análisis de antibióticos polipeptídicos en matrices de ......conclusiones en la extracción, la...
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Antoni Rubies
Laboratorio de la Agencia de Salud Pública de Barcelona.
CNA, 30 Mayo 2017
Análisis de antibióticos polipeptídicos
en matrices de origen animal
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I. IntroducciónII. ObjetivosIII. Espectrometría de Masas de Alta Resolución (HRMS)IV. Separación cromatográficaV. Tratamiento de muestraVI. ValidaciónVII. Conclusiones
Indice
1
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Antibióticos Polipeptídicos
Bacitracin A (1422.693 Da)
Colistin A (1169.460 Da); Colistin B (1155.434 Da)
Polymyxin B1 (1203.477 Da); Polymyxin B2 (1189.450 Da)
Usados en la producción ganadera
Están compuestos por aminoácidos
Son efectivos contra microorganismosgram-negativo and gram-positivos
Tienen PM: 1000-2000 Da
Son mezclas de isómeros
Colistina, también llamada Polimixina E
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
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Límite máximo de Residuo (37/2010/UE)
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
- Polimixina B: no existe LMR publicado para se considera tolerancia = 0- Bacitracina: LMR únicamente en conejo (150 µg/kg)- Colistina: legislada en todas las matrices a 150 µg/kg
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Bacitracina A, únicamente Reglamento 37/2010/UE incluye Bacitracina A, B, C
Polimixina: el certificado incluye abundancias:- B1: 69,7%, B2:15,9%, - B3:3,2%, B1-I: 6,1%
Colistina: son 2 picos cromatográficos, pero el certificado no detalla abundanciasColistina A: Polimixina E1Colistina B: Polimixina E2
Certificados de análisis
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
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Otros límites regulados
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Unión aduanera, Eurasia
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Cloranfenicol < 0,0003 mg/kgΣ (Tetraciclinas) < 0,01 mg/kgBacitracina < 0,02 mg/kg
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
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Planes de control (UD) 2016:121 muestras en matrices diversas: Hígado, grasa, corazón, músculo, lengua, bacon ahumado, riñón…
Necesidad de un método de análisis transversal!
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
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EN CUANTO AL PNIR 2016:EVALUACIÓN DE LOS LABORATORIOS DE REFERENCIA
Antibióticos polipeptídicos no incluidos!
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Métodos Analíticos
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Son métodos de LC-MS/MS: QqQ
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Etapas de los Métodos de Análisis
Pesada de la muestra
Extracción
Clean-up
LC-MS/HRMS
Mezcla hidro-orgánica
Metanol o Acetonitrilo
Se acidifica para precipitar las proteinas
Cartuchos SPE de fase polimérica
Columna C18
Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo
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Objetivo
Desarrollar un método sencillo, robusto y rápido para el análisis de antibióticos polipeptícidos en rutina y aplicarlo a campañas de muestreo
• Optimizar los parámetros del espectrómetro de masas
• Optimizar la separación cromatográfica
• Optimizar el tratamiento de la muestra
• Validar el método siguiendo la Decisión 2002/657/EC
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
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HRMS: Error masa < 5 ppmRs: 70000 (m/z= 200 FWHM)HESI+, CaracteristicA: moleculas cargadas doble y triplemente : [M+H3]3+, [M+H2]2+
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Bacitracina A
Colistina A/BPolimixina B1/B2
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Parámetros de HRMS
Cuantificación: Iones triplemente cargados
Confirmación: Iones doblemente cargados
No fragmentan
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Selección de la Columna C18
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Columna C18
Hypersil Gold aQ C18
Kinetex C18
Polymyxin B2 (m/z = 397.2520)
Colistin A (m/z = 390.5952)
Polymyxin B1 (m/z = 401.9230)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0Time (min)
0
0
2040
60
80
1000
20
40
60
80
1000
2040
60
80
1000
20
40
40
80
100 2.53
2.65
2.71
2.83
4.75
20
40
6080
100
Bacitracin A = (m/z= 474,9232)
Colistin B (m/z = 385,9234 )
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Fases Móviles
Fases móviles descritas por Kaufmann:
Fase Móvil A: 5% acetonitrilo, 0.3% ácido fórmico y 0.01% ácidotrifluoroacético en agua
Fase Móvil B: 5% agua, 0.3% ácido fórmico, and 0.01% ácido trifluoroacéticoen acetonitrilo
Fases móviles escogidas:Fase Móvil A: 0.2% ácido fórmico enagua
Fase Móvil B: 0.2% ácido fórmico enacetonitrilo
Ventajas/inconvenientes: Picos más estrechos y mejor
sensibilidad
No es necesario el lavado entre inyecciones
La fuente de ionización se ensucia más
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Fase Móvil
Pares iónicos!
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Optimización del Gradiente
Gradiente (tiempo, %B):
Gradiente (tiempo, %B):
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Gradiente
Tiempo (min) %B
0-1,5 10
1,6 25
9 50
9-11 98
11-15 10
Tiempo (min) %B
0-2 8
7 20
8 30
11-12,5 100
12,5-14 8
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Condiciones Cromatográficas finales
Columna: Kinetex C18
Fase Móvil A: 0.2% ácidoformico en agua
Fase Móvil B: 0.2% formic acid in ACN
Gradiente (tiempo, %B): (0-1, 10), (1.5-3.5, 20), (4-6.5, 90), (7-9, 100), (9.1-11, 10)
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Disolución de Extracción
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Extracción
Disolvente Orgánico: Metanol o Acetonitrilo?
Ácidos para precipitar las proteínas: HCl, H2SO4 o HCOOH?Pesar la muestra
Extracción
Clean-up
LC-MS/HRMS
HCOOH (de izquierda a derecha): 0.1 M, 0.5 M, 1.0 M
H2SO4 (de izquierda a derecha): 0.1 M, 0.5 M, 1.0 M
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Disolución de Extracción
Pesar la muestra
Extracción
Clean-up
LC-MS/HRMS
Disolución de Extracción: metanol: agua (1:3)
Ácido para precipitar las proteínas : 0.5 M H2SO4
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Extracción
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Cartuchos SPE de fase polimérica
Pesar la muestra
Extracción
Clean-up
LC-MS/HRMS
Cartuchos SPE de fase polimérica: Bond Elut Plexa (200 mg, 6 mL)
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
SPE
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Evaporación
Pesar la muestra
Extracción
Clean-up
LC-MS/HRMS Evaporación: Evaporar hasta sequedad
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Evaporación
Reproducibilidad
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Selectividad / Especificidad
La matriz pescado presenta una mayor respuesta respecto al resto de matrices; se excluye del estudio de validación.
La matriz conejo se validará por separado (LMR para BCT).
Una vez excluídas la matriz pescado y conejo, se evalúa la respuesta del resto de matrices.
RSD para todos los analitos es <20%.
Se demuestra la equivalencia de matrices y se lleva a cabo una únicavalidación.
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
Selectividad / Especificidad
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LOQ y Linealidad
Introducción Objetivos HRMS Separación CL Tratamiento Muestra Validación Conclusiones
LOQ / Linealidad
Requisitos: Bacitracina: 20 µg/kg (UD); Bacitracina (conejo): LMR= 150 µg/kg Colistina: LMR= 150 µg/kg
Estudio: dopaje a concentraciones crecientes partiendo de 1 µg/kg 50 µg/kg
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Precisión
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Precisión
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Veracidad, CCα y CCβ
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Veracidad / CCα / CCβ
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Incertidumbre y aplicación del método
El método está incluído en la cartera de servicios del LASPB
Se han analizado 121 muestras de rutina (2016), y todasellas han resultados negativas (< CCα) para todos losanalitos.
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Incertidumbre / Aplicación
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EXPRESIÓN DE RESULTADOS
LMR= 150 µg/kg
Estudio proporción Colistina A/B
- Muestras dopadas (75-225) µg/kg: 28%-72%
- Stándares en disolución: 60%-40%
Para expresar resultados:Colistina como suma de (A+B)
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Conclusiones
En la extracción, la adición de ácido sulfúrico al 0.5 M ha demostradomejorar la extracción de los compuestos, gracias a la precipitación de la proteína.
Evaporar los extractos a sequedad presenta una mayor reproducibilidad.
Se ha conseguido una buena separación cromatográfica usando la columnaKinetex C18 y las fases móviles 0.2 % ácido fórmico en agua / acetonitrilo.
El Q-Orbitrap presenta una excelete selectividad, resolviendo interferenciasde la matriz con m/z muy cercanas a los antibióticos.
Se ha desarrollado un método sencillo, robusto y rápido que se usa comoparte del programa de control de residuos veterinarios en el LASPB.
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Gracias per la
atención!!