análise de fitoplâncton, cianobactérias e clorofila do... · • heterogeneidade espacial:...
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Análise de Fitoplâncton, Cianobactérias eClorofila
Maria do Carmo Carvalho
Gerente – Setor de Comunidades Aquá[email protected] ou [email protected]
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Importância na Análise da Comunidade Fitoplanctônica e Clorofila
�Verificação da causa da coloração, turbidez, odores indesejáveis e partículas visíveis da água;
� Subsidiar a interpretação de análises químicas, por exemplo, corre-lacionando à presença de certas formas com a deficiência ou super-saturação de oxigênio na água;
� Explicar a obstrução de filtros e ajudar no projeto e operação de esta-ções de tratamento de água e esgoto;
� Atendimento legislação (CONAMA 357/2005 e Portaria 2914/2012);
� Fornecer dados sobre o estado trófico de um sistema aquático;
� Subsidiar a investigação de causas de mortandade de peixes;
� Indicativo de problemas relacionados a toxicidade na água, comidentificação de espécies potencialmente tóxicas;
� Estudos ecológicos.
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FITOPLÂNCTONCARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
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Requisitos da TécnicosQualidade
• Pessoal;• Acomodações e meio ambiente;• Referências normativas;• Amostragem;• Instalação e Equipamentos;• Métodos de ensaio e calibração e validação;• Rastreabilidade de medição;• Garantia da qualidade de resultados - controles
internos e externos;• Cálculo da Incerteza;• Apresentação de resultados.
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PESSOAL
O pessoal deve ser competente para:
• Operar equipamentos específicos;• Realizar os ensaios;• Avaliar resultados.
=> Conhecimento técnico-científico atualizado.
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TREINAMENTO/CAPACITAÇÃO
• Profissionais: nível superior habilitado;
• Específico sobre o tema;
• Ministrado por especialistas.
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PLANEJAMENTO AMOSTRAL, COLETA E PRESERVAÇÃO
• Heterogeneidade Espacial: -vertical
- horizontal;
- Heterogeneidade Temporal.
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A : Nata na margem e na superfície;
B: População dispersa no epilímnio e nata no sedimento;
C e D: floração sub-superficial (metalímnio);
E: População dispersa homogeneamente na coluna - mistura;
F: nata sob gelo;
Florações de Cianobactérias
Localização de Florações em um reservatório raso
Adaptado de http://pubs.usgs.gov/sir/2008/5038/pdf/SIR2008-5038.pdf
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Florações de Cianobactérias
Res. Barra Bonita, SP
Res. Billings, SP
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Amostragem
Variáveis correlatas: alíquotas da mesma tomada
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EQUIPAMENTOSMicroscópio Invertido
- Objeto visualizado por baixo, o
revólver das objetivas está sob a
platina.
- Luz transmitida: fonte de luz,
coletor e condensador
intercambiáveis com longas
distâncias de trabalho.
Câmara de Utermöhl: espessura de lamínula de 0,17 mm.
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Microscópio Comum
Limita o aumento do objeto a ser analisado
Volume limitado
objetiva de longo alcance
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Metodologia de Análise
3. Calibrações, verificações, cálculos e fatores
Tanto para Sedgwick-Rafter como para câmara de Utermöhl,
deve ser realizada a calibração do Retículo de Whipple.
O Retículo de Whipple é importante pois pode ser usado para
medir organismos e delimitar área da leitura.
Lâmina Micrométrica (deve ser calibrada ao menos uma
antes da primeira utilização )
Fonte: www.reticles.com
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Metodologia de AnáliseCalibrações, verificações, cálculos e fatores
10 colunas
Retículo de Whipple
5 colunas
50µm
1 coluna = 50/3 = 16,67µmO retículo = 16,67 x 10 = 166,7µm1 quadradinho = 16,67/5= 3,3µm
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Câmara de Utermöhl: fatores de concentração
A = π . R2 =
A = 3,1416 x (1,3)2 = 5,03093 cm2
onde: F = FatorA = área da câmara a”= área do(s) transecto(s) lidoV = volume da câmaraR= raio da câmara de Utermöhl
0,0167 cm 2,6cm
F = A / a” = 5,3093 / (0,0167 x 2,6) =
v 2F = 5,3093 / 0,0434 = 61,17
2
F = A / a”
v
Metodologia de AnáliseCalibrações, verificações, cálculos e fatores
CÂMARA DE 2 ML
1,3 cm
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CÂMARA DE 5 ML 10 CAMPOS
3. Calibrações, verificações, cálculos e fatores
Metodologia de Análise
Câmara de Utermöhl: fatores de concentração
F = A / a” = 5,3093 / (0,0192 x 2,6) =
v 5F = 5,3093 / 0,0499 = 21,27
5
onde:
F = FatorA = área da câmara a”= área do(s) transecto(s) lidoV = volume da câmara
onde:
F = FatorA = área da câmara a”= área retículo de WhippleV = volume da câmara
F = A / 10a” = 5,3093 / 10 x (0,0192)²=
v 2F = 5,3093 / 0,00368 = 721,37
2
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Fitoplâncton
- Preservação da amostra até24h após a coleta, com lugolou formol;
- Visualização da amostra vivaem epifluorescência.
- Preparo da CâmaraHomogeneização
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Metodologia de Análise
Contagem em Câmara de Utermöhl
Transectos
Campo
Não contaesteorganismo
Conta esteorganismo
5. Estratégias de Contagem
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Metodologia de Análise
Estratégias de Contagem
Contagem em Câmara de Utermöhl ou Sedgwick Rafter
Contagem de Organismos em Campos
� Mais rápido ;� Número de campos
depende do erro aceitável.� Se não for distribuído
corretamente pode aumentar efeito
Contagem de Organismos em Transectos
� Demanda maior tempo, amostra muito densa, há maior esforço (não pode parar o transecto no meio!);
� Minimiza os efeitos da distribuição não homogênea.
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Tempo de Sedimentação Câmaras de Utermohl
Tempo por centímetro de altura da câmara
Autor
1,5 horas Lund et al. (1958)
3 horas Utermohl
4 horas Nauwerk (1976)
4 horas Willen (1976
3 a 4 horas Lawton et al. (1999)
Miller, C. 2011
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Tempo de Sedimentação para câmaras de Sedgwick-Rafter
Tempo de sedimentação Autor
7 minutos Woelkerling,Kowal e Gough(1976)
24 minutos ASTM (2004)
15 minutos APHA (2012)??
15 minutos LeGresley e McDermott (2010)
Miller, C. 2011
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O QUE FAZER?????
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Contagem
Transectos
Campo
Não contaesteorganismo
Conta esteorganismo
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Estratégias de Contagem
� Diluição - Amostra com grande quantidade de organismos variados
coloniais e filamentosos;
� Retículo de Whipple – Quantas células tem em um quadro do retículo e e
conta os quadrados e multiplica pelas células estabelecidas;
� Hidróxido de Potássio ou Sódio – Técnica utilizada para contagem das
cianobactérias coloniais;
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Metodologia de Análise
Colônias
Filamentos
Retículo de Whipple
Estratégias de Contagem
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Determinação da clorofila a e feofitina a
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Filtro ou membrana de fibra de vidrode 47mm de diâmetro com porosidadeentre 0,45 a 1,0 µm.
Colocar a membrana no porta-filtro (com o vácuo já em funcionamento)
Homogeneizar delicadamente a amostra
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HOMEGENEIZAÇÃO
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Este procedimento deve ser realizado minimizando-se a exposição à luz.Utiliza-se um sistema de bomba a vácuo e porta filtro.
Clorofila-a : Filtração
Sistema de vácuo
Kitassato
Porta filtro
- Proveta graduada;- Filtro/membrana de fibra de vidro com porosidade entre 0,45 - 1,0 µm.- Pinça;- Envelope Pardo – guardar em recipiente preto ou envolvido em papel alumínio com sílica gel.
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Clorofila-a : Extração
Neste procedimento é utilizado como solvente orgânico a acetona 90%.Se necessário acertar o pH da acetona 90% entre 8 a 9 utilizandoHidróxido de amônio 25%. Tempo: mínimo de 2 h máximo 24h
- Macerador ou homogeneizador de tecidos (com haste de aço para triturar o filtro)
- Acetona 90%- Tubos de vidro âmbar com tampa rosqueável
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Clorofila a (µg/L)= 26,73 . (Dc664-Dc665) . v ( V.L)
Feofitina a (µg/L)= 26,73 . [(1,7. Dc665) – Dc664] v
(V.L)
Equações monocromáticas
Onde:V= Volume, em litros, da amostra filtradav= Volume, em mL, de acetona 90% usada para extraçãoL= Caminho óptico, em cm da cubeta
espectrofotométrica usadaDc664= Densidade óptica a 664nm, corrigidaDc665= Densidade óptica a 665nm, corrigida
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Resultados- Clorofila
Método Analítico 1ª via 2ª via 3ª via Média
Espectrofotométrico. 6,94 10,95 - 8,95Espectrofotométrico. 57,98 61,03 57,98 59,00 Espectrofotométrico. 63,10 67,40 73,80 68,10 Espectrofotométrico. 69,69 69,53 72,42 70,55 Espectrofotométrico. 6,32 13,02 - 9,67Espectrofotométrico. 50,00 52,00 52,00 51,33 Espectrofotométrico. 65,68 49,55 - 57,61 Espectrofotométrico. 24,17 19,54 21,31 21,67 Espectrofotométrico. 59,70 59,70 57,92 59,11 Espectrofotométrico. 55,37 46,30 67,00 56,22Espectrofotométrico. 54,58 54,79 54,13 54,50 Espectrofotométrico. 58,55 58,71 59,14 58,80 Espectrofotométrico. 72,17 77,52 74,84 74,84 Espectrofotométrico. 20,80 22,60 21,70 21,70
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Resultados de Clorofila – IETÍndice de Estado Trófico
Resultados
1ª via 2ª via 1ª via Média
6,94 10,95 - 8,95
57,98 61,03 57,98 59,00
63,10 67,40 73,80 68,10
69,69 69,53 72,42 70,55
6,32 13,02 - 9,67
50,00 52,00 52,00 51,33
65,68 49,55 - 57,61
24,17 19,54 21,31 21,67
59,70 59,70 57,92 59,11
55,37 46,30 67,00 56,22
54,58 58,71 59,14 54,50
58,55 58,71 59,14 58,80
72,17 77,52 74,84 74,84
20,80 22,60 21,70 21,70
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Resultados Cianobactérias
Método Analítico 1ª via 2ª via 3ª via Média
Utermöhl. 20.766,00 19.981,00 26.915,00 22.554,00Utermöhl. 65.051,00 74.309,00 69.492,00 69.617,33Utermöhl. 204.416,00 116.964,00 183.109,00 168.163,00Utermöhl. 24.296,00 - - 24.296,00Utermöhl. 141.336,00 163.835,00 145.866,00 150.345,67Utermöhl. 77.516,00 76.696,00 59.299,00 71.170,33
Sedgwick-rafter. 239.391,00 227.652,00 212.783,00 226.608,67Sedgwick-rafter. 132.370,00 144.463,00 105.535,00 127.456,00
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Legislações – CONAMA 357/2005
VARIÁVEIS CLASSE I CLASSE II CLASSE III
CLOROFILA a 10 µµµµg/L 30µµµµg/L 60µµµµg/L
Densidade deCianobactérias
20.000céls./mL
50.000céls./mL
100.000céls./mL
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Portaria 2914/2012
CONTROLE DAS CIANOBACTÉRIAS E CIANOTOXINAS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO PÚBLICO DEVIDO AO POTENCIAL TÓXICO
Freqüência mensal se o nro. Cianobactérias < 10.000 céls./mLsemanal > 10,000 céls.mL
Proibição do uso de algicidas para o controle de cianobactérias se o númerode células > 20.000 céls./mL
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Interferência nos resultados Clorofila
� Armazenamento/transporte da amostra encaminhada pelos laboratórios� Homogeneização� Porosidade do filtro� Volume filtrado� Extração – solvente e maceração� Método de determinação (acidificação) – Determinação de feofitina??� Cálculos (uso do volume errado na equação)� Transcrição errada dos dados� LQ - recomendação de pelo menos 1µg/L máximo
LQ de <0,06 a 0,21µg/L
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Interferência nos resultados Cianobactérias
� Técnico sem o treinamento adequado� Homogeneização� Equipamento – Microscópios (calibração e cálculos)� Tempo de sedimentação� Estratégia adotada não adequada� Variabilidade da amostra (tamanho dos organismos)� Transcrição errada dos dados (fatores, diluição, etc)
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Obrigada a todos pela atenção!