KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

Audrius Ivanauskas

ANKSTYVOS SKRANDŽIO VĖŽIO

BEI IKIVĖŽINIŲ BŪKLIŲ DIAGNOSTIKOS

GALIMYBIŲ ĮVERTINIMAS

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)

Kaunas, 2008

Disertacija rengta 2003–2007 metais Kauno medicinos universitete

Mokslinis vadovas

Prof. habil. dr. Limas Kupčinskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai,

medicina – 07 B)

Konsultantas

Doc. dr. Laimas Virginijus Jonaitis (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai,

medicina – 07 B)

2

TURINYS

SANTRUMPOS..................................................................................................................................5

1. ĮVADAS ..........................................................................................................................................7

1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai ........................................................................................................8 1.2. Darbo naujumas ........................................................................................................................9

2. LITERATŪROS APŽVALGA ...................................................................................................11 2.1. Skrandžio vėžys ......................................................................................................................11 2.2. Etiopatogenetiniai mechanizmai .............................................................................................12

2.2.1. Epigenetinės pažaidos ..................................................................................................12

2.2.2. H. pylori reikšmė skrandžio vėžio vystymuisi .............................................................20

2.2.3. Skrandžio gleivinės atrofija ir žarninė metaplazija ......................................................21

2.3. Skrandžio vėžio patomorfologija ............................................................................................23 2.4. Ikivėžinių skrandžio būklių – gleivinės atrofijos ir žarninės metaplazijos invazinė diagnostika .....................................................................................................................................26 2.5. Neinvazinė serologinė atrofinio gastrito diagnostika..............................................................28

3. MEDŽIAGA IR TYRIMO METODAI .....................................................................................30 3.1. Tiriamųjų kontingentas ...........................................................................................................30

3.1.1. I dalis – epigenetinis tyrimas........................................................................................30

3.1.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe..................................31

3.1.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas..............................................................................................................................31

3.2. Tyrimo metodai.......................................................................................................................32

3.2.1. I dalis – epigenetinis tyrimas........................................................................................32

3.2.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe..................................43

3.2.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas...................................................................................................................................44

3.3. Matematinė-statistinė duomenų analizė..................................................................................46

4. REZULTATAI .............................................................................................................................48 4.1. I dalis – epigenetinis tyrimas ..................................................................................................48 4.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe .....................................................................52

4.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas.....................................................................................................................................54

3

5. REZULTATŲ APTARIMAS .....................................................................................................605.1. I dalis – epigenetinis tyrimas ..................................................................................................60 5.2. II–III dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe, neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas ...............................................................................................62

6. IŠVADOS......................................................................................................................................66

7. REKOMENDACIJOS.................................................................................................................67

8. PADĖKOS ....................................................................................................................................68

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS .......................................................................................................69

10. PUBLIKACIJOS........................................................................................................................79

11. PRIEDAI.....................................................................................................................................80

4

SANTRUMPOS

A – adeninas

APC – žarnų adenomatozinės polipozės (angl. adenomatous polyposis coli) genas

aps./min. – apsisukimai per minutę

bp – bazių pora

C – citozinas

CpG – citozino ir guanino

CIMP – CpG salelių metilinimo fenotipas

DNR – dezoksiribonukleorūgštis

RT-PGR – atvirkštinė transkriptazės polimerazės grandininė reakcija

cDNR – viengrandė komplimentinė DNR

CDH1 – epitelinio kadherino (angl. E-cadherin) genas

G – guaninas

MgCl2 – magnio chloridas

mRNR – informacinė ribonukleorūgštis (angl. messenger ribonucleoacid)

PGI – pepsinogenas I

PGII – pepsinogenas II

G-17 (F) – gastrinas 17, bazinis (angl. fasting-nevalgęs)

G-17 (S) – gastrinas 17, stimuliuotas (angl. stimulated-stimuliuotas)

IgA – imunoglobulinas A

IgG – imunoglobulinas G

H. pylori – Helicobacter pylori

ŽM – žarninė metaplazija

HCl – druskos rūgštis

HE – hematoksilinas eozinas

EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis

NSG – naviką slopinantys genai

pav. – paveikslas

PGR – polimerazės grandininė reakcija

PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

MSI – mikrosatelitinis nestabilumas

MSP – metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija

p – paklaidos tikimybė, reikšmingumo lygmuo

r – koreliacijos koeficientas

5

ACTB, β2M – β aktinas

TPEF/HPP1 – genas, koduojantis transmembraninį baltymą, turintį epidermio augimo fakto-

riaus ir folistatino modulius; žmogaus hiperplastinių polipų baltymo genas

(angl. transmembrane protein containing epidermal growth factor and follista-

tin domains/ hyperplastic polyposis protein)

n – atvejų skaičius, imties tūris

NS – statistiškai nereikšminga

SN – standartinis nuokrypis

T – timinas

x – vidurkis

ROC – ROC kreivė (angl. Receiver operating characteristic)

TPV – teigiama prognostinė vertė

NPV – neigiama prognostinė vertė

5-FU – 5-fluorouracilas

NPV – nesteroidiniai priešuždegiminiai vaistai

6

1. ĮVADAS

Visame pasaulyje skrandžio vėžys yra didelė problema, kasmet diagnozuojama apie 875000

naujų atvejų ir 645000 miršta nuo šios ligos [1]. Sergamumas skrandžio vėžiu auga, daugelyje šalių

jis išlieka viena dažniausių mirtį sąlygojančių priežasčių. Remiantis GLOBOCAN duomenimis, 2002

m. Vokietijoje sergamumas skrandžio vėžiu buvo 15,1 vyrų ir 8,8 moterų tarpe 100000 gyventojų,

Lietuvoje, atitinkamai, 25,3 vyrų ir 13,0 moterų tarpe, Latvijoje 24,6 vyrų ir 11,1 moterų tarpe 100000

gyventojų [2]. Lietuvos vėžio registro duomenimis, 2005 m. Lietuvoje sergamumas skrandžio vėžiu

buvo 35,0 vyrų ir 22,1 moterų tarpe 100000 gyventojų, mirtingumas nuo šios ligos 2004 m. – 30,4

vyrų ir 17,8 moterų tarpe 100000 gyventojų [3]. Šis susirgimas vis dar dažniausiai diagnozuojamas

vėlyvose stadijose, kuomet radikali operacija jau nėra galima.

Šiuo metu pirminė ir antrinė skrandžio vėžio profilaktika yra labiausiai efektyvi mažinant ser-

gamumą ir mirtingumą nuo šios ligos. Vis dėlto, sėkmingas šios strategijos vystymas labai priklau-

so nuo suvokimo etiologinių faktorių ir patogenezinių mechanizmų, dalyvaujančių skrandžio kance-

rogenezėje [4]. Skrandžio vėžio vystymasis yra kompleksinis ir šiuo metu dar pilnai neišaiškintas

procesas.

Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) 1994 m. paskelbė Helicobacter pylori (H. pylori) I kla-

sės kancerogenu, susijusiu su skrandžio vėžio išsivystymu [5]. Tačiau yra žinoma, kad be lėtinio

gastrito, sukeliamo H. pylori, dietos (gausus druskos, nitratų vartojimas), rūkymo ir galimai pikt-

naudžiavimo alkoholiu, egzistuoja papildomi skrandžio vėžio rizikos faktoriai [6-11].

Genetiniai faktoriai ir genetiškai nulemtas atsakas į aplinkos faktorius yra kertiniai skrandžio

kancerogenezės mechanizmų supratime [12]. Genetinės ir epigenetinės pažaidos sukelia molekuli-

nius pokyčius. Pagrindinis skirtumas tarp genetinių ir epigenetinių pažaidų yra tas, kad epigenetiniai

pokyčiai yra grįžtami, eliminavus toksinį faktorių ar veikiant terapinėms priemonėms bei chemi-

niams veiksniams [13-15]. Dezoksiribonukleorūgšties (DNR) metilinimas – tai epigenetinė pažaida,

kuri, nesukeldama DNR nukleotidų sekos pokyčių, lemia paveldimus genų ekspresijos pokyčius.

Genų metilinimas yra ankstyvas bei vienas iš pagrindinių naviką slopinančių genų (NSG) inaktyva-

vimo mechanizmų, nustatomas įvairių lokalizacijų navikų atvejais. Netipiškas CpG salelių metili-

nimas demonstruoja genų, neabejotinai dalyvaujančių vėžio vystymęsi, transkripcinį ,,nebylumą“.

Azotinės bazės citozino (C) metilinimas šiose salelėse sukelia geno ekspresijos nebuvimą ir yra su-

sijęs su X chromosomos inaktyvacija [16,17]. Metilinimo proceso išaiškinimas yra labai svarbus

klinikine prasme, įskaitant ankstyvą diagnostiką, chemoprevenciją, prognozę ir vėžio gydymą [18].

TPEF/HPP1 genas koduoja ląstelės paviršiaus receptorių su trumpa citoplazmos dalimi, trans-

membraninę sritį ir ekstraląstelinį komponentą su dviem folistatino moduliais (epidermio augimo

faktoriaus ir prijungimo glikozaminoglikanams vietos) [19]. Galimai TPEF/HPP1 genas atlieka

7

įvairias funkcijas ląstelės augimo, brendimo fazėse, adhezijos procese, šio geno inaktyvavimas yra

ankstyvas įvykis virškinamojo trakto navikų vystymesi [20]. Nauji tyrimai patvirtino, kad

TPEF/HPP1 geno metilinimas yra dažnas reiškinys tulžies ir šlapimo pūsles, kolorektalinio vėžio

atvejais [19,21,22]. Šio geno metilinimas yra dažnas reiškinys kolorektalinio vėžio tolimosiose me-

tastazėse [23]. Vis dėlto, nėra pakankamai duomenų apie TPEF/HPP1 geno metilinimo reikšmę

skrandžio kancerogenezėje [20,24].

Kitas svarbus skrandžio vėžio rizikos faktorius yra H. pylori sąlygotas atrofinis gastritas. Kli-

nikinėje praktikoje atrofinis gastritas patvirtinamas histologiškai ištyrus daugybines skrandžio glei-

vinės biopsijas, paimtas endoskopijos metu, pagal 1994 m. Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus klasifi-

kaciją [25,26]. Šie tyrimai yra pakankamai brangūs naudoti atrankinei patikrai. Keletą dešimtmečių

yra žinoma, kad skrandžio kūno ir dugno atrofiją galima nustatyti remiantis pepsinogeno I (PGI),

pepsinogeno II (PGII) koncentracija kraujo plazmoje. Tačiau nebuvo žinoma serologinio žymens,

kuris atspindėtų skrandžio antruminės dalies atrofijos. Pentti Ilmari Sipponen iš Jorvi ligoninės (Es-

poo, Suomija) nustatė, kad skrandžio antruminės dalies atrofiją galima nustatyti remiantis gastrino-

17 (G-17) koncentracija kraujo plazmoje [27,28]. Remiantis šiais serologiniais žymenimis (PGI,

PGII, PGI/PGII santykiu ir G-17), o taip pat antikūnių prieš H. pylori (IgA/IgG) koncentracija krau-

jo plazmoje galima nustatyti bei atrinkti pacientus, kurie turi padidintą riziką sirgti skrandžio vėžiu,

opalige ir nukreipti juos endoskopiniam tyrimui, o taip pat diagnozuoti neatrofinį H. pylori gastritą

ir skirti H. pylori eradikacinį gydymą, neatliekant endoskopinio tyrimo. Atliktų tyrimų rezultatai

rodo gerą šio testo diagnostinį jautrumą (79 proc.) ir specifiškumą (91 proc.), teigiamą prognostinę

vertę (TPV) 64 proc., neigiamą prognostinę vertę (NPV) 93 proc. [29]. Tačiau nėra visiškai aišku,

ar šis testas yra tinkamas Rytų Europos ir Tolimųjų Rytų gyventojų, turinčių padidintą riziką sirgti

skrandžio vėžiu, atrankinei patikrai.

1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai

Darbo tikslas

Ištirti naujas ankstyvos skrandžio vėžio bei ikivėžinių būklių diagnostikos galimybes, įvertinant

skrandžio audinių epigenetinių pažaidų ypatumus bei ikivėžinės būklės – gleivinės atrofijos serologi-

nės diagnostikos metodus.

Darbo uždaviniai

1. Nustatyti sergančiųjų skrandžio adenokarcinoma TPEF/HPP1 metilintų genų dažnumą

navikiniame ir nenavikiniame skrandžio audinyje bei funkcine dispepsija sergančiųjų

skrandžio audinyje.

8

2. Įvertinti sąsajas tarp tirtų epigenetinių pažaidų ir sergančiųjų skrandžio vėžiu (adeno-

karcinoma) klinikinių ir morfologinių charakteristikų.

3. Nustatyti sergančiųjų skrandžio vėžiu (adenokarcinoma) TPEF/HPP1 metilintų genų

ekspresiją navikiniame ir nenavikiniame skrandžio audinyje.

4. Ištirti I klasės kancerogeno (PSO, 1994) H. pylori bei ikivėžinės būklės – atrofinio gast-

rito dažnumą sergančių funkcine dispepsija (vyresnių nei 55 metų amžiaus) ligonių tar-

pe Lietuvoje, Latvijoje ir Taivanyje.

5. Įvertinti atrofinio gastrito neinvazinės serologinės diagnostikos metodą, tiriant PGI,

PGII ir G-17 koncentracijas kraujo plazmoje ir palyginti rezultatus su skrandžio gleivi-

nės bioptatų histologinio tyrimo duomenimis.

1.2. Darbo naujumas

Šiame darbe nagrinėjama viena sparčiausiai pastaraisiais metais mokslo pasaulyje besivystan-

čių skrandžio vėžio molekulinės biologijos sričių – epigenetika. Epigenetinių pažaidų nustatymui

taikytas šiuolaikinis pasaulinius standartus atitinkantis tyrimo metodas — metilinimui jautri po-

limerazės grandininė reakcija (MSP). TPEF/HPP1 geno metilinimas gerai ištyrinėtas ir literatūroje

aprašytas tulžies ir šlapimo pūslės, kolorektalinio vėžio (taip pat ir metastazėse kepenyse) atvejais

[19,21,22,23]. Disertacijoje pateikti šio geno metilinimo tyrimai skrandžio adenokarcinoma sergan-

čiųjų audiniuose vieni iš pirmųjų pasaulyje. Darbe kompleksiškai įvertintos TPEF/HPP1 geno me-

tilinimo sąsajos su sergančiųjų skrandžio adenokarcinoma klinikinėmis ir morfologinėmis

charakteristikomis.

Skrandžio vėžys yra labiau paplitęs vyresnių žmonių populiacijose. Tai leidžia daryti prielaidą,

kad atrofija ir žarninė metaplazija (ŽM) labiau susijusios su vyresniu pacientų amžiumi, galbūt dėl ilgai

besitęsiančio H. pylori sąlygoto gastrito. Literatūroje trūksta palyginamųjų duomenų apie H. pylori

paplitimą vyresnių žmonių populiacijose tiek Lietuvoje, tiek ir Latvijoje bei Taivanyje. Gerai žinoma,

kad vyresnių pacientų, sergančių atrofiniu gastritu, H. pylori diagnostika yra pakankamai sudėtinga dėl

mažo šių patogenų kiekio. Vyresniems pacientams H. pylori nustatoma remiantis keliais skirtingais H.

pylori diagnostiniais metodais. Būtent šiame darbe ir tirtas gyventojų, vyresnių nei 55 metai, infekuo-

tumas H. pylori, atrofijos ir ŽM dažnumas ir sunkumas Rytų Europos šalyse (Lietuvoje, Latvijoje) bei

Taivanyje. Nauja šiame darbe dar ir tai, kad visus histologinius skrandžio gleivinės pakitimus „ak-

lai“ vertino 2 skirtingų šalių (Lietuvos ir Suomijos specialistai), o esant nuomonių skirtumui, spren-

dimas buvo priimamas bendru 3 šalių (Suomijos, Latvijos ir Lietuvos) specialistų sutarimu. Tai už-

tikrino duomenų standartizavimą ir rezultatų tikslumą.

9

Taip pat šiame darbe nagrinėjamos atrofinio gastrito neinvazinės serologinės diagnostikos, ti-

riant PGI, PGII ir G-17 koncentraciją kraujo plazmoje, galimybės. Šis metodas yra atsiradęs nese-

niai ir palaipsniui įdiegiamas ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse. Apie šio metodo galimybes šaly-

se, kuriose yra didelis H. pylori infekuotumas, duomenų pateikiama nedaug ir nėra visai aišku, ar jis

tinkamas šiems regionams. Lietuvoje atrofinio gastrito serologinės diagnostikos metodas pritaikytas

pirmą kartą.

10

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Skrandžio vėžys

Kasmet pasaulyje diagnozuojama apie 875000 naujų skrandžio vėžys atvejų ir 645000 miršta

nuo šios ligos [1]. Sergamumas skrandžio vėžiu auga, daugelyje šalių jis išlieka viena dažniausių mirtį

sąlygojančių priežasčių. Remiantis GLOBOCAN duomenimis, 2002 m. Vokietijoje sergamumas

skrandžio vėžiu buvo 15,1 vyrų ir 8,8 moterų tarpe 100000 gyventojų, Lietuvoje, atitinkamai, 25,3

vyrų ir 13,0 moterų tarpe, Latvijoje 24,6 vyrų ir 11,1 moterų tarpe 100000 gyventojų [2]. Lietuvos

vėžio registro duomenimis, 2005 m. Lietuvoje sergamumas skrandžio vėžiu buvo 35,0 vyrų ir 22,1

moterų tarpe 100000 gyventojų, mirtingumas nuo šios ligos 2004 m. – 30,4 vyrų ir 17,8 moterų tarpe

100000 gyventojų [3]. Šis susirgimas vis dar dažniausiai diagnozuojamas vėlyvose stadijose, kuomet

radikali operacija jau nėra galima.

Vakarų šalyse daugumai pacientų nustatomas lokaliai išplitęs skrandžio vėžys, pagal TNM

klasifikaciją apibūdinamas kaip T3-4N0-2M0. Radikali operacija galima maždaug pusei šių pacien-

tų, o dviems trečdaliams 2-3 metų bėgyje stebimi recidyvai [30]. Panaši situacija ir Lietuvoje. Radi-

kalus chirurginis gydymas galimas ir taikomas pacientams, sergantiems I-III stadijos skrandžio vė-

žiu. Chirurginio gydymo tikslas – atlikti skrandžio rezekciją su plačiais sveiko audinio kraštais ir

limfonodektomiją.

Pažengusio skrandžio vėžio sisteminė chemoterapija – dažniausiai paliatyvi priemonė.

Daugelio citostatikų poveikis tyrinėtas gydant skrandžio vėžį. 5-fluorouracilas (5-FU) ir šio-

mis dienomis išlieka centrine skrandžio vėžio chemoterapijos schemų ašimi. Klinikinis efektas (at-

sakas) su 5-FU siekia 20-30 proc., tiek skiriant boliusu, tiek ilgalaikės infuzijos būdu. 5-FU pašali-

niai reiškiniai – mukozitas, viduriavimas, mielosupresija (kuomet taikoma ilgalaikės infuzijos būdu)

ir taip vadinamas rankų-pėdų sindromas (angl. hand-foot syndrome). Kiti citostatikai, kurių akty-

vumas buvo įrodytas gydant skrandžio vėžį, mitomicinas C, antraciklinai (doksorubicinas, epirubi-

cinas), etopozidas. Klinikinis efektas, taikant šiuos medikamentus svyravo nuo 6 iki 30 proc. Kitas

citostatikas plačiai naudojamas gydant skrandžio vėžį – cisplatina, naudojama kombinacijoje su

kitais citostatikais schemose [31,32].

Buvo bandoma taikyti ir naujos kartos citostatikus gydant skrandžio vėžį: taksanus (paklitakselį ir

docetakselį), irinotekaną, tačiau šių medikamentų klinikinis efektas monoterapija buvo nedidelis. II fa-

zės klinikiniai tyrimai atskleidė docetakselio platų citotoksinį spektrą solidinių navikų (kiaušidžių, krū-

ties, skrandžio, galvos-kaklo, plaučių) gydyme. Trijuose II fazės klinikiniuose tyrimuose (dalyvavusių

pacientų skaičius 113), atliktuose JAV, Europoje ir Japonijoje, docetakselio monoterapija gautas 17–24

11

proc. klinikinis efektas gydant išplitusį skrandžio vėžį. Šie rezultatai vertė toliau tirti docetakselio kom-

binacijas su kitais citostatikais [33].

Neseniai atliktas TAX 325 klinikinis tyrimas įrodė chemoterapijos docetakselio, cisplatinos,

5-FU schemos efektyvumą išplitusio skrandžio vėžio gydyme [34,35,36].

2.2. Etiopatogenetiniai mechanizmai

2.2.1. Epigenetinės pažaidos

DNR metilinimas

Epigenetinės pažaidos – tai ląstelės genetinėje medžiagoje, DNR ir chromatine, paveldimi po-

kyčiai, dėl kurių sutrinka genų raiškos reguliacija. Epigenetinės pažaidos, skirtingai nuo genetinių,

nesukelia DNR nukleotidų sekos pokyčių – mutacijų, delecijų ir kitų [37].

Viena pagrindinių epigenetinių pažaidų yra pakitęs DNR metilinimas. DNR metilinimas – tai

poreplikacinis cheminis DNR modifikavimas. DNR metilinimo metu metilo grupė (-CH3) kovalen-

tiškai prijungiama prie citozino anglies molekulės 5 pozicijoje ir susidaro metilintas citozinas, arba

metilcitozinas [38]. Reakcija katalizuojama vieno ar kelių fermentų – DNR metiltransferazių. Meti-

lo grupių donoru ląstelėje esti S-adenozilmetioninas, kuris per metilinimo reakciją virsta S-

adenozilhomocisteinu.

CpG salos

Žmonių ir žinduolių ląstelėse dažniausiai metilinamas citozinas, esantis prieš guaniną (G),

taip vadinamuosiuose citozino ir guanino dinukleotiduose arba CpG dinukleotiduose [39]. Žinduo-

lių ląstelėse tik 3-5 proc. viso citozino yra metilinta [40]. Šios DNR sekos buvo pavadintos CpG

salomis. CpG salose CpG dinukleotidai nustatomi penkis kartus dažniau palyginti su CpG dinukleo-

tidų kiekiu visame genome, ir jose citozinas yra apsaugotas nuo metilinimo. Apie 60 proc. žmogaus

genų, dalyvaujančių svarbiuose ląstelės procesuose, turi minėtas CpG salas.

Dažnai šios salos yra susijusios su šių genų 5’ galo reguliacinėmis sritimis – promotoriais ir

(ar) pirmu egzonu [41]. Todėl manoma, kad nemetilintų CpG dinukleotidų skaičiaus išlaikymas

reguliacinėse geno srityse yra svarbus šių genų raiškos procesui. Genomo sekvenavimo tyrimais

nustatyta, kad žmogaus genome yra 29000 CpG salų. Jose yra daugiau kaip 19 milijonų CpG dinuk-

leotidų [42,43].

CpG saloms apibūdinti buvo pasiūlyti keli apibrėžimai. CpG salos – tai trumpos (apie 200 ba-

zių porų ilgio) DNR sritys. Šiose DNR srityse daugiau kaip 50 proc. visų bazių sudaro citozinas ir

guaninas (o visame genome citozino ir guanino kiekis tesiekia 40 proc.). Jų faktinis, palyginti su

teoriniu, CpG dinukleotidų dažnio santykis lygus 0,6 arba yra didesnis [44,45]. Siekiant atmesti

12

pasikartojančias DNR sekas ir palikti tik susijusias su genais CpG salas, vėliau buvo pasiūlytas

griežtesnis CpG salų apibrėžimas. Tai – DNR sritys, ilgesnės kaip 500 bp, kuriose daugiau kaip 55

proc. visų bazių sudaro citozinas ir guaninas. Jų faktinis, palyginti su teoriniu, CpG dinukleotidų

dažnio santykis lygus 0,65 arba yra didesnis [46].

DNR metilinimo reikšmė

Pirmą kartą metilintas citozinas buvo paminėtas ir išskirtas dar praėjusio amžiaus pradžioje,

tačiau ilgą laiką jo biologinė reikšmė buvo neaiški [47]. Šiuo metu yra žinoma, kad DNR metilini-

mas yra normalus procesas vykstantis įvairiuose organizmuose – nuo bakterijų iki žmogaus. Be to,

vis daugiau duomenų rodo, kad DNR metilinimo pobūdis keičiasi sergant įvairiomis ligomis, tarp jų

ir vėžiu [48].

DNR metilinimas taip pat dalyvauja genų imprintinge [49] ir genų, esančių moterų X chromo-

somoje inaktyvinime [50]. Normaliose ląstelėse tai yra du išimtiniai atvejai, kai genų promotorių

CpG dinukleotiduose esantis citozinas yra metilintas ir tada genų raiška vyksta tik nuo vieno alelio.

DNR metiltransferazės

Vienas svarbesnių epigenetikos mokslo laimėjimų buvo DNR metiltransferazių, kurios katali-

zuoja citozino metilinimą, atradimas. 1988 metais nustatytas pirmasis DNR metiltransferazės genas,

kurio koduojamas produktas, DNR metiltransferazė 1, ilgą laiką buvo vienintelė žinoma DNR me-

tiltransferazė tarp žinduolių [51]. Šiuo metu yra žinomas dviejų tipų DNR metilinimas – palaikoma-

sis (angl. maintenance methylation) ir de novo metilinimas. Palaikomasis metilinimas apibūdinamas

kaip procesas, kurio metu pusiau metilinta DNR virsta visiškai metilinta DNR arba kaip naujai sin-

tezuotos dukterinės nemetilintos DNR grandinės metilinimas, metilinimo profilį nukopijuojant nuo

motininės DNR grandinės. De novo metilinimas – DNR metilinimas, kai abi DNR grandinės yra

nemetilintos. Manoma, kad DNR metiltransferazė 1 užtikrina DNR metilinimo palaikymą ląstelės

ciklo S fazės metu ir yra nuo 5 iki 30 kartų aktyvesnė pusiau metilintos (angl. hemimethylated) pa-

lyginti su nemetilintos (angl. nonmethylated) DNR atžvilgiu [52]. Vėlesnių tyrimų metu buvo nu-

statyta DNR metiltransferazė 2 [53], DNR metiltransferazė 3a ir 3b. Šiuo metu DNR metiltransfera-

zės 2 funkcija ir biologinė reikšmė neaiški, kadangi atliekant eksperimentinius tyrimus in vitro ne-

nustatytas DNR metiltransferazės 2 metiltransferazinis aktyvumas.

DNR metilinimas ir genų raiškos reguliacija

Pirmieji tyrimai, nagrinėję DNR metilinimo reikšmę genų raiškos reguliacijai, paskelbti praė-

jusio amžiaus septintajame dešimtmetyje, nustatė tiesioginį priklausomumą tarp bendro metilcitozi-

no kiekio sumažėjimo genome (DNR hipometilinimo) ir genų raiškos [54]. Papildomi duomenys

gauti atlikus eksperimentinius tyrimus su DNR metiltrasferazių inhibitoriais, citozino analogais 5-

13

azacitidinu ir 5-aza-2-deoksicitidinu. Klasikiniai pavyzdžiai, kaip genų promotorių DNR metilini-

mas dalyvauja šių genų raiškos slopinime, yra genų imprintingas ir X chromosomos inaktyvinimas.

Todėl neatsitiktinai pirmą kartą geno raiškos indukcija DNR metiltransferazės inhibitoriumi 5-

azacitidinu buvo įrodyta ištyrus inaktyvintos X chromosomos genus [55].

Mokslinė literatūra aprašo mechanizmus, kuriais DNR metilinimas, gali slopinti genų raišką:

1. Tiesioginis mechanizmas. DNR metilinimas blokuoja specifiškų tam tikroms DNR se-

koms transkripcijos veiksnių (AP-2, c-Myc/Myn, CREB, E2F, NFkB) prisijungimą prie

geno promotoriaus metilintos DNR [47,56,57].

2. Netiesioginis mechanizmas, kai dalyvauja su metilcitozinu sąveikaujantys baltymai

(angl. methylcytosine-binding proteins ir methylcytosine-binding domain proteins), pvz.,

MeCP1, MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, Kaiso. Šie baltymai nėra specifiški

DNR sekoms, tačiau pasirinktinai jungiasi su metilinta DNR. Be to, baltymai sudaro

kompleksus su histonų deacetilazėmis HDAC1, HDAC2 ir įvairiais transkripcijos ko-

represoriais [58,59]. Žinduolių ląstelėse DNR ir histonai sudaro nukleosomas. Nukleo-

soma – tai 146 bp ilgio DNR, apsisukusi apie baltymų oktamerus, sudarytus iš histonų

H2A, H2B, H3 ir H4 molekulių. Histonų deacetilazės deacetilina histonų lizino liekanas

ir palengvina sąveiką tarp gretimų histonų. Taip formuojasi transkripciškai neaktyvus

kondensuotas chromatinas [60].

DNR metilinimo tyrimo metodai

Šiuo metu egzistuoja daugybė kokybinių ir kiekybinių DNR metilinimo tyrimo metodų. Pra-

diniais metodais buvo nustatomas bendras metilcitozino kiekis genome, o šiuolaikiniais metodais

daugiau tyrinėjamas specifinių DNR sekų metilinimas. Pagrindiniai DNR metilinimo tyrimo meto-

dai [61,62,63] yra šie:

1. Bendro metilcitozino kiekio genome nustatymo metodai:

1.1. Efektyviosios chromatografijos metodai (efektyvioji skysčių chromatografija, efekty-

viosios skysčių chromatografijos ir masės spektrometrijos derinys, efektyvioji kapiliari-

nė elektroforezė), pagrįsti DNR chemine hidrolize iki bazių, jų frakcionavimu ir kieky-

biškai įvertinamu metilcitozino kiekiu.

1.2. Fermentiniai-cheminiai metodai: metilo grupių akceptoriaus analizė (angl. Methyl-

acceptor assay), besiremianti tričiu žymėtos metilo grupės perkėlimu ant nemetilinto ci-

tozino CpG dinukleotiduose naudojant bakterijų DNR metiltransferazę, bei fluorescen-

cinis DNR žymėjimas chloroacetaldehidu, pagrįstas chloroacetaldehido kiekybine reak-

cija sudaryti fluorescencinius etenocitozino ir etenoadenino aduktus.

14

1.3. In situ hibridizacijos metodas, panaudojant metilcitozinui specifinius polikloninius ar

monokloninius antikūnus.

2. Specifinių DNR sekų metilinimo tyrimo metodai:

2.1. Nebisulfitiniai metodai, panaudojant metilinimui jautrias ir nejautrias restrikcijos endo-

nukleazes, kurios kerpa DNR tam tikroje vietoje priklausomai nuo DNR metilinimo

būklės.

2.2. Bisulfitinio modifikavimo metodai. Denatūravus DNR, natrio bisulfitas paverčia nemetilin-

tą citoziną uracilu, o metilintas citozinas lieka nepakitęs. Taip atsiranda skirtingos DNR se-

kos, priklausomai nuo metilinimo būklės. Yra daugybė metodų, kuriais toliau gali būti nu-

statoma, ar natrio bisulfitu modifikuotos DNR specifinės sekos yra metilintos ar nemetilin-

tos. Tai sekvenavimas, kombinuota bisulfitinio modifikavimo ir restrikcijos analizė, (angl.

Combined bisulfite restriction analysis – COBRA), metilinimui jautri vieno nukleotido ilgi-

nimo reakcija (angl. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension), metilinimui

jautri DNR grandinės konformacijos analizė (angl. Methylation-sensitive single-strand con-

formation analysis). Tačiau plačiausiai šiuo metu taikomas metodas – metilinimui jautri po-

limerazės grandininė reakcija ir jos modifikacijos [64]. Po DNR modifikavimo natrio bisul-

fitu metilinta DNR seka skiriasi nuo nemetilintos „laukinės“ (angl. wild type) DNR sekos.

Šiuos pokyčius atpažįsta specifiniai pradmenys (angl. primers). Rezultatai dokumentuojami

atlikus elektroforezę gelyje. Yra keletas šio metodo modifikacijų: „pusiau lizdinė“ (angl.

seminested), „lizdinė“ (angl. nested) dviejų etapų, MSP ir in situ hibridizacijos ar efektyvio-

sios skysčių chromatografijos derinys, kiekybinis MethyLight metodas [65].

3. Genominiai tyrimo metodai [66].

DNR metilinimas ir kancerogenezė

Daugiau nei prieš 17 metų buvo pastebėta, kad vėžinėse ląstelėse yra įvykę DNR metilinimo

pokyčiai, kurie skiriasi nuo normalių ląstelių DNR metilinimo pobūdžio.

Vėžinėse ląstelėse gali būti trys procesai, susiję su DNR metilinimo pokyčiais [47]:

1. Bendro metilcitozino kiekio sumažėjimas genome – genomo hipometilinimas (angl. ge-

nome-wide hypomethylation).

2. Genų promotorinių sekų CpG salų metilinimas (angl. hypermethylation, aberrant me-

thylation).

3. DNR metiltransferazių aktyvumo padidėjimas.

Šie procesai vėžinėje ląstelėje gali vykti kartu, dominuojant genomo hipometilinimui. Tačiau

dar nėra aišku, ar genomo hipometilinimas ir genų promotorių metilinimas yra vieno proceso atski-

ros dalys, ar tai atskiri nesusiję procesai. Žinant, kad šie procesai vyksta skirtingose DNR vietose,

15

manoma, jog minėti procesai tarp savęs nesusiję. Yra duomenų, kad CpG salų metilinimas gali

įvykti anksčiau nei genomo hipometilinimas [67].

Genomo hipometilinimas

Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad koduojančių geno sričių, kurios daugiausia būna meti-

lintos, hipometilinimas menkai koreliuoja su genų raiškos reguliacija. O reguliacinės geno sritys

(geno promotoriai) normaliomis sąlygomis yra nemetilintos ir neveikiamos hipometilinimo proceso.

Manoma, kad tuo gali būti paaiškinamas silpnas ryšys tarp DNR hipometilinimo ir genų raiškos

aktyvinimo [68].

Genų promotorių CpG salų metilinimas

Kaip minėta, per septintąjį ir aštuntąjį praėjusio amžiaus dešimtmečius nustatytas ryšys tarp DNR

metilinimo ir genų raiškos pokyčių. Buvo iškelta hipotezė, kad ir vėžinėse ląstelėse gali vykti panašūs

procesai. Baylin su bendraautoriais pirmieji praėjusio amžiaus aštuntąjį dešimtmetį tai patvirtino,

nustatydami metilintą kalcitonino geno promotorių 11 chromosomos trumpajame petyje solidiniais

navikais ir leukemijomis sergantiems ligoniams [69,90]. Kalcitonino geno reikšmė kancerogenezei

abejotina, tačiau buvo rasta ir daugiau metilintų CpG salų 11q chromosomoje, kurioje yra daugelis NSG

[71]. Tuo metu prieita išvados, kad 11q chromosomoje yra genų promotorių CpG salų metilinimo

„karštieji taškai“, ir DNR metilinimas gali būti vienas esminių NSG inaktyvinimo mechanizmų

navikuose [72]. Iki devintojo praėjusio amžiaus dešimtmečio tiesioginių tyrimų, patvirtinančių minėtą

hipotezę, nebuvo. Pirmasis klasikinis NSG, kurio promotoriuje 1991 metais rasta metilinta DNR, buvo

retinoblastomos genas [73]. 1993 metais atliekant eksperimentus in vitro buvo įrodyta, kad šio geno

promotoriaus metilinimas blokuoja transkripcijos veiksnių sąlygojamą promotoriaus aktyvinimą [74].

Tačiau visiškai aiškus ryšys tarp geno promotoriaus metilinimo ir geno raiškos slopinimo buvo įrodytas

ištyrus kitą klasikinį NSG – von Hippel-Lindau geną, būdingą inkstų vėžiui [75]. Remiantis šio geno

tyrimais, buvo apibrėžti klasikiniai teiginiai, apibūdinantys NSG inaktyvinimo ir šių genų promotorių

DNR metilinimo ryšį [75]:

1. Pažeidžiami NSG.

2. Metilinta genų promotorių DNR nustatoma tik navikiniame audinyje, tačiau ne

atitinkamame sveikame audinyje.

3. Navikuose, kuriuose nustatytas metilintas genas, nerandama atitinkamo geno alelio

koduojančios srities mutacijos.

4. Nenustatoma metilinto geno raiška informacinės ribonukleorūgšties (mRNR) lygyje.

5. Metilintų genų raišką galima atnaujinti paveikus juos demetilinančiais preparatais.

6. Geno promotoriaus metilinimas lemia ekvivalentišką mutacijai pažeisto geno veiklos

slopinimą.

16

Normaliose (nevėžinėse) ląstelėse genų promotorių CpG salų DNR yra nemetilinta, o histonų

molekulės – acetilintos. Tai sąlygoja transkripciškai aktyvią nekondensuoto chromatino struktūrą,

transkripcijos veiksnių (pirminio transkripcijos veiksnio, histono acetiltrasferazių, transkripcijos

koaktyvatorių) prieinamumą prie nemetilintos DNR ir aktyvią geno raišką.

Nemetilintas genų promotorių CpG salas iš abiejų pusių supa metilinti CpG dinukleotidai,

susiję su anksčiau minėtų baltymų ir histono deacetilazių kompleksais, kompaktiška nukleosomų

sandara, deacetilintais histonais. Normalios ląstelės tarp šių sričių turi barjerą, neleidžiantį plisti

metilinimui į geno promotoriaus sritį. Iki šiol nėra visiškai aiškūs šio barjero molekuliniai

mechanizmai, tačiau manoma, kad egzistuoja lokalūs veiksniai, apsaugantys genų promotorių CpG

salas nuo metilinimo. Prie tokių veiksnių priskiriamos transkripcijos veiksnių, pvz., specifinio

baltymo 1 (angl. specific protein 1 – Sp-1), ir CTCCC sujungiančio veiksnio (angl. CTCCC binding

factor – CTCF) prisijungimo prie DNR sritys [76,77,78], taip pat kai kurie baltymai (pvz., histonas

H1e) [79,80]. Keli autoriai nurodo, kad barjerui palaikyti taip pat svarbi aktyvi transkripcija,

aktyvus demetilinimas, replikacijos laikas, lokali chromatino struktūra [81]. Manoma, kad vėžinėse

ląstelėse yra apeinamas šis apsauginis barjeras ir metilinimas plinta į geno promotoriaus sritį. Nors

molekuliniai mechanizmai nėra aiškūs, galvojama, kad tai gali vykti dėl DNR metiltransferazės

aktyvumo padidėjimo arba minėtų transkripcijos veiksnių ir baltymų pokyčių [77,82].

DNR metiltransferazių aktyvumo padidėjimas

T. L. Kautiainen ir P. A. Jones (1986 m.) pirmieji nustatė, kad pelių ir žmogaus navikinėse

ląstelėse DNR metiltransferazės aktyvumas yra daug kartų didesnis nei normaliose ląstelėse. Tai

buvo netikėtas atradimas, nes tose pačiose navikinėse ląstelėse kartu buvo nustatytas genomo

hipometilinimas. Autoriai padarė prielaidą, kad padidėjęs DNR metiltrasferazių aktyvumas sąlygoja

DNR metilinimą „karštuose taškuose“ [83].

Po kelių metų pirmieji duomenys apie padidėjusį DNR metiltransferazės aktyvumą vėžinėse

ląstelėse buvo patvirtinti kitų mokslininkų tyrimais, kuriuose įvairių tipų navikinėse ląstelėse nusta-

tytas didesnis DNR metiltransferazės, mRNR kiekis palyginti su nenavikinių ląstelių kultūromis

[84]. T. Matsumura su bendraautoriais ir vėliau P. M. Vertino su kolegomis nustatė, kad fibroblas-

tams senėjant vyksta DNR hipometilinimas ir mažėja DNR metiltransferazės geno aktyvumas. O

užkrėtus fibroblastus SV40 virusu, išvengiama fibroblastų senėjimo, pailgėja ląstelių gyvenimo

trukmė, kai kurie fibroblastai išvengia krizės ir tampa imortalizuotais. Šiuose SV40 virusu užkrės-

tuose fibroblastuose, palyginti su normaliais fibroblastais, nenustatytas DNR metiltransferazės geno

aktyvumo sumažėjimas [85,86,87]. DNR metiltransferazės aktyvumo padidėjimas yra ankstyvas

kancerogenezės procesas. DNR metiltransferazės taip pat susijusios su vėžio plėtotės procesu. Dau-

gelis mokslininkų, tyrinėdami storžarnės vėžio genezės ir plėtotės procesus, nustatė, kad DNR me-

17

tiltransferazės kiekis didėja pradedant nuo storžarnės normalios gleivinės, toliau – adenomos ir bai-

giant storžarnės vėžiu [84,88].

Manoma, kad padidėjęs DNR metiltransferazės aktyvumas tiesiogiai dalyvauja kancerogenezės

procese, sukeldamas NSG inaktyvinimą dėl šių genų promotorių metilinimo. Atliekant tyrimus su

SV40 virusu užkrėstais fibroblastais, pastebėta, kad fibroblastuose ne tik nemažėja DNR metiltransfe-

razės aktyvumas, bet vyksta „jautrių“ metilinimui CpG salų de novo metilinimas, kai DNR metiltrans-

ferazės aktyvumas padidėja daugiau kaip devynis kartus. Šių pokyčių daugėja laikui bėgant [82]. Kla-

sikiniai eksperimentiniai tyrimai, kuriuose nustatytas ryšys tarp DNR metiltranferazės aktyvumo ir

NSG promotorių metilinimo, buvo atlikti Jaenisch laboratorijoje. Eksperimentinėms pelėms, kurios

turėjo žarnų adenomatozinės polipozės (angl. Adenomatous polyposis coli – APC) geno ir DNR me-

tiltransferazės geno heterozigotines mutacijas, nustatyta 50 proc. mažiau adenomų 6 mėnesius po gi-

mimo ir visiškai nerasta papildomai skiriant 5-azadeoksicitidiną [89]. Iš pradžių manyta, kad mažes-

nis DNR metiltransferazės aktyvumas lemia mažesnį DNR mutacijų dėl metilcitozino virtimo timinu

skaičių. Vėliau prieita išvados, kad eksperimentinėms pelėms mažiau adenomų susiformavo dėl ma-

žesnio NSG inaktyvinimo [89].

TPEF/HPP1 geno charakteristikos ir metilinimas biologiniuose mėginiuose

Kaip buvo minėta, genų metilinimas yra ankstyvas bei vienas iš pagrindinių NSG inaktyvavimo

mechanizmų. Pasitelkus MSP, metilintas DNR fragmentas buvo išskirtas ir vėliau nustatyta, kad tai yra

genas, koduojantis transmembraninį baltymą, turintį epidermio augimo faktoriaus ir folistatino modu-

lius, pavadintas TPEF [19,21]. Šis genas yra 2q33 chromosomoje, kurioje dažnai nustatoma vieta, pra-

randanti heterozigotiškumą įvairios lokalizacijos navikų, tokių kaip stemplės, storžarnės, prostatos, krū-

ties, atvejais. Jo struktūra panaši į tomoregulino, kuris randamas ne tik centrinės nervų sistemos neuro-

nuose ir neuroglijos ląstelėse, bet ir virškinamojo trakto perikriptiniuose miofibroblastuose [90]. Vėlesni

tyrimai parodė, kad TPEF , kuris taip pat žinomas kaip HPP1, yra ekspresuojamas normalioje storžar-

nės gleivinėje, storžarnės vėžio metu jo ekspresijos nelieka. Įdomu tai, kad TPEF/HPP1 geno ekspresi-

jos išnykimas yra susijęs su šio geno 5' regiono metilinimu [19,91]. Taip pat nustatyta, kad TPEF/HPP1

genas dažnai metilinamas tulžies, šlapimo pūslės, skrandžio vėžio atvejais [19,21,22,24]. Šio geno meti-

linimas yra dažnas reiškinys kolorektalinio vėžio tolimosiose metastazėse [23].

Tiksli šio geno funkcija nėra visiškai aiški, tačiau ištyrus jo struktūrą, manoma, kad jis veikia

kaip augimo faktoriaus inhibitorius [21]. Liang'o [21], Young'o [19], Sato [91] atlikti tyrimai byloja,

kad TPEF/HPP1 geno metilinimas yra susijęs su šio geno ekspresijos išnykimu storžarnės vėžio atve-

jais.

Skrandžio adenokarcinomos „pranašingi“ pokyčiai nėra taip ištyrinėti, kaip storžarnės karci-

nogenezėje. Tačiau kaip ir storžarnės vėžiui, taip ir skrandžio vėžiui būdingas reliatyviai didelis

18

mikrosatelitinis nestabilumas (MSI) [92]. TPEF/HPP1 geno metilinimas gali atspindėti ankstyvą

įvykį skrandžio vėžio evoliucijoje. Papildomi skrandžio vėžio tyrimai nustatė metilinimo fenomeno

egzistavimą skrandžio onkogenezėje [20]. Prielaida šiai teorijai išplaukia iš CpG salelių metilinimo

fenotipo (CIMP) ir MSI tarpusavio ryšio, kuris buvo nustatytas storžarnės vėžio atveju [93,94]. Šio

skrandžio vėžio patogenetinio mechanizmo išaiškinimas gali suteikti galimybę kryptingai tirti

priešvėžinius pakitimus, tokius kaip skrandžio adenoma ir displazija, siekiant nustatyti jų piktybiš-

kumo potencialą ir prognozę [20].

TPEF/HPP1 geno metilinimo vaidmuo sveikame audinyje dar tik tyrinėjamas ir šio geno

funkcija nėra pilnai išaiškinta. TPEF/HPP1 pristatoma kaip transmembraninė tirpi molekulė, turinti

epidermio augimo faktoriaus modulį ir du folistatino modulius ekstraceliulinėje terpėje. Be to, ji turi

G baltymą, aktyvuojantį motifą citoplazomos terpėje. TPEF/HPP1 funkcionuoja ir kaip epidermio

augimo faktorius, ir kaip receptorius. Tyrimai pademonstravo, kad TPEF/HPP1 skrandžio ląstelėse

indukuoja ergB4 fosforilinimą iš tirozino [90]. TPEF/HPP1 gali prailginti nervinių ląstelių gyvavi-

mo laiką [95]. Tiksli TPEF/HPP1 geno funkcija nėra išaiškinta, tačiau, kaip ir tumoregulino, epi-

dermio augimo faktoriaus dalis yra c-erbB-4 ligandas, folistatino dalis gali sujungti ir reguliuoti

transformuojamą augimo faktorių β [19]. Galimai TPEF/HPP1 genas atlieka įvairias funkcijas ląs-

telės augimo, brendimo fazėse, adhezijos procese, šio geno inaktyvavimas yra ankstyvas įvykis

virškinamojo trakto navikų vystymesi [20]. Kartu sudėjus, šie duomenys leidžia teigti, kad

TPEF/HPP1 vaidmuo yra svarbus proliferacijos, diferenciacijos ir apoptozės procesuose.

E-cadherino (CDH1) geno mutacijos ir skrandžio vėžys

Nuo 1 iki 3 proc. pacientų, sergančių skrandžio vėžiu, turi vienoką ar kitokią genetinę skrandžio

vėžio predispoziciją. E-cadherino (CDH1) geno mutacijos nustatomos 25 proc. šeimų, turinčioms au-

tosominę dominantinę difuzinio tipo skrandžio vėžio predispoziciją. Ši skrandžio vėžio rūšis vadina-

ma paveldimu (šeimyniniu) difuziniu skrandžio vėžiu. CDH1 yra transmembraninis homodimerinis

baltymas, atsakingas už epitelinių ląstelių adheziją, jis yra chromosomoje 16q22.1 ir yra NSG.

Šeimyninio skrandžio vėžio forma pirmą kartą literatūroje aprašyta 1800 m., kai Bonaparte

šeimoje nustatyti daugybiniai skrandžio vėžio atvejai. 1998 m. P.Guilford su kolegomis pateikė il-

galaikio (nuo 1964m.) Maori genties šeimų (Naujoji Zelandija) stebėjimų duomenis ir pirmasis nu-

statė CDH1 mutacijas [96]. Jauniausias asmuo, kuris sirgo skrandžio vėžiu, buvo 14-metis, o dau-

guma individų gentyje mirdavo iki 40 metų amžiaus.

19

Paveldimo (šeimyninio) difuzinio skrandžio vėžio diagnostiniai kriterijai [97]:

• du arba daugiau dokumentuotų difuzinio skrandžio vėžio atvejų pirmos arba antros eilės

giminaičių tarpe, vienam iš jų vėžys nustatytas iki 50 metų amžiaus arba

• trys ar daugiau dokumentuotų difuzinio skrandžio vėžio atvejų pirmos arba antros eilės

giminaičių tarpe nepriklausomai nuo amžiaus.

2.2.2. H. pylori reikšmė skrandžio vėžio vystymuisi

Visuotinai pripažinta, kad H. pylori yra pagrindinis veiksnys daugiapakopiame skrandžio vė-

žio atsiradimo procese, ypač kai jis yra žarninio tipo ir vystosi distalinėje skrandžio dalyje. 1994 m.

Tarptautinis vėžio tyrimo centras prie PSO H. pylori pripažino I klasės kancerogenu [5]. Šį postula-

tą patvirtina ir pastarojo dešimtmečio tyrimų duomenys [98,99,100]. Skrandžio vėžys išlieka viena

iš pagrindinių mirties priežasčių nuo vėžio išsivysčiusiose Vakarų šalyse, kuriose, kaip pastebėta,

H. pylori užsikrečiama vaikystėje [101].

Sergamumas skrandžio vėžiu tiesiogiai koreliuoja su skrandžio opaligės ir atvirkščiai kore-

liuoja su dvylikapirštės žarnos opaligės sergamumu [102]. Ilgą laiką buvo dirbama šios bakterijos

išnaikinimo linkme, kuriami įvairūs antibiotikų deriniai. Bene daugiausiai Europoje šioje srityje

nuveikė Europos H. pylori studijų grupė, vadovaujama P. Malfertheiner, F. Megraud, O'Morain. Ši

studijų grupė yra detaliai apibrėžusi H. pylori eradikacijos indikacijas [103,104,105]. MALT lim-

fomos gydymą taip pat siūloma pradėti nuo H. pylori eradikacijos [105,106,107].

Apie 50 proc. pasaulio gyventojų yra infekuoti H. pylori [108]. Išsivysčiusiose šalyse infe-

kuotumas šiuo mikroorganizmu dramatiškai mažėja ir siekia 10–30 proc. Lietuvos mokslininkų

duomenimis, infekuotumas tarp sergančiųjų funkcine dispepsija 1995–1998 m. sieke 80 proc., tarp

20–22 metų studentų medikų – 60 proc.[109], tarp 11–12 metų vaikų – 30 proc. [110], tarp 50–60

metų kraujo donorų – 70–80 proc.[111]. Tačiau nėra duomenų apie pastarųjų metų vyresnių žmonių

infekuotumą šia bakterija.

Skrandžio vėžys yra vyresnių žmonių liga. Iš to galima daryti prielaidą, kad skrandžio gleivi-

nės atrofija ir ŽM taip pat susijusi su amžiumi, galbūt su ilgai besitęsiančiu H. pylori gastritu. Gerai

žinoma, kad H. pylori diagnostika yra apsunkinta asmenims, kuriems yra skrandžio gleivinės atrofi-

ja, dėl mažo šio mikroorganizmų kiekio. Todėl įvairių H. pylori diagnostinių testų duomenys gali

būti skirtingi ir H. pylori nustatoma remiantis kelių teigiamų testų duomenimis. 1 paveiksle (pav.)

pateikiamas histologinis H. pylori diagnostikos metodas.

20

1 pav. H. pylori skrandžio epitelio paviršiuje, dažyta Gimza metodu. H. pylori, pažymėtos raudo-

nom rodyklėm, lyg mažytės „drumzlės“ epitelio paviršiuje, gleivėse

2.2.3. Skrandžio gleivinės atrofija ir žarninė metaplazija

Atrofija – gleivinės liaukučių skaičiaus sumažėjimas ar visiškas išnykimas, kuris gali būti

daugiažidininis (tiek kūne, tiek antruminėje srityje) ar lokalizuotas tik druskos rūšties (HCl) sekre-

tuojamoje gleivinėje. ŽM vystosi, kai skrandžio gleivinės epitelyje atsiranda taurinių ląstelių. Atro-

finio gastrito mikroskopinis vaizdas pateikiamas 2 pav.

21

2 pav. Atrofinis gastritas, dažymas hematoksilinu eozinu (HE), matosi šviesios taurinės ląstelės,

pažymėtos baltomis rodyklėmis

Atrofija ir ŽM apibūdinamos kaip ikivėžinės būklės [4]. Skrandžio gleivinės atrofija ir ŽM yra

dažnesnės šalyse, kuriose yra didelis sergamumas skrandžio vėžiu. Iki šiol nėra žinoma, ar atrofija yra

grįžtamas procesas ar ne, ir kokio laipsnio atrofija yra ta riba, kai dar galimas grįžtamasis procesas.

Skrandžio vėžys yra dažnesnis vyresnių asmenų populiacijose, taigi galima daryti prielaidą, kad atro-

fija ir ŽM tiesiogiai susijusi su amžiumi, galbūt dėl ilgai besitęsiančio H. pylori gastrito. Taip pat

mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie atrofijos ir ŽM dažnumą vyresnių asmenų populiacijose.

Nedaug duomenų yra pateikiama apie atrofijos ir ŽM dažnumą Rytų Europos šalyse, kuriose serga-

mumas skrandžio vėžiu yra pakankamai didelis, kaip ir Baltijos šalyse bei Taivanyje [2,112].

22

2.3. Skrandžio vėžio patomorfologija

Skrandžio vėžio išplitimas vertinamas pagal TNM klasifikaciją [113].

Patologinė pTNM klasifikacija:

pT – pirminis navikas

pTX – pirminio naviko neįmanoma įvertinti histologškai

pT0 – pirminio naviko histologinių požymių nėra

pTis – carcinoma in situ

pT1 – navikas infiltravęs lamina propria ar pogleivį

pT2 – navikas infiltravęs raumeninį sluoksnį (pT2a) ar subserosą (pT2b)

pT3 – navikas infiltravęs serozą (visceralinę pilvaplėvę) neinfiltruodamas gretimų struktūrų1,2,3

pT4 – navikas infiltravęs gretimas struktūras1,2,3

Pastabos:

1. Navikas gali infiltruoti raumeninį sluoksnį išplisdamas į gastrokolinį ir gastrohepatinį

raiščius arba didžiąją bei mažąją taukines neperforuodamas dengiančios šias struktūras

visceralinės pilvaplėvės. Šiuo atveju navikas klasifikuojamas kaip T2. Jei navikas penet-

ruoja dengiančią raiščius ir taukinę visceralinę pilvaplėvę, jis klasifikuojamas, kaip T3.

2. Skrandžio gretutinės struktūros yra blužnis, gaubtinė žarna, diafragma, kasa, pilvo sie-

na, antinkstis, inkstas, plonosios žarnos ir retroperitoninis tarpas.

3. Išplitimas į dvylikapirštės žarnos ar stemplės sienelę klasifikuojamas pagal gylį invazijos į

bet kurį iš šių organų, taip pat į skrandžio sienelę.

pN – metastazės sritiniuose limfmazgiuose

pNX – metastazių sritiniuose limfmazgiuose neįmanoma įvertinti histologiškai

pN0 – metastazių sritiniuose limfmazgiuose histologinių požymių nėra

pN1 – yra metastazių 1-6 sritiniuose limfmazgiuose

pN2 – yra metastazių 7-15 sritiniuose limfmazgiuose

pN3 – yra metastazių daugiau kaip 15 sritinių limfmazgių.

M – tolimosios metastazės.

Naviko diferenciacijos laipsnis nustatomas remiantis PSO klasifikacija [114]. Naviko diferen-

ciacijos laipsnis G:

GX – naviko diferenciacijos laipsnio neįmanoma įvertinti

G1 – gerai diferencijuotas navikas

G2 – vidutiniškai diferencijuotas navikas

G3 – blogai diferencijuotas navikas

G4 – nediferencijuotas navikas

23

Histologinis tipas nustatomas remiantis PSO klasifikacija skirta adenokarcinomoms [114] ir

Lauren'o klasifikacija [115].

Žarninio ir difuzinio tipo skrandžio vėžys

1965 m. Lauren pateikė skrandžio vėžio histologinę klasifikaciją, paremtą vėžinių ląstelių di-

ferenciacijos laipsniu ir stromos reakcija [115]. Pagal Lauren klasifikaciją išskiriami šie tipai:

1. Žarninis (intestinalinis) tipas: gerai diferencijuotas, su žarnine metaplazija ir stipria stro-

mos reakcija, navikinės ląstelės sudaro tubulines, į liaukutes panašias struktūras (3 pav.).

3 pav. Žarninio tipo adenokarcinoma, dažymas HE, plonom rodyklėm pažymėta ŽM, t. y. skrandžio gleivinės liaukų epitelis su žarninio tipo taurinėm ląstelėm, o storos rodyklės nukreiptos į navikines

liaukutes, t. y. vidutiniškai diferencijuotą žarninio tipo adenokarcinomą pagal Lauren

2. Difuzinis tipas: blogai diferencijuotas, be liaukinės struktūros, blogai ribotas, be stro-

mos reakcijos, pavienės navikinės ląstelės infiltruoja sienelę, išsidėstydamos tarp fibro-

zinio audinio ir nesudarydamos naviko (4 pav.).

24

4 pav. Difuzinė žiedinių ląstelių blogai diferencijuota adenokarcinoma, atlikta imunohistocheminė

reakcija su plataus spektro citokeratinų žymekliu, žydra spalva dažosi normalaus ir navikinio epite-lio citoplazma bei citoplazminė membrana, rodyklėmis pažymėtos navikinės ląstelės

3. Mišrus tipas – tai tarpinis variantas tarp šių dviejų tipų.

Žarninio tipo skrandžio vėžys gali vystytis iš šių ikivėžinių ligų: atrofinio gastrito, perniciozinės

anemijos, skrandžio opos, skrandžio polipų, Menetrier ligos. Gerai žinomas skrandžio vėžio rizikos

faktorius yra H. pylori infekcija, dėl kurios vystosi atrofija, atsiranda kita ikivėžinė būklė – ŽM. 1992

m. Correa pasiūlė kaskadinį žarninio tipo skrandžio vėžio patogenezės modelį, pavaizduotą 5 pav.

[116]. Correa su bendraautoriais atžymi, kad egzistuoja nuosekli seka histomorfologinių pokyčių, ve-

dančių į skrandžio vėžį. Remiantis šia teorija, išsivysčius lėtiniam gastritui, atrofijai, ŽM ir galiausiai

displazijai, išsivystys skrandžio vėžys. Šis modelis vis dar diskutuojamas, nes nėra visiškai aišku, ar

išvardinti pokyčiai vystosi nuosekliai, pereidami iš vienos pakopos į kitą, ar galima tiesioginė trans-

formacija į skrandžio vėžį. Šios teorijos autoriai pateikia rizikos faktorių koncepcinį modelį, kaip įvai-

rios histomorfologinių pokyčių pakopos skirtingai padidina skrandžio vėžio vystymosi riziką [117].

25

Skrandzio vezys

Sunki epitelio displazija

Zarnine metaplazija

Hipochlorhidrija (pH > 5)

Letinis atrofinis gastritaas

Pavirsinis gastritas

H.pylori

Normali skrandzio gleivine

5 pav. Correa kaskadinis žarninio tipo skrandžio vėžio patogenezės modelis

Difuzinio tipo skrandžio vėžio atveju H. pylori gastritas yra neatrofinis, nesivysto metaplazija.

Šios rūšies skrandžio vėžiui prasidėti svarbiausi yra molekuliniai mechanizmai – specifiniai ląstelių

sulipimo (adhezijos ) pokyčiai.

2.4. Ikivėžinių skrandžio būklių – gleivinės atrofijos ir žarninės metaplazi-jos invazinė diagnostika

Klinikinėje praktikoje atrofija ir ŽM patvirtinama histologiškai ištyrus daugybines skrandžio

gleivinės biopsijas, paimtas endoskopijos metu, pagal 1994 m. Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus kla-

sifikaciją [25,26].

Atrofijos ir ŽM gradacijos laipsniai pagal Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus klasifikaciją patei-

kiami 2.4.1 lentelėje ir 6 pav.

26

2.4.1 lentelė. Atrofijos ir ŽM gradacijos laipsniai pagal Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus klasifikaciją

Histologinis skyrius Endoskopinis skyrius ūminis gastritas lėtinis gastritas specialios formos

antruminis gastritas pangastritas kūno gastritas topografija

etiologija topografija morfologija aprašomieji terminai endoskopinės gastritų formuluotės

H. pylori, autoimuninis, vaistai (NPV), alkoholis, tulžies refliuk-sas, infekcija (ne H. pylori) kriptogeninis

pangastritas antruminis gastritas kūno gastri-tas

graduojami morfologiniai požymiai: • uždegimas • aktyvumas • atrofija • ŽM • H. pylori tankis negraduojami morfologi-niai požymiai: • nespecifiniai erozijos edema hemoragijos • specifiniai granuliomos

• edema • eritema • gleivinės trapumas • eksudatas • paviršinės erozijos • tikrosios erozijos • grūdėtumas • raukšlių hiperplazija • raukšlių atrofija • matomas pogleivio krau-jagyslių tinklas • pogleivio hemoragijos

• eriteminis/eksudacinis • erozinis tikrosios pa-

viršinės • atrofinis • hemoraginis • refliuksinis • hiperplastinis

Gradacijos laipsniai: nėra, lengvas, vidutinis, sunkus

6 pav. Vizualinės histologinių lėtinio gastrito požymių gradavimo skalės

Kaip jau buvo minėta, šie tyrimai yra pakankamai brangūs naudoti atrankinei patikrai.

27

2.5. Neinvazinė serologinė atrofinio gastrito diagnostika

Kraujo plazmos pepsinogenas I ir pepsinogenas II

Pepsinogenas (pepsino pirmtakas) yra dviejų pagrindinių tipų I ir II. Elektroforezeje

išssiskiria septynios skirtingos PG izoformos: penkios PGI ir dvi PGII. PGI yra sitezuojamas

išimtinai skrandžio kūno gleivinėje, tuo tarpu PGII gali būti sintezuojamas ne tik skrandžio kūno

gleivinėje, bet ir antruminėje dalyje bei pradinėje dvylikapirštės dalyje Brunner’io liaukų. Didesnė

dalis PG yra sekretuojama į skrandžio spindį ir metabolizuojama į aktyvų pepsiną, labai maža dalis

PG patenka į kraują. Skrandžio gleivinės atrofijos atveju sumažėja liaukučių, gaminančių PG, jos

pakeičiamos piliorinėmis liaukomis ar ŽM. Tai sąlygoja PGI koncentracijos sumažėjimą, tuo tarpu

PGII koncentracija išlieka stabili arba sumažėja nežymiai, arba netgi padidėja. PGI koncentracija

kraujo plazmoje arba PGI/PGII santykis atspindi skrandžio kūno gleivinės liaukučių skaičių, tuo

remiantis nustatomas skrandžio gleivinės atrofijos laipsnis. Kuo atrofija labiau išreikšta, tuo

plazmos PGI koncentracija ir PGI/PGII santykis mažesnis [118].

Kraujo plazmos gastrinas 17

G-17 sekretuojamas išimtinai skrandžio antruminės dalies G ląstelių, G-17 koncentracija

sumažėja skrandžio antruminės dalies atrofijos atveju. Jeigu yra antruminės dalies gleivinės atrofija,

G-17 koncentracija nepasikeičia po stimuliacijos baltymu, kai tuo tarpu sveikų asmenų G-17

koncentracija po stimuliacijos baltymu padidėja nuo 4 iki 5 kartų lyginant su bazine koncentracija.

Dėl nepaaiškinamų priežasčių skrandžio antruminės dalies atrofija susijusi su didesne skrandžio

vėžio rizika, ši rizika, sergant atrofiniu gastritu, daug didesnė negu tų asmenų, kurių antruminės

dalies gleivinė yra normali [119].

Atrofinio gastrito serologinė diagnostika GastroPanel testu

Sipponen su kolegomis iš Helsinkio Centrinės universitetinės ligoninės Patologijos skyriaus

bei BIOHIT kompanijos pateikė duomenis, kaip remiantis PGI, PGII, PGI/PGII santykio, G-17, o

taip pat antikūnių prieš H. pylori (IgA/IgG) koncentracija kraujo plazmoje, galima nustatyti: ar yra

gastritas, ar jis atrofinis, ar ne, kurioje skrandžio dalyje yra atrofija, ar pacientas infekuotas H. pylo-

ri. Skrandžio gleivinės atrofijos serologinių žymenų koncentracijų tikėtini pokyčiai įvairių skran-

džio patologijų atvejais pateikiami 2.5.1. lentelėje.

28

2.5.1 lentelė. Skrandžio gleivinės atrofijos serologinių žymenų koncentracijų tikėtini pokyčiai įvai-rių skrandžio patologijų atvejais

PGI PGII PGI/PGII G-17 (F)

G-17 (S)

H. pylori IgA/IgG

Skrandžio kūno atrofinis gastritas maža maža didelė Skrandžio antruminės dalies atrofinis gastritas maža maža didelė Skrandžio kūno ir antruminės dalies atrofinis gastri-tas

maža maža maža maža

Neatrofinis gastritas didelė Neatrofinis gastritas H.pylori infekuotumas didelė didelė Gastroezofaginio refliukso liga maža

F – bazinis (angl. fasting-nevalgęs); S – stimuliuotas (angl. stimulated-stimuliuotas).

Normali serologinių žymenų koncentracija nurodo, kad skrandžio gleivinė sveika ir funkcio-

nuoja gerai. Maža PGI koncentracija ir/ar mažas PGI/ PGII santykis atspindi skrandžio kūno atrofi-

nį gastritą, sąlygotą H. pylori. Retais atvejais tai gali būti sąlygota autoimuninės ligos. Skrandžio

vėžio rizika padidėjusi. Didelė PGI koncentracija atspindi didelę HCl sekreciją, kuri gali pažeisti ir

stemplės gleivinę. Protonų siurblio inhibitoriai taip pat gali padidinti PGI lygį. Maža G-17 F kon-

centracija atspindi didelę bazinę HCl sekreciją. Yra padidėjusi gastroezofaginio refliukso ligos, Bar-

rett metaplazijos ir kitų ligų, susijusių su padidintu rūgštingumu, rizika. Didelė G-17 F koncentraci-

ja atspindi skrandžio kūno atrofiją arba protonų siurblio inhibitorių vartojimą. Maža G-17 S kon-

centracija atspindi antruminės skrandžio dalies atrofiją ir/ar H. pyliori sąlygotą antruminės dalies

gastritą. Didelis antikūnių prieš H. pylori IgA/IgG titras atspindi H. pylori infekcijos buvimą arba

tai, kad šios bakterijos eradikacija buvo nesėkminga. Tačiau ir po sėkmingos H. pylori eradikacijos

ilgą laiką (mėnesiais) antikūnių prieš H. pylori IgA/IgG titras lieka padidėjęs. Didelė PGII koncent-

racija atspindi uždegiminį procesą, sąlygotą bakterijos, priešuždegiminių medikamentų, stiprių al-

koholinių gėrimų.

Suomių atliktame multicentriniame klinikiniame tyrime, kuriame dalyvavo 404 funkcine dis-

pepsija sergantys pacientai, buvo palygintas atrofinio gastrito serologinės diagnostikos metodas

GastroPanel sistema su skrandžio gleivinės bioptatų histologiniu tyrimu [29]. Nustatytas testo 79

proc. jautrumas, 91 proc. specifiškumas, TPV 64 proc., NPV 93 proc. palyginus su histologinio ty-

rimo rezultatais [29]. Be to pagerėja gastroskopijos tikslumas, kai papildomai atliekamas GastroPa-

nel testas, kadangi tyrėjas gauna papildomos informacijos apie atrofijos lokalizaciją ir sunkumą.

29

3. MEDŽIAGA IR TYRIMO METODAI

Disertacija sudaryta iš trijų dalių:

1. Epigenetinio tyrimo, nustatant TPEF/HPP1 metilintų genų ekspresiją navikiniame ir

nenavikiniame skrandžio audinyje bei sergantiems funkcine dispepsija.

2. Atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumo ir sunkumo, infekuotumo H. pylori

dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe tyrimo,

3. Neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimo, tiriant

PGI, PGII, G-17 koncentraciją kraujo plazmoje, tyrimo.

3.1. Tiriamųjų kontingentas

3.1.1. I dalis – epigenetinis tyrimas

Epigenetiniame tyrime dalyvavo pacientai, sergantys skrandžio vėžiu (adenokarcinoma), ku-

rie buvo gydyti Kauno medicinos universiteto Gastroenterologijos ir Chirurgijos klinikose bei Kau-

no medicinos universiteto onkologijos ligoninėje. Visiems ligoniams skrandžio vėžio diagnozė bu-

vo patvirtinta histologiškai. Skrandžio audiniai buvo paimti 48 pacientams (28 vyrams ir 20 mote-

rų), sergantiems ne kardijinės dalies skrandžio vėžiu, endoskopijos arba chirurginės operacijos me-

tu. Pacientų amžiaus vidurkis – 65 metai (amžius nuo 26 iki 84 metų). Skrandžio audiniai imti iš

pačio naviko ir histologiškai normalaus audinio, mažiausiai 2 cm atstumu nuo naviko krašto, t.y. be

navikinių ląstelių infiltracijos. Papildomai skrandžio audiniai buvo imami endoskopijos metu iš 11

pacientų, sergančių funkcine dispepsija, be vėžio anamnezėje (6 moterų ir 5 vyrų, kurių amžiaus

vidurkis 46 metai, amžius nuo 24 iki 66 metų). Operacijos ar endoskopijos metu paimti audiniai

buvo tuoj pat užšaldyti skystame azote ir iki tyrimo laikomi – 80°C temperatūroje.

Skrandžio vėžio išplitimas vertintas pagal TNM klasifikaciją [113]. Histologinis tipas nustaty-

tas remiantis PSO klasifikacija skirta adenokarcinomoms [114] ir Lauren'o klasifikacija [115]. Na-

viko diferenciacijos laipsnis nustatytas remiantis PSO klasifikacija [114]. Tirtų asmenų klinikinės

morfologinės charakteristikos pateiktos 3.1.1.1 lentelėje. Visų 48 skrandžio vėžiu ir 11 funkcine

dispepsija sergančių pacientų paimti audiniai buvo skirti molekulinės biologijos tyrimams.

30

3.1.1.1 lentelė. Tirtų asmenų skrandžio vėžio klinikinės morfologinės charakteristikos

Požymis Pacientai, sergantys skrandžio vėžiu adenokarcinoma (n=48) Amžius (metai)

vidurkis 65 nuo iki 26–84

Lytis vyrai/ moterys 28/20

Lauren'o klasifikacija žarninis/ difuzinis/ mišrus tipas 21/19/ 8

Naviko diferenciacijos laipsnis G 1 / 2 / 3 / 4 / x 5 / 18 / 19 / 2 / 4

TNM pT kategorija 1 / 2 / 3 / 4 / x 3 / 17 / 22 / 3 / 3

TNM pN kategorija 0 / 1 / 2 / 3 / x 9 / 23 / 10 / 2 / 4

3.1.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infe-kuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe Atrofinio gastrito tyrime dalyvavo dispepsijos simptomų turintys pacientai, vyresni nei 55

metai. Tyrime negalėjo dalyvauti asmenys, sirgę pepsine opalige, skrandžio vėžiu bei skrandžio

vėžiu sirgusių asmenų pirmos eilės giminaičiai, pacientai po skrandžio rezekcijos, po H. pylori era-

dikacijos, vartoję protonų siurblio inhibitorius ir (ar) antibiotikus likus mažiau kaip 1 mėn. laiko iki

įtraukimo į tyrimą.

Iš viso atrofinio gastrito tyrime Lietuvije, Latvijoje, Taivanyje dalyvavo 322 pacientai: 52 iš

Taivanio, 171 iš Latvijos, ir kaip jau buvo minėta 99 iš Lietuvos. Pacientų amžiaus vidurkis – 66,4

± 7,5 metų. Iš jų 227 (70 proc.) moterys ir 95 (30 proc.) vyrai. Lietuvių amžiaus vidurkis – 66,5 ±

7,5 metai, (amžius nuo 55 iki 88 metų), 73 (74 proc.) moterys ir 26 (26 proc.) vyrai. Taivanio paci-

entų tarpe – 24 (46 proc.) moterys ir 28 (54 proc.) vyrai, Latvijos pacientų tarpe – 130 (76 proc.)

moterų ir 41 (24 proc) vyras.

3.1.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas Serologinių žymenų tyrimas buvo atliktas 80 Lietuvos, Latvijos, Taivanio atrofinio gastrito

tyrime dalyvavusių Lietuvos pacientų, kurių amžiaus vidurkis 66,5 ± 7,5 metai (amžius nuo 55 iki

88 metų), iš jų – 20 vyrų ir 60 moterų. Visiems pacientams buvo paimtas iš venos kraujas. Iš kraujo

išskirta plazma saugota šaldiklyje –80°C temperatūroje Kauno medicinos universiteto Gastroentero-

logijos klinikoje iki tolimesnių tyrimų BIOHIT kompanijos laboratorijoje Helsinkyje (Suomija).

Visi tyrimai atlikti gavus leidimus iš Kauno regiono Biomedicininių tyrimų etikos komiteto

(protokolo Nr. 12/2004 (tyrimo protokolo pakeitimai patvirtinti etikos komiteto protokolu Nr.P1-

12/2004) ir Nr. 41/2005) ir paciento sutikimą. Kiekvienas pacientas užpildė informuoto asmens su-

tikimo formą.

31

3.2. Tyrimo metodai

3.2.1. I dalis – epigenetinis tyrimas

Skrandžio audinių histologinis tyrimas

Įtariant skrandžio vėžį (adenokarcinomą) endoskopijos metu paimta nuo 5 iki 10 skrandžio

gleivinės gabalėlių iš naviko kraštų histologiniam ištyrimui.

Operacijos metu skrandžio audiniai histologiniam ištyrimui dėl navikinių ląstelių infiltracijos

paimti iš vizualiai normalaus skrandžio audinio mažiausiai 2 cm atstumu nuo naviko krašto, t.y. be

tikėtinos navikinių ląstelių infiltracijos.

Iškart po paėmimo skrandžio gabalėliai patalpinti fiksavimui į neutralaus 10 proc. buferinio

formalino tirpalą stikliniuose buteliukuose. Buteliukai su fiksuotais skrandžio audiniais pristatyti į

Kauno medicinos universiteto klinikų ir Kauno medicinos universiteto onkologijos ligoninės Pato-

logijos skyrius. Patologijos skyriuose skrandžio gabalėliai buvo dažomi HE. Skrandžio vėžio histo-

loginis tipas nustatytas remiantis PSO klasifikacija skirta adenokarcinomoms [114] ir Lauren'o kla-

sifikacija [115]. Naviko diferenciacijos laipsnis nustatytas remiantis PSO klasifikacija [114]. Prepa-

ratus vertino Kauno medicinos universiteto klinikų Patologijos skyriaus gydytojas patologas Dai-

nius Jančiauskas ir Kauno medicinos universiteto onkologijos ligoninės Patologijos skyriaus vado-

vas gydytojas patologas Vidmantas Baltrėnas.

Skrandžio audinių paėmimas epigenetiniam tyrimui

Operacijos metu iš pačio skrandžio naviko ir histologiškai normalaus skrandžio audinio, esan-

čio mažiausiai 2 cm atstumu nuo naviko krašto, t. y. be navikinių ląstelių infiltracijos, paimti 0,25–

0,5 cm2 audinių gabalėliai. Skrandžio gabalėliai nedelsiant dedami į kriomėgintuvėlius, kurie tuoj

pat užšaldomi skystame azote ir iki tyrimo laikomi šaldiklyje – 80°C temperatūroje.

Endoskopijos metu tiriamoji medžiaga buvo imama standartinėmis Olympus arba Pentax

kompanijų biopsinėmis žnyplėmis, paimti skrandžio gleivinės gabalėliai nedelsiant dedami į krio-

mėgintuvėlius, kurie tuoj pat užšaldomi skystame azote ir iki tyrimo laikomi šaldiklyje –80°C tem-

peratūroje.

Molekulinės biologijos tyrimai buvo atliekami Magdeburgo Otto-von-Guericke universiteto

Gastroenerologijos, hepatologijos ir infekcinių ligų klinikos mokslinėje laboratorijoje (Vokietija).

DNR išskyrimo etapai:

1. Tiriamosios medžiagos degradavimas.

2. Tiriamosios medžiagos lizavimas.

3. Baltymų ir kitų kontaminuojančių medžiagų pašalinimas.

4. Visiškai grynos DNR eliuavimas

32

DNR išskyrimas iš šviežiai šaldyto skrandžio audinio

Genominės DNR išskyrimui iš audinio buvo naudotas rinkinys “NucleoSpin® Tissue“ (Ma-

cherey-Nagel, Vokietija). DNR iš audinių išskirta taikant proteinazės K metodiką [28].

Šviežiai šaldyti navikinio ir nenavikinio skrandžio vėžiu (adenokarcinoma) sergančiųjų bei

funkcine dispepsija sergančiųjų skrandžio audinio gabalėliai (masė ~25 mg) susmulkinami, atitirpi-

nami kambario temperatūroje, ir sudedami į mėgintuvėlius. Į mėgintuvėlius su skrandžio audinio

gabalėliais įpilama 180 μl lizavimo buferinio tirpalo T1 (tirpalo sudėtis - Macherey-Nagel kompani-

jos nuosavybė) ir 25 μl proteinazės K. Mėgintuvėlio turinys sumaišomas purtykle ir inkubuojamas

termostate per naktį 56°C temperatūroje, kas 20 min. centrifuguojant 10 sekundžių 1350 aps./min.

greičiu. Kitą dieną į mėgintuvėlius su lizuotais skrandžio audinio gabalėliais, po tirpalo maišymo

purtykle 15 sekundžių, įpilama 200 μl lizavimo buferinio tirpalo B3 (tirpalo sudėtis – Macherey-

Nagel kompanijos nuosavybė). Tirpalas 15 sekundžių maišomas purtykle ir inkubuojamas termosta-

te 10 min. 70°C temperatūroje. Po inkubavimo į mėgintuvėlius įpilama 210 μl 96–100 proc. etano-

lio tirpalo. Gautas tirpalas 15 sekundžių maišomas purtykle. Tirpalas supilamas į filtravimo stulpe-

lius (NucleoSpin®Tissue column), patalpintus į centrifugavimo mėgintuvėlius. Filtravimo stulpeliai

centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min. (11000×g) greičiu. Gautas filtratas su centrifugavimo mėgin-

tuvėliais pašalinamas. Filtravimo stulpeliai įdedami į naujus centrifugavimo mėgintuvėlius, atsar-

giai įpilama 500 μl plovimo buferinio tirpalo BW (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos

nuosavybė) ir centrifuguojama 1 min. 9000 aps./min. (11000×g) greičiu. Gautas filtratas pašalina-

mas. Įpilama 600 μl plovimo buferinio tirpalo B5 (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos

nuosavybė). Filtravimo stulpeliai centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min. (110000×g) greičiu. Gautas

filtratas pašalinamas ir filtravimo stulpeliai dar kartą centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min.

(110000×g) greičiu siekiant pašalinti etanolio likučius. Tuomet filtravimo stulpeliai įdedami į nau-

jus mėgintuvėlius ir DNR išplaunama tiesiai ant filtravimo stulpelio gelio-silikono membranos su-

pylus 100 μl eliuavimo buferinio tirpalo BE (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos nuosa-

vybė), pakaitinto iki 70°C. Filtravimo stulpeliai su mėginiais 1 min. inkubuojami kambario tempe-

ratūroje, po to centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min (11000×g) greičiu. Ši procedūra iš viso buvo

atliekama du kartus. Iš kiekvieno mėginio eliuavimo metu gauta po 100 μl eliuato su išskirta DNR.

DNR modifikavimas natrio bisulfitu atliekamas iš karto arba eliuatas laikomas – 20°C tempe-

ratūroje iki tyrimo.

Išskirtos DNR koncentracijos ir kokybės nustatymas

Prieš DNR modifikavimą natrio bisulfitu spektrofotometru buvo išmatuota DNR, išskirtos iš

šviežiai šaldyto navikinio ir nenavikinio skrandžio audinio bei funkcine dispepsija sergančiųjų

skrandžio audinio, koncentracija.

33

DNR koncentracijai matuoti spektrofotometru 5 μl tirpalo su išskirta DNR atskiedžiama su 65

μl dukart distiliuotu vandeniu. Dukart distiliuotas vanduo naudojamas kaip kontrolė.Mėginių optinis

tankis matuojamas spektrofotometru esant bangos ilgiui 260 nm ir 280 nm. DNR tirpalai sugeria

ultravioletinius spindulius 260 nm srityje. Optinių tankių santykis 260 nm/280 nm rodo DNR tirpa-

lo švarumą. Šis santykis turėtų būti ne mažesnis kaip 1,8.

Siekiant įvertinti DNR vientisumą ir kokybę taip pat atliktas išskirtos DNR elektroforetinis

frakcionavimas agarozės gelyje ir vizualizavimas.

Agarozės gelis ruošiamas iš 1 gramo agarozės miltelių (Universal Agarose, PeQlab Biotechno-

logie GmbH, Erlagen, Vokietija, katalogo Nr. 35–1030) ir 100 ml buferio 1×TAE. Mišinys pašildo-

mas 3 min. 800 W mikrobangų krosnelėje. Įdedama 3 μg etidžio bromido tirpalo (Merck, Darmstadt,

Vokietija, katalogo Nr. 1116080030). Agarozės tirpalas išmaišomas, išpilamas į gelio formą, įstato-

mos šukutės ir paliekama sustingti kambario temperatūroje (apie 45 min.). Iš sustingusio gelio ištrau-

kiamos šukutės ir padėkliukas su paruoštu agarozės geliu įdedamas į elektroforezės aparatą, užpila-

mas 1×TAE buferinio tirpalo, kad visiškai apsemtų gelį. Į kiekvieną DNR mėginį (10 μl tirpalo) įde-

dami 4 μl nešančiojo buferinio tirpalo (Loading Mix). Šio buferinio tirpalo sudėtis: dažai – 0,03 proc.

bromfenolio mėlynasis ir 0,03 proc. ksileno cianolis, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 60 proc. glicerolis, 60

mM EDTA. Jis su 30 proc. glicerolio tirpalu skiedžiamas santykiu 1:10. Elektroforezei agarozės gely-

je vartotas molekulinės masės žymuos L, turintis skirtingo ilgio fragmentus: 1118, 881, 692, 501, 489,

404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67 bp. 1 μl molekulinio masės žymens tirpalo sumaišomas su 19 μl

dukart distiliuoto vandens bei 4 μl nešančiojo buferio. Mėginiai ir molekulinės masės žymuo įneša-

mas į gelio šulinėlius. Elektroforezė vykdoma režimu: įtampa – 90 V, trukmė – 45 min. DNR elektro-

foretinis frakcionavimas agarozės gelyje vizualizuojamas ultravioletiniais spinduliais, naudojant vaiz-

do dokumentacijos sistemą, pateikiamas 7 pav. Duomenys išsaugomi.

7 pav. DNR elektroforetinis frakcionavimas agarozės gelyje

DNR modifikavimas natrio bisulfitu

DNR, išskirta iš skrandžio audinio, buvo modifikuota natrio bisulfitu. Dėl šios modifikacijos

nemetilintas citozinas virsta uracilu, kuris PGR ciklo metu virsta timinu, o metilintas citozinas lieka

nepakitęs. Šis modifikavimas atliktas naudojant CpGenomeTM DNR modifikavimo rinkinį (angl.

CpGenomeTM DNA Modification Kit, Chemicon® International, katalogo Nr. S7820).

34

Pirma diena. Ištirpinus 1 g natrio hidroksido 8,3 ml dukart distiliuotame vandenyje paruo-

šiamas 3 M natrio hidroksido tirpalas. Apskaičiavus reikiamą kiekį šviežiai paruošiamas DNR mo-

difikavimo reagento I tirpalas, kuriame yra natrio bisulfitas (vienam mėginiui reikia 227 mg reagen-

to I (reagento I sudėtis kompanijos Chemicon® International nuosavybė), ištirpinto 571 μl dukart

distiliuotame vandenyje). Gautas tirpalas kiekvienam mėginiui įpylus 20 μl 3M natrio hidroksido

tirpalo pašarminamas iki pH=5,0. Modifikavimui paimamas 1 μg DNR, išskirtos iš skrandžio audi-

nio, ir užpilamas 100 μl dukart distiliuotu vandeniu. Tuomet į Ependorfo mėgintuvėlius su mėgi-

niais įpilama 7 μl 3 M natrio hidroksido tirpalo. Gautas tirpalas išmaišomas pipete. DNR denatūra-

cijai Ependorfo mėgintuvėliai inkubuojami termostate 10 min. 50°C temperatūroje. Į kiekvieną mė-

gintuvėlį įlašinama po 550 μl šviežiai paruošto DNR modifikavimo reagento I tirpalo ir mėginiai

sumaišomi purtykle. Mėgintuvėliai su mėginiais inkubuojami termostate 16 valandų 50°C tempera-

tūroje. Natrio bisulfitas sąlygoja nemetilinto citozino sulfoninimą (HO3S – grupės įjungimą į mole-

kulę) ir hidrolitinį deamininimą.

Antra diena. Po inkubavimo (t.y. kitą dieną) modifikuota DNR išgryninama. 1 μl β-merkapto-

etanolio tirpalas atskiedžiamas 20 ml dukart distiliuotu vandeniu. Apskaičiavus reikiamą kiekį švie-

žiai paruošiamas DNR modifikavimo reagento II tirpalas (vienam mėginiui reikia 1,35 g DNR modi-

fikavimo reagento II (sudėtis kompanijosChemicon® International nuosavybė), ištirpinto 750 μl du-

kart distiliuoto vandens ir 1 μl β-merkaptoetanolio tirpalo). Šviežiai paruošiamas 20 mM natrio hid-

roksido ir 90 proc. etanolio tirpalas, sumaišant 900 μl 100 proc. etanolio, 93,4 μl dukart distiliuoto

vandens ir 6,6 μl 3M natrio hidroksido tirpalus.

DNR modifikavimo reagentas III (tirpalo sudėtis kompanijos Chemicon® International nuosa-

vybė) sumaišomas purtykle. Šis reagentas yra mikro dalelių nešėjas (angl. micro-particulate carrier),

kuris esant reagentui II suriša DNR. Po 5 μl reagento III įpilama į kiekvieną mėgintuvėlį su mėginiu.

Tuomet įpylama 750 μl šviežiai paruošto DNR modifikavimo reagento II, gaunamas tirpalas keturis

kartus sumaišomas pipete. Ependorfo mėgintuvėliai su mėginiais inkubuojami 10 min. kambario tem-

peratūroje ir centrifuguojami 10 sekundžių 5000×g greičiu. Tirpalas visiškai nusiurbiamas nuo nuosė-

dų. Įpilama 1 ml 70 proc. etanolio, tirpalas trumpai maišomas purtykle ir centrifuguojamas 10 sekun-

džių 5000×g greičiu. Dar kartą visiškai pašalinamas tirpalas nuo nuosėdų. Pastaroji procedūra iš viso

kartojama tris kartus. Plaunant 70 proc. etanolio tirpalu pašalinamos druskos. Tuomet mėgintuvėliai

centrifuguojami 2 min. 13000×g greičiu ir nusiurbiamas visas likęs tirpalas paliekant nuosėdas. De-

sulfoninimui ant nuosėdų užpilama 50 μl 20 mM natrio hidroksido ir 90 proc. etanolio tirpalo. Tirpa-

las trumpai maišomas purtykle ir inkubuojamas 5 min. kambario temperatūroje. Ependorfo mėgintu-

vėliai su mėginiais centrifuguojami 10 sekundžių 5000×g greičiu. Tirpalas nusiurbiamas paliekant

nuosėdas. Ant nuosėdų užpilama 1 ml 90 proc. etanolio, centrifuguojama 10 sekundžių 5000×g grei-

čiu. Tirpalas dar kartą pašalinamas paliekant nuosėdas. Plovimo 90 proc. etanoliu procedūra iš viso

35

kartojama du kartus. 90 proc. etanolio tirpalas pašalina likusias druskas. Tuomet Ependorfo mėgintu-

vėliai su mėginiais centrifuguojami 3 min. 13000×g greičiu ir nusiurbiamas visas likęs tirpalas palie-

kant nuosėdas. Atviri Ependorfo mėgintuvėliai paliekami 10-20 min. kambario temperatūroje, kad

pilnai išsigaruotų etilo alkoholis. Ant nuosėdų užpilamas 50 μl buferis TE (10mM (hidroksimetil)

aminometano (Tris), 1 mM etilendiamino tetraacto rūgšties (EDTA), pH 8,0). Mėgintuvėliai trumpai

maišomi pustykle, inkubuojami termostate 15 min. 60°C temperatūroje ir centrifuguojami 3 min.

13000×g greičiu. Tirpalas su išskirta DNR perkeliamas į naujus Ependorfo mėgintuvėlius, kurie iškart

patalpinti į – 20°C temperatūros šaldiklį. Tokioje temperatūroje DNR galima saugiai laikyti iki 2 mėn.

Modifikuota DNR toliau buvo naudojama MSP.

Metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija ir metilinimo analizė

Skrandžio audinyje MSP metodu buvo tirta TPEF/HPP1 geno promotorių metilinimo būklė,

t.y. ar genas metilintas ar nemetilintas. DNR modifikavimas natrio bisulfitu leidžia atskirti metilin-

tas DNR sekas nuo „laukinio tipo“ (angl. wild type), t.y. pradinių nemetilintų DNR sekų. Šiuos po-

kyčius atpažįsta specifiniai pradmenys. Atlikus bisulfito konversiją, aprašytą Eads su bendraauto-

riais [120,121,122], DNR analizuota MethyLight technika. MethyLight metodika yra jautri, speci-

fiška, fluorescencija paremta realaus laiko PGR sistema, kuri naudojant tris DNR oligonukleotidus

(vedantis pradmuo, atvirkštinis pradmuo, žymuo), skirtingai besijungiančius prie bisulfitu modifi-

kuotos DNR (priklausomai nuo pradinės DNR metilinimo statuso), skaičiuoja pasirinktos DNR sri-

ties metilinimą. TPEF/HPP1 genui nustatyti MethyLight analizėje naudoti pradmenys pateikti

3.2.1.1 lentelėje. TPEF/HPP1 geno seka pavaizduota 8 pav.

3.2.1.1 lentelė. TPEF/HPP1 genui nustatyti MethyLight analizėje naudoti pradmenys

Vedantysis pradmuo 5´-TTTTTTTTTCGGACGTCGTTG-3´ Atvirkštinis pradmuo 5´-CCTCTACATACGCCGCGAAT-3‘ Žymuo 6FAM-AATTACCGAAAA CATCGACCGA-BHQ1

36

cagagactcc tgccgagtta gaccttctct cgtcgcccca ggtcaccggc catccggcaaagacccgagt aaggaacgca gggtcactgc ctgggccaac aaatggagcc cgctctcccc ttcccggacg ccgctgcccg gccgatgctc ccggcaaccc acccgcggcg tatgcagagg agcctttctc tttctctcag accacttgtc ccgaccaatc tgaccttcca aacacatctgac-cgcacctc ccaggtggac cactaataggc tacgggct ggagaggagc gggtgatgaggagagggatt caaacctgcg aacgcttggg tgggtcgnag ctgcggggg gcctgggagga gagagggga gaagagagaa ggaaggagag cgcctgccgg gatggctgag ctgcctcggc gagcagcctt ggggttgcac gctcttgtgg gagatgctgc tgttgcttcc aggtcggcaag agcggttct aacaccatcg cctctcaccc tctttcctgt aaatccctag agaaacgtcc ctggcctctc cgccgcgaca ttcccagcct gcatccccct acagcctagg cggcgcgctc ccgcacgctg gagcgccggt cgccagcagg acgccctctc ccgcgccgac tcgcccctct cgtgccctgc tgctgctgct cctctgacac ctccgccccc accatctcca gctcggagag acgccaccca gccgcggccg cactcgcggc ccggggtcac gcgcggaaga ggggcgctag tccggacccc gcttcggtag ggggcgtcct ggagcggaga gtgaggcgaa tggtatatga gtgtgcgggt agcccaccct gaagcccgag cttctcactt gagccatccc cgcctagccc cactcgggcc agcgcctgcg agcgagccca tctgtggctt ccgcggccgc ctcctccttg catccttgca cctcctcgtc gacccctccc tcccgggacc tgcatcctgc tccaccaatc agagcccgac tgcctcttcc cacgtgaccc cgggcgggct gaggacctgc tgcttcccaa acgccagagg gatgcgggcg gcagagctcg agaggcggct gccgggctgc ggggcgcctt gactctccct ccaccctgcc tcctcgggct ccactcgtct gcccctggac tcccgtctcc tcctgtcctc cggcttccca gagctccctc cttatggcag cagcttcccg cgtctccggc gcagcttctc agcggacgac cctctcgctc cggggctgag cccagtccct ggatgttgct gaaactctcg agatcatgcg cgggtttggc tgctgcttcc ccgccgggtg ccactgccac cgccgccgcc tctgctgccg ccgtccgcgg gatgctcagt agcccgctgc ccggcccccg cgatcctgtg ttcctcggaa gccgtttgct gctgcagagt tgcacgaact agtcatg

8 pav. TPEF/HPP1 geno seka (genų banko Nr. AF242221). Pradmenų jungimosi vietos paryškintos juodai, zondo jungimosi vieta – pabraukta ir pasvirusi, 1 egzono seka – pabraukta

Teigiamai kontrolei buvo naudota universali, 100 proc. metilinta DNR (angl. CpGenome uni-

versal Methylated DNA (Chemicon, Temecula, CA), neigiamai kontrolei – nemetilinta žmogaus

spermos DNR. Paraleliai buvo atliekama kontrolinė β aktino (ACTB) geno PGR analizė, naudojant

specifinius šiam genui pradmenis, kurie pateikiami 3.2.1.2 lentelėje.

3.2.1.2 lentelė. β aktino (ACTB) geno PGR analizei naudoti pradmenys

Vedantysis pradmuo 5‘-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3‘ Atvirkštinis pradmuo 5‘-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3‘

Paskaičiuojamas (priklausomai nuo tiriamų DNR mėginių skaičiaus) ir paruošiamas PGR

reakcijos mišinys (3.2.1.3 lentelė), kurio bendras tūris 1 pavyzdžiui yra 50 μl.

3.2.1.3 lentelė. PGR reakcijos mišinys Reagentai Koncentracija 1 pvz (μl)

Žaliasis buferis 5× 10 μl dNTP 0,2 pmol 1 μl MgCl2 25 mM 4 μl Vedantysis pradmuo 100 pmol/μl 1 μl Atvirkštinis pradmuo 100 pmol/μl 1 μl Go Taq® Flexi DNR polimerazė 5 U/μl 0,25 μl ddH2O Iki 50 μl 37,5 µl Bendras tūris 50 μl

Paruoštas PGR reakcijos mišinys išpilstomas į 0,2 ml mėgintuvėlius po 48 μl ir pridedama 2 μl

cDNR. Mėgintuvėliai centrifuguojami 30 s esant 13 000 aps./min ir sudedami į PGR aparatą Light-

37

Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Vokietija). Nustatomas temperatūrų režimas genų pa-

gausinimui: TPEF/HPP1 geno PGR protokolas pateikiamas 3.2.1.4 lentelėje, β aktino (ACTB) geno –

3.2.1.5 lentelėje.

3.2.1.4 lentelė. PGR protokolas TPEF/HPP1 geno amplifikacijai

Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius Procesas 94 3 min. 1 Pradžia (predenatūracija) 94 30 sek. Denatūracija 55 45 sek. Pradmenų prisijungimas 72 60 sek.

25 DNR grandinės sintezė (elongacija)

72 7 min. 1 Galutinė elongacija 4 Pauzė Pabaiga

3.2.1.5 lentelė. PGR prot