amplifiye edilen DNA ürünleri % 1.4’

lük agaroz jelde elektroforetik olarak ayrılmıştır. Agaroz jelin hazırlanmasında ve

elektroforez tankında tampon çözeltisi olarak 1XTAE (40 mM Tris-acetate, 1mM EDTA)

35

tampon çözeltisi kullanılmıştır (Sambrook et al. 1989). Ayrıca tüm çalışmalarda elde edilen

bantların molekül ağırlıklarının belirlenmesinde marker olarak GeneRuler 100 bp DNA

Ladder Plus (MBI Fermentas GmbH, Germany) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi 100 V’

da 2 saat süreyle gerçekleştirilmiştir. İşlem bittikten sonra agaroz jel “ethidium bromide”

(1 mg/ml) ile boyanarak UV ışık altında incelenmiş ve bio-imaj bilgisayar sistemi

(Syngene, Cambridge UK) kullanılarak kaydedilmiştir.

3.10 Verilerin Analizi ve Değerlendirilmesi

Tüm PCR analizleri farklı zamanlarda en az iki kez tekrarlamış ve tekrarlanabilen bantlar

değerlendirmeye alınmıştır. Daha sonra tüm izolatlar için primerler tarafından oluşturulan

bantlar bir araya getirilmiş ve NTSYS ver. 2.02 (Numerical Taxonomy and Multivariate

Analysis) software programına aktarılmıştır (Rohlf 1998). Her primer tarafından

oluşturulan belirli moleküler ağırlığa sahip bantlar 0 (yok) ve 1 (var) olarak kodlanmış ve

rectangular matriks verisi kullanılarak değerlendirilmiştir. Daha sonra SIMQUAL

(Similarity for qualitative data) programı kullanılarak Dice’ ın metoduna (Sij=2a/(2a+b+c))

göre izolatlar arasındaki benzerlik matriksi oluşturulmuştur. Elde edilen benzerlik katsayısı

ve UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) yardımıyla

dendogram oluşturularak izolatlar arasındaki genetik akrabalık değerlendirilmiştir (Sneath

and Sokal 1973). Yapılan cluster analizinin geçerliliği, benzerlik ve kofenetik matriks

değerleri karşılaştırılarak test edilmiştir. İki matriks arasındaki ilişkinin derecesi Mantel

testi kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca RAPD ve ISSR verilerileri kullanılarak oluşturulan

dendogramlar arasındaki farklılığı değerlendirmek için her dendogramdan hesaplanan

kofenetik matriks değerleri Mantel testi kullanılarak analiz edilmiştir.

36

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.1 Türkiye’ deki Nohut Kök Hastalıklarının Durumu ve Patojenisite Testleri

Nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan funguslar arasındaki genetik farklılığı

ve coğrafi dağılımı tespit etmek amacıyla yapılan bu çalışmada Türkiye’deki toplam nohut

ekim alanının yaklaşık % 70’ ni temsil eden 15 farklı ilde survey yapılmıştır. Bu survey

sonucunda 144 adet nohut kök patojeni izole edilmiştir. Klasik yöntemler kullanılarak

yapılan teşhisler sonuncunda bu hastalık etmenlerinin Fusarium oxysporum, F. solani,

F. equiseti, F. semitectum, F. acuminatum, Macrophomina phaseolina, ve Rhizoctonia

solani olduğu tespit edilmiştir. Hastalık etmenlerinin survey yapılan illere göre dağılımı

Çizelge 4.1’ de verilmiştir. Bu çalışma sonucunda nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa

sebep olan en yaygın fungusun % 72 oranında Fusarium oxysporum olduğu ve bunu

F. solani ve Macrophomina phaseolina’ nın takip ettiği görülmüştür.

Türkiye’deki önemli nohut ekim alanlarından elde edilen ve klasik yöntemlerle teşhisi

yapılan 144 izolatın patojenisite testi Nene and Haware (1980)’ nin toprak inokulasyon

metodu esas alınarak hassas nohut çeşitleriyle yapılmıştır. Patojenisite testleri sonucunda

hassas nohut çeşidinin 3.1 - 4.0 skala değeri almasına neden olan 26 izolat virülantı yüksek

(YV), 1.1 - 3.0 skala değerine neden olan 104 izolat orta derecede virülant (OV) ve 0.0 –

1.0 değerine neden olan 14 izolat düşük virülant (DV) veya non patojen olarak

değerlendirilmiştir.

37

Çizelge 4.1 Nohut surveyi yapılan iller, bu illerden elde edilen kök çürüklüğü ve solgunluk etmenleri ve bu etmenlerden elde edilen izolat sayıları

Survey yapılan iller Tespit edilen kök patojenleri

F. o

xysp

oru

m

F. s

ola

ni

F. e

quis

eti

F. s

emit

ectu

m

F. a

cum

inatu

m

M. p

hase

oli

na

R. s

ola

ni

İllere Göre Toplam

Adıyaman 1 1

Amasya 2 2

Ankara 22 4 2 1 1 2 32

Antalya 1 1

Burdur 7 2 2 11

Denizli 14 3 1 2 2 22

Diyarbakır 13 3 1 17

Eskişehir 7 1 8

K. Maraş 17 3 1 21

Kayseri 1 1

Kırşehir 2 1 3

Konya 2 2

Kütahya 4 4

Tokat 3 2 5

Uşak 6 3 1 10

Diğer 4 4

Toplam izolat Sayısı 104 22 4 5 1 6 2 144

Bu izolatların illere göre dağılımı ve virulenslik dereceleri Çizelge 4.2’ de verilmektedir.

38

Çizelge 4.2 Nohutlarda hastalığa sebep olan fungus izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri

İzolat ismia Alındığı il Tür Virulenslik derecesib Adı-1 Adıyaman-Atatürk barajı F. oxysporum YV Ama-1 Amasya F. oxysporum OV Ama-2 Amasya F. oxysporum OV Ank-1 Ankara-Ayaş F. oxysporum OV Ank-3 Ankara-Akyurt F. oxysporum DV Ank-4 Ankara-Akyurt F. oxysporum YV Ank-5 Ankara-Akyurt F. oxysporum OV Ank-6 Ankara-Bala F. oxysporum DV Ank-7 Ankara-Bölüm F. oxysporum OV Ank-8 Ankara-Çubuk F. oxysporum OV Ank-9 Ankara-Çubuk F. oxysporum YV Ank-10 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-11 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-12 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-13 Ankara-Haymana F. oxysporum YV Ank-14 Ankara-Haymana F. oxysporum DV Ank-15 Ankara-Haymana F. oxysporum OV Ank-16 Ankara-Haymana F. oxysporum OV Ank-17 Ankara-Polatlı F. oxysporum OV Ank-18 Ankara-Sünlü çıkışı F. oxysporum OV Ank-19 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-20 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-21 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-22 Ankara F. oxysporum DV Ank-32 Ankara F. oxysporum OV Ank-25 Ankara-Bala F. solani OV Ank-26 Ankara-Bala F. solani OV Ank-27 Ankara-Haymana F. solani OV Ank-28 Ankara-Bölüm F. solani OV Ank-29 Ankara-Haymana F. semitectum OV Ank-30 Ankara-Haymana F. equiseti OV Ank-31 Ankara-Sünlü çıkışı F. equiseti YV Ank-33 Ankara-Güdül R. solani YV Ank-34 Ankara-Çubuk R. solani OV Ank-36 Ankara-Bölüm M. phaseolina OV Ant-1 Antalya F. solani YV

39

Çizelge 4.2 Nohutlarda hastalığa sebep olan fungus izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri (Devam)

Bur-1 Burdur F. oxysporum OV Bur-2 Burdur F. oxysporum OV Bur-3 Burdur F. oxysporum OV Bur-4 Burdur F. oxysporum OV Bur-5 Burdur F. oxysporum OV Bur-6 Burdur F. oxysporum OV Bur-7 Burdur F. oxysporum OV Bur-8 Burdur-Tefenni F. solani OV Bur-9 Burdur-Tefenni F. solani DV Bur-10 Burdur-Bucak F. semitectum YV Bur-11 Burdur F. semitectum YV Dez-1 Denizli-Baklan F. oxysporum YV Dez-2 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-3 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-4 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-5 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-6 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-7 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-8 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-9 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-10 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-11 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-12 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-13 Denizli F. oxysporum OV Dez-14 Denizli F. oxysporum YV Dez-16 Denizli-Çameli F. solani OV Dez-18 Denizli-Serinhisar F. solani OV Dez-19 Denizli-Serinhisar F. solani OV Dez-20 Denizli-Kale F. equiseti OV Dez-21 Denizli-Çameli F. semitectum OV Dez-22 Denizli-Tavas F. semitectum OV Dez-23 Denizli-Tavas M. phaseolina OV Dez-24 Denizli M. phaseolina YV Diyar-1 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum DV Diyar-2 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-3 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum DV Diyar-4 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-5 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-6 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-8 Diyarbakır-Ergani F. oxysporum OV Diyar-9 Diyarbakır-Hazro F. oxysporum YV Diyar-10 Diyarbakır-Silvan F. oxysporum OV

40


Diyar-12 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum OV Diyar-13 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum DV Diyar-15 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum OV Diyar-16 Diyarbakır F. oxysporum OV Diyar-19 Diyarbakır-Çınar F. solani OV Diyar-20 Diyarbakır-Silvan F. solani OV Diyar-21 Diyarbakır-Silvan F. solani OV Diyar-22 Diyarbakır-Silvan M. phaseolina YV Esk-2 Eskişehir-Mihalıççık F. oxysporum OV Esk-3 Eskişehir-Mihalıcçık F. oxysporum YV Esk-4 Eskişehir-Mihalıcçık F. oxysporum OV Esk-5 Eskişehir-Merkez F. oxysporum DV Esk-6 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum OV Esk-7 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum OV Esk-8 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum YV Esk-12 Eskişehir-Sivrihisar F. equiseti DV Km-1 K.Maraş-Afşin F. oxysporum DV Km-2 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-3 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-4 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-6 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-7 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-8 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-9 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-10 K.Maraş-Çardak F. oxysporum YV Km-11 K.Maraş-Çardak F. oxysporum DV Km-13 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-14 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-15 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-16 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum YV Km-17 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-18 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-19 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum YV Km-21 K.Maraş-Afşin F. solani OV Km-23 K.Maraş-Afşin F. solani OV Km-25 K.Maraş-Pazarcık F. solani OV Km-28 K.Maraş-Pazarcık M. phaseolina OV Kay-1 Kayseri M. phaseolina YV

41


Kır-1 Kırşehir F. oxysporum DV Kır-2 Kırşehir F. oxysporum OV Kır-3 Kırşehir F. solani YV Kon-1 Konya F. oxysporum OV Kon-3 Konya F. oxysporum YV Küt-1 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt-2 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt-3 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt 4 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Tok-1 Tokat F. oxysporum OV Tok-2 Tokat F. oxysporum OV Tok-3 Tokat F. oxysporum OV Tok-4 Tokat F. solani OV Tok-5 Tokat F. solani OV Uşk-1 Uşak-Karahallı F. oxysporum YV Uşk-2 Uşak-Sivaslı F. oxysporum OV Uşk-3 Uşak-Merkez F. oxysporum YV Uşk-4 Uşak-Banaz F. oxysporum YV Uşk-5 Uşak-Banaz F. oxysporum OV Uşk-6 Uşak-Sivaslı F. oxysporum OV Uşk-7 Uşak-Merkez F. solani OV Uşk-8 Uşak-Sivaslı F. solani OV Uşk-9 Uşak-Merkez F. solani OV Uşk-11 Uşak-Karahallı F. acuminatum OV Ç.I.beyaz Diğer F. oxysporum OV Ç 12 Diğer F. oxysporum DV Ova1 Diğer F. oxysporum YV Gergen 1 Diğer F. oxysporum OV aİzolatlar toplandıkları illerin isimleri kısaltılarak kodlanmıştır; Adıyaman (Adı), Amasya (Ama), Ankara (Ank), Antalya (Ant), Burdur (Bur), Denizli (Dez), Diyarbakır (Diyar), Eskişehir (Esk), Kahraman Maraş (Km), Kayseri (Kay), Kırşehir (Kır), Konya (Kon), Kütahya (Küt), Tokat (Tok), Uşak (Uşk). bYV: Yüksek virülant, OV: Orta derecede virülant, DV: Düşük virülant Patojenisite testleri sonucunda izolatların sararma, solgunluk, kök çürüklüğü ve tohum

çimlenmesinin engellenmesine neden oldukları görülmüştür (Şekil 4.1).

42

Şekil 4.1 Kök patojenlerinin nohut bitkilerinde sebep olduğu simptomlar (a:sararma, ..b:.solgunluk, c: kök çürüklüğü, d: tohum çimlenmesinin engellenmesi)

43

4.2 Nohut Kök Patojenleri Arasındaki Genetik Farklılığın Moleküler Yöntemlerle

.Tespiti

4.2.1 Ön denemeler

Teşhis edilen fungus izolatlarının moleküler karakterizasyonu için farklı PCR koşullarında

ön denemeler yapılmıştır. Bu amaçla farklı dNTPs, Taq DNA polimeraz ve MgCl2

konsantrasyonlarında ön denemeler yapılmış ve en uygun olan miktarlar belirlenmiştir

(Şekil 4.2).

Ayrıca ISSR analizinde kullanılan primerler için annealing sıcaklıkları ayrı ayrı tespit

edilmiştir (Şekil 4.2). Bu amaçla öncelikli olarak Wallace ((G+C)x4+(A+T)x2=Tm)

formülü kullanılarak Tm (temperature melting) sıcaklıkları belirlenmiştir (Innis and

Gelfand 1990). Ancak bu formülle hesaplanan Tm sıcaklılığının her primer için uygun

olmadığı görülmüş ve bu sebeple her primer için farklı Ta (temperature annealing)

sıcaklıkları denenerek uygun Ta sıcaklıkları tespit edilmiştir (Çizelge 3.3). Fungus

izolatlarının ayırımında kullanılacak primerleri seçmek için ise her fungus türünü temsil

eden belirli sayıda izolat alınarak tüm primerlerle test edilmiştir. Bu primerlerden PCR

amplifikasyonlarında değerlendirilebilir bantlar veren primerler seçilerek diğer örneklerin

test edilmesinde kullanılmıştır. Buna karşın amplifikasyon ürünü oluşturmayan veya zayıf

amplifikasyon ürünü oluşturan primerler ise kullanılmamıştır.

44

Şekil 4.2 Farklı dNTPs (a: mM), MgCl2 (b: mM) ve annealing sıcaklıklarının (c: °C) .Fusarium oxysporum izolatlarının PCR amplifikasyonuna etkisi

c

b

a

45

4.2.2 Moleküler yöntemlerle Fusarium oxysporum izolatları arasındaki genetik

..farklılığın tespit edilmesi

4.2.2.1 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD ile analizi

Nohutlarda solgunluk ve sararma simptomlarına sebep olan Fusarium oxysporum izolatları

arasındaki genetik farklılığı ortaya koymak için elde edilen 104 izolattan coğrafik bölge ve

patojenisiteleri dikkate alınarak seçilen 67 izolat ve referans olarak kullanılan 7 izolat

olmak üzere toplam 74 Fusarium oxysporum izolatı moleküler karakterizasyon için

kullanılmıştır. Bu amaçla yapılan RAPD analizlerinde Operon firmasına ait OPK ve OPA

kitlerine ait 30 primer kullanılmıştır (Çizelge 3.2). Bu primerlerden OPA-6 primeri bu

izolatlar ile herhangi bir polimorfizim oluşturmamıştır. OPA-16, OPA-17, OPK-2, OPK-3

ve OPK-15 primerleri ise değerlendirilebilir bantlar oluşturmadıkları için kullanılmamıştır.

Diğer 24 primer ise F. oxysporum izolatları arasında 0.2 (OPK-7) – 3.2 kb (OPK-10,

OPK-19) arasında değişen büyüklüklerde bantlar oluşturmuştur.

RAPD analizi sonucunda F. oxysporum izolatlarından toplam 205 adet (8.54 fragment /

primer) fragment amplifiye edilmiştir. Bunlardan 200 tanesinin (8.3 polimorfik marker /

primer) F. oxysporum izolatları arasında polimorfik, 5 fragmentin ise monomorfik olduğu

tespit edilmiştir. Elde edilen DNA fragmentlerindeki polimorfizim seviyesi ise % 97.5

olarak bulunmuştur (polimorfik band sayısı / toplam band sayısı x 100). Kullanılan

primerler ile amplifiye edilen fragment sayısı ise 4 (OPK-4, OPK-9, OPK-10) – 13

(OPA-3, OPK-7, OPK-8, OPK-12) arasında değişmiştir. F. oxysporum izolatları arasındaki

intraspesifik farklılıkları araştırmak için OPK-12, OPA-9 ve OPA-4 primerlerinin oldukça

faydalı olduğu görülmüştür (Şekil 4.3). Bu primerler sırasıyla izolatlar arasında polimorfik

olan 13, 10 ve 8 fragmentin amplifiye olmasını sağlamıştır.

46

Şekil 4.3 Fusarium oxysporum izolatlarının a, OPK-12 b, OPA-9 ve c, OPA-4. primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri

47

UPGMA algoritması kullanılarak oluşturulan dendogramda ise farklı genotiplerde yer alan

tüm olası çiftler arasındaki benzerlik katsayısının 0.2 – 0.98 arasında değiştiği görülmüştür.

En yüksek benzerlik oranı Diyar-3 ile Diyar-4 (0.986), Ank-10 ile Ank-11 (0.985) ve

Kon-1 ile Diyar-13 (0.987) izolatları arasında en düşük benzerlik ise Esk-7 ile Dez-8

(0.216) ve Küt-4 ile Km-19 (0.218) izolatları arasında tespit edilmiştir. Dendogramdan

hesaplanan kofenetik matriks değeri ile benzerlik indeksinin karşılaştırılması sonucunda

elde edilen matriks korelasyonu ise oldukça yüksek olup r= 0.961 olarak bulunmuştur.

Oluşturulan bu dendogram ile F. oxysporum izolatları 3 ana gruba ayrılmış ve gerek gruplar

arasında gerekse grup içerisinde yüksek bir polimorfizimin olduğu görülmüştür (Şekil 4.4).

Grup 1 Amasya ili hariç diğer bölgelerden elde edilen toplam 41 izolattan (% 55.4)

oluşmakta olup bu grup içerisindeki benzerlik indeksinin 0.403 (Km-7 ile Diyar-15) - 0.987

(Kon-1 ile Diyar-13) arasında değiştiği görülmüştür. Diyar-6, Diyar-15 ve Küt-4 izolatları

ise bu gruba yüksek oranda benzerlik göstermekle beraber bu grup içerisinde ikinci bir alt

grubu oluşturmuştur. OPA-4 primeri ile bu grubun tüm üyelerinden yaklaşık 1074 bp

büyüklüğünde bir fragment amplifiye edilerek diğer gruplardan ayrılması sağlanmıştır.

Grup 2 Ankara, Amasya, Kütahya, Denizli, K. Maraş ve Diyarbakır illerini temsil eden

izolatlardan oluşmaktadır ve bunlar kendi arasında 4 alt gruba ayrılmıştır. Birinci alt grup

15 izolattan oluşmakta olup bu alt grup içerisindeki benzerlik indeksinin 0.65 (A6 ile Ank-

5) - 0.986 (Diyar-3 ile Diyar-4) arasında değiştiği görülmüştür. Küt-2, Diyar-8 ve Ama-1

izolatları ise bu grup içerisinde kendi başlarına birer alt grubu oluşturmuşlardır. Bu grupta

OPA-9 primeri 700 bp büyüklüğünde bir polimorfik markerı amplifiye etmiştir.

Grup 3 Ankara, Eskişehir, Tokat, Uşak, Burdur, Denizli, K. Maraş illerinden elde edilen 15

izolattan oluşmakta olup kendi içerisinde 4 alt gruba ayrılmıştır. Bu izolatlardan 10 tanesi

birinci grubu oluşturmuş, Kc9 izolatı ise tek başına ikinci grubu oluşturmuştur. Esk-4,

Dez-8 ve Km-19 izolatları ise ortalama 0.79 benzerlik indeksi ile üçüncü alt grubu

oluşturmuşlardır. Ank-13 izolatı ise tek başına dördüncü alt grubu oluşturmuştur.

48

Şekil 4.4 Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi

ile oluşturulan dendogram

Coefficient

0.35 0.51 0.67 0.83 0.99

Tok-1 Km-6 Dez-5 Esk-8 Diyar-16 Dez-1 Dez-13 Km-9 Küt-1 Dez-6 Esk-6 Ank-9 Kon-1 Diyar-13 Ank-7 Dez-3 Ank-21 a4 Adı-1 Esk-3 Km-2 Uşk-5 Ank-6 Kır-1 Km-4 Ank-16 hay5 Esk-5 kc7 Ank-3 Bur-5 Dez-11 Ank-17 Esk-7 Km-7 Dez-4 Bur-3 Ank-20 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Dez-12 Km-14 ka1 Diyar-3 Diyar-4 Ank-4 Km-1 Km-13 Ank-5 kc6 a6 Diyar-9 Küt-2 Diyar-8 Ama-1 Uşk-6 ova-1 gergen Bur-6 Uşk-3 Tok-2 Bur-2 Esk-2 Km-16 Dez-14 kc9 Esk-4 Dez-8 Km-19 Ank-13

Grup 1

Grup 2

Grup 3

49

F. oxysporum içerisinde tespit edilen gruplar içerisinde en fazla benzerlik gösteren grup 3

de ise OPA-9 primeri 1390 bp, OPA-4 primeri ise yaklaşık 1617 bp büyüklüğünde

polimorfik markerlar sağlamıştır. RAPD analizi ile F. oxysporum izolatları üç gruba

ayrılmasına rağmen izolatların bölgelere göre dağılımı ve virulenslik dereceleri ile

dendogramdaki gruplanmaları arasında bir ilişki tespit edilememiştir.

4.2.2.2 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın ISSR ile analizi

ISSR analizinde 5’ veya 3’ modifiye edilmiş, 2 veya 3’ lü microsatellit tekrarları taşıyan 20

primer kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Bu primerlerden (GC)9YR, (AT)9YR, (CT)8RG ve

(CA)8RT primerleri ile herhangi bir polimorfizim elde edilememiş, (GA)8YT primeri ise

temiz bantlar oluşturmadığı için değerlendirme dışı tutulmuştur. Yapılan ISSR analizi

sonucunda 0.26 ((TG)8RT) - 5 ((AG)8YC) kb arasında değişen moleküler büyüklükte

toplam 187 fragment amplifiye edilmiş ve bunlardan % 90.37’ sinin polimorfik olduğu

bulunmuştur. Onsekiz fragmentin ise F. oxysporum izolatları arasında monomorfik olduğu

tespit edilmiştir. Ayrıca primer başına düşen band sayısı 12.46, polimorfik band sayısı ise

11.26 olarak bulunmuştur. ISSR analizinde (GA)8T, (AC)9RY ve (AG)8T primerleri

oldukça faydalı intraspesifik polimorfizim sağlamış ve bu izolatlardan sırasıyla 15 (0.3-3.1

bp), 15 (0.39-4.8 bp), 16 (0.3-3.4 bp) fragment amplifiye edilmiştir (Şekil 4.5).

Elde edilen bu verilerin analizi sonucunda Dice’ın benzerlik indeksinin 0.29 (Ova-1 ile

Ank-5) - 1 (Ova-1, Gergen, ve Uşk-3) arasında değiştiği görülmüştür. Ayrıca Mantel testi

ile hesaplanan orijinal benzerlik matriksi ve kofenetik benzerlik matriksi arasındaki

korelasyon katsayısı ise r=0.985 olarak bulunmuş olup oldukça önemli olarak kabul

edilmiştir. ISSR verisinden SAHN (Sequential agglomerative hierarchical nested cluster

analysis) analizi ile oluşturulan dendogram ile F. oxysporum izolatları yaklaşık % 75

benzerlik oranı ile yine üç farklı gruba ayrılmıştır.

50

Şekil 4.5 Fusarium oxysporum izolatlarının a, (GA)8T b, (AC)9RY ve c, (AG)8T.primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri

51

ISSR analizi sonucunda gruplar içerisinde izolatların yerleşiminde farklılıklar görülmekle

birlikte F. oxysporum izolatları RAPD analizindekine benzer bir dağılım göstermişlerdir.

Bununla birlikte RAPD analizi ile kıyaslandığında gerek gruplar arasındaki gerekse gruplar

içerisindeki benzerlik oranının daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.6).

Grup 1 yine farklı bölgelerden 41 F. oxysporum izolatından oluşmuştur. Diyar–6, Diyar-15

ve Küt-4 izolatları RAPD analizindeki gibi bu grup içerisinde yer almakla beraber ortalama

0.911 benzerlik indeksi ile dendogramın farklı bir dalını oluşturmuşlardır. Grup içerisindeki

benzerlik oranının ise 0.627 (Diyar-6 ile Bur-5) – 0.992 (Dez-1 ile Dez-13) arasında

değiştiği görülmüştür. Bu grupta (AC)9RY primeri 836 bp büyüklüğündeki fragmenti

amplifiye ederek diğer gruplardaki izolatlardan ayrılmalarını sağlamıştır.

Grup 2 ise RAPD analizinde aynı grupta yer alan izolatlardan oluşmuş ancak bu izolatların

grup içerisindeki yerleşiminde farklılıklar görülmüştür. RAPD analizinde alt grup olarak

ayrılan Küt-2, Ama-1 ve Diyar-8 izolatları ISSR analizinde alt gruba ayrılmayıp ana grup

içerisinde yer almışlardır. Ayrıca grup içerisinde 0.791 (Küt-2 ile Ama-1) - 1 (Ank-10 ile

Ank-11) arasında değişen oranlarda benzerlik görülmüştür. Bu grupta ise (AG)8T primeri

1700 bp, (GA)8T primeri 543 bp, (AC)9RY primeri ise 547 ve 1060 bp büyüklüğünde

polimorfik markerlar sağlamıştır.

Grup 3 de yine durum değişmemiş izolatların ağaç içerisindeki yerleşimleri dışında benzer

bir dağılım görülmüştür. RAPD analizinde farklı alt grupları oluşturan KC9 ve Ank-13

biraz farklılık göstermekle beraber alt grup oluşturmadan aynı grup içerisinde yer

almışlardır. Bu grup içerisindeki benzerlik oranı ise 0.748 (Esk-4 ile Km-19) – 1 (Ova-1,

Gergen, ve Uşk-3) olarak tespit edilmiştir. (AG)8T primeri 1045 bp, (GA)8T primeri 1090

bp büyüklüğündeki polimorfik markerlar ile bu grubun diğer gruplardan ayrılmasını

sağlamışlardır. RAPD analizinde olduğu gibi ISSR analizinde de izolatların coğrafi

dağılımı ve virulenslik dereceleri ile dendogramdaki yerleşimleri arasında bir ilişki tespit

edilememiştir.

52

Şekil 4.6 Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen ISSR verisinin UPGMA analizi


Coefficient

0.39 0.55 0.70 0.85 1.00

Tok-1 Küt-1 Km-6 Km-9 Dez-5 Diyar-16 Dez-1 Dez-13 Kon-1 Diyar-13 a4 Ank-21 Kır-1 kc7 Adý-1 Km-2 Km-7 Ank-20 Bur-5 Bur-3 Esk-7 Dez-6 Km-4 Ank-16 Esk-6 Ank-9 Esk-8 Esk-3 Ank-7 Dez-3 Dez-11 Ank-17 Uşk-5 Dez-4 Ank-6 Esk-5 Ank-3 hay5 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Ank-4 Km-1 Ka1 kc6 Dez-12 Diyar-3 Diyar-4 Km-14 a6 Diyar-9 Km-13 Diyar-8 Ama-1 Küt-2 Ank-5 Uşk-6 ova-1 gergen Uşk-3 Esk-2 Bur-6 Km-16 Tok-2 Bur-2 Dez-14 Dez-8 Km-19 Esk-4 kc9 Ank-13

Grup 1

Grup 2

Grup 3

53

4.2.2.3 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD+ISSR ile analizi

RAPD ve ISSR primerlerinin birlikte kullanılarak F. oxysporum izolatları arasındaki

genetik farklılığın ortaya konulmasında toplam 392 (RAPD: 205, ISSR: 187 amplifikasyon

ürünü) fragment değerlendirilmiştir. Yapılan bu analizde primer başına düşen band sayısı

10.05, polimorfik band sayısı ise 9.46 olarak bulunmuştur. Benzerlik oranının 0.282 (Bur-6

ile Ank-5) - 0.992 (Ank-10 ile Ank-11) arasında değiştiği, kofenetik korelasyon

katsayısının ise r=0.983 olduğu tespit edilmiştir. RAPD+ISSR analizi ile oluşturulan

dendogramda F. oxysporum izolatları ayrı ayrı olarak yapılan bireysel analizlerde olduğu

gibi benzer bir dağılım göstermiş ve yaklaşık % 70 benzerlik ile üç gruba ayrılmıştır

(Şekil 4.7).

Grup 1, 0.592 (Diyar-15 ile Km-7) - 0.985 (Kon-1 ile Diyar-13) arasında değişen benzerlik

indeksi ile test edilen F. oxysporum izolatları arasında en büyük grubu oluşturmuştur.

Diyar–6, Diyar-15 ve Küt-4 izolatları RAPD ve ISSR analizindeki gibi bu grup içerisinde

yer almakla beraber ortalama 0.88 benzerlik indeksi ile dendogramın farklı bir dalını

oluşturmuşlardır. Grup 2 de ise Dice’ ın benzerlik katsayısının 0.70 (A6 ile Ama-1) – 0.99

(Ank-10 ile Ank-11) arasında olduğu tespit edilmiştir. Ancak Küt-2, Diyar-8 ve Ama-1

izolatları ISSR analizinden farklı olarak bu grup içerisinde yer almakla beraber RAPD

analizinde olduğu gibi grup içerisinde en fazla farklılık gösteren izolatlar olmuşlardır.

Grup 3 de ise Kc9 ve Ank-13 izolatları bu grup içerisinde en fazla farklılık gösteren

izolatlar olmuştur. Bu grup içerisindeki benzerlik oranının 0.69 (Kc9 ile Km-19) – 0.974

(Gergen–Uşk-3) arasında değiştiği tespit edilmiştir.

54

Şekil 4.7 Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen RAPD+ISSR verilerinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram

Coefficient

0.37 0.53 0.68 0.84 0.99

Tok-1 Km-6 Dez-5 Diyar-16 Küt-1 Dez-1 Dez-13 Km-9 Ank-9 Esk-8 Ank-7 Dez-3 Kon-1 Diyar-13 Ank-21 Kır-1 a4 Esk-3 Kc7 Adı-1 Dez-6 Esk-6 Km-4 Ank-16 Hay5 Km-2 Esk-5 Ank-3 Dez-11 Ank-17 Uşk-5 Ank-6 Dez-4 Km-7 Bur-5 Ank-20 Bur-3 Esk-7 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Ank-4 Km-1 Dez-12 Km-14 Ka1 Diyar-3 Diyar-4 Kc6 Km-13 Ank-5 a6 Diyar-9 Küt-2 Diyar-8 Ama-1 Uşk-6 Ova-1 Gergen Uşk-3 Bur-6 Esk-2 Tok-2 Bur-2 Km-16 Dez-14 Esk-4 Dez-8 Km-19 Kc9 Ank-13

Grup 1

Grup 2

Grup 3

55

4.2.2.4 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin

..karşılaştırılması

Elde edilen bu dendogramlardan hangisinin F. oxysporum izolatları arasındaki genetik

farklılığın ortaya konulmasında daha etkili olduğunu tespit etmek için kofenetik matriks

değerleri MXCOMP algoritma programı kullanılarak Mantel testi ile karşılaştırılmıştır.

Analiz sonucunda her iki yöntemin kofenetik matriks değerleri arasındaki korelasyon

katsayısı r=0.966 olarak bulunmuştur. Bu ise RAPD ve ISSR analizi elde edilen

dendogramlar arasında çok güçlü bir korelasyonun olduğunu göstermektedir. Her 3

dendogramdan elde edilen yüksek korelasyon katsayıları (0.961, 0.985 ve 0.983) RAPD ve

ISSR yöntemlerinin tek başlarına veya birlikte kombine edilerek kullanılmasının

F. oxysporum izolatları içerisindeki genetik varyasyonun ortaya konulmasında faydalı

olacağını göstermektedir.

4.2.3 Moleküler yöntemlerle Fusarium solani izolatları arasındaki genetik farklılığın

tespit edilmesi

4.2.3.1 F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD ile analizi

F. solani, ülkemizde nohutta hastalığa sebep olan Fusarium solgunluk kompleksi içerisinde

ikinci sırayı almıştır. Nohuttan izole edilen 25 F. solani izolatı arasındaki polimorfizimin

belirlenmesi amacıyla 30 RAPD primeri kullanılmıştır (Çizelge 3.2.). Bu primerler 0.2

(OPK-7) - 3.4 (OPK-15) kb arasında değişen büyüklüklerde amplifikasyon ürünleri

oluşturmuştur.

RAPD analizi ile test edilen F. solani izolatlarından 239 tanesi polimorfik, 7 tanesi ise

monomorfik olmak üzere toplam 248 band değerlendirilmiş ve elde edilen bu 248 DNA

fragmentindeki polimorfizim seviyesi ise % 96.3 olarak bulunmuştur. Kullanılan primerler

56

izolatlar arasında polimorfik olan 6 (OPA-18, OPK-9) ile 16 (OPA-19, OPK-16) adet

fragmenti amplifiye etmiştir Primer başına düşen toplam band sayısı 9.9, polimorfik band

sayısı ise 9.56 olarak bulunmuştur. İzolatların ayırımında en iyi sonuçlar OPK-12, OPK-4

ve OPA-9 primerleri ile sağlanmıştır (Şekil 4.8). Elde edilen dendogram ile benzerlik

matriksi arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı r=0.995 olarak bulunmuştur. RAPD

analizi sonucunda F. solani izolatları 2 ana gruba ayrılmış ve gerek gruplar arasında

gerekse grup içinde yüksek bir polimorfizim olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.9).

Grup 1 referans olarak kullanılan izolat ile birlikte Ankara, Uşak , Denizli ve Antalya’ dan

elde edilen 11 izolatı içermektedir. Hay 6 izolatı bu grup içerisinde yer almakla beraber

grup içerisinde en fazla polimorfizim gösteren izolat olmuştur. Bu grup içerisindeki

benzerlik oranı ise % 50-97 arasında değişmiştir. OPK-12 primeri ile yapılan amplifikasyon

sonucunda bu gruptaki tüm izolatlardan 1400 bp büyüklüğünde bir fragment elde

edilmiştir. Ayrıca OPA-9 primeri ile 1390 bp, OPK-4 primeri ile 460 bp büyüklüğünde elde

edilen fragmentler bu grup içerisinde yer alan F. solani izolatlarının diğer gruptan

ayrılmasını sağlamıştır.

Grup 2 ise 9 ilden (Ankara, Uşak, Denizli, Antalya, Burdur, Kırşehir, Tokat, Diyarbakır ve

Kahraman Maraş) elde edilen toplam 15 izolattan oluşmuştur. Grup 2 içerisindeki benzerlik

oranı (% 64-98) grup 1’ e (%50-97) göre nispeten daha yüksek olarak bulunmuş ve en

yüksek benzerlik oranının da Km-25 ile Diyar-21 izolatları arasında olduğu tespit

edilmiştir. Güney Doğu Anadolu ve Karadeniz bölgelerinden elde edilen 5 izolat grup 1

içerisinde yer almamıştır. Bu grupta ise OPK-12 primeri 1340 bp büyüklüğündeki fragment

ile bu grup üyelerinin grup 1 izolatlarından ayrılmasını sağlamıştır.

57

Şekil 4.8 Fusarium solani izolatlarının a, OPK-12 b, OPA-9 ve c, OPK-4 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri

58

Şekil 4.9 Fusarium solani izolatlarından elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram

Coefficient

0.23 0.42 0.61 0.80 0.98

Ref-1

dez-16

dez-18

ka4

ant-1

ank-26

ank-25

usk-7

ka8

usk-8

hay6

dez-19

usk-9

bur-9

bur-8

kır-3

tok-4

km-23

km-25

diyar-21

diyar-20

km-21

tok-5

diyar-19

ank-27

ank-28

Grup 1

Grup 2

59

4.2.3.2 F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın ISSR ile analizi

ISSR analizinde kullanılan 20 primer (Çizelge 3.3) ile patojen kombinasyonuna bağlı

olarak F. solani izolatlarından toplam 137 fragment amplifiye edilmiş ve bunlardan 124

tanesinin izolatlar arasında polimorfizim sağladığı tespit edilmiştir. Bunun yanısıra

kullanılan primerler ile elde edilen polimorfizimin seviyesinin % 90.5 olduğu ve her primer

başına düşen band sayısının 9.1, polimorfik marker sayısının ise 8.26 olduğu görülmüştür.

Test edilen primer ile F. solani izolatlarından 4 ((AC)8YA) - 18 ((GA)8C) arasında değişen

sayılarda band elde edilmiştir. Elde edilen bu amplifikasyon ürünlerinin moleküler

ağırlıklarının ise 0.34 ((AG)8YC) - 4.6 ((AC)8YA) kb arasında değiştiği tespit edilmiştir.

İzolatlar arasındaki Dice’ ın benzerlik katsayısı 0.31 - 0.98, kofenetik korelasyon katsayısı

ise r=0.992 olarak bulunmuştur. (AG)8G, (GA)8C ve (AC)8YA primerleri F. solani

izolatları arasındaki intraspesifik varyasyonun ortaya konulması için oldukça faydalı

bilgiler sağlamışlardır (Şekil 4.10).

F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın ISSR analizi ile test edilmesi sonucunda

RAPD analizi ile elde edilen dağılıma benzer bir dağılım elde edilmiştir (Şekil 4.11).

RAPD analizinde olduğu gibi F. solani izolatları iki farklı gruba ayrılmıştır. Ancak RAPD

analizi ile kıyaslandığında bu gruplar içerisinde izolatların dağılımında ve benzerlik

oranında (% 75) farklılıklar olduğu görülmüştür.

Grup 1 RAPD analizindeki gibi yine aynı bölgelerden elde edilen 10 izolat ve 1 referans

olmak üzere 11 izolattan oluşmuştur ve benzerlik oranı 0.69 - 0.98 dir. Bu grup içerisinde

yer alan izolatlar arasında en fazla benzerlik oranı Ank-26 ve Ank-25 izolatları (0.983)

arasında farklılık ise Uşk-8 ve Hay-6 izolatları arasında (0.741) görülmüştür.

60

Şekil 4.10 Fusarium solani izolatlarının a, (AG)8G b, (GA)8C ve c, (AC)8YA primerleri ..ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri

61

Şekil 4.11 Fusarium solani izolatlarından elde edilen ISSR verisinin UPGMA analizi


Coefficient

0.38 0.53 0.68 0.83 0.98

Ref-1

dez-18

ka4

ant-1

usk-8

ank-26

ank-25

ka8

usk-7

hay6

dez-16

dez-19

usk-9

bur-8

bur-9

diyar-19

tok-5

km-21

kır-3

tok-4

km-23

km-25

diyar-20

diyar-21

ank-27

ank-28

Grup 1

Grup 2

62

RAPD analizi ile kıyaslandığında bu grup içerisindeki dağılımda en fazla farklılığın Uşk-8

ve Dez–16 izolatları arasında olduğu görülmüştür. Bu grup için (AG)8G primeri 1200 bp,

(AC)8YA primeri 1945 bp, (GA)8C primeri ise 1074 bp büyüklüğünde polimorfik

markerlar sağlamıştır.

Grup 2 içerisinde yer alan izolatlar arasındaki benzerlik katsayısının 0.75 (Dez-19 ile

Ank-28) - 0.98 (Km-25 ve Diyar-20) arasında değiştiği tespit edilmiştir. Bu grup

içerisindeki yerleşimde en fazla farklılığın ise Diyar-19, Tok-5 ve Km-21 izolatlarında

olduğu görülmüştür. Genel olarak RAPD analizi ile kıyaslandığında ISSR analizinde gerek

gruplar arasında gerekse gruplar içerisinde daha yüksek benzerlik olduğu ve izolatların

bölgelere göre gruplanmalarının aynı olduğu tespit edilmiştir. RAPD analizinde olduğu gibi

Güney Doğu Anadolu ve Karadeniz bölgelerinden elde edilen izolatlar sadece grup 2

içerisinde yer almıştır. (AG)8G primeri 1080 bp, (AC)8YA primeri 890 bp, (GA)8C primeri

ise 1480 ve 1270 bp büyüklüğünde spesifik fragmentleri amplifiye ederek grup 2’ nin diğer

gruptan ayrılmasını sağlamışlardır.

4.2.3.3 F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD+ISSR ile analizi

F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın ortaya konulmasında hangi marker

sisteminin uygun olduğuna karar vermek için RAPD (248 amplifikasyon ürünü) ve ISSR

(137 amplifikasyon ürünü) verisi birlikte değerlendirilerek bir dendogram oluşturulmuştur

(Şekil 4.12). Oluşturulan bu dendogramın farklı marker sistemleri kullanılarak elde edilen

bireysel dendogramlar ile karşılaştırıldığında gruplar içerisinde izolatların yerleşiminde

görülen birkaç istisna ile F. solani izolatları arasında benzer bir gruplandırma sağladığı

görülmüştür. Her primer başına düşen bant sayısı 12.8, polimorfik band sayısı ise 10.37

olarak bulunmuştur. İzolatlar arasındaki benzerlik katsayısının 0.26 - 0.97 arasında

değiştiği, kofenetik korelasyon katsayısının ise 0.996 olduğu tespit edilmiştir. Her üç

yöntemde de primer başına düşen polimorfik marker sayısı yüksek oranda benzerlik

göstermektedir.

63

Şekil 4.12 Fusarium solani izolatlarından elde edilen RAPD+ISSR verilerinin UPGMA

analizi ile oluşturulan dendogram

Coefficient

0.30 0.47 0.64 0.81 0.98

Ref-1

dez-16

dez-18

ka4

ant-1

usk-8

ank-26

ank-25

usk-7

ka8

hay6

dez-19

usk-9

bur-9

bur-8

kır-3

tok-4

km-23

km-21

tok-5

km-25

diyar-20

diyar-21

diyar-19

ank-27

ank-28

Grup 1

Grup 2

64



RAPD ve ISSR analizi ile elde edilen dendogramlar arasındaki farklılığı değerlendirmek

için her bir dendograma ait kofenetik matriks değerleri Mantel testi kullanılarak

karşılaştırılmıştır. Buna göre RAPD ve ISSR yöntemlerine ait kofenetik matriks değerleri

arasındaki korelasyon r=0.992 olarak bulunmuştur. Mantel testleri sonucunda elde edilen

bireysel korelasyon katsayılarıda (0.995, 0.992, 0.996) birbirlerine yüksek oranda benzerlik

göstermektedir. Bu ise F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığı değerlendirmek için

her iki yönteminde oldukça etkili olduğunu ve kullanılabileceğini göstermektedir.

4.2.4 Moleküler yöntemlerle farklı kök patojenleri arasındaki genetik farklılığın tespit

edilmesi

4.2.4.1 Nohut kök patojenleri arasındaki ilişkinin RAPD analizi ile incelenmesi

Nohutlarda hastalığa sebep olan kök patojenleri arasındaki intra ve inter spesifik

polimorfizimlerin tespit edilmesi amacıyla gerçekleştirilen bu çalışmada hastalıklı nohut

bitkilerinden yapılan izolasyonlar sonucunda elde edilen 5 Fusarium türü, 2 farklı fungus

türü ile farklı araştırıcılardan temin edilen 7 farklı fungus türüne ait toplam 95 izolat

kullanılmıştır (Çizelge 3.1 ve 4.2). Nüklear DNA’ ın amplifikasyonu sonucunda test edilen

tüm primerler kök patojenleri arasındaki genetik varyasyonu ortaya koyan polimorfik

markerlar sağlamıştır. Bu farklı fungus türleri ile yapılan RAPD analizi sonucunda tüm

fungus türleri kesin olarak birbirlerinden ayırt edilebilmiştir. Ayrıca morfolojik kriterler

kullanılarak kesin teşhisi yapılamayan fungus izolatları RAPD analizi ile gruplandırılmıştır.

Nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan fungus izolatları arasındaki inter ve

intra spesifik farklılıkların RAPD analizi ile değerlendirilmesinde toplam 402 fragment

65

değerlendirilmiş ve genelde aynı tür içerisinde yer alan izolatlar benzer amplifikasyon

ürünleri göstermiştir. Test edilen primerler ile bu kök patojenlerinden 0.2 (OPA-4, OPK-7,

OPA-9) – 3.6 (OPA-9) kb arasında değişen büyüklüklerde 1-8 fragment amplifiye

edilmiştir. Bu izolatların OPK-7, OPK-19 ve OPA-18 primerleri ile oluşturdukları

amplifikasyon ürünleri Şekil 4.13’ de verilmiştir. RAPD analizi ile elde edilen benzerlik

indeksi ile cluster analizi arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı ise r=0.981 olarak

bulunmuştur

Diğer çalışmalarda olduğu gibi bu çalışmada da RAPD analizi ile farklı fungus cins ve

türleri arasında yüksek bir genetik varyasyon tespit edilmiştir. UPGMA cluster analizi ile

elde edilen dendogramın ilk dalını oluşturan F. semitectum izolatları arasında ortalama 0.84

oranında bir benzerlik olduğu görülmüştür (Şekil 4.14). Bu izolatlar ile morfolojik

özellikler bakımından poliblastik konidi verici hücrelerin bulunup bulunmamasıyla ayrılan

F. equiseti izolatları arasındaki benzerlik oranı 0.233 olarak tespit edilmiştir. F. semitectum

ile F. oxysporum izolatları arasındaki benzerlik oranın ise 0.247 olduğu görülmüştür.

Denemede kullanılan F. oxysporum izolatları bireysel analizdeki gibi üç farklı gruba

ayrılmıştır. Morfolojik olarak kesin teşhisi yapılamayan Kon-3 izolatının birinci grupta yer

alan F. oxysporum izolatları ile birlikte dallanma gösterdiği belirlenmiştir. Cylindrocarpon

olmasından şüphelenilen Ank-32 izolatının ise Grup 2’ de yer alan F. oxysporum izolatları

ile birlikte gruplandığı ve bu izolat ile C. tonkinense arasındaki benzerlik oranın 0.269

olduğu tespit edilmiştir. F. sambucinum olmasından şüphe edilen KA2 izolatının ise

referans olarak kullanılan F. sambucinum (Ref-6) izolatından (0.272 benzerlik oranı) farklı

olarak F. oxysporum izolatları ile birlikte Grup 3 içerisinde yer aldığı, ayrıca teşhisi şüpheli

olan Km-11 izolatının ortalama 0.724 benzerlik oranı ile bu grup içerisindeki izolatlar ile

birlikte gruplandığı görülmüştür. Morfolojik kriterlere göre F. subglutinans olmasından

şüphe edilen Tok-3 izolatının ise dendogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte

gruplandığı ve Ref-7 (F. subglutinans) izolatı ile arasındaki benzerlik oranının 0.184

olduğu yine bu çalışma ile tespit edilmiştir.

66

Şekil 4.13 Farklı kök patojenlerinin a, OPK-7 b, OPK-19 ve c, OPA-18 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri

1- Marker, 2-6 Fusarium semitectum, 7-13 F. equiseti, 14- Cylindrocarpon tonkinense, 15-16 F. acuminatum, 17-19 F. moniliforme, 20-21 F. solani, 22-29 F. oxysporum, 30- F. sambucinum, 31-F. subglutinans, 32-37 Macrophomina phaseolina, 38-39 Rhizoctonia solani, 40- negatif kontrol

67

Şekil 4.14 Onbir farklı fungus türüne ait RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan

dendogram

Coefficient

0.10 0.32 0.54 0.76 0.98

Bur-11 Ank-29 Bur-10 Dez-22 Dez-21 Kon-3 Dez-14 Gergen Bur-6 Uşk-3 Esk-2 Km-27 Uşk-6 Ova-1 Ank-13 Esk-4 Dez-8 Km-19 Ank-32 Km-9 Km-6 Diyar-16 Dez-5 Esk-8 Küt1 Esk-6 Tok-1 Kir-1 Dez-6 Ank-21 Ank-9 Kon-1 Diyar-13 Km-4 Esk-5 Km-2 Dez-11 Ank-3 Bur-5 Diyar-6 Ank-17 Km-7 Km-11 Ka2 Ank-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Dez-12 Km-14 Km-13 Ank-5 Küt-2 Tok-3 Ref-6 Ref-7 Ank-30 Ank-35 Ref-5 Dez-20 Esk-12 Ank-31 Ref-4 Ank-39 Ref-1 Dez-16 Dez-18 Ka4 Ant-1 Usk-8 Ank-26 Ka8 Hay6 Dez-19 Km-25 Diyar-20 Km-21 Usk-9 Kır-3 Km-23 Ank-27 Ank-28 Ref-3 Ank-37 Ref-2 Ank-38 Usk-11 Diyar-22 Dez-24 Dez-23 Km-28 Ank-36 Kay-1 Ank-34 Ank-33

F. semitectum

F. oxysporum

F. sambucinum

F. subglutinans

F. equiseti

C. tonkinense

F. solani

F. moniliforme

F. acuminatum

M. phaseolina

R. solani

68

Referans olarak kullanılan F. subglutinans (Ref-7) ve F. sambucinum (Ref-6) izolatları

aralarındaki 0.298 benzerlik oranı ile tek başlarına ayrı olarak dallanma göstermişlerdir.

Test edilen F. equiseti izolatları arasında ise Ref-4 izolatı hariç 0.671 oranında bir benzerlik

görülmüştür. Referans olarak kullanılan Ref-5 izolatı ile nohuttan elde edilen F. equiseti

izolatları arasında 0.657 oranında benzerlik var iken bu oran Ref-4 izolatında 0.271 olarak

tespit edilmiştir. Bu sebeple Ref-4 izolatı bu grup içerisinde ayrı bir alt grup olarak

sınıflandırılmıştır. Ayrıca spor verici yapının tam olarak belirlenememesi sebebiyle

F. semitectum olmasından şüphe edilen Ank-31 izolatının bu grup içerisindeki izolatlar ile

dağılım gösterdiği tespit edilmiştir.

Cylindrocarpon tonkinense (Ank-39) izolatı ise dendogramda (0.178) diğer nohut kök

patojenlerinden ayrı bir grup içinde yer almıştır. F. solani izolatları da bireysel analizdeki

gibi iki farklı gruba ayrılmıştır. Dendogramda diğer izolatlardan ayrı bir dağılma gösteren

F. moniliforme izolatlarında, F. equiseti izolatlarındakine benzer bir durum ile

karşılaşılmıştır. Bonn Üniversitesinden temin edilen Ref-2 izolatı bu grup içerisinde ayrı bir

alt grubu oluşturmuştur. Ank-37 izolatı ile Ref-3 izolatı arasında 0.80 oranında bir

benzerlik varken bu oran Ref-2 izolatında 0.288 olarak tespit edilmiştir. F. acuminatum ve

R. solani izolatlarının genetik yapısının ise oldukça homojen olduğu görülmüştür. Uşk-11

ve Ank-38 (F. acuminatum) izolatları arasında 0.854 oranında benzerlik varken bu oran

R. solani izolatlarında 0.791 olarak bulunmuştur. Kültürdeki gelişim renkleri ile birbirinden

ayrılan F. acuminatum ve F. equiseti izolatları arasında ise 0.145 oranında benzerlik olduğu

görülmüştür. Bu oran M. phaseolina izolatları arasında 0.757 olarak tespit edilmiştir.

4.2.4.2 Nohut kök patojenleri arasındaki ilişkinin ISSR analizi ile incelenmesi

Nohut kök patojenlerinin ISSR yöntemiyle incelenmesinde RAPD analizindekine benzer

sonuçlar elde edilmiştir. Primer-patojen kombinasyonuna bağlı olarak test edilen tüm

primerler bireyler veya gruplar arasındaki polimorfizimi gösteren 383 fragmenti amplifiye

etmiştir. Bu amplifikasyonlar sonucunda tüm izolatlardan 0.18 ((GA)9RY))-4.6 ((AC)8YA))

69

kb arasında değişen büyüklüklerde 1-9 band elde edilmiştir. Bu izolatların (GA)8T, (AG)8G

ve (AC)8T primerleri ile oluşturdukları amplifikasyon ürünleri Şekil 4.15’ de verilmiştir.

ISSR verisi ile yapılan cluster analizi sonucunda tüm patojenler birbirlerinden ayrı olarak

gruplandırılmış, kofenetik korelasyon katsayısı ise r=0.985 olarak bulunmuştur

Yine bu çalışmada da bazı fungus izolatları ile referans izolatlar arasındaki benzerlik

oranının oldukça düşük olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte F. semitectum,

F. acuminatum ve R. solani izolatlarındaki genetik yapının oldukça konservatif olduğu

görülmüştür. F. semitectum izolatları arasındaki genetik benzerlik 0.936 olarak tespit

edilmiştir. F. semitectum ile morfolojik özellikler bakımından oldukça benzer olan

F. equiseti izolatları arasındaki benzerlik oranı ise 0.244 dür (Şekil 4.16). Bireysel olarak

yapılan analizlerdeki gibi F. oxysporum izolatları üç farklı grupta F. solani izolatları ise iki

farklı grupta yer almışlardır. Ayrıca RAPD analizindeki gibi morfolojik olarak kesin teşhisi

yapılamayan Kon-3, Ank-32, Km-11, Tok-3 izolatlarının ve F. sambucinum olarak teşhis

edilen KA2 izolatının dendogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte gruplandığı tespit

edilmiştir. Cylindrocarpon tonkinense izolatı ise dendogramda diğer fungus izolatlarından

ayrılmış ve F. oxysporum izolatları ile 0.282 oranında benzerlik göstermiştir.

F. moniliforme’ nin Ank-37 ile Ref-3 izolatları arasındaki benzerlik oranı 0.698 olarak

tespit edilirken diğer Ref-2 izolatı arasındaki benzerlik oranı 0.256 olarak bulunmuştur.

F. moniliforme ve F. equiseti izolatları arasında ise 0.206 oranında benzerlik olduğu

gözlenmiştir. F. subglutinans ve F. sambucinum referansları ortalama 0.192 benzerlik oranı

ile dendogramda tek başlarına ayrı olarak dallanma göstermişlerdir. F. equiseti izolatları

arasındaki benzerlik oranı ise 0.762 olarak bulunmuştur. Ref-4 izolatı bu grupta yer almakla

beraber RAPD analizindeki gibi oldukça farklı olduğu görülmüştür (0.418). Ank-31 izolatı

da yine bu grup içerisinde yer almıştır. Aralarında 0.913 oranında benzerlik olan

F. acuminatum izolatları (Ank-38 ile Uşk-11) dendogramda ayrı bir grup oluşturmuşlardır.

Dendogramın ayrı gruplarını oluşturan M. phaseolina izolatları arasındaki benzerlik oranı

0.764, R. solani izolatları arasında ise 0.891 olarak bulunmuştur. Bu çalışmada da izolatlar

arasında görülen benzerlik oranının RAPD analizi ile kıyaslandığında daha yüksek olduğu

gözlemlenmiştir.

70

Şekil 4.15 Farklı kök patojenlerinin a, (GA)8T b, (AG)8G ve c, (AC)8T primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri

1-Marker, 2-6 Fusarium semitectum, 7-13 F. equiseti, 14- Cylindrocarpon tonkinense, 15-16 F. acuminatum, 17-19 F. moniliforme, 20-21 F. solani, 22-29 F. oxysporum, 30- F. sambucinum, 31-F. subglutinans, 32-37 Macrophomina phaseolina, 38-39 Rhizoctonia solani, 40- negatif kontrol

71

Şekil 4.16 Onbir farklı fungus türüne ait ISSR verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan

dendogram

Coefficient

0.15 0.36 0.57 0.79 1.00

Bur-11 Ank-29 Bur-10 Dez-21 Dez-22 Kon-3 Dez-14 Km-27 Ova-1 Gergen Uşk-3 Esk-2 Bur-6 Dez-8 Km-19 Uşk-6 Esk-4 Ank-13 Ank-32 Km-9 Küt1 Tok-1 Km-6 Diyar-16 Dez-5 Kir-1 Ank-9 Esk-8 Ank-21 Kon-1 Diyar-13 Dez-6 Km-4 Esk-6 Km-2 Km-7 Esk-5 Ank-3 Dez-11 Ank-17 Bur-5 Diyar-6 Km-11 Ank-4 Ank-11 Ank-12 Km-13 Dez-12 Km-14 Ka2 Ank-10 Küt-2 Ank-5 Tok-3 Ank-39 Ref-3 Ank-37 Ref-2 Ref-7 Ref-6 Ank-30 Dez-20 Ank-31 Esk-12 Ank-35 Ref-5 Ref-4 Ref-1 Dez-16 Dez-18 Ka4 Usk-8 Ank-26 Ka8 Hay6 Ant-1 Dez-19 Usk-9 Km-21 Kır-3 Km-23 Km-25 Diyar-20 Ank-27 Ank-28 Ank-38 Usk-11 Diyar-22 Dez-24 Kay-1 Dez-23 Km-28 Ank-36 Ank-34 Ank-33

F. semitectum

F. oxysporum

C. tonkinense

F. moniliforme

F. subglutinans

F. sambucinum

F. equiseti

F. solani

F. acuminatum

M. phaseolina

R. solani

72



RAPD ve ISSR analizi ile elde edilen dendogramların kök patojenlerinin ayırımındaki

etkinliklerini değerlendirmek için daha önce olduğu gibi dendogramdan hesaplanan

kofenetik matriks değerleri MXCOMP algoritma programı kullanılarak Mantel testi ile

karşılaştırılmıştır. Analiz sonucunda her iki yöntemin kofenetik matriks değerleri (0.985 -

0.981) arasındaki korelasyon katsayısı r=0.98 olarak bulunmuştur. Bu ise kök

patojenlerinin ayırımında RAPD ve ISSR analizlerinden elde edilen dendogramlar arasında

çok güçlü bir korelasyonun olduğunu göstermektedir (Şekil 4.17).

Şekil 4.17 Onbir farklı fungus türünün RAPD ve ISSR analizlerine ait kofenetik matriks değerleri arasındaki korelasyon eğrisi (r=0.98)

73

5. TARTIŞMA ve SONUÇ

Bitkilerde kök çürüklüğü ve solgunluk gibi belirtilere neden olan kök patojenlerinin

epidemiyolojisi oldukça karmaşık olup inokulum yoğunluğu, patotip, bitki yaşı, konukçu

dayanıklılığı ve genetik potansiyeli, sıcaklık, nem ve besin maddesi gibi çevre koşulları bu

patojenlerin gelişimini etkileyebilmektedir (Haware et al. 1990). Özellikle Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris, F. solani f. sp. pisi, Pythium ultimum ve Thielaviopsis basicola’

nın neden olduğu hastalık şiddetinin toprak sıcaklığı ve inokulum yoğunluğu ile orantılı

olarak değiştiği bilinmektedir (Bhatti and Kraft 1992). Ayrıca Fusarium oxysporum f. sp.

ciceris’ in sebep olduğu hastalık şiddetinin düşük toprak pH’ sında ve 25 °C’ de arttığı

tespit edilmiştir (Gupta et al. 1987). Survey çalışmaları sonucunda Fusarium oxysporum,

F. solani, F. equiseti, F. acuminatum, F. semitectum, M. phaseolina ve R. solani

nohutlarda hastalığa sebep olan etmenler olarak saptanmışlardır. Ülkemizde nohutlarda

görülen en yaygın kök patojeninin ise Fusarium oxysporum olduğu ve bunu F. solani ve

M. phaseolina’ nın takip ettiği yine bu çalışma ile tespit edilmiştir. Bu sonuç, Ankara

bölgesinde nohutlarda görülen en yaygın solgunluk ve kök patojenlerinin sırasıyla

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve F. solani olduğunu bildiren Dolar (1996) sonuçlarıyla

uyumludur. Ülkemizde 25 farklı ilden temin edilen 140 tohum örneğini inceleyen Maden

(1987) nohut ekim alanlarının yaklaşık olarak % 50’ sinin bu etmenle bulaşık olduğunu ve

önemli ürün kayıplarına neden olduğunu bildirmiştir. Yapılan patojenisite testlerinde

Fusarium oxysporum izolatlarının virulensliklerinin oldukça değişken olduğu bununla

birlikte M. phaseolina ve R. solani izolatlarının virulensliklerinin nohut tarlalarında en

fazla tespit edilen fungus türleri olan Fusarium oxysporum ve F. solani’ den daha yüksek

olduğu görülmüştür. Demirci vd. (1999) tohum üretim tarlalarında solgunluk ve kök

çürüklüğü simptomları gösteren 175 adet Aziziye-94 bitkisinden yapılan izolasyonlar

sonucunda Fusarium solani f. sp. pisi (% 50.3), Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

(% 38.3), Macrophomina phaseolina (% 5.7), Rhizoctonia solani (% 3.4), F. acuminatum,

F. equiseti ve F. avenaceum izolatlarını elde etmişlerdir. Ayrıca bu nohut çeşidinde

Fusarium solani f. sp. pisi ve Rhizoctonia solani’ nin diğer etmenlerden daha yüksek bir

virulenslik potansiyeline sahip olduğunu bildirmişlerdir. Abou- Zeid and Hallila (2003)

74

Mısır’ ın farklı bölgelerindeki nohut ekim alanlarında F. solani’ nin sebep olduğu siyah

kök çürüklüğünün Fusarium solgunluğuna göre daha yaygın ve ciddi olduğunu tespit

etmişlerdir. Bununla birlikte nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa neden olan Pythium,

Phytophthora spp., Verticillium sp. gibi kök patojenleri ülkemizde 2001-2002 yıllarında

survey yapılan 15 ildeki nohut ekim alanlarında tespit edilememiştir. Bunun survey yapılan

dönemdeki iklim koşullarının bu hastalıkların gelişimi için elverişli olmaması veya örnek

alma döneminin uygun olmamasından dolayı kaynaklanmış olabileceği düşünülmüştür.

Bitkilerde hastalığa sebep olan funguslar arasındaki genetik ilişkinin incelenmesi ve

hastalıktan esas sorumlu olan fungus türlerinin yakın olarak ilişkili fungus türlerinden ve

non patojenlerden ayrılmasını sağlayan genetik markerların belirlenmesinin hastalık

etmenlerinin teşhisinde büyük öneme sahip olacağı bilinmektedir. Bu nedenle farklı

organizmalardaki genetik farklılıkları ortaya koymak amacıyla birçok teknik geliştirilmiştir.

Organizmaların genetik yapılarındaki farklılıkları ortaya koyan bu polimorfizimler ise

organizmaların biyolojik aktiviteleri ve patojenisitelerindeki farklılıkları ortaya

koyabilmektedir (Hernandez et al. 1999).

Günümüzde genetik farklılıkların araştırılmasında ve genom araştırmalarında pek çok DNA

markerı kullanılmaktadır. Bunlar içerisinde PCR’ a dayalı olan ve en yaygın olarak

kullanılan marker sistemleri ise RAPD, AFLP, SSRs, Microsatellitlerdir. Ancak bu

metotlardan bazılarının düşük polimorfizim vermesi, yüksek maliyeti, enzim kesimi ve

ligasyon gibi zaman alıcı yöntemleri içermesi ve spesifik primer geliştirilmesinde sekans

bilgisine ihtiyaç duyulması bu yöntemlerin kullanılabilirliğini sınırlandırmaktadır. Bununla

birlikte RAPD gibi hızlı ve kolay olmasına rağmen tekrarlanabilirlik problemi olan

yöntemlerde DNA ektraksiyonunun oldukça önemli olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada iki

farklı DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılmış ve RAPD analizlerinin tekrarlanabilirliği

açısından kullanılan DNA ekstraksiyon yönteminin oldukça önemli olduğu görülmüştür.

Özellikle Macrophomina ve Rhizoctonia gibi spor vermeyen, koyu renkli funguslardan

DNA ekstraksiyonunda CTAB metodunun daha etkili olduğu tespit edilmiştir. ISSR

75

analizinde ise elde edilen polimorfizimlerin kalitesinin ve tekrarlanabilirliğinin primerlerin

G+C içeriği, annealing sıcaklığı ve incelenen genomda bulunma sıklığı ile yakından ilişkili

olduğu bilinmektedir (Kumar et al. 2001, Zhou et al. 2001). Bu çalışmada da temiz ve

tekrarlanabilir bantlar elde etmek için kullanılan annealing sıcaklığının oldukça önemli

olduğu ve her primer için ayrı ayrı belirlenmesinin gerektiği görülmüştür. Benzer şekilde

Bornet and Branchard (2001), ISSR primerleri için annealing sıcaklılığının primere özgü

olduğunu, Wallace formülü ile hesaplanan annealing sıcaklığından daha yüksek bir

sıcaklığın kullanılması gerektiğini bildirmişlerdir. Bununla birlikte primerlerin G+C

içeriğine bağlı olarak yüksek annealing sıcaklıklarının kullanılmasına imkan veren ISSR

analizinde elde edilen bantların tekrarlanabilirliğinin RAPD analizindeki kadar önemli

olmadığı görülmüştür. ISRR analizinde bazı primerler ((GC)9YR, (AT)9YR, (CT)8RG ve

(CA)8RT)) ile herhangi bir amplifikasyon ürününün oluşmaması ise bu microsatellite

primerlere komplementar bölgelerin fungus genomunda diğer eukaryot genomlarına göre

daha az sıklıkta bulunmasından kaynaklandığı ileri sürülmektedir (Meyer et al. 1992,

Longato and Bonfante 1997).

Moleküler markerların patojen populasyonlarındaki genetik farklılığın araştırılmasında

faydalı olduğu ve dayanıklı çeşitlerin geliştirilebilmesi için patojen varyasyonunun

değerlendirilebilmesini sağladığı bilinmektedir. Bu amaçla gen ekspressiyonuna bağlı

olmamalarından dolayı dejenere olmuş, spor vermeyen mutantların teşhisine olanak

sağlayan ISSR ve RAPD tekniği, patojen populasyonlarındaki genetik polimorfizimi ortaya

koymak, konukçu spesifitesi ve coğrafik dağılımı incelemek için değişik araştırıcılar

tarafından farklı organizmalarda başarıyla uygulanmıştır (Fernandez et al. 1997, Migheli et

al. 1998, Grunig et al. 2001, Jana et al. 2003, Mishra et al. 2004, Rodrigues et al. 2004).

Bu çalışmada ülkemizdeki önemli nohut ekim alanlarında görülen kök patojenleri

arasındaki genetik farklılığın değerlendirilmesi için bu iki farklı moleküler metot

kullanılmıştır. Her iki metotta da izolatların grup içerisindeki yerleşimlerinde görülen

farklılıklar ile beraber benzer bir gruplanmanın gerçekleştiği görülmüştür.

76

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ülkemizde ve dünyadaki nohut ekim alanlarında görülen

önemli bir hastalıktır. Nohutun en önemli kök patojeni olarak kabul edilen F. oxysporum

izolatları bu çalışma ile üç farklı gruba ayrılmış ve incelenen primerlerden bazılarının bu

izolat populasyonlarındaki genetik varyasyonun ortaya konulması için oldukça faydalı

bilgiler sağladığı görülmüştür. RAPD analizi ile gerek gruplar arasında gerekse gruplar

içerisinde yüksek bir polimorfizim olduğu tespit edilmiş ve ISSR analizindeki gibi

F. oxysporum izolatları arasında benzer bir dağılım görülmüştür. Bu yöntemler ile elde

edilen dendogramların benzerlikleri ve her iki yöntemin ayırım güçleri MXCOPH

programı kullanılarak Mantel testi ile ortaya konulmuştur. Her iki yöntemin birlikte

kombine edilmesiyle oluşturulan dendogramında bu fungus populasyonundaki genetik

polimorfizimin incelenmesi için oldukça faydalı olduğu görülmüştür. Ayrıca Fusarium

oxysporum izolatları her iki marker sistemiyle kesin olarak diğer nohut kök patojenlerinden

ayrılabilmiştir. Tek bir vejetatif uyum grup içerisinde yüksek bir genetik benzerlik

paylaşmalarına rağmen Fusarium oxysporum f. sp. ciceris içerisinde farklı ırkların

bulunması bu izolatların birbirinin klonu olabileceğini veya ortak bir soydan gelmiş

olabileceklerini göstermektedir (Leslie 1993, Jimenez-Gasco et al. 2001). Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris’ in ırklarının serolojik ve elektroforetik değişkenliğini inceleyen

Desai et al. (1992) bu ırkların yakın bir antijenik ilişki gösterdiğini ve ortak bir isoenzim

içeriğini paylaştıklarını, Perez-Artes et al. (1995) ise mitokondrial DNA’ in RFLP

analizinde aynı restriksiyon profilini gösterdiklerini ifade etmişlerdir. Jimenez-Gasco et al.

(2002) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ in EF1α (Elongation factor), β-tubulin, histone

3, actin ve calmodulin gen sekanslarının aynı olmasından dolayı bu patojenin monofiletik

orjinli olduğunu belirtmişlerdir. Zamani et al. (2004) nohutta vasküler solgunluğa sebep

olan F. oxysporum’ un 15 izolatını vejetatif uyum, patojenisite ve RAPD analizi

bakımından karşılaştırdıkları çalışmalarında patojenisite ve vejetatif uyum testi ile bu

izolatları üç farklı gruba ayırmışlardır. Oniki primer kullanarak yaptıkları RAPD

analizinde ise Fusarium oxysporum izolatları arasında yüksek bir genetik varyasyonun

olduğunu tespit etmişlerdir. Ancak RAPD analizi ile elde edilen dağılım ve diğer iki analiz

arasında herhangi bir ilişki bulamamışlardır. Fusarium oxysporum izolatlarını koloni

büyüklüğü, enzim aktivitesi ve RAPD analizi ile karşılaştıran Motallebi et al. (2002)

77

yüksek virulensliğe sahip izolatların aynı enzim aktivitesine ve daha büyük kolonilere

sahip olduğunu bildirmişlerdir. RAPD analizi ile de yüksek virulensliğe sahip izolatlar

düşük virulenslikteki izolatlardan ayrı olarak gruplandırılmıştır. Meksika’ nın farklı

bölgelerinden elde edilen 41 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatını RAPD analizi ile

inceleyen Luna-Paez et al. (2003) Dice’ ın benzerlik katsayısını kullanarak yaptıkları

UPGMA analizi ile bu 41 izolatı 7 farklı gruba ayırmışlardır. Kelly et al. (1994)

büyüklükleri 17- 20 bp arasında değişen üç primer ile gerçekleştirdiği RAPD analizi ile 63

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve 11 farklı fungus izolatını birbirinden ayırmışlardır.

Elde edilen RAPD verisi ile yapılan UPGMA analizi ile Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

izolatlarını sararma ve solgunluk belirtisine sebep olmalarına göre iki farklı gruba

ayırmışlardır. Bunun yanı sıra F. oxysporum ve F. solani izolatları arasındaki benzerlik

oranının % 11-18 arasında değiştiğini tespit etmişlerdir.

Fusarium solani nohutta kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan Fusarium kompleksi

içerisinde Fusarium oxysporum f. sp. ciceris’ den sonra ikinci sırada yer almasına rağmen

bu fungusun izolatları arasındaki genetik ilişki ile ilgili herhangi bir bilgi mevcut değildir.

Bununla birlikte klasik yöntemlerle yapılan teşhislerde çok yaygın olmamakla beraber

araştırıcılara göre farklı formae speciales ayırımları görülmektedir. Ancak farklı konukçu

dizisindeki hastalık reaksiyonlarına göre bir ayırım yapılamamıştır. Bu sebeple F solani

izolatları arasındaki genetik varyasyonun ortaya konulması yapılacak dayanıklılık ıslahı

çalışmaları açısından önem taşıyacaktır. F. solani izolatlarının hem ISSR hemde RAPD

yöntemi ile iki farklı gruba ayrıldığı görülmüş ve her iki yöntem arasında yüksek bir

korelasyon tespit edilmiştir. Ayrıca kısmen de olsa izolatların coğrafik orjini ve

dendogramdaki dağılımı arasında bir ilişki olduğu bulunmuştur. Soya fasulyesinde

hastalığa sebep olan F. solani f. sp. phaseoli izolatları arasındaki genetik farklılığı ortaya

koymak için yapılan RAPD ve sekans analizleri sonucunda rDNA’ nın D2 ve ITS

bölgelerinin sekans analizlerinin bu varyasyonu ortaya koymak için yeterli olmadığı

görülmüştür (Achenbach et al. 1997). Bununla beraber RAPD analizi ile ani ölüm

sendromuna sebep olan F. solani f. sp. phaseoli izolatları iki farklı gruba ayrılabilmiştir.

RAPD ile iki gruba ayrılmalarına rağmen bu ayırım patojenisite testleriyle

78

sağlanamamıştır. Ayrıca elde edilen dendogramlar ile izolatların coğrafik dağılımları

arasında kısmen de olsa bir ilişki olduğu tespit edilmiştir (Achenbach et al. 1997).

Fusarium cinsi kültür koşullarına bağlı olarak yüksek derece değişken olan ve morfolojik

kriterlere dayanılarak bir araya getirilen mitosporik bir fungus topluluğudur (Yoder and

Christianson 1998). Bu sebeple morfolojik ve kültürel özelliklere dayanılarak yapılan

Fusarium türlerinin teşhisi uzman taksonomistlerce yapılsa bile her zaman güvenilir

sonuçlar vermemekte ve genetik olarak farklı olan türler aynı tür olarak

sınıflandırılabilmektedir. Bu çalışmada da morfolojik kriterlere dayanılarak bazı fungus

izolatlarının teşhisleri mutasyonlar, kültür aktarmaları, ortam koşulları gibi farklı

sebeplerden dolayı yapılamamıştır. Ancak morfolojik özelliklere dayanılarak kesin

teşhisleri yapılamayan izolatların moleküler yöntemlerle kesin olarak türleri belirlenebilmiş

ve bu izolatların RAPD ve ISSR yöntemiyle oluşturulan dendogramlarda ufak farklılıklarla

beraber benzer dağılım gösterdikleri tespit edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan her iki analiz

yöntemiyle daha önce F. semitectum olmasından şüphelenilen Kon-3 izolatının Fusarium

oxysporum olduğu tespit edilmiştir. Yine teşhisleri tam olarak yapılamayan Km-11 ve

Tok-3 izolatları dendogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte dağılım göstermişlerdir.

Ayrıca F. sambucinum olarak teşhis edilen KA2 izolatının ve Cylindrocarpon tonkinense

olmasından şüphelenilen Ank-32 izolatının F. oxysporum izolatları ile birlikte gruplandığı

görülmüştür. Yine poliblastik spor verici yapıların tespit edilememesi nedeniyle

F. semitectum olmasından şüphelenilen Ank-31 izolatının F. equiseti izolatları ile birlikte

dağılım gösterdiği yapılan bu çalışma ile saptanmıştır. Analizler sırasında nohuttan elde

edilen bazı kök patojenlerinin referans olarak kullanılan izolatlar ile oldukça farklı olduğu

görülmüştür. Diğer izolatlar ile referans izolatlar arasında görülen bu farklılık muhtemelen

referans izolatların sınıflandırılmasında kullanılan teşhis anahtarlarından veya farklı

konukçulardan elde edilmelerinden kaynaklanmaktadır. Kını et al. (2002), RAPD analizi ile

farklı konukçulardan elde edilen F. moniliforme izolatları arasında 5 farklı grubun

olduğunu bildirmiştir. Bu çalışmada Ref-2 izolatı ile diğer F. moniliforme izolatları

arasında tespit edilen farklılığın nedeni konukçu farklılığı veya nohuttaki F. moniliforme’

nin yeni sınıflandırmaya göre F. verticilloides olarak tanımlanması olabilir. Jana et al.

79

(2005) nohuttan elde edilen M. phaseolina izolatları arasında yüksek bir genetik farklılığın

olduğunu, bu izolatların soya fasulyesi ve pamuktan izole edilen izolatlardan oldukça farklı

olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca farklı araştırıcılar tarafından morfolojik olarak yanlış

sınıflandırılan değişik Fusarium türlerine ait izolatların kesin tanısı, moleküler yöntemler

kullanılarak tespit edilmiştir (Altomare et al. 1997, Yoder and Christianson 1998,

Vakalounakis and Fragkiadakis 1999). F. semitectum, F. acuminatum ve R. solani

izolatlarının genetik yapısının oldukça konservatif olduğu yine yapılan bu çalışma ile tespit

edilmiştir. Bununla birlikte test edilen bazı fungus izolatlarının az olması sebebiyle bu

funguslardaki genetik farklılığın ortaya konması için daha fazla izolatın kullanılmasının

faydalı olacağı düşünülmüştür.

Bitkilerin patojen mikroorganizmalarla sürekli olarak interaksiyon halinde olması sebebiyle

zaman içerisinde patojenlere karşı dayanıklılık mekanizmalarında kırılmalar olmaktadır. Bu

sebeple dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi ve etkili hastalık kontrol sistemlerinin

oluşturulabilmesi için patojen populasyonlarında var olan genetik farklılığın ortaya

konması gerekmektedir. Yapılan bu çalışma ile elde edilen RAPD ve ISSR profilleri kök

patojenlerinin birbirinden ayrılmasını sağlamakla beraber aynı tür içindeki izolatlar

arasındaki intraspesifik farklılığın ortaya konulmasında oldukça faydalı olmuştur. Özellikle

mutasyon sebebiyle klasik olarak teşhisi mümkün olmayan veya teşhisi şüpheli olan fungus

izolatları elde edilen dendogramlardaki grublanmaları ile birbirlerinden ayırt

edilebilmişlerdir. Ayrıca her iki yöntem ile elde edilen gruplanmanın benzer olduğu ve bu

sebeple her iki yönteminde kök patojenleri arasındaki genetik farklılığı incelemek için

oldukça uygun olduğu tespit edilmiştir. Her iki yöntemin kombine edilmesiyle oluşturulan

dendogramların ise RAPD analizine kıyasla ISSR analizi ile edilen dendograma daha fazla

benzediği tespit edilmiştir. Bunun yanısıra ISSR analizi ile elde edilen benzerlik oranının

RAPD analizine göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Colletotrichum izolatlarının

konukçu spesifitesi ve genetik farklılığını araştıran Lu et al. (2004) ISSR ve RAPD analizi

ile izolatların dağılımında küçük farklılıklar olmakla beraber elde edilen dendogramların

büyük ölçüde benzer olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar RAPD analizi ile

Colletotrichum izolatlarında tesbit edilen benzerlik oranının % 18-85 arasında değişir iken

80

ISSR analizinde bu oranın % 44-90 arasında değiştiğini ve her iki yönteminde morfolojik

olarak teşhis edilemeyen izolatların ayrılmasında ve Colletotrichum türlerinin populasyon

analizi için uygun olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca ISSR ve RAPD verisinin birlikte

değerlendirilmesi ile elde edilen dendogramın büyük ölçüde ISSR dendogramına benzediği

yine bu araştırıcılar tarafından ifade edilmiştir. Benzer şekilde ISSR analizinin

funguslardaki populasyon yapısının incelenmesi için oldukça faydalı olacağı değişik

araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Grunig et al. 2001, Rodrigues et al. 2004, Jana et al.

2005).

Tüm dünyada nohutlarda hastalığa sebep olan bu patojenlerle mücadele yöntemi olarak

dayanıklı nohut çeşitlerinin geliştirilmesi önerilmektedir. Ancak patojenlerin genetik

yapısında görülen mutasyon ve rekombinasyonlar dayanıklılıkta kırılmalara sebep

olmaktadır. Ayrıca dayanıklılığın bölgesel olarak değişkenlik göstermesi nedeniyle ıslah

materyallerinin farklı üretim bölgelerinde test edilmesi gerekmektedir. Bu moleküler

tekniklerle patojenlerdeki populasyon genetiğinin incelenerek bölgelere göre intra ve

interspesifik varyasyonun tespit edilmesi; farklı genetik yapıya sahip patojenlerin farklı

üretim bölgelerine girmesinin engellenmesi ve hassas çeşitlerin ekilerek belirli bir alanda

inokulum birikmesinin önüne geçilmesine olanak sağlayacaktır. Yapılan bu çalışma ile elde

edilen sonuçların klasik yöntemlerde karşılaşılan problemleri elemine ederek patojenlerin

daha hızlı ve doğru bir şekilde tespitini sağlayan metotların geliştirilmesinde, populasyon

yapısındaki değişikliklerin incelenerek bölgelere göre dayanıklı çeşitlerin belirlenmesinde

ve böylelikle hastalıklara karşı entegre mücadele yöntemlerinin daha etkili olarak

uygulanmasında araştırmacılara faydalı olacağı düşünülmektedir.

81

KAYNAKLAR

Abou-Zeid, N.M. and Hallila, H. 2003. Current status of chickpea diseases in Egypt. In:

International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 156-166, India.

Achenbach, L.A., Patrick, J.A. and Gray, L.E. 1997. Genetic homogeneity among isolates of Fusarium solani that cause soybean sudden death syndrome. Theor. Appl. Genet., 95, 474-478.

Akem, C. 1999. Ascochyta blight of chickpea: present status and future priorities. International Journal of Pest Management, 45, 131-137.

Almeida, A.M.R., Abdelnoor, R.V., Arias, C.A.A., Carvalho, V.P., Jacoud Filho, D.S., Marin, S.R.R., Benato, L.C., Pinto, M.C. and Carvalho, C.G.P. 2003. Genotypic diversity among Brazilian isolates of Macrophomina phaseolina revealed by RAPD. Fitopatologia Brasileira, 28, 279-285.

Altomare, C., Petrini, O., Logrieco, A. and Bottalico, A. 1997. Taxonomic relationships among the toxigenic species Fusarium acuminatum, Fusarium sporotrichioides and Fusarium tricinctum by isozyme analysis and RAPD assay. Can. J. Bot., 75, 1674-1684.

Alves-Santos, F.M., Ramos, B., Garcia-Sanchez, M.A., Eslava, A.P. and Diaz-Minquez, J.M. 2002. A DNA-based procedure for in plant detection of Fusarium oxysporum

f. sp. phaseoli. Phytopathology, 92, 237-244. Anonymous. 1996. International code on the identification of fungi of agricultural and

environmental significance. IMI, Egham, UK. Anonymous. 2003. Web sitesi. DNA minipreps fungi. http://www.dumru.mc.duke.edu.

Erişim Tarihi: 10.05.2003. Anonymous. 2005. Web sitesi. F.A.O. http://www.fao.org.Erişim Tarihi: 07.03.2006. Armstrong, G.M. and Armstrong, J.K. 1981. Formae speciales and races of Fusarium

oxysporum causing wilt disease. In: P.E. Nelson, T.A. Toussoun, & R.J. Cook [eds.] Fusarium: Disease, Biology, and Taxonomy. Pennsylvania State University Press, University Park, pp. 391-399.

Assigbetse, K.B., Fernandez, D., Dubois, M.P. and Geiger, J.P. 1994. Differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum races on cotton by Random Amplified Polymorfic DNA (RAPD) analysis. Phytopathology, 84, 622-626.

Balmas, V., Scherm, B., Primo, P.D., Rau, D., Marcello, A. and Migheli, Q. 2005a. Molecular characterisation of vegetative compatibility groups in Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and f. sp. lycopersici by random amplification of polymorphic DNA and microsatellite-primed PCR. Eur. J. Plant Pathol., 111, 1-8.

Balmas, V., Scherm, B., Ghignone, S., Mohamed-Salem, A.O., Cacciola, S.O. and Migheli, Q. 2005b. Characterisation of Phoma tracheiphila by RAPD-PCR, microsatellite-primed PCR and ITS rDNA sequencing and development of specific primers for in planta PCR detection. Eur. J. Plant Pathol., 111, 235-247.

82

Barnes, I., Gaur, A., Burgess, T., Roux, J., Wingfield, B.D. and Wingfield, M.J. 2001. Microsatellite markers reflect intra-specific relationships between isolates of the vascular wilt pathogen Ceratocystis fimbriata. Mol. Plant Pathol., 2(6), 319–325.

Barve, M.P., Haware, M.P., Sainani, M.N., Ranjekar, P.K. and Gupta, V.S. 2001. Potential of microsatellites to distinguish four races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri

prevalent in India. Theor. Appl. Genet., 102, 138-147. Beniwal, S.P.S., Ahmed, S. and Gorfu, D. 1992. Wilt/root rot diseases of chickpea in

Ethiopia. Tropical Pest Management 38 (1), 48-51. Bhaduoria, P., Chaturvedi, S.K., Gurha, S.N. and Awasthi, N.N.C. 2003. Inheritance of

resistance to wilt (Fusarium oxysporum f. sp. ciceri) in chickpea (Cicer arietinum L.). In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 208-209, India.

Bhattti, M.A. and Kraft, J.M. 1992. Effects of inoculum density and temperature on root rot and wilt of chickpea. Plant Dis., 76, 50-54.

Booth, C.1971. Fusarium a laboratory guide to the identification of the major species. C.M.I. Kew surrey, pp.58. England.

Bornet, B. and Branchard, M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter, 19, 209-215.

Cabrera de la Colina, J., Trapero-Casas, A. and Jimenez-Diaz, R.M. 1985. Races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri in Andalucia, Southern Spain. International Chickpea Newsletter, 13, 24-26.

Chakrabarti, A., Mukherjee, P.K., Sherkhane, P.D., Bhagwat, A.S. and Murthy, N.B.K. 2001. A simple and rapid molecular method for distinguishing between races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris from India. Current Science, 80 (4), 571-575.

Chiocchetti, A., Ghignone, S., Minuto, A., Gullino, M.L., Garibaldi, A. and Migheli, Q. 1999. Identification of Fusarium oxysporum f. sp. basilici isolated from soil, basil seed, and plants by RAPD analysis. Plant Dis., 83(6), 576-581.

Cramer, R.A., Byrne, P.F., Brick, M.A., Panella, L., Wickliffe, E. and Schwartz, H.F. 2003. Characterization of Fusarium oxysporum isolates from common bean and sugar beet using pathogenicity assays and random-amplified polymorphic DNA markers. J. Phytopathol., 151, 352–360.

Crowhurst, R.N., Hawthrorne, B.T., Rikkerink, E.H.A. and Templeton, M.D. 1991. Differentiation of Fusarium solani f. sp. cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA. Curr. Genet., 20, 391-396.

De Haan, L.A.M., Numansen, A., Roebroeck, E.J.A. and Van Doorn, J. 2000. PCR detection of Fusarium oxysporum f. sp. gladioli race 1, causal agent of Gladiolus yellows disease, from infected corms. Plant Pathol., 49, 89-100.

Demirci, E., Eken, C. and Kantar, F. 1999. Pathogenicity of wilt and root rot pathogens of chickpea cv. Aziziye-94. J. Turk. Phytopath., 28, 25-32.

Desai, S., Nene, Y.L., Jambunathan, R. and Reddy, R.A.G. 1992. Races of Fusarium

oxysporum causing wilt in chickpea: biochemical variability. Indian

Phytopathology, 45 (1), 62-65. Dice, L.R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology

26, 297-302.

83

Dolar, F.S. 1996. Determination of chickpea diseases in Ankara, Turkey. International Chickpea and Pigeonpea Newsletter No:3, 33-34.

Dolar, F.S. 1997. Determination of the races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in Ankara province, Turkey. J. Turk. Phytopath., 26(1), 11-15.

Dolar, F.S. and Nirenberg, H.I. 1998. Cylindrocarpon tonkinense Bugn.- A new Pathogen of chickpea. J. Phytopathol., 146(10), 521-523.

Duncan, S., Barton, J.E. and O’Brien, P.A. 1993. Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay. Mycol. Res., 97(9), 1075-1082.

Edel, V., Steinberg, C., Avelange, I., Laguerre, G. and Alabouvette, C. 1995. Comparison of three molecular methods for the characterization of Fusarium oxysporum strains. Phytopathology, 85, 579-585.

Eser, D. ve Soran, H. 1978. Yerli ve Yabancı Kökenli Nohut Çeşitlerinin Orta Anadolu Koşullarında Erkencilik, Verimlilik ve Hastalılara Dayanıklılık Yönünden Mukayeseli İncelenmesi. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayın No. 684, Ankara.

Fenille, R.C., Souza, N.L. and Kuramae E.E. 2002. Characterization of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil. Eur. J. Plant Pathol., 108, 783-792.

Fenille, R.C., Ciampi, M.B., Kuramae, E.E. and Souza, N.L. 2003. Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences. Fitopatologia Brasileira 28:413-419.

Fernandez, D., Quinten, M., Tantaoui, A. and Geiger, J.P. 1997. Molecular records of micro- evolution within the Algerian population of Fusarium oxysporum f. sp. albedinis during its spread to new oases. Eur. J. Plant Pathol., 103, 485-490.

Freeman, S. and Maymon, M. 2000. Reliable detection of the fungal Fusarium oxysporum

f. sp. albedinis, causal agent of bayoud disease of date palm, using molecular techniques. Phytoparasitica, 28(4), 341-348.

Garcia-Pedrajas, M.D., Bainbridge, B.W., Heale, J.B., Artes, E.P. and Diaz, J. 1999. A simple PCR based method for the detection of chickpea wilt pathogen Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris in artificial and natural soils. Eur. J. Plant Pathol., 105, 251-259.

Gente, S., Desmasures, N., Panoff, J.M. and Gueguen, M. 2002. Genetic diversity among Geotrichum candidum strains from various substrates studied using RAM and RAPD-PCR. Journal of Applied Microbiology, 92, 491-501.

Gerlach, W. and Nirenberg, H. 1982. The Genus Fusarium: a Pictorial Atlas. Mitteilungen Biologie Bundesanst Land Forstwirtschaft Berlin Dahlem 209, 1-406.

Grajal-Martin, M.J., Simon, C.J. and Muehlbauer, F.J. 1993. Use of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) to Characterize Race 2 of Fusarium oxysporum f. sp. pisi. Phytopathology, 83, 612-614.

Grunig, C.R., Sieber, T.N. and Holdenrieder, O. 2001. Characterisation of dark septate endophytic fungi (DSE) using inter-simple-sequence-repeat-anchored polymerase chain reaction (ISSR-PCR) amplification. Mycol. Res., 105(1), 24-32.

Gupta, O.M., Kotasthane, S.R. and Khare, M.N. 1987. Factors influencing epidemiology of vascular wilt of chickpea. Proceedings of Indian Academy of Sciences, 57, 86-91.

84

Gupta, O. and Babbar, A. 2003. Occurrence of sources of resistance in desi and kabuli chickpea genotypes against collar rot and yield contributing characters. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp 64. India.

Han, Q., Inglis, G.D. and Hausner, G. 2002. Phylogenetic relationships among strains of the entomopathogenic fungus, Nomuraea rileyi, as revealed by partial b-tubulin sequences and inter-simple sequence repeat (ISSR) analysis. Letters in Applied Microbiology, 34, 376–383.

Hantula, J., Dusabenyagasani, M. and Hamelin, R.C. 1996. Random amplified microsatellites (RAMS) a novel method for characterizing genetic variation within fungi. Eur. J. for Path., 26, 159–166.

Hantula, J. and Muller, M.M. 1997. Variation within Gremmeniella abietina in Finland and other countries as determined by random amplified microsatellites (RAMS). Mycol. Res., 101(2), 169-175.

Hantula, J., Lilja, A., Nuorteva, H., Parikka, P. and Werres, S. 2000. Pathogenicity, morphology and genetic variation of Phytophthora cactorum from strawberry, apple, rhododendron and silver birch. Mycol. Res., 104(9), 1062-1068.

Haware, M.P. and Nene, Y.L. 1982. Races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Plant Dis., 66, 809-810.

Haware, M.P., Nene, Y.L. and Mathur, S.B. 1986. Ascochyta blight. Seed Borne Diseases of Chickpea Technical Bulletin from the Danish Government Institute of Seed Pathology for Developing Countries, No:1, pp. 9-15. Copenhagen, Denmark.

Haware, M.P., Jimenez-Diaz, R.M., Amin, K.S. and Halila, H. 1990. Integrated management of wilt and root-rots of chickpea. pp.129-137. In: H.A. van Rheenen and M.C. Saxena (eds.), chickpea in the Nineties: Proceedings of the Second International Workshop on Chickpea Improvement. Dec 1989, ICRISAT Center, Patancheru, India.

Hernandez, J.F., Posada, M.A. and Arbelaez, G. 1999. Identification of molecular markers of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi by RAPD. Proc. of the Int. Symp. on cut flowers in the Tropics, 123-131.

Huang, R., Galperin, M., Levy, Y. and Perl-Treves, R. 1997. Genetic diversity of Fusarium

moniliforme detected by vegetative compatibility groups and random amplified polymorphic DNA markers. Plant Pathol., 46, 871-881.

Huhtala, S.P., Hyvönen, J., Bulat, S.A. and Ylı-Mattila, T. 1999. RAPD-PCR, isozyme, rDNA RFLP and rDNA sequence analyses in identification of Finnish Fusarium

oxysporum isolates. Mycol. Res., 103(5), 625-634. Innis, M.A. and Gelfand, D.H. 1990. Optimisation of PCRs. In PCR Protocols: A guide to

methods and applications (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky& T.J. White eds.): 3-11. Academic Press, San Diago.

Jana, T., Sharma, T.R., Prasad, R.D. and Arora, D.K. 2003. Molecular characterization of Macrophomina phaseolina and Fusarium species by a single primer RAPD technique. Microbiol. Res., 158, 249-257.

Jana, T., Sharma, T.R. and Singh, N.K. 2005. SSR-based detection of genetic variability in the charcoal root rot pathogen Macrophomina phaseolina. Mycol. Res., 109(1), 81-86.

85

Jimenez-Diaz, R.M., Trapero-Casas, A. and Cabrera de la Colina, J. 1989. Races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris infecting chickpeas in Southern Spain. In: Tjamos, E.C. and Beckman, C. (eds.) Vascular wilt diseases of plants, NATO ASI Series, Springer-Verlag, Vol. H28, pp. 515-520, Berlin

Jimenez-Diaz, R.M., Singh, K.B., Trapero-Casas, A. and Trapero-Casas, J.L. 1991. Resistance in kabuli chickpeas to Fusarium wilt. Plant Dis., 75, 914-918.

Jimenez-Gasco, M., Perez-Artes, E. and Jimenez-Diaz, R.M. 2001. Identification of pathogenic races 0, 1 B/C, 5, and 6 of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris with random amplified polymorphic DNA (RAPD). Eur. J. Plant Pathol., 107, 237-248.

Jimenez-Gasco, M., Milgroom, M.G. and Jimenez-Diaz, R.M. 2002. Gene genealogies support Fusarium oxysporum f. sp. ciceris as a monophyletic group. Plant Pathol., 51, 72-77.

Jimenez-Gasco, M. and Jimenez-Diaz, R.M. 2003. Development of a specific polymerase chain reaction-based assay for the identification of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris and its pathogenic races 0, 1A, 5, and 6. Phytopathology, 93, 200-209.

Justesen, A.F., Yohalem, D., Bay, A. and Nicolaisen, M. 2003. Genetic diversity in potato field populations of Thanatephorus cucumeris AG-3, revealed by ITS polymorphism and RAPD markers. Mycol. Res., 107(11), 1323-1331.

Kaiser, W.J., Alcala-Jimenez, A.R., Hervas-Vargas, A., Trapero-Casas, J.L. and Jimenez-Diaz, R.M. 1994. Screening of wild Cicer species for resistance to race 0 and 5 of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Plant Dis., 78, 962-967.

Kelly, A., Alcala-Jimenez, A.R., Bainbridge, B.W., Heale, J.B., Perez-Artes, E. and Jimenez-Diaz, R.M. 1994. Use of Genetic Fingerprinting and Random Amplified Polymorphic DNA to Characterize Pathotypes of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

Infecting Chickpea. Phytopathology, 84, 1293-1298. Kelly, A., Bainbridge, B.W., Heale J.B., Perez-Artes, E. and Jimenez-Diaz, R.M. 1998. In

planta-polymerase chain reaction detection of the wilt inducing pathotype of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in chickpea (Cicer arietinum L.). Physiol. Mol. Plant Pathol., 52, 397-409.

Kını, K.R., Leth, V. and Mathur, S.B. 2002. Genetic variation in Fusarium moniliforme isolated from seeds of different host species from burkina faso based on random amplified polymorphic DNA analysis. J. Phytopathol., 150, 209–212.

Kumar, L.S., Sawant, A.S., Gupta, V.S. and Ranjekar, P.K. 2001. Comparative analysis of genetic diversity among Indian populations of Scirpophaga incertulas by ISSR-PCR and RAPD-PCR. Biochemical Genetics, 39, 297-309.

Leslie, J.F. 1993. Fungal vegetative compatibility. Annual Review of Phytopathology, 31, 127-151.

Lilja, A., Hietala, A.M. and Karjalainen, R. 1996. Identification of a uninucleate Rhizoctonia sp. by pathogenicity, hyphal anastomosis and RAPD analysis. Plant Pathol., 45, 997-1006.

Longato, S. and Bonfante, P. 1997. Molecular identification of mycorrhizal fungi by direct amplification of microsatellite regions. Mycol. Res., 101 (4), 425-432.

Lu, G., Cannon, P.F., Reid, A. and Simmons, C.M. 2004. Diversity and molecular relationships of endophytic Colletotrichum isolates from the Iwokrama Forest Reserve, Guyana. Mycol. Res., 108(1), 53-63.

86

Luna-Paez, A., Valadez-Moctezuma, E., Silva-Rojas, H.V. and Marban-Mendoza, N. 2003. Genetic variability of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris strains in Mexica using PCR-RAPD. Latin American Association of Plant Pathology, and Mexican Society for Plant Pathology April 6-11, meeting abstracts South Padre Island, Texas.

Maden, S. 1987. Seed-borne Fungal Diseases of Chickpea in Turkey. J. Turk. Phytopath., 16(1), 1-8.

Manulis, S., Kogan, N., Reuven, M. and Ben-Yephet, Y. 1994. Use of the RAPD Technique for Identification of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi from Carnation. Phytopathology, 84, 98-101.

Meng, X. and Chen, W. 2001. Applications of AFLP and ISSR techniques in detecting genetic diversity in the soybean brown set rot pathogen Phialophora gregata. Mycol. Res., 105(8), 936-940.

Menzies, J.G., Bakkeren, G., Matheson, F., Procunier, J.D. and Woods, S. 2003. Use of inter-simple sequence repeats and amplified fragment length polymorphisms to analyze genetic relationships among small grain-infecting species of Ustilago. Phytopathology, 93, 167-175.

Meyer, W., Lieckfeldt, E., Wöstemeyer, J. and Börner, T.H. 1992. DNA fingerprinting for differentiating aggressivity groups of the rapeseed pathogen Leptosphaeria maculans. Mycol. Res., 96(8), 651-657.

Meyer, W., Mitchell, T.G., Freedman, E.Z. and Vilgays, R. 1993. Hybridization probes for conventional DNA fingerprinting used as single primers in the polymerase chain reaction to distinguish strains of Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol., 31, 2274–2280.

Migheli, Q., Briatore, E. and Garibaldi, A. 1998. Use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) to identify races 1, 2, 4 and 8 of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in Italy. Eur. J. Plant Pathol., 104, 49-57.

Mishra, K.P., Fox, R.T.V. and Culham, A. 2003. Inter-simple sequence repeat and aggressiveness analyses revealed high genetic diversity, recombination and long-range dispersal in Fusarium culmorum. Ann. Appl. Biol., 143, 291-301.

Mishra, P.K., Tewari, J.P., Clear, R.M. and Turkington, K.T. 2004. Molecular genetic variation and geographical structuring in Fusarium graminearum. Ann. Appl. Biol., 145, 299-307.

Moricca, S., Ragazzi, A., Kasuga, T. and Mitchelson, K.R. 1998. Detection of Fusarium

oxysporum f. sp. vasinfectum in cotton tissue by polymerase chain reaction. Plant Pathol., 47, 486-494.

Motallebi, M., Zamani, M.R., Jazayeri, O. and Harighi, M.J. 2002. Use of RAPD, enzyme activity staining, and colony size to differentiate phytopathogenic Fusarium

oxysporum isolates from Iran. Brezilian Journal of Microbiology, 33, 299-303. Muehlbauer, F.J. and Singh, K.B. 1987. Genetics of chickpea. In: M.C. Saxena and K.B.

Singh (eds.), The Chickpea. CAB. International, Wallingford, Oxon, OX10 8DE, pp. 99-125, UK.

Muehlbauer, F.J. 1993. Food and grain legumes. In: J. Janick and J.E. Simon (eds.), New crops., pp. 256-265., Wiley, New York.

Nelson, P.E., Toussoun, T.A. and Marasas, W.F.O. 1983. Fusarium Species: an Illustrated Manual for Identification. Pennsylvania State University Press, University Park.

87

Nene, Y.L. and Haware, M.P. 1980. Screening chickpea for resistance to wilt. Plant Dis., 66, 379-380.

Nene, Y.L., Sheila, V.K. and Sharma, S.B. 1984. A world list of chickpea (Cicer arietinum L.) and pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.) pathogens. ICRISAT Pulse Pathology Progress Report 32. pp.19.

Nene, Y.L. and Reddy, M.V. 1987. Chickpea diseases and their control. In: Saxena, M.C. and Singh K.B. (eds.), The Chickpea, pp. 233-270. C.A.B. Wallingford, Oxon, UK.

Nene, Y.L., Sheila, V.K. and Sharma, S.B. 1996. A world list of chickpea and pigeonpea pathogens. 5th edn. Patoncheru 502 324 Andhra Pradesh, India: International Crops Research Institute for the Semi Arid Tropics. 27p.

Niessen, M.L. and Vogel, R.F. 1997. Specific Identification of Fusarium graminearum by PCR with gaoA Targeted Primers. System. Appl. Microbiol., 20,111-113.

Perez-Artes, E., Roncero, M.I.G. and Diaz, R.M.J. 1995. Restriction fragment length polymorphism analysis of the mitochondrial DNA of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. J. Phytopathol., 143, 105-109.

Phillips, J.C. 1988. A distinct race of chickpea wilt in California. International Chickpea Newsletter, 18, 19-21.

Rathaparkhe, M.B., Tekeoğlu, M. and Muehlbauer, F.J. 1998. Inter-simple sequence-repeat (ISSR) polymorphism are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters. Theor. Appl. Genet., 97, 515-519.

Reader, U. and Broda, P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, 1, 17-20.

Rodrigues, K.F., Sieber, T.N., Grunig, C.R. and Holdenrieder, O. 2004. Characterization of Guignardia mangiferae isolated from tropical plants based on morphology, ISSR-PCR amplifications and ITS1-5.8S-ITS2 sequences. Mycol. Res., 108(1), 45-52.

Rohlf, F.I. 1998. NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Version 2.0. Applied Biostatistics, New York, USA.

Rutherford, M.A., Bridge, P.D., Paterson, R.R.M., Brayrford, D. and Thomas, V. 1995. Development of in vitro identification techniques for special pathogenic forms of Fusarium oxysporum. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 25, 137-142.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A Laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Schilling, A.G., Möller, E.M. and Geiger, H.H. 1996. Polymerase Chain Reaction-Based Assays for Species-Specific Detection of Fusarium culmorum, F. graminearum, and F. avenaceum. Phytopathology, 86, 515-522.

Sharma, K.D., Chen, W. and Muehlbauer, F.J. 2004. A consensus set of differential lines for identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. International chickpea newsletter, 11, 34-36.

Shrivastava, A. and Agrawal, S.C. 2003. Studies on pathotypes of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri in Vindhyan plateau zone of Madhya Pradesh. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp 201-203, India.

Shukla, J., Tuteja, U., Ratnaparkhe, M.B. and Batra, H.V. 2001. Inter-simple-sequence-repeat (ISSR)-PCR for the identification of saprophytic strains of Leptospira. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17, 529-533.

88

Singh, K., Singh, D., Singh, S. and Gupta, S.K. 2003. Sources of resistance in chickpea entries against wilt/root rot complex. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 196-200, India.

Singleton, L.L., Mihail J.D. and Rush, C.M. 1992. Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. APS press, pp.266. St. Paul, Minnesota.U.S.A

Sivaramakrishnan, S., Kannan, S. and Singh, S.D. 2002. Genetic variability of Fusarium wilt pathogen isolates of chickpea (Cicer arietinum L.) assessed by molecular markers. Mycopathologia, 155, 171-178.

Smith, D.R., Bronson, J.J. and Stanosz, G.R. 2003. Host-related variation among isolates of the Sirococcus shoot blight pathogen from conifers. For. Path. 33, 141–156.

Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. 1973. Numerical Taxonomy. Freeman. San Francisco. pp. 573

Sneh, B., Burpee, L. and Ogoshi, A. 1991. Identification of Rhizoctonia species. APS press St. Paul, M.N., U.S.

Soran, H. 1977. The fungus disease situation of edible legumes in Turkey. J. Turk. Phytopath., 6(1), 1-7.

Sreekar, Y.R., Thakur, M.P., Pandey, R.L., Shrivastava, G.K., Gupta, S.B. and Khare, N. 2003. Detection of soil borne pathogens associated with chickpea wilt complex under varying agronomical practices. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 43, India.

Toda, T., Hyakumachi, M. and Arora, D.K. 1999. Genetic relatedness among and within different Rhizoctonia solani anastomosis groups as assessed by RAPD, ERIC and REP-PCR. Microbiol. Res., 154, 247-258.

Trapero-Casas, A. and Jimenez-Diaz, R.M. 1985. Fungal wilt and root rot diseases of chickpea in Southern Spain. Phytopathology, 75, 1146-1151.

Turner, A.S., Lees, A.K., Rezanoor, H.N. and Nicholson, P. 1998. Refinement of PCR-detection of Fusarium avenaceum and evidence from DNA marker studies for phenetic relatedness to Fusarium tricinctum. Plant Pathology, 47, 278-288.

Vakalounakis, D.J. and Fragkiadakis, G.A. 1999. Genetic Diversity of Fusarium

oxysporum Isolates from Cucumber: Differentiation by Pathogenicity, Vegetative Compatibility, and RAPD Fingerprinting. Phytopathology, 89, 161-168.

Voight, K., Schleier, S. and Bruckner, B. 1995. Genetic variability in Gibberella fujikuroi and some related species of the genus Fusarium based on random amplification of polymorphic DNA (RAPD). Curr. Genet., 27, 528-535.

Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Res., 18, 7213-7218.

Westerlund, F.V., Campbell, R.N. and Kimble, K.A. 1974. Fungal root rots and wilt of chickpea in California. Phytopathology, 64, 432-436.

Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res., 18, 6531-6535.

Yang, H.A., Sivasithamparam, K., Barton, J.E. and O’Brien, P.A. 1995. Characterization of cereal bare patch isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA analysis. Plant Pathol., 44, 811-818.

89

Yoder, W.T. and Christianson, L.M. 1998. Species-specific primers resolve members of Fusarium section Fusarium. Fungal Genetics and Biology, 23, 68-80.

Zamani, M.R., Motallebi, M. and Rostamian, A. 2004. Characterization of Iranian isolates of Fusarium oxysporum on the basis of RAPD analysis, virulence and vegetative compatibility. J. Phytopathol., 152, 449–453.

Zhou, S., Smith, D.R. and Stanosz, G.R. 2001. Differentiation of Botryosphaeria species and related anamorphic fungi using Inter Simple or Short Sequence Repeat (ISSR) fingerprinting. Mycol. Res., 105(8), 919-926.

Zietkiewicz, E., Rafalski, A. and Labuda, D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genome, 20, 176-183.

90

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: Harun BAYRAKTAR

Doğum Yeri: Ankara/Beypazarı

Doğum Tarihi: 25.12.1976

Medeni Hali: Bekar

Yabancı Dili: İngilizce

Eğitim Durumu

Lise: Yenimahalle Endüstri Meslek Lisesi (1993)

Lisans: Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü (1994-1998)

Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma

.Anabilim .Dalı (1998-2001)

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl

Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü, Araştırma Görevlisi

(1999-2006)

Yayınları

Bayraktar, H. ve Dolar, F.S. 2001. In vitro koşullarda salisilik asit ve asetilsalisilik asit’in nohut kök patojenlerine etkilerinin saptanması. Türkiye IX. Fitopatoloji Kongresi Bildirileri, 3-8 Eylül, Tekirdağ.

Bayraktar, H. ve Dolar, F.S. 2002. Induction of resistance in chickpea to Ascochyta blight [Ascochyta rabiei (pass.) Labr.] by salicylic acid. J.Turk. Phytopath., 31(1):49-61.

Bayraktar, H., Babalıoğullu, I., Demirci, F., Dolar F.S. and Maden, S., 2002. Distribution of ascochyta blight in some of the important chickpea grown provinces of Turkey . J.Turk. Phytopath., 31 (2):105-110 .

Demirci, F. Bayraktar, H., Babalıoğullu, I., Dolar, F.S. and Maden, S. 2003. In vitro and in vivo effects of some fungicides against chickpea blight pathogen, Ascochyta rabiei. J. Phytopathol., 151, 519-524.

Maden, S., Dolar, F.S., Babalıoğullu, I., Bayraktar, H. and Demirci, F. 2004.Determination of pathogenic variability of Ascochyta rabiei and reactions of chickpea cultivars against the pathotypes in Turkey. 5th European Conference on Grain Legumes Handbook, 307. 7-11 June, Dijon, France.

ankara Üniversitesi fen bilimleri enstitÜsÜ doktora tezi nohutlarda kÖk...

Documents