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Resumen

El estudio de la composición quími-ca del aceite esencial de la planta re-conocida con el nombre vernáculo dearrayán y que pertenece a la especieMyrcianthes rhopaloides (Kunth inH.B.K.) McVaugh, familia Myrta-ceae, fue realizado mediante la técni-ca de cromatografía de gases acopladaa masas, la que permitió identificaruna mezcla de componentes mono ysesquiterpenos. Es así, que los princi-pales compuestos que se destacaronfueron Linalol, Eucaliptol, D –Li-moneno y Terpineol; seguidos, enmenor proporción, de 4 Terpineol,cis Mirtanol, Cariofileno, ·-Cariofi-leno, Cadineno y Espatulenol.

El efecto de la actividad antimicro-biana del aceite de arrayán evidencióuna acción fuerte sobre microorganis-mos como Streptococcus mutans yStreptococcus pyogenes, menor sobreStaphilococcus aureus y Staphilococcusepidermidis, y ausente sobre Escheri-chia coli y Candida albicans.

Introducción

En la mayoría de los países en desarro-llo es frecuente el uso de plantas medi-cinales o de sus derivados en casi todoslos programas de salud. La identifica-ción del valor curativo de las plantasproviene, comúnmente, de la informa-ción recopilada a partir del conoci-miento médico tradicional, ya que éste

María Elena Maldonado R.1Cesare Dacarro2

1 Centro de Investigación y Valoración de la Biodiversidad, Universidad Politécnica Salesiana, Quito2 Laboratorio de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Pavia

Análisis de la composición del aceite esencialde Myrcianthes rhopaloides (Kunth in H.B.K.)

McVaugh, Myrtaceae, y evaluación de su actividad biológica

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es una fuente importante para el desa-rrollo de investigaciones fitoquímicas,especialmente en lo que concierne a laidentificación de principios activos.

El saber ancestral, relacionado conla etnomedicina usada por los indígenasen Ecuador y en América Latina, estáfundamentado en una concepción par-ticular de salud-enfermedad, la que hapermitido desarrollar una terapéuticabasada en la utilización de plantas quetiene como sustento una cosmovisiónparticular que se manifiesta en creenciasmágico-religiosas. En este sentido, sedebe resaltar que a través de la historiase puede comprobar que los conoci-mientos prácticos de la etnomedicinapor tradición se transmiten de maneraoral de generación en generación.

En Ecuador existe un basto cono-cimiento en la utilización de las plan-tas como medicamento, especialmen-te por ser una terapéutica muy difun-dida en los estratos poblacionales debajos recursos económicos rurales yurbanos; sin embargo, son pocas lasespecies de plantas que han sido estu-diadas de acuerdo a los parámetroscientíficos modernos y las normas éti-cas internacionales. Por esta razón,una planta de uso popular que es em-pleada como medicamento debe serestudiada con un análisis fitoquímico

para: comprobar su efectividad, deter-minar su potencial de toxicidad y eva-luar la relación riesgo-beneficio en losseres humanos. Además, se debe con-siderar que el uso frecuente de una es-pecie de planta no es garantía de su ac-tividad, primero porque pueden exis-tir diferentes variedades de una mismaespecie, luego porque una planta pue-de ser usada como placebo y por últi-mo, si los componentes activos de unaplanta se desconocen inclusive puedeser tóxica.

Por lo antes expuesto, este estudiose propuso relacionar el conocimientoancestral de la utilización de las plan-tas medicinales con las técnicas mo-dernas de evaluación de actividad bio-lógica y análisis fitoquímico, porquede esta manera consiguió identificarlos principios activos de una plantaresponsables de la actividad biológicaevaluada. Así, el objetivo de esta inves-tigación fue determinar la composi-ción química del aceite de arrayán[Myrcianthes rhopaloides (Kunth inH.B.K.) McVaugh] y su acción anti-bacteriana contra las bacterias de in-fecciones propias de la cavidad oral.La selección del arrayán se basó en laetnomedicina, ya que es una plantaampliamente usada para la limpiezabucal en las comunidades indígenasde las provincias de Cotopaxi y Chim-

borazo; por lo tanto, se decidió com-probar cuál es su eficiencia o ineficien-cia contra los virus y bacterias.

Métodos empleados para deter-minar la actividad biológica y lacomposición fitoquímica de Myrcianthes rhopaloides (Kunthin H.B.K.) McVaugh

1. Recolección del material: Las ho-jas de arrayán fueron recolectadas enla provincia de Cotopaxi en el mes demarzo de 2006, la identificación taxo-nómica fue realizada por el biólogoMarco Cerna, Botánico de la UPS, yel material vegetal fue liberado de im-purezas para luego realizar la extrac-ción del aceite esencial.

2. Screening antibacteriano: En estaprueba se usó el método de los discosde papel, porque el uso de discos depapel aumenta la diversidad de anti-microbianos que pueden usarse simul-táneamente (Vincent y Vincent 1944;Bauer y Kirby 1966; CYTED 1995).Las bacterias y levaduras utilizadasfueron diferentes (Tablas 1 y 2) paraestudiar el tipo de reacción.

La clasificación de las bacterias ylevaduras se realizó de acuerdo a surespuesta morfológica y tintorial(Tabla 3).

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Bacterias y levadura Morfología y coloración

Escherichia coli Bacilos Gram-negativosStaphilococcus aureus Cocos Gram-positivosStaphilococcus epidermidis Cocos Gram-positivosStreptococcus mutans Cocos Gram-positivosStreptococcus pyogenes Cocos Gram-positivosCandida albicans Levadura/No se utiliza el método Gram de coloración

Nombre científico Familia

Escherichia coli EnterobacteriaceaeStaphylococcus aureus MicrococaceaeStaphylococcus epidermidis MicrococaceaeStreptococcus mutans StreptococaceaeStreptococcus pyogenes Streptococaceae

3. Métodos para determinar la activi-dad biológica de inhibición del aceitede arrayán: En esta prueba, se determi-nó por el método Bauer-Kirby de discosde papel la respuesta de los microorga-

nismos a diferentes concentraciones delaceite de arrayán de acuerdo al halo deinhibición que presentan las bacterias yla levadura (Tabla 4). Además, se aplicóla técnica en medio líquido para obser-

var cuál es la concentración mínima in-hibitoria (CMI) de aceite de arrayánpor partes de millón (ppm) requeridapara inhabilitar el crecimiento de lasbacterias y la levadura (Tabla 5).

Tabla 1. Bacterias utilizadas en el estudio de la actividad bactericida del aceite de arrayán.

Tabla 2. Levaduras utilizadas en el estudio de la actividad bactericida del aceite de arrayán.

Tabla 3. Clasificación morfológica y tintorial de las bacterias y levadura.

Nombre científico Familia Orden Phylum

Candida albicans Saccharomycetaceae Saccharomycetales Ascomycota

Tabla 4. Respuesta de las bacterias y levadura al aceite esencial de arrayán.

Bacterias/ Estándar Halo de inhibición Concentración Halo deLevadura (10 ug) estándar (mm) estándar (µg/mL) inhibición (mm)

E. coli Gentamicina 26 5 —-E. coli Gentamicina 26 10 —-E. coli Gentamicina 26 25 —-E. coli Gentamicina 26 50 17,9E. coli Gentamicina 26 70 24,0

Tabla 5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) por partes por millón (ppm) del aceite esencialde arrayán sobre las bacterias y la levadura

Bacterias/ Estándar Halo de inhibición Concentración Halo deLevadura (10 ug) estándar (mm) estándar (µg/mL) inhibición (mm)

S. aureus Gentamicina 26 5 —-S. aureus Gentamicina 26 10 7,23S. aureus Gentamicina 26 25 11,36 S. aureus Gentamicina 26 50 14,3 S. aureus Gentamicina 26 70 14,5

S. epidermidis Gentamicina 26 5 —-S. epidermidis Gentamicina 26 10 8,0 S. epidermidis Gentamicina 26 25 7,88 S. epidermidis Gentamicina 26 50 —-S. epidermidis Gentamicina 26 70 14,07

S. pyogenes Gentamicina 26 5 9,7 S. pyogenes Gentamicina 26 10 11,7 S. pyogenes Gentamicina 26 25 25,11 S. pyogenes Gentamicina 26 50 22,2 S. pyogenes Gentamicina 26 70 31,5

C. albicans Clotrimoxazole 16 5 —-C. albicans Clotrimoxazole 16 10 7,7 C. albicans Clotrimoxazole 16 25 15,6 C. albicans Clotrimoxazole 16 50 17,4 C. albicans Clotrimoxazole 16 70 27,23

Concentración de aceite esencial E. coli S. aureus S. epidermidis S. mutans S. pyogenes C. albicansde arrayán (ppm)

50 crece ausencia ausencia ausencia ausencia crece25 crece crece crece ausencia ausencia crece12,5 crece crece crece ausencia ausencia crece6,25 crece crece crece ausencia ausencia crece3,125 crece crece crece ausencia ausencia crece1,5625 crece crece crece crece crece crece0,78125 crece crece crece crece crece crece0,390625 crece crece crece crece crece crece0,1953125 crece crece crece crece crece crece0,09765625 crece crece crece crece crece crece

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4. Análisis de la composición quími-ca del aceite esencial extraído de lashojas de arrayán: Primero se realizaun tamizaje fitoquímico de acuerdo almanual de Miranda (2000).Las con-diciones para realizar el análisis cro-matográfico fueron con el uso de: un

cromatógrafo de gases acoplado a ma-sas Modelo Saturn 2001 programadoa: T inyector 250ºC Columna (Tabla6), Factor four VF-5ms (30m x0,25mm), gas transportador Helio1ml/min, Split 200, energía de ioni-zación 70 eV, corriente de emisión

40mA, rango de masas 40 – 650 m/ze ion source a una temperatura de220 ºC. Las condiciones de la mues-tra fueron de una inyección de 1 ÌL auna solución de 1:50 de aceite esen-cial en n-hexano.

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Temperatura (ºC) Velocidad (ºC/min) Permanencia (min) Total (min)

50 0 2 2100 20 0 4,50220 5 1,50 30

Tabla 6. Condiciones de la columa del cromatógrafo de gases acoplado a masas para análisis del aceite de arrayán

Resultados de la actividad bioló-gica y del análisis fitoquímico deMyrcianthes rhopaloides (Kunthin H.B.K.) McVaugh

En este proyecto se ha realizado la pri-mera investigación sobre la actividadantimicrobiana del arrayán [Myr-cianthes rhopaloides (Kunth inH.B.K.) McVaugh], recolectando laplanta en la provincia de Cotopaxi,puesto que hasta el momento existen

pocos trabajos con relación a estudiosde la actividad biológica del géneroMyrcianthes, registrándose algunos enArgentina (Kott et al. 1999; Penna et al.2001).

La evaluación de la actividad anti-microbiana del aceite de arrayán se

realizó primero por la técnica deBauer-Kirby, midiendo los halos deinhibición y comparándolos con elhalo producido por una sustanciacontrol, en el caso de las bacterias fueun antibiótico de amplio espectro co-mo la gentamicina y en el caso de lalevadura fue Clotrimoxazole. En estaprueba, se evidenció que la acción delaceite esencial es fundamentalmentesobre las bacterias Staphilococcus yStreptococcus.

La investigación fitoquímica a tra-vés del tamizaje del aceite de arrayánevidencia la presencia de diversoscompuestos químicos (Tabla 7), entrelos que se destacan alcaloides, azúcaresy compuestos fenólicos.

El aceite esencial de las hojas dearrayán se obtuvo mediante la técni-ca de arrastre de vapor, obteniéndoseun rendimiento del 2% de extraccióndel material vegetal seco y pulveriza-do. La técnica de cromatografía degases acoplada a masas identificó co-mo principales componentes delaceite esencial alcoholes como lina-lol, eucaliptol, limoneno y a-terpi-neol (Tabla 8).

El linalol (monoterpeno) es un al-cohol terpénico (C10H18O) terciarioinsaturado y está presente en un por-centaje del 19%, por lo tanto sería unbuen marcador químico en las prue-bas de control de calidad del aceite;además, es un componente reconoci-do en los aceites esenciales de lavanday menta. El eucaliptol (monoterpeno)es un alcohol terpénico (C10H18O) yestá presente en un porcentaje del11,73%; además, es un componentemayoritario en la esencia de eucaliptoque se caracteriza por sus propiedadescomo balsámico, expectorante y anti-séptico. El limoneno es un hidrocar-buro terpénico principal componen-te de muchos aceites esenciales, prin-cipalmente cítricos, y está presenteen una concentración del 8,56%. Elα−terpineol es un monoterpeno(C10H18O) presente en numerososaceites esenciales y está presente enuna concentración del 7,31%.

En el aceite de arrayán se detecta-ron con la cromatografía de gases aco-plada a masas un total de 52 compo-nentes, de los cuales 31 fueron identi-ficados comparándose con la base dedatos del “Scientific Instrument Servi-ces, Inc.” (http://www.sisweb.com-/software/ms/nist.htm).

Tabla 7. Tamizaje fitoquímico del aceite de arrayán para identificación de compuestos

Compuesto Presencia

Alcaloides presencia Compuestos fenólicos presenciaFlavonoides presenciaAzúcares reductores presenciaSaponinas ausenciaMucílagos ausenciaPrincipios amargos presenciaCatequinas presenciaResinas ausenciaCompuestos lactónicos ausenciaTriterpenos-esteroides presenciaAminoácidos libres ausenciaQuinonas presenciaCardenólicos negativoAntocianidinas presenciaAceites esenciales presencia

Compuestos Método de Tiempo de Identificado/ No identificado (NI)/identificación retención (min) abundancia relativa (%) abundancia relativa (%)

Cis 3-hexanol CG-MS 4,766 0,090Metil-butil oxirano CG-MS 4,901 0,078Butil acetona CG-MS 5,146 0,0712-heptanol CG-MS 5,277 0,9731R α- pineno pineno CG-MS 5,767 0,237NI CG-MS 6,404 0,617β-pineno CG-MS 6,449 0,276Cimeno CG-MS 7,069 0,265D-Limoneno CG-MS 7,146 8,563Eucaliptol CG-MS 7,231 11,730α- terpineno CG-MS 7,602 0,162n-octanol CG-MS 7,727 0,187α metil α( 4 metil-3 pentil- 7 oxirano metanol) CG-MS 7,829 1,565NI CG-MS 8,106 0,765Linalol CG-MS 8,258 19,691R+ novinone CG-MS 9,240 1,270Borneol CG-MS 9,874 0,164Citral c CG-MS 9,940 0,2554 terpineol CG-MS 9,995 2,266oxido de β-pineno CG-MS 10,139 0,628α terpineol CG-MS 10,280 7,310NI CG-MS 10,361 4,540cis carveol CG-MS 10,772 0,336cis mirtanol CG-MS 11,832 2,645NI CG-MS 11,989 0,532Mirtenil acetato CG-MS 13,050 0,916α cubebeno CG-MS 13,608 0,400NI CG-MS 14,209 0,230NI CG-MS 14,335 1,497

Actividad antibacteriana delaceite de Myrcianthes rhopaloi-des (Kunth in H.B.K.) McVaugh

En las provincias de Cotopaxi yChimborazo, las comunidades indíge-nas mastican la hoja de arrayán para lalimpieza bucal, acción que de acuerdoa los estudios de actividad antimicro-biana realizados se comprueba, pues elaceite esencial de esta planta tiene ac-ción bactericida sobre Streptococcusmutans que es el agente causal de lascaries dentales.

La colonización bacteriana de lassuperficies lisas de los dientes se pro-

duce como consecuencia de un ancla-je firme de células bacterianas indivi-duales, seguido de un crecimiento enforma de microcolonias. A partir deuna superficie dentaria recién limpia,el primer evento es la formación deuna fina película orgánica de variasmicras de espesor como resultado dela fijación de glicoproteínas ácidas dela saliva. Esta película proporciona unsitio de anclaje más firme para la colo-nización por microcolonias bacteria-nas. La colonización de esta películaglicoproteica es muy específica y sóloimplica a unas cuantas especies deStreptococcus, principalmente el

S. sanguis, S. sobrinus, S. mutans yS. mitis, por lo que se recomienda con-tinuar con los estudios de actividad an-tiadherente del aceite de arrayán.

El aceite esencial de arrayán pre-senta un amplio espectro de acción an-tibacteriano, pues los análisis realiza-dos comprueban su acción bactericidasobre microorganismos Gram (+),principalmente por la actividad del eu-caliptol sobre Staphylococcus aureus yStreptococcus pyogenes que patógenos tí-picos de las vías respiratorias superio-res. Así, estos datos se convierten enuna base para estudios posteriores diri-

Tabla 8. Compuestos químicos identificados por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.

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gidos a la formulación de preparacio-nes de uso tópico, especialmente parala limpieza y la desinfección de la cavi-dad oral. En este sentido, se recomien-da continuar con los estudios de toxi-cidad y estabilidad de un producto quesirva como desinfectante bucal ya quese lo podría desarrollar bajo las exigen-cias y normativas vigentes para pro-ductos farmacéuticos.

Es importante señalar que los re-sultados obtenidos en este trabajo sonaún preliminares, por lo tanto se re-quieren estudios más profundos queconfirmen todas las acciones que tieneel aceite de arrayán como inhibidor dela actividad microbiana.

Por último, cabe señalar que alser Ecuador uno de los países conmayor biodiversidad en el mundo esprioritario continuar con investiga-ciones sobre su flora nativa, porqueesto permitirá al país dejar de ser un

simple proveedor de materias primasque luego regresan como productosde alta calidad y con un alto valoragregado. Sumándose, que cuando lainvestigación se desarrolla localmen-te permite que el conocimiento que-de en el país y que los beneficiariosdirectos sean las comunidades localesque son las dueñas del conocimientoancestral y las productoras de los re-cursos vegetales.

Literatura citada

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Compuestos Método de Tiempo de Identificado/ No identificado (NI)/identificación retención (min) abundancia relativa (%) abundancia relativa (%)

NI CG-MS 14,512 0,330NI CG-MS 14,609 0,169NI CG-MS 15,104 0,345cariofileno CG-MS 15,417 3,918NI CG-MS 15,586 0,292NI CG-MS 15.851 1,140α cariofileno CG-MS 16,250 2,179NI CG-MS 16,360 1,151NI CG-MS 16,613 1,364NI CG-MS 17,035 4,084NI CG-MS 17,108 0,554NI CG-MS 17,178 4,870NI CG-MS 17,295 1,331τ cadineno CG-MS 17,532 1,369β cadineno CG-MS 17,603 3,028NI CG-MS 17,744 1,373NI CG-MS 18,055 0,211Neroidol CG-MS 18,476 0,406Espatulenol CG-MS 19,069 1,144Óxido de cariofileno CG-MS 19,221 1,136NI CG-MS 20,495 0,619α Eudesmol CG-MS 20,842 0,358NI CG-MS 20,900 0,629

TOTAL 73,616 26,643

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Agradecimientos

Los autores agraden por su colabora-ción en el desarrollo de la investigacióna los profesores Paola Vita Finzi y Gio-vanni Vidari del Departamento de Quí-mica Orgánica, Universidad de Pavía,Italia, y por la revisión del texto a Mar-co Cerna y Paco Noriega, quienes ayu-daron con los aspectos botánicos y laspruebas de espectros de cromatografíade gases acoplada a masas.

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