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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
de la Facultad de Veterinaria
Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (CBATEG)
ANÁLISIS EN ANIMALES TRANSGÉNICOS DEL
PAPEL DEL INCREMENTO EN LA
GLICERONEOGÉNESIS O EN LA CAPTACIÓN
DE GLUCOSA POR EL TEJIDO ADIPOSO
SERGIO ANTONIO MUÑOZ FORERO
Memoria presentada por el licenciado SERGIO
ANTONIO MUÑOZ FORERO para optar al grado
de Doctor en Bioquímica.
Esta Tesis Doctoral ha sido realizada bajo la
dirección de la Dra. Fàtima Bosch i Tubert y la
Dra. Sylvie Franckhauser en el Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular de la
Facultad de Veterinaria y en el Centro de
Biotecnología Animal y Terapia Génica
(CBATEG).
SERGIO ANTONIO MUÑOZ FORERO
FÀTIMA BOSCH I TUBERT SYLVIE FRANCKHAUSER
Abril de 2006
Bellaterra
“Si quieres hallar en cualquier parte amistad, amor y felicidad, llévalas siempre contigo” (adaptado de George Duhamel)
Abreviaturas
ABREVIATURAS
18S Subunidad ribosómica 18S
28S Subunidad ribosómica 28S
2-DG 2-deoxiglucosa
ADP Adenosina difosfato
AMP Adenosina monofosfato
AMPK Proteína quinasa activada por AMP
aP2 Proteína intracelular de unión a lípidos específica del adipocito
aP2-GK Ratón transgénico que expresa GK en tejido adiposo
aP2-PEPCK Ratón transgénico que sobreexpresa PEPCK en tejido adiposo
ATP Adenosina trifosfato
BAT Tejido adiposo marrón
BMI Índice de masa corporal
BSA Albúmina sérica bovina
cAMP Adenosina monofosfato cíclica
cDNA DNA complementario sintetizado utilizando RNA como molde
Ci Curio
cpm cuentas por minuto
Cts Número de ciclo en que se produce el incremento significativo
de la fluorescencia en PCR a tiempo real(threshold cycle)
C/EBPs Proteínas inductoras de la transcripción que se unen a la
secuencia CCAAT
C/EBPα Factor de transcripción alfa que se une a la secuencia CCAAT
C/EBPβ Factor de transcripción beta que se une a la secuencia CCAAT
C/EBPδ Factor de transcripción delta que se une a la secuencia CCAAT
C/EBPζ Factor de transcripción zeta que se une a la secuencia CCAAT
dCTP deoxicitidina trifosfato
DEPC Dietilpirocarbonato
DHAP Dihidroxiacetona fosfato
DNA Ácido desoxirribonucleico
DTT Ditiotreitol
Abreviaturas
EDTA Etilendiaminotetraacetato
EGTA Ácido etilenglicol bis(2-aminoetil éter)-N,N,N´,N´-tetraacético
ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (“enzime-linked
immunosorbent assay”)
FADH2 Forma reducida del dinucleótido de adenina
FFAs Ácidos grasos libres
F1P Fructosa-1-fosfato
F6P Fructosa-6-fosfato
Glicerol-3-P Glicerol-3-fosfato
GK Glucoquinasa
GKRP Proteína reguladora de la glucoquinasa
GLUTs Transportadores de azúcares independientes de sodio
GLUT4 Transportador de glucosa estimulado por la insulina
G6P Glucosa-6-fosfato
G-6Pasa Glucosa-6-fosfatasa
HFD Dieta alta en lípidos
HK Hexoquinasas
HSL Lipasa sensible a hormonas
H+ Protones
IDP Inosin difosfato
IL6 Interleuquina-6
kb kilobases
kDa kiloDaltons
LB Medio Luria-Bertrani
M Molar
mA miliAmperios
MDH Malato deshidrogenasa
mM miliMolar
MOPS Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
NA Noradrenalina
NADH Forma reducida del dinucleótido de nicotinamida
Abreviaturas
nm nanómetros
oligo-dT Oligo deoxitimina
pb pares de bases
PC Piruvato carboxilasa
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa
PEPCK-C Forma citosólica de la PEPCK
PEPCK-M Forma mitocondrial de la PEPCK
PFK/FBPasa 6-fosfofructo-2-quinasa/ fructosa-2,6-bifosfatasa
PG Prostaglandinas
PGC-1α Coactivador-1 alfa del PPARγ
PMSF Fenilmetilsulfonil fluoruro
PPARs Familia de receptores nucleares activados por proliferadores de
peroxisomas
PPARα Receptor alfa activado por proliferadores de peroxisomas
PPARδ Receptor delta activados por proliferadores de peroxisomas
PPARγ Receptor gamma activado por proliferadores de peroxisomas
ppm partes por millón
P-enolpiruvato Fosfoenolpiruvato
RIA Radioinmunoensayo
RMN Resonancia Magnética Nuclear
RNA Ácido ribonucleico
RXR Receptores X para retinoides
SDS Dodecil sulfato sódico
SDS-PAGE Gel de SDS y poliacrilamida para electroforesis
SE Error estándar
SNC Sistema Nervioso Central
SNP Sistema Nervioso Parasimpático
SNS Sistema Nervioso Simpático
SRC-1 Coactivador-1 del receptor activado por esteroides
SREBPs Familia de proteínas de unión a elementos que responden a
esteroles
Abreviaturas
SREBP-1a Factor-1a de unión a elementos que responde a esteroles
SREBP-1c Factor-1c de unión a elementos que responde a esteroles
SSC Citrato sódico salino
SV40 Virus simio 40
TAE Tampón tris-acetato-EDTA
Tg Ratón transgénico
TIF2 Factor transcripcional intermediario-2
TNF-α Factor alfa de necrosis tumoral
TZDs Tiazolidinedionas
UAB Universitat Autònoma de Barcelona
UCP1 Proteína desacopladora 1
WAT Tejido adiposo blanco
AGRADECIMIENTOS
Tras un largo y arduo camino, repleto de experimentos y resultados, de alegrías y
de tristezas, se hace difícil resumir todo el agradecimiento que siento a todos los que han
hecho posible mi embarque en el navío de la ciencia y el discurrir por sus mares hasta
alcanzar el puerto donde ahora concluyo. No quisiera olvidarme de ninguno, si fuera así,
perdonadme...
En primer lugar, agradezco a la Dra. Fàtima Bosch la oportunidad que me brindó al
aceptarme en su grupo de investigación bajo su dirección y haber supervisado mi trabajo
durante todos estos años. Le agradezco su entusiasmo y capacidad de trabajo casi
incansable.
Especialmente agradezco a la Dra. Franckhauser la codirección de esta Tesis
Doctoral y todo el trabajo realizado conjuntamente... Diga lo que diga, poco representará lo
que tanto te debo y agradezco, Sylvie. Muchísimas gracias. Desde el primer día al último he
crecido científica y personalmente, y mucho de ello te lo debo a ti. Sólo espero que, aunque
sea un poquito, estés orgullosa...
Doy las gracias muy especialmente al reciente Dr. Antonio Hidalgo por toda su
ayuda y su amistad. Hemos madurado juntos, tanto en la ciencia como en la vida. Para tu
suerte o desgracia, difícilmente te librarás de mi, amigo...
Muchos han contribuido con su granito de arena en esta larga travesía... Desde la
ayuda indispensable en un laboratorio de experimentación animal a las conversaciones
científico-humanas, pasando por el día a día de las relaciones laborales y personales... a
todos y a todas, muchas gracias por vuestra ayuda, presencia, cariño y apoyo. Gracias a los
“veteranos” que han viajado conmigo desde mis inicios compartiendo mucho: Miquel García,
Edu, Joel, Xavi,... A Carles Ros por guiar mis primeros pasos en el laboratorio, al Dr. Pedro
Otaegui por su “avisados quedáis” y a las nuevas técnicas: Jennifer y Lidia... A la unidad al
completo de la UAT: Anna Pujol, Anna Arbòs y Ainara, por su simpatía y buen hacer... A mi
club femenino de fans que tanto me han cuidado y a las que tanto he cuidado y cuidaré:
Alba, Ariana, Sylvie, Marta, Mireia, Virginia, Tura, Judith, Ivet y las nuevas incorporaciones:
María Molas, Gloria, Vero y Pilar... A esos grandes compañeros que, además de echarme una
mano, cada día me ayudan a sonreír, Charly y Albert... A los nuevos, alguno ya talludito:
David, Albert Ribera, Gor y Chris Mann... A los que ya no están pero que antes estuvieron:
Alex, María, Efrén, Gemma, Mónica, Marisa, Estefanía... A todo el personal del estabulario de
la UAB, especialmente a Rafi, Juanjo y Matías que tanto me facilitaron el trabajo con los
ratones, y al personal del nuevo estabulario SPF por el mantenimiento y el trabajo con mis
actuales animales.
Con el traslado al nuevo centro, no quisiera olvidarme de dar las gracias a todos los
que dejé allí... Especialmente doy las gracias a la Dra. Anna Bassols por presentarme por
primera vez el mundo científico y un laboratorio de Bioquímica Clínica... También a Yolanda
Saco por enseñarme que era un autoanalizador y un proteinograma, a Mercè per la seva
gentilesa amb un gran somriure... Al Dr. Joaquim Ariño por su trato cordial y permitirme “ser
uno de los suyos” las veces que entré a su laboratorio, a la Dra. Barceló por su amabilidad...
Gràcies al peculiar i únic Dr. Néstor Gómez per les llargues hores i els anticossos secundaris
de última hora... A los compadres del V0-181, V0-177 y V0-175, tanto los que están como
los que estuvieron, por convertir el pasillo de Bioquímica de Veterinaria en el de mejor
ambiente laboral y personal, además de uno de los más productivos, de ello estoy seguro...
A la meva molt apreciada Anna Vilalta per ser la gran mare de tots els que hem estat a
Bioquímica de Veterinària i compartir “vivències” amb els autoanalitzadors... Gracias a todo
el personal de administración, tanto el del Departamento de Bioquímica de Veterinaria como
el del CBATEG, que siempre me ha facilitado el papeleo: Carmen, Rosa, Silvia, Montse, Espe,
Esther, Lluís, Sara, Teresa...Al personal de seguridad de la UAB, por las veces que hemos
coincidido, especialmente en los inicios...
Finalmente, aunque el mayor agradecimiento de todos, doy las gracias a mi
numerosa familia, muy especialmente a mis padres y a mi hermano y cuñada, por todo el
apoyo, sacrificios, ayuda, comprensión y cariño necesarios para alcanzar, no sólo este puerto
de la vida sino cualquiera al que quisiera, ayer, hoy y siempre... ¡¡Muchísimas gracias!!
El trabajo de todo este tiempo se ha realizado gracias, en primer lugar, a la beca
predoctoral de la Direcció General d´Universitats de la Generalitat de Catalunya, de la que
he sido beneficiario durante mis primeros cuatro años. Las investigaciones han sido
financiadas por el Plan Nacional de I+D+I (SAF2005-01262 y GEN2001-4758-C07-02), el
Instituto de Salud Carlos III (FIS 01/0427, Red de Centros Metabolismo y Nutrición C03/08 y
Red de Grupos Diabetes Mellitus G03/212), la Fundació La Maratò de TV3 (992710) y la
Comunidad Europea (FP6 EUGENE2 [LSHM-CT-2004-512013]). Gracias al Dr. R.W. Hanson
(Case Western Reserve University, Cleveland, USA) por el gen de la PEPCK, al Dr. B.M.
Spiegelman (Harvard Medical School, Boston, USA) por el promotor aP2 y los cDNAs de
PPARγ y PGC-1α, al Dr. P.B. Iynedjian (University of Geneva, Geneva, Switzerland) por el
cDNA de la GK de rata y al Dr. D. Ricquier (Centre Nacional de la Recherche Scientifique
(CNRS), Paris, France) por el cDNA de UCP1. Thanks for Dr. Malcolm Watford for helpful
discussions. También quiero agradecer especialmente la colaboración y asesoramiento del
Dr. Sebastián Cerdán (Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, Facultad de
Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid, España) en los estudios por Resonancia
Magnética Nuclear.
Índice
ÍNDICE
I. PRESENTACIÓN.....................................................................................................1-2
II. INTRODUCCIÓN................................................................................................3-42
1. OBESIDAD Y SÍNDROME METABÓLICO: un problema de salud mundial..............3-8
1.1. OBESIDAD: LA GRAN EPIDEMIA DEL SIGLO XXI...................................................3
1.2. OBESIDAD, SÍNDROME METABÓLICO Y DIABETES DE TIPO 2............................4-7
1.2.1. Obesidad...................................................................................................4
1.2.2. Síndrome Metabólico...............................................................................4-5
1.2.3. Diabetes mellitus de tipo 2.......................................................................5-7
1.3. DEFINICIÓN DE SOBREPESO Y DE OBESIDAD...................................................7-8
1.4. TIPOS DE OBESIDAD HUMANA............................................................................8
2. EL TEJIDO ADIPOSO..............................................................................................9-34
2.1. ORGANIZACIÓN DEL TEJIDO ADIPOSO...........................................................9-10
2.2. TIPOS DE ADIPOCITOS MADUROS................................................................10-11
2.2.1. Los adipocitos blancos..............................................................................10
2.2.2. Los adipocitos marrones...........................................................................11
2.3. LOCALIZACIÓN ANATÓMICA DEL TEJIDO ADIPOSO.......................................11-12
2.4. EL ÓRGANO ADIPOSO Y LA TRANSDIFERENCIACIÓN DEL ADIPOCITO............13-14
2.5. CRECIMIENTO DEL TEJIDO ADIPOSO...........................................................14-19
2.5.1. La familia C/EBPs.................................................................................15-16
2.5.2. La familia PPARs..................................................................................16-18
2.5.3. La familia SREBPs.....................................................................................18
2.5.4. Regulación transcripcional de la adipogénesis........................................18-19
2.6. FUNCIONES DEL ÓRGANO ADIPOSO.............................................................20-34
2.6.1. Función lipogénica del adipocito............................................................22-26
2.6.1.1. Producción de glicerol-3-fosfato..............................................23-24
2.6.1.2. Reesterificación de ácidos grasos: papel de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa..............................................24-26
2.6.2. Función lipolítica del adipocito..............................................................27-28
2.6.3. Función termogénica del adipocito marrón.............................................28-30
2.6.3.1. Regulación de la termogénesis en tejido adiposo marrón...............30
2.6.4. Función secretora del adipocito blanco y marrón....................................31-34
Índice
2.6.4.1. Leptina..................................................................................31-33
2.6.4.2. Adiponectina..............................................................................33
2.6.4.3. Factor-α de necrosis tumoral..................................................33-34
2.6.4.4. Interleuquina-6...........................................................................34
3. HOMEOSTASIS DE LA GLUCOSA..........................................................................35-42
3.1. LOS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA.........................................................36-37
3.2. LAS HEXOQUINASAS....................................................................................37-42
3.2.1. Las hexoquinasas I-III..............................................................................38
3.2.2. La hexoquinasa IV o glucoquinasa........................................................39-42
3.2.2.1. Regulación de la glucoquinasa en hepatocitos..........................40-41
3.2.2.2. Regulación de la glucoquinasa en células β..............................41-42
III. OBJECTIVOS.........................................................................................................43
IV. RESULTADOS................................................................................................44-107
PARTE I: EFECTO DEL INCREMENTO DE LA GLICERONEOGÉNESIS EN TEJIDO
ADIPOSO EN EL DESARROLLO DE OBESIDAD Y RESISTENCIA A LA INSULINA..................44-80
1.1. OBTENCIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBREEXPRESEN PEPCK EN
TEJIDO ADIPOSO..........................................................................................44-49
1.1.1. Construcción del gen quimérico aP2-PEPCK...........................................44-45
1.1.2. Obtención de los animales transgénicos aP2-PEPCK...............................46-47
1.1.3. Análisis de la expresión del transgen aP2-PEPCK....................................47-48
1.1.4. Determinación de la actividad enzimática PEPCK en el tejido adiposo...........49
1.2. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES EN TEJIDO ADIPOSO CAUSADAS POR LA
SOBREEXPRESIÓN DE PEPCK EN DICHO TEJIDO.............................................50-54
1.2.1. Análisis del peso corporal, del peso del tejido adiposo y del contenido de
grasa corporal.......................................................................................50-52
1.2.2. Estudio histológico del tejido adiposo....................................................52-53
1.2.3. Determinación de la gliceroneogénesis y de la reesterificación de ácidos
grasos libres..............................................................................................54
1.3. ESTUDIO DE LOS EFECTOS SISTÉMICOS PROVOCADOS POR LA
SOBREEXPRESIÓN DE PEPCK EN TEJIDO ADIPOSO.........................................55-61
1.3.1. Análisis de la glucemia e insulinemia..........................................................55
Índice
1.3.2. Test de tolerancia a la glucosa..............................................................56-57
1.3.3. Test de tolerancia a la insulina..............................................................56-57
1.3.4. Utilización de glucosa in vivo por el músculo esquelético.........................57-58
1.3.5. Determinación de otros metabolitos sanguíneos y hormonas
circulantes............................................................................................58-61
1.3.5.1. Triglicéridos y lactato séricos.......................................................59
1.3.5.2. Ácidos grasos libres y glicerol séricos.......................................59-60
1.3.5.3. Determinación de leptina y de TNF-α...........................................61
1.4. ESTUDIO DEL EFECTO DE UNA DIETA ALTA EN LÍPIDOS EN LOS ANIMALES
TRANSGÉNICOS aP2-PEPCK...........................................................................62-80
1.4.1. Efecto de la dieta alta en lípidos sobre el peso corporal..........................62-63
1.4.2. Efecto del consumo de la dieta HFD sobre el tejido adiposo blanco.........63-66
1.4.2.1. Análisis del peso del tejido adiposo blanco epididimal y
expresión de PEPCK tras una dieta HFD....................................64-65
1.4.2.2. Análisis histológico del tejido adiposo blanco epididimal tras
una dieta alta en lípidos...........................................................65-66
1.4.3. Estudio de los efectos sistémicos de la dieta alta en lípidos en los
animales transgénicos aP2-PEPCK..........................................................67-72
1.4.3.1. Determinación de la glucemia e insulinemia.............................67-68
1.4.3.2. Test intraperitoneal de tolerancia a la insulina..........................68-69
1.4.3.3. Test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa...............................69
1.4.3.4. Determinación de los niveles circulantes de triglicéridos y
ácidos grasos libres.................................................................70-71
1.4.3.5. Determinación de los niveles circulantes de adipocitoquinas......72-73
1.4.4. Estudio de los efectos de la dieta diabetogénica a nivel hepático en los
animales transgénicos aP2-PEPCK..........................................................73-75
1.4.4.1. Análisis histológicos del hígado de animales en dieta alta en
lípidos.........................................................................................74
1.4.4.2. Contenido de triglicéridos en el hígado.........................................75
1.4.5. Estudio de los efectos de la dieta alta en lípidos a nivel del tejido adiposo
marrón en animales transgénicos aP2-PEPCK..........................................76-80
1.4.5.1. Análisis histológicos del BAT de animales tras la dieta alta en
lípidos.....................................................................................76-77
1.4.5.2. Análisis de la expresión génica en BAT....................................77-78
1.4.5.3. Análisis del nivel de proteínas en BAT......................................78-80
Índice
PARTE II: EFECTO DEL INCREMENTO EN LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA POR EL TEJIDO
ADIPOSO EN LA PRODUCCIÓN DE GLICEROL-3-FOSFATO, OBESIDAD Y RESISTENCIA A
LA INSULINA...............................................................................................................81-107
2.1. OBTENCIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESEN GLUCOQUINASA
EN TEJIDO ADIPOSO.....................................................................................81-86
2.1.1. Construcción del gen quimérico aP2-GK.................................................81-82
2.1.2. Obtención y genotipado de los animales transgénicos aP2-GK.................83-84
2.1.3. Análisis de la expresión del transgen aP2-GK..............................................85
2.1.4. Determinación de la presencia de glucoquinasa en tejido adiposo blanco......86
2.2. ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LA EXPRESIÓN DE GK EN TEJIDO ADIPOSO....87-95
2.2.1. Utilización basal de glucosa in vivo por el tejido adiposo blanco y
músculo esquelético...................................................................................87
2.2.2. Análisis del peso corporal, peso del tejido adiposo epididimal y contenido
de grasa corporal.......................................................................................88
2.2.3. Estudio histológico del tejido adiposo blanco..........................................88-89
2.2.4. Determinación de la producción de glicerol-3-P y síntesis de novo de
lípidos a partir de la glucosa.......................................................................90
2.2.5. Estudios por resonancia magnética nuclear del destino de la glucosa
en WAT................................................................................................91-93
2.2.6. Consumo de glucosa y producción de lactato in vitro por el tejido adiposo
blanco epididimal..................................................................................94-95
2.3. ESTUDIO DE LOS EFECTOS SISTÉMICOS DE LA EXPRESIÓN DE GK EN TEJIDO
ADIPOSO....................................................................................................96-100
2.3.1. Determinación de los niveles circulantes de lactato.............................96
2.3.2. Test de tolerancia a la glucosa..................................................................97
2.3.3. Test de tolerancia a la insulina..................................................................98
2.3.4. Análisis de los metabolitos sanguíneos.......................................................99
2.3.5. Determinación de los niveles circulantes de hormonas...............................100
2.4. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDO ADIPOSO BLANCO DE ANIMALES
TRANSGÉNICOS........................................................................................101-106
2.4.1. Cambios en la expresión de genes involucrados en el metabolismo de la
glucosa.............................................................................................101-102
Índice
2.4.2. Cambios en la expresión de genes involucrados en el metabolismo de los
lípidos...............................................................................................103-104
2.4.3. Cambios en la expresión de genes involucrados en el metabolismo
mitocondrial......................................................................................104-106
2.5. ESTUDIO DEL METABOLISMO HEPÁTICO DE ANIMALES TRANSGÉNICOS aP2-
GK............................................................................................................106-107
V. DISCUSIÓN...................................................................................................108-119
VI. CONCLUSIONES.........................................................................................120-121
VII. MATERIALES Y MÉTODOS......................................................................122-159
1. MATERIALES....................................................................................................122-126
1.1. ANIMALES...............................................................................................122-123
1.1.1. Obtención de ratones transgénicos y el establecimiento de sus
líneas...............................................................................................122-123
1.2. CEPAS BACTERIANAS Y VECTORES PLASMÍDICOS......................................123-124
1.3. SONDAS DE DNA......................................................................................124-125
1.4. ANTICUERPOS................................................................................................125
2. MÉTODOS.........................................................................................................126-159
2.1. OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE DNA..............................................................126-130
2.1.1. Preparación DNA plasmídico....................................................................126
2.1.2. Enzimas de restricción del DNA................................................................127
2.1.3. Aislamiento y purificación de fragmentos de DNA...............................127-128
2.1.3.1. Geles de agarosa................................................................127-128
2.1.3.2. Purificación de los fragmentos de DNA........................................128
2.1.4. Construcción de moléculas híbridas de DNA.......................................128-129
2.1.4.1. Subclonaje de los fragmentos de DNA..................................128-129
2.1.4.2. Transformación de las células de E. coli......................................129
2.1.5. Marcaje radioactivo de las sondas de DNA.........................................129-130
2.2. DETECCIÓN DE LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS........................................130-133
2.2.1. Obtención del DNA genómico..................................................................130
2.2.2. Análisis del DNA mediante Southern blot...........................................131-133
2.2.2.1. Digestión y electroforesis del DNA genómico...............................131
Índice
2.2.2.2. Transferencia del DNA desde el gel a una membrana..................131
2.2.2.3. Prehibridación/hibridación de la membrana..........................131-132
2.2.2.4. Lavados de la membrana y revelado....................................132-133
2.3. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DEL RNA.........................................................133-135
2.3.1. Extracción del RNA total..........................................................................133
2.3.2. Electroforesis del RNA en geles desnaturalizantes de
agarosa/formaldehído..............................................................................134
2.3.3. Análisis del RNA mediante “Northern blot” (hibridación DNA-RNA).......134-135
2.4. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS................................................135-138
2.4.1. Extracción de proteínas totales..........................................................135-136
2.4.2. Determinación de la concentración de proteínas.......................................136
2.4.3. Análisis de las proteínas mediante Western-blot.................................137-138
2.4.3.1. Separación de proteínas por electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida..............................................137
2.4.3.2. Electrotransferencia a membrana e inmunodetección............137-138
2.5. TÉCNICAS IN VIVO...................................................................................138-141
2.5.1. Dieta alta en lípidos................................................................................138
2.5.2. Determinación del consumo de alimento..................................................139
2.5.3. Test de tolerancia la glucosa...................................................................139
2.5.4. Test de tolerancia a la insulina..........................................................139-140
2.5.5. Determinación del índice de utilización de la glucosa..........................140-141
2.6. TÉCNICAS IN VITRO.................................................................................141-144
2.6.1. Determinación de la gliceroneogénesis y de la síntesis de novo de ácidos
grasos a partir del piruvato................................................................141-142
2.6.2. Determinación de la producción de glicerol-3-P y de la síntesis de novo de
lípidos a partir de la glucosa...............................................................142-143
2.6.3. Determinación de la reesterificación de los ácidos grasos....................143-144
2.6.4. Consumo de glucosa y producción de lactato por el WAT epididimal...........144
2.7. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PEPCK CITOSÓLICA. .........................144-145
2.8. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR A PARTIR DE EXTRACTOS
TISULARES...............................................................................................145-148
2.8.1. Espectroscopia de la RMN de 13C.......................................................146-147
2.8.2. Asignaciones de las posiciones de la RMN de 13C del WAT y cálculos....147-148
2.9. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE GRASA CORPORAL................................148
2.10. DETERMINACIÓN DE METABOLITOS HEPÁTICOS.....................................148-152
Índice
2.10.1. Determinación del contenido de glucógeno, glucosa-6-fosfato y
lactato...........................................................................................149-151
2.10.1.1. Determinación del contenido de glucógeno.........................149-150
2.10.1.2. Determinación del contenido de glucosa-6-fosfato y
lactato..............................................................................150-151
2.10.2. Determinación del contenido de triglicéridos hepáticos......................151-152
2.11. PCR SEMICUANTITATIVA EN TIEMPO REAL.............................................152-154
2.12. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS SANGUÍNEOS....................................155-158
2.12.1. Metabolitos sanguíneos...................................................................155-156
2.12.1.1. Glucosa sanguínea..................................................................155
2.12.1.2. Triglicéridos............................................................................155
2.12.1.3. Ácidos grasos libres..........................................................155-156
2.12.1.4. Glicerol...................................................................................156
2.12.1.5. Lactato...................................................................................156
2.12.1.6. β-hidroxibutirato.....................................................................156
2.12.2. Hormonas séricas...........................................................................157-158
2.12.2.1. Insulina..................................................................................157
2.12.2.2. Leptina...................................................................................157
2.12.2.3. Citoquinas: TNF-α e IL-6.........................................................157
2.12.2.4. Adiponectina...........................................................................158
2.13. ANÁLISIS HISTOLÓGICOS.......................................................................158-159
2.13.1. Análisis morfométricos....................................................................158-159
2.14. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS..............................................................................159
VIII. BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................160-178
I. PRESENTACIÓN.
Presentación
1
La obesidad y la diabetes de tipo 2 se han convertido en las dos grandes epidemias
de los países desarrollados y en vías de desarrollo (James, 2004;Zimmet et al., 2001). El
conocimiento de las causas y mecanismos que desencadenan el desarrollo de obesidad,
resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 es de vital importancia para su posterior
prevención y tratamiento. Tanto la producción de glicerol-3-fosfato como la obtención de
ácidos grasos libres son fundamentales para la síntesis de triglicéridos por el tejido adiposo.
Por tanto, alteraciones metabólicas primarias en el tejido adiposo que incrementen la
obtención de glicerol-3-fosfato podrían aumentar su capacidad de almacenar lípidos,
induciendo el desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2. En
condiciones fisiológicas, se considera que el adipocito produce glicerol-3-fosfato a partir de la
glucosa durante el periodo post-prandial, o a través de la gliceroneogénesis durante el ayuno.
Así, en la primera parte de este estudio, se analizaron los efectos de un incremento
en la gliceroneogénesis del tejido adiposo a través de la sobreexpresión de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) en ratones transgénicos. La sobreexpresión de
PEPCK llevaba a un incremento en la reesterificación de ácidos grasos y un mayor depósito de
lípidos en tejido adiposo. Sin embargo, aunque estos animales presentaron obesidad
hipertrófica, mostraban una sensibilidad a la insulina y tolerancia a la glucosa similar a los
controles. Ello probablemente era debido a la ausencia de niveles elevados de FFAs, leptina y
TNF-α circulantes, junto con la ausencia de depósito de grasa en tejidos no adiposos y altos
niveles de adiponectina sérica. Con el fin de estudiar si un incremento en la reesterificación de
ácidos grasos era capaz de contrarrestar el incremento en los niveles séricos de FFAs y la
resistencia a la insulina inducida por una dieta alta en lípidos, los animales transgénicos aP2-
PEPCK se alimentaron con este tipo de dieta durante un corto período. Sin embargo, estos
animales presentaban obesidad mórbida y una severa resistencia a la insulina e intolerancia a
la glucosa respecto a los controles. Por tanto, los efectos combinados de la dieta alta en
lípidos junto al incremento en la reesterificación de ácidos grasos en tejido adiposo,
Presentación
2
probablemente saturaban la capacidad de éste de almacenar lípidos. Ello llevaba al depósito
de lípidos en hígado y a hipertrigliceridemia. Además, la acumulación de lípidos en tejido
adiposo marrón disminuía su capacidad termogénica. Todo ello probablemente contribuyó a la
obesidad y resistencia a la insulina tan severas que presentaban estos animales transgénicos
alimentados con una dieta alta en lípidos. Estos resultados sugieren que la regulación de la
capacidad del tejido adiposo blanco para almacenar lípidos es crucial para el mantenimiento
de la sensibilidad a la insulina.
Por otra parte, un incremento en la fosforilación de la glucosa en tejido adiposo
también podría llevar a una mayor esterificación de ácidos grasos y depósito de lípidos, a
través de un aumento en su obtención de glicerol-3-fosfato. Por ello, en la segunda parte de
la presente Tesis Doctoral, se expresó la enzima glucoquinasa (GK) en tejido adiposo de
ratones, una enzima reguladora de la utilización de glucosa en hígado. La presencia de GK en
tejido adiposo incrementaba su captación basal de glucosa, y mejoraba la tolerancia a la
glucosa y la sensibilidad a la insulina en estos animales. A pesar de la mayor utilización de
glucosa en tejido adiposo blanco, ello no generaba más glicerol-3-fosfato ni alteraba el
depósito de lípidos, sino que aumentaba su producción de lactato, incrementando sus niveles
circulantes. Por tanto, estos resultados indican que un incremento de la captación de glucosa
por parte del tejido adiposo no lleva a una mayor síntesis de lípidos sino a un aumento en la
producción de lactato.
Todos estos resultados parecen indicar que la regulación del aporte de glicerol-3-
fosfato contribuye al control de la síntesis de triglicéridos. Además, muestran la implicación
directa de la PEPCK en la síntesis de glicerol-3-fosfato y resaltan el papel clave de la
gliceroneogénesis en la reesterificación de ácidos grasos y la consiguiente acumulación de
grasa, tanto en tejido adiposo blanco como marrón. Sin embargo, el incremento en la
captación y utilización de la glucosa no es suficiente para promover la generación de glicerol-
3-fosfato y el depósito de grasa.
II. INTRODUCCIÓN.
Introducción
3
1. OBESIDAD Y SÍNDROME METABÓLICO: UN PROBLEMA DE
SALUD MUNDIAL.
1.1. OBESIDAD: LA GRAN EPIDEMIA DEL SIGLO XXI.
En las últimas décadas, la prevalencia de la obesidad se ha disparado en el mundo
occidental y en los países occidentalizados, convirtiéndola en la gran epidemia de nuestro
tiempo. Según estimaciones actuales más de 1 billón de adultos en el mundo sufren
sobrepeso y al menos 300 millones de éstos son clínicamente obesos (IDF, 2004). En Estados
Unidos y en Europa, el 20% de los hombres y el 25% de las mujeres son obesos (James,
2004). En España, el porcentaje de población obesa se sitúa en el 13%, siendo Andalucía la
Comunidad Autónoma con mayor porcentaje (16,9%) y Navarra con el menor (7,5%)
(Martinez et al., 2004). Además, esta epidemia también afecta a los jóvenes (Schwartz and
Puhl, 2003). En Estados Unidos, el número de niños y adolescentes con sobrepeso se ha
doblado desde 1980 y se calcula que en el mundo ya hay 22 millones de niños menores de 5
años con sobrepeso (IDF, 2004).
La importancia del fenómeno pandémico de la obesidad radica sobretodo, y por
encima de cualquier implicación estética, en los problemas de salud pública a los que se
relaciona (NIH, 2004). La obesidad puede reducir la esperanza de vida en ocho años (IDF,
2004) e incluso, en poco años, se convertirá en la principal causa de mortalidad por encima
del hábito de fumar (Bell et al., 2005).
Introducción
4
1.2. OBESIDAD, SÍNDROME METABÓLICO Y DIABETES DE TIPO 2.
1.2.1. Obesidad.
La obesidad se ha relacionado con un gran número de alteraciones de la salud. Así,
los individuos obesos o con sobrepeso presentan un incremento en el riesgo de padecer
hipertensión, dislipidemia, diabetes de tipo 2, resistencia a la insulina e intolerancia a la
glucosa, hiperinsulinemia, enfermedad cardíaca coronaria, angina de pecho, fallo cardíaco
congestivo, infartos, cálculos biliares, colecistitis y colelitiasis, gota, osteoartritis, apnea
obstructiva del sueño y problemas respiratorios, algunos tipos de cáncer (endometriales,
prostáticos, de colon, de mama), complicaciones del embarazo (diabetes gestacional,
hipertensión gestacional, preeclampsia), complicaciones en el parto (cesáreas), alteraciones
de la fertilidad de la mujer (irregularidades menstruales, infertilidad, ovulaciones irregulares),
problemas en el control de la micción (incontinencia por estrés), nefrolitiasis y desórdenes
psicológicos (depresión, desórdenes en la conducta alimenticia, baja autoestima). Algunas de
estas patologías asociadas a la obesidad han sido agrupadas bajo el término Síndrome
Metabólico.
1.2.2. Síndrome Metabólico.
El Síndrome Metabólico también es conocido como Síndrome X (Reaven, 1988),
Síndrome plurimetabólico o Síndrome de la Resistencia a la Insulina (IRS) (Zimmet, 2002).
Este síndrome se define como un conjunto de factores de riesgo específicos de patologías
cardiovasculares (CVD) cuya fisiopatología subyacente podría ser la resistencia a la insulina
(Kahn et al., 2005). La Federación Internacional de Diabetes (IDF) ha propuesto
recientemente una nueva definición en la que la resistencia a la insulina es sustituida por la
obesidad visceral como elemento clave del síndrome (Alberti et al., 2005). Los factores de
Introducción
5
riesgo incluidos en el síndrome han variado junto con las diferentes definiciones que se han
descrito. En la definición propuesta por el Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol
(Tercer Panel para el Tratamiento de los Adultos o ATP III) (NCEP, 2001), los factores de
riesgo incluidos son:
- Circunferencia de la cintura: >102 cm en hombres y >88 cm en mujeres.
- Triglicéridos séricos: >1.7 mmol/l.
- Presión sanguínea: >130/85 mmHg.
- Colesterol contenido en lipoproteínas de elevada densidad (HDL): <1.0 mmol/l en
hombres y <1.3 mmol/l en mujeres.
- Glucemia: >6.1 mmol/l.
A pesar del intento de agrupar diferentes factores de riesgo cuyo mecanismo
fisiopatológico pudiera ser común, el valor diagnóstico del síndrome no está claro. El
tratamiento del síndrome no difiere del tratamiento de cada uno de sus componentes ni el
riesgo de enfermedades cardiovasculares asociadas al síndrome parece mayor que la suma de
los distintos componentes. Así, se cuestiona la utilización del Síndrome Metabólico dada la
ambigüedad de los criterios incluidos en las definiciones y la idoneidad de modificar algunos
componentes del síndrome (Kahn et al., 2005).
1.2.3. Diabetes mellitus de tipo 2.
La diabetes mellitus de tipo 2, o diabetes mellitus independiente de insulina
(NIDDM), está caracterizada por la resistencia a la insulina de los tejidos periféricos como la
principal responsable, y aparecen sus síntomas cuando se acompaña del defecto en la
secreción de la hormona. También es llamada “diabetes del adulto” porque afecta
mayoritariamente a este grupo poblacional. Al menos en el inicio de la patología, o incluso a lo
largo de toda la vida, no es necesaria la administración de la hormona para la supervivencia
Introducción
6
de estos pacientes. La relación entre la obesidad y la diabetes de tipo 2 es clara, ya que la
epidemiología de la diabetes de tipo 2 sigue la misma dinámica que la de la obesidad (IDF,
2004;WHO, 1999). Existen numerosos estudios que sugieren que la resistencia a la insulina es
el primer signo de la diabetes de tipo 2. Una alteración funcional que afecte a las células β
pancreáticas, a los hepatocitos, a las fibras musculares esqueléticas, a los adipocitos o al
Sistema nervioso central puede llevar a una alteración en la homeostasis de la glucosa. La
aparición de resistencia a la insulina en los diferentes tejidos insulino-dependientes
desencadena distintas consecuencias según el tejido de que se trate. El músculo esquelético
es el tejido responsable del 80% de la captación y utilización de la glucosa circulante. Así, la
resistencia a la insulina a nivel muscular reduce la utilización de glucosa corporal. La
producción hepática de glucosa está fuertemente inhibida por la insulina (DeFronzo et al.,
1983). La falta de sensibilidad a la insulina en hígado induce un aumento de la producción de
glucosa, contribuyendo a la hiperglucemia característica del estado diabético. El incremento en
la producción de glucosa se produce principalmente por un aumento en la gluconeogénesis,
aunque la glucogenolisis también se encuentra incrementada (Consoli et al., 1989). La
resistencia a la insulina también reduce la captación de glucosa por el tejido adiposo y,
aunque su utilización del azúcar es menor que la del músculo, también contribuye a la
hiperglucemia diabética. Sin embargo, la inhibición de la lipólisis es el principal efecto de la
insulina sobre el adipocito. Así, la resistencia a la insulina en el adipocito principalmente
incrementa la liberación de ácidos grasos a la circulación, cuyos efectos contribuyen al
desarrollo de la resistencia a la hormona en otros tejidos y a las alteraciones pancreáticas
(Bays et al., 2004). El exceso de disponibilidad de ácidos grasos circulantes induce resistencia
a la insulina en músculo esquelético (Kelley et al., 1993), resistencia a la capacidad de la
insulina de suprimir la producción hepática de glucosa (Saloranta et al., 1991) e
hipertrigliceridemia (Kissebah et al., 1976). Además, reduce la eliminación de insulina de la
circulación sanguínea por el hígado (Hennes et al., 1990) y altera la secreción de insulina por
las células β (McGarry and Dobbins, 1999;Zhou and Grill, 1994). Estas alteraciones provocadas
Introducción
7
por el exceso de ácidos grasos circulantes, conocidas como lipotoxicidad, son las mismas que
las asociadas a la obesidad. Por este motivo, las alteraciones en el flujo de ácidos grasos
pueden ser responsables de algunas de las complicaciones metabólicas de la obesidad. La
falta de acción de la insulina en cerebro incrementa la ingesta e induce obesidad,
contribuyendo al desarrollo de la diabetes de tipo 2 (Schwartz and Porte, Jr., 2005). En
respuesta a la resistencia a la insulina en tejidos periféricos, las células β pancreáticas
incrementan su secreción de insulina, produciendo una hiperinsulinemia compensatoria para
paliar la falta de efecto de la hormona (Ahren and Pacini, 2005). Mientras la secreción de
insulina pueda ajustarse a la resistencia periférica a la hormona, la homeostasis de la glucosa
no se encontrará gravemente alterada. En cambio, aparecerán los síntomas de la diabetes de
tipo 2 si se produce un fallo en la secreción de insulina, ya sea por alteraciones en la
señalización de la hormona en célula β, alteraciones en la producción de insulina o
alteraciones en el metabolismo o en la masa de células β durante este periodo de
compensación (Ahren and Pacini, 2005).
1.3. DEFINICIÓN DE SOBREPESO Y DE OBESIDAD.
La obesidad se define como un acúmulo excesivo de tejido adiposo. El índice de
masa corporal (BMI) es el parámetro más aceptado en la determinación de la obesidad al
proporcionar una buena medida indirecta de la grasa corporal. El BMI se define como el peso
del individuo, en kilogramos, dividido por la altura, en metros, al cuadrado (kg/m2). En
algunos casos, como son en personas ancianas o en individuos muy musculosos o con mucha
altura, este parámetro pierde su validez (James, 2004). Sin embargo, se ha establecido una
clasificación consensuada de la obesidad a partir del BMI (WHO, 1999). Se consideran
personas con sobrepeso aquellos individuos que muestran un BMI superior a los 25 kg/m2 e
individuos obesos aquellos que presentan un BMI por encima de los 30 kg/m2. Además, nos
Introducción
8
referimos como individuos que presentan obesidad mórbida a aquellas personas que
presentan un BMI superior a los 40 kg/m2.
1.4. TIPOS DE OBESIDAD HUMANA.
La obesidad hace referencia a la expansión de todos los depósitos de grasa, aunque
en general se produce de forma localizada. Así, podemos distinguir dos tipos de obesidad
según la región corporal donde se produce el mayor incremento del depósito de grasa
(Lafontan and Berlan, 2003;Montague and O'Rahilly, 2000):
-La obesidad visceral o abdominal (upper-body obesity), caracterizada por un
acúmulo de grasa en la zona abdominal. En estos casos, se produce un incremento de la
grasa subcutánea de la región abdominal superior y del depósito de grasa visceral, compuesto
por la grasa del omento mayor, del omento menor y la grasa mesentérica. La grasa visceral
representa el depósito de grasa corporal minoritario, aproximadamente un 5-8% en las
mujeres, aunque puede alcanzar hasta un 20% en los varones. Por ello, a este tipo de
obesidad también se le denomina obesidad andrógena (android obesity).
-El otro tipo de obesidad se caracteriza por un acúmulo de grasa
especialmente localizado en las partes inferiores del cuerpo, sobretodo en el tejido adiposo
subcutáneo femoral y gluteal. También se denomina lower-body obesity u obesidad ginoide
(gynoid obesity), ya que es la forma de obesidad más habitual en las mujeres.
La obesidad visceral presenta un mayor grado de correlación con el riesgo de
desarrollar las patologías asociadas a la obesidad, respecto a la lower-body obesity (Jensen,
1997;Kissebah et al., 1982). Por este motivo, actualmente se considera la distribución de
grasa corporal, determinada como la medida de la circunferencia de la cintura y la relación
cintura/cadera (WHR), un mejor indicador de riesgo respecto el BMI (Lev-Ran, 2001).
Introducción
9
2. EL TEJIDO ADIPOSO.
2.1. ORGANIZACIÓN DEL TEJIDO ADIPOSO.
El tejido adiposo se encuentra presente en todas las especies de mamíferos y en una
amplia variedad de especies no mamíferas. Podemos diferenciar dos tipos de tejido adiposo, el
tejido adiposo blanco (WAT) y el tejido adiposo marrón (BAT). El tejido adiposo está formado
por: adipocitos maduros, células vasculares y del estroma (células de soporte), vasos
sanguíneos, nódulos linfoides y nervios. Cada adipocito se encuentra próximo a un capilar
sanguíneo (Crandall et al., 1997). El aporte sanguíneo del tejido adiposo proporciona los
sustratos metabólicos necesarios y recoge los distintos productos metabólicos originados.
Aunque el flujo sanguíneo en el tejido adiposo, expresado como mililitros de sangre por cada
100 gramos de tejido y por minuto, parezca pequeño comparado con otros tejidos, la
situación cambia radicalmente si es expresado por célula. En humanos delgados, el tejido
adiposo recibe 0.2-0.6 litros de sangre por minuto, un 3-7% del gasto cardíaco, mientras que
en individuos obesos mórbidos puede representar el 15-30% del gasto cardíaco (Alexandre et
al., 1962). El tejido adiposo marrón se encuentra más densamente vascularizado que el
blanco, lo que macroscópicamente le confiere una coloración más rojiza que permite su
identificación.
Además, el tejido adiposo contiene nódulos linfoides cuyo número depende de la
localización del depósito (Pond, 1996). El tejido adiposo se encuentra inervado tanto por
neuronas post-ganglionares del sistema nervioso simpático (SNS) como por nervios sensitivos
(Hausman et al., 2001). Se ha identificado la presencia de neurotransmisores típicos de las
fibras nerviosas sensitivas, como la sustancia P y el péptido relacionado con el gen de la
calcitonina (CGRP) en tejido adiposo. Aunque no se conoce aún la función fisiológica de la
inervación sensitiva, ésta podría regular la irrigación sanguínea e incluso la diferenciación
celular (Giordano et al., 1998). En cambio, la inervación por el SNS, mayoritariamente fibras
Introducción
10
noradrenérgicas, controla la movilización de lípidos al regular la lipólisis (Bartness and
Bamshad, 1998). La inervación del tejido adiposo marrón es más densa que la del blanco.
Incluso se han encontrado fibras nerviosas colinérgicas pertenecientes al sistema nervioso
parasimpático (SNP), además de las fibras nerviosas noradrenérgicas del SNS. Esta doble
inervación del tejido adiposo marrón podría regular su capacidad termogénica (Giordano et
al., 2004).
2.2. TIPOS DE ADIPOCITOS MADUROS.
2.2.1. Los adipocitos blancos.
El componente celular mayoritario del tejido adiposo blanco son los adipocitos
blancos. Microscópicamente, el adipocito blanco maduro es una célula más o menos esférica
que acumula grasa de forma unilocular, es decir, presenta una única gota de grasa. Esta gota
lipídica ocupa prácticamente todo el citoplasma de la célula, mientras que el núcleo,
mitocondrias y el resto de orgánulos citoplasmáticos quedan en la periferia, entre la
membrana plasmática y la gota (Figura 1).
Núcleo
Mitocondrias
Gota lipídica
Figura 1. El adipocito blanco. Esquema de un adipocito blanco e imagen histológica de una sección de tejido adiposo blanco teñida con hematoxilina-eosina.
Introducción
11
2.2.2. Los adipocitos marrones.
En cambio, el adipocito marrón maduro acumula grasa de forma multilocular, es
decir, presenta múltiples gotas lipídicas de distintos tamaños. Por ello, la forma de
almacenamiento intracelular de grasa es una de las principales características microscópicas
utilizadas para diferenciar los dos tipos de adipocitos. Además, el adipocito blanco presenta un
bajo número de mitocondrias, mientras que el adipocito marrón presenta multitud de
mitocondrias dispersas en su citoplasma (Figura 2).
Núcleo
Mitocondrias
Gotas lipídicas
Figura 2. El adipocito marrón. Esquema de un adipocito marrón e imagen histológica de una sección de tejido adiposo marrón teñida con hematoxilina-eosina.
2.3. LOCALIZACIÓN ANATÓMICA DEL TEJIDO ADIPOSO.
Los adipocitos blancos murinos se encuentran ampliamente distribuidos por todo el
organismo, principalmente en la región subcutánea, dérmica e intraperitoneal (Figura 3).
También podemos encontrarlos en el músculo esquelético, tanto alrededor del conjunto de
fibras musculares (intermuscular) como alrededor de las fibras musculares (intramuscular).
Incluso es posible encontrar adipocitos blancos en otras localizaciones como médula ósea,
páncreas, glándula parótida y paratiroides (Cinti, 2005). El tejido adiposo blanco no siempre
crece o responde uniformemente al estímulo que le obliga a almacenar lípidos o a movilizarlos.
Introducción
12
Actualmente se conocen diferencias específicas del tipo de depósito de WAT de que se trate,
tanto en su morfología como en su respuesta ante los mismos estímulos, especialmente las
respuestas proliferativas (Hausman et al., 2001). Además, también existen diferencias
metabólicas entre los distintos depósitos de grasa. Los adipocitos del WAT mesentérico
presentan un mayor metabolismo de la glucosa y una mayor producción de lactato respecto al
resto de adipocitos. Es más, estos adipocitos mesentéricos son más pequeños y menos
sensibles a la insulina respecto a la utilización de la glucosa. Aunque presentan la misma
respuesta lipolítica estimulada por hormonas, muestran una mayor capacidad lipolítica basal
(Hausman et al., 2001).
Los adipocitos marrones no se distribuyen por el organismo tan difusamente como
los blancos. Además de las regiones visibles macroscópicamente (Figura 3),
microscópicamente podemos encontrar adipocitos marrones en la región inguinal, periovárica
y retroperitoneal, incluso grupos o “clusters” de adipocitos marrones entre los adipocitos
blancos en los distintos depósitos de WAT (Cinti, 2005).
Figura 3. Distribución del tejido adiposo blanco y marrón en una hembra adulta de ratón. Se muestra tanto la disección de los depósitos de grasa subcutáneos y viscerales más representativos, así como un esquema en donde la coloración de las áreas indicadas representa el tipo de tejido adiposo mayoritario (blanco=WAT; marrón=BAT). A= depósito cervical profundo; B=depósito subcutáneo anterior que incluye el interescapular, subescapular, axilo-torácico y cervical superficial; C= depósito mediastínico visceral; D= depósito mesentérico visceral; E= depósitos viscerales perirenal, periovárico, parametrial y perivesical; G= depósito subcutáneo posterior que incluye el dorso-lumbar, inguinal y gluteal. Fuente: Cinti S, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 73:9-15, 2005 (Cinti, 2005).
Introducción
13
2.4. EL ÓRGANO ADIPOSO Y LA TRANSDIFERENCIACIÓN DEL ADIPOCITO.
De la clásica simpleza de tejido inerte, el tejido adiposo ha demostrado poseer una
compleja organización con diferentes relaciones entre los diversos tipos celulares contenidos y
un comportamiento distinto entre los depósitos regionales de grasa. El tejido adiposo blanco y
el marrón presentan diferencias morfológicas, de distribución anatómica y de funcionalidad
derivada del tipo de adipocito que los compone. Ambos adipocitos son tipos celulares distintos
por su capacidad metabólica, por los genes que expresan y por sus funciones. Sin embargo
presentan similitudes, como la capacidad para acumular/liberar ácidos grasos, presencia de
receptores adrenérgicos específicos (β3-adrenérgicos) e incluso comparten célula precursora.
Por ello, en los últimos años se ha reintroducido el concepto de órgano adiposo (adipose
organ) formado tanto por adipocitos blancos como marrones, propuesto en 1940 por Wells
(Cinti, 2005). El órgano adiposo de los mamíferos está compuesto por diferentes depósitos de
grasa localizados en diferentes regiones anatómicas (Figura 3). Aunque algunos depósitos de
grasa tienen un componente mayoritario blanco (WAT) y otros mayoritariamente marrón
(BAT), todos ellos están formados por una combinación de ambos. Las proporciones de la
población de cada tipo celular son determinadas por la edad, la especie y las condiciones
ambientales y nutricionales (Cinti, 2005). Aunque los adipocitos blancos y marrones se
originan a partir de un precursor común, algunos estudios sugieren que la célula adiposa
madura es capaz de transdiferenciarse en un tipo u otro de adipocito. Cada tipo celular, cada
célula diferenciada posee unas características fenotípicas y funcionales concretas y propias. La
transdiferenciación es un fenómeno biológico en el que una célula diferenciada es capaz de
diferenciarse en otro tipo celular, sin necesidad de desdiferenciarse a una célula menos
madura y más indiferenciada (Tosh and Slack, 2002). El adipocito blanco maduro es capaz de
transdiferenciarse a adipocito marrón y viceversa, probablemente regulando la expresión de la
proteína desacopladora 1 (UCP1) a través de sus receptores β3-adrenérgicos (Cinti, 2005). De
esta forma, el órgano adiposo se convierte en el órgano con mayor capacidad de adaptación a
Introducción
14
las necesidades energéticas, al estar formado por dos tipos de adipocitos maduros y un
precursor común, junto con la posibilidad de transdiferenciarse en uno u otro sin necesidad de
recurrir al precursor común (Cinti, 2005).
2.5. CRECIMIENTO DEL TEJIDO ADIPOSO.
El tejido adiposo blanco es el tejido con mayor plasticidad del organismo, siendo el
único tejido del cuerpo que puede cambiar drásticamente su masa a pesar de haber alcanzado
la edad adulta. Su porcentaje respecto al peso corporal puede ser muy variable según
individuos, pudiendo representar desde el 2-3% en los atletas profesionales al 60-70% en los
casos de obesidad humana extrema (Hausman et al., 2001). La población de adipocitos
maduros en el tejido adiposo blanco incluye células de tamaños muy variables, desde
adipocitos muy pequeños de menos de 35 µm de diámetro hasta adipocitos de 200 µm.
Cuando la población de adipocitos incrementa de tamaño, debido al crecimiento o durante el
desarrollo de la obesidad, la heterogeneidad de la población de los adipocitos disminuye. Esto
sugiere la existencia de un “tamaño máximo del adipocito” o tamaño crítico, el cual depende
de la especie animal y la localización del depósito graso (Hausman et al., 2001).
El crecimiento del tejido adiposo involucra dos respuestas celulares del adipocito: la
hipertrofia o incremento del tamaño celular, y la hiperplasia o incremento del número de
células. La hipertrofia de los adipocitos se produce como resultado de un incremento en la
acumulación de triglicéridos en adipocitos ya existentes, cuando la ingestión de energía
sobrepasa al gasto energético. Sin embargo, la hiperplasia de los adipocitos se produce como
resultado del reclutamiento de nuevos adipocitos a partir de células precursoras o
preadipocitos. Estos preadipocitos proliferan y se diferencian hasta adipocitos maduros a
través de un proceso denominado adipogénesis. La hiperplasia suele ser precedida por la
hipertrofia y también se produce por un balance energético positivo (Bjorntorp, 1974;Johnson
et al., 1978). Los términos de hipertrofia e hiperplasia también se aplican a la obesidad,
Introducción
15
reflejando el tipo de crecimiento del tejido adiposo, especialmente del blanco. En la gran
mayoría de casos humanos, la obesidad es hipertrófica mientras que la presencia de
hiperplasia se utiliza como un signo de obesidad de peor pronóstico (Hirsch and Batchelor,
1976). El tipo de crecimiento celular que predomina en un depósito de grasa u otro,
hipertrofia versus hiperplasia, está determinado por varios factores de regulación. En el tejido
adiposo blanco, entre estos factores se incluyen la población de preadipocitos, la capacidad de
perfusión sanguínea y la densidad de terminaciones nerviosas que lo inervan. Se ha descrito
una relación inversa entre el grado de inervación simpática y la capacidad del tejido para
proliferar (DiGirolamo et al., 1998).
La adipogénesis tiene lugar a lo largo de toda la vida del organismo, desde el periodo
prenatal hasta la etapa adulta, debido tanto a la continua renovación celular como a las
cambiantes necesidades energéticas (Rangwala and Lazar, 2000;Rosen and Spiegelman,
2000). El complejo proceso de diferenciación del preadipocito está controlado hormonalmente
y desencadenado por la aparición secuencial de diferentes factores de transcripción hasta la
consecución de la expresión de aquellos genes característicos del adipocito maduro. Los
principales factores de transcripción implicados pertenecen a tres grandes familias: la familia
de proteínas inductoras de la transcripción que se unen a la secuencia CCAAT (C/EBPs), la
familia de receptores nucleares activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs) y la
familia de proteínas de unión a elementos que responden a los esteroles (SREBPs).
2.5.1. La familia C/EBPs.
La familia C/EBPs engloba diferentes proteínas nucleares capaces de reconocer y
unirse a una determinada secuencia de DNA (CCAAT), presente en los promotores de algunos
genes, promoviendo su expresión transcripcional. Cuatro de los seis miembros de la familia
C/EBPs son expresados por el tejido adiposo, aunque no de forma específica de tejido:
C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPδ y C/EBPζ. Mientras que C/EBPβ y C/EBPδ son expresados en la fase
Introducción
16
de diferenciación temprana, C/EBPα es inducido en la fase tardía. Se ha demostrado la
implicación de C/EBPβ y C/EBPδ en la cascada de la adipogénesis como inductores directos de
la transcripción del PPARγ (Rosen and Spiegelman, 2000;Tanaka et al., 1997;Yeh et al., 1995).
C/EBPα es uno de los principales reguladores y desencadenantes del proceso de
diferenciación, tanto en los adipocitos blancos como marrones. La expresión de C/EBPα
también es inducida por PPARγ, y la expresión de éste por C/EBPα, creándose así un feedback
positivo que refuerza la expresión de ambos y asegura la diferenciación completa del
preadipocito (Rosen and Spiegelman, 2000). Promotores de varios genes específicos del
adipocito presentan lugares de unión para C/EBPs, como el transportador de glucosa GLUT4,
la proteína intracelular de unión a lípidos específica del adipocito aP2/422, las enzimas
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) y ácido graso sintasa, y las proteínas
desacopladoras de la fosforilación oxidativa (Rangwala and Lazar, 2000).
2.5.2. La familia PPARs.
Se conocen tres miembros de la familia PPARs: PPARα, PPARδ o PPARβ y PPARγ.
PPARγ juega un papel central en el proceso de diferenciación, siendo el principal regulador y
desencadenante junto con C/EBPα. Aunque podrían activar los mismos genes diana de PPARγ,
PPARα y PPARδ no están implicados en la adipogénesis del adipocito blanco (Rangwala and
Lazar, 2000). Sin embargo, PPARα y PPARδ adquieren una mayor importancia en el caso de
los adipocitos marrones. Ambos regulan la expresión de genes relacionados con la β-oxidación
de ácidos grasos (Rosen and Spiegelman, 2000) y además PPARδ promueve la expresión de
UCP1 (Wang et al., 2003).
Existen dos isoformas de PPARγ, PPARγ1 y PPARγ2, generadas a partir de un gen
único gracias a promotores alternativos, aunque en humanos se ha descrito una tercera
isoforma (PPARγ3) (Fajas et al., 1998;Rangwala and Lazar, 2000). Mientras que PPARγ1 está
ampliamente expresado, predominantemente en tejido adiposo blanco y marrón, la isoforma
Introducción
17
PPARγ2 es específica y altamente expresada en el blanco. PPARγ3 se expresa en tejido
adiposo e intestino delgado. PPARγ reconoce lugares de unión al DNA y forma heterodímeros
con otro factor nuclear, el receptor X para retinoides (RXR), en concreto con su isoforma
RXRα. Se han descrito lugares de unión para PPARγ en promotores de genes específicos del
adipocito, como los de las proteínas aP2 y PEPCK, siendo absolutamente necesaria la unión de
PPARγ para su expresión (Rangwala and Lazar, 2000;Rosen and Spiegelman, 2000). La
actividad de este tipo de factores nucleares está determinada por la unión con su ligando.
Según su naturaleza, existen dos tipos de ligandos para PPARγ: ligandos naturales y ligandos
sintéticos. Entre sus ligandos naturales se encuentran ácidos grasos y sus derivados, como las
prostaglandinas J2 y D2 (PGJ2 y PGD2), siendo la prostaglandina 15-deoxi-∆12,14 PGJ2 el más
potente (Forman et al., 1995). Pero los ligandos para PPARγ más potentes que se conocen son
las tiazolidinedionas (TZDs), familia de fármacos sintéticos con propiedades antidiabéticas
(Lehmann et al., 1995). Las TZDs no sólo poseen efectos hipoglucemiantes sino que también
promueven la adipogénesis al comportarse como agonistas selectivos de alta afinidad para
PPARγ.
La expresión de UCP1 durante la diferenciación del preadipocito decanta la célula
adiposa hacia la diferenciación a adipocito marrón. Aunque PPARδ puede promover la
expresión UCP1, su principal regulador transcripcional es PPARγ, el cual desempeña la misma
función reguladora de la adipogénesis tanto en el adipocito blanco como en el marrón. PPARγ
promueve la expresión de UCP1, de forma diferencial y exclusiva en la diferenciación del
adipocito marrón, a través del factor coactivador-1α del PPARγ (PGC-1α) (Puigserver et al.,
1998). Aunque PGC-1α también se expresa en tejido adiposo blanco, sus niveles de expresión
son mucho más altos en el marrón. PGC-1α coactiva al heterodímero formado por PPARγ y
RXRα para activar la expresión de UCP1, y así regular la adipogénesis hacia la diferenciación a
adipocito marrón. Se conocen otras proteínas coactivadoras que intervienen en la
adipogénesis diferencial por PPARγ en ambos tipos de adipocitos, el coactivador-1 del receptor
activado por esteroides (SRC-1) y el factor transcripcional intermediario-2 (TIF2) (Rosen and
Introducción
18
Spiegelman, 2000). Ambas proteínas interaccionan con PGC-1α, y sus complejos con él tienen
una actividad coactivadora transcripcional diferente (Picard et al., 2002). Mientras que el
complejo PGC-1α-SRC-1 es más activo y promueve la termogénesis, el complejo PGC-1α-TIF2
es menos activo e induce un mayor depósito de grasa. Por tanto, la relación existente entre
TIF2 y SRC-1, junto con PGC-1α, permiten a PPARγ regular la diferenciación del preadipocito
hacia adipocito blanco o marrón.
2.5.3. La familia SREBPs.
SREBP-1 es el miembro de la familia SREBPs involucrado en la adipogénesis. SREBP-
1 es un factor de transcripción que se une a una región específica del DNA (CANNTG) o E-box
motif que responde a esteroles. A partir de un único gen y mediante dos inicios de
transcripción alternativos, se obtienen dos isoformas, SREBP-1a y SREBP-1c o ADD-1. Además
de regular el metabolismo del colesterol, SREBP-1/ADD-1 regula el metabolismo lipídico al
inducir la captación y la síntesis de lípidos. Aunque está implicado en la adipogénesis, no tiene
un efecto tan importante como C/EBPα y PPARγ. SREBP-1/ADD-1 induce PPARγ, incluso la
producción de ligandos endógenos de PPARγ (Kim and Spiegelman, 1996;Kim et al., 1998).
Además, SREBP-1/ADD-1 está regulado in vivo tanto nutricionalmente, durante el ayuno y la
realimentación, como hormonalmente a través de la insulina, relacionando así los cambios
nutricionales con la adipogénesis/lipogénesis (Rosen and Spiegelman, 2000).
2.5.4. Regulación transcripcional de la adipogénesis.
A partir de los numerosos estudios sobre la proliferación y diferenciación del
adipocito, especialmente in vitro, se ha establecido un modelo de “cascada transcripcional”. El
modelo más aceptado es el propuesto por Rosen y Spiegelman (Rosen and Spiegelman, 2000)
(Figura 4). En este modelo, el proceso de diferenciación se inicia con la activación de los
Introducción
19
factores de diferenciación temprana, C/EBPβ y C/EBPδ, a través de estímulos hormonales pro-
adipogénicos. Estos dos factores inducen la expresión y activación de PPARγ, el cual a su vez
activa C/EBPα. En el modelo se incluye el feedback positivo entre C/EBPα y PPARγ que
mantiene la diferenciación del preadipocito, una vez iniciada. La activación de PPARγ también
está regulada tanto por su unión a sus ligandos como por su unión al receptor nuclear RXRα.
También se incluye la regulación de PPARγ por SREBP-1/ADD-1, tanto a nivel transcripcional
como a nivel de producción de sus ligandos. Además de establecer una inducción de la
adipogénesis independiente de C/EBPβ y C/EBPδ, SREBP-1 permite integrar una regulación
nutricional y hormonal al control de la adipogénesis. Además de estos factores de
transcripción, otros factores pueden estar implicados en la inducción o en el mantenimiento
del proceso de diferenciación, aunque tienen un papel regulador menor.
Figura 4. Modelo del control transcripcional de la adipogénesis. Se muestran los principales factores de transcripción implicados y sus relaciones. Fuente: Rosen ED and Spiegelman BM, Annu Rev Cell Dev Biol 2000 (Rosen and Spiegelman, 2000).
Introducción
20
2.6. FUNCIONES DEL ÓRGANO ADIPOSO.
La principal función del órgano adiposo es regular la homeostasis energética,
desarrollando un papel central gracias a la distinta funcionalidad del adipocito blanco y del
marrón. Durante años, el adipocito blanco se consideró una célula “inerte” que almacena y
libera la energía de forma pasiva (Figura 5A). Los lípidos, en concreto los triglicéridos, son las
moléculas biológicas a partir de las cuales podemos obtener más energía, ya que presentan
una capacidad calórica de aproximadamente 9 kcal/g, el doble que otros sustratos energéticos
como la glucosa y las proteínas. El adipocito blanco sintetiza triglicéridos, a partir de ácidos
grasos libres durante la alimentación, y los degrada durante el ayuno liberando a la circulación
ácidos grasos y glicerol. Estos dos procesos se denominan lipogénesis y lipólisis,
respectivamente. Estas funciones contrapuestas del adipocito están reguladas principalmente
por la insulina. Por el contrario, la principal función fisiológica del adipocito marrón es la
generación de calor para el mantenimiento de la temperatura corporal. Aunque la lipogénesis
y la lipólisis también ocurren en el adipocito marrón, ambas están más implicadas en la
regulación de su capacidad termogénica. Además de estas funciones, en la actualidad se le
otorga al adipocito, tanto blanco como marrón, un papel más activo gracias a su capacidad
secretora de proteínas, antes desconocida (Figura 5B).
Introducción
21
ALIMENTACIÓN AYUNO
Ácidos grasos
Glicerol
Ácidos grasos
Glucosa
Lipogénesis Lipólisis(A)TG
TG
TG
Ácidos grasos
Glucosa
Metabolismo lípidosÁcidos grasos y glicerolLipoproteína lipasaAcylation stimulating protein (ASP)Prostaglandinas, glucocorticoidesAutotaxina (ácido lisofosfatídico)Retinol binding protein 4 (RBP4)
Metabolismo yhomeostasis energíaLeptina, VisfatinaAdiponectinaTNF-α, IL6Resistina
Angiogénesis y vasculaturaAdiponectinaVEGFLeptinaAngiotensinógeno/Angiotensina IIPAI-1FIAF
Matriz extracelularColágeno IVPAI-1Metaloproteinasas (MMP-2, MMP-9)Inhibidores de metaloproteinasas (TIMP-1, TIMP-2)Metalotioneina-1
Citoquinas y proteínas fase agudaTNF-αInterleuquinas proinflamatorias (IL6,IL1β,IL8,IL18,IL17D)Interleuquinas antiinflamatorias (IL10,IL1Ra)Factores complemento: C3, B, D (adipsina)Quimioquinas (MCP1, MIF, CSF1)PAI-1, Lipocalina 24p3SAA3, haptoglobulina, CRP
Factores de crecimientoTumor growth factor (TGF-β)Nerve growth factor (NGF)
(B)TG
TG
TG
Figura 5. Evolución de la funcionalidad del adipocito. A) Esquema que representa la visión clásica del adipocito como depósito inerte para el almacenamiento de lípidos. B) Visión actual del adipocito como célula secretora de múltiples moléculas implicadas en diferentes procesos, además del almacen y liberación de sustratos energéticos. CRP: C-reactive protein; CSF1: Colony stimulating factor-1; FIAF: Fasting-induced adipocyte factor; MCP-1: Monocyte chemoattractant protein-1; MIF: macrophage migration inhibitory factor; PAI-1: Plasminogen activator inhibitor-1; SAA3: Serum amyloid A 3; VEGF: Vascular endothelial growth factor.
Introducción
22
2.6.1. Función lipogénica del adipocito.
Los triglicéridos son sintetizados a partir de la esterificación de tres cadenas de
ácidos grasos libres (FFAs) con una molécula de glicerol-3-fosfato (glicerol-3-P),
principalmente en hígado y adipocito. Este proceso de síntesis es conocido como lipogénesis.
La principal fuente de ácidos grasos para los adipocitos son los lípidos circulantes, ya sean
procedentes de la dieta o los sintetizados en el hígado. Debido a su gran tamaño, los lípidos
circulantes no pueden ser captados como tales, así que han de ser hidrolizados a ácidos
grasos y glicerol por la lipoproteína lipasa, previa a su captación. Los adipocitos son capaces
de captar ácidos grasos mediante un transporte activo a través de proteínas transportadoras
específicas. Una vez en el interior de los adipocitos, los FFAs son esterificados para formar los
triglicéridos, los cuales se acumularán. Los ácidos grasos también pueden ser sintetizados de
novo a partir de precursores, como la glucosa, por un proceso denominado síntesis o
lipogénesis de novo. Aunque el hígado es el principal tejido donde se produce la lipogénesis
de novo, el adipocito también puede sintetizar ácidos grasos de novo. Independientemente del
origen de los ácidos grasos, para que puedan ser esterificados necesitan glicerol-3-P como
“esqueleto” de los triglicéridos. El glicerol-3-P puede ser sintetizado por las células a partir de
la fosforilación del glicerol, tanto del procedente de la lipólisis como el glicerol exógeno,
reacción catalizada por la enzima glicerol quinasa, o ser sintetizado de novo. Al menos en
condiciones normales, el adipocito blanco no puede utilizar el glicerol como sustrato para la
esterificación de ácidos grasos, por su bajísima actividad glicerol quinasa, aunque el tejido
adiposo marrón sí podría hacerlo (Hanson and Reshef, 2003). Ante la necesidad de sintetizar
glicerol-3-P para la síntesis de triglicéridos, se considera que el tejido adiposo tiene dos formas
de obtenerlo: a través de precursores como el piruvato y el lactato gracias a la
gliceroneogénesis, o a través de la glucosa (Figura 6).
Introducción
23
Ayuno, aporte glucosa reducido(hipoinsulinemia,hipoglucemia)
(A)
Alimentación(hiperinsulinemia, hiperglicemia)
(B)
Dihidroxiacetonafosfato
Glicerol-3-P
Fosfoenolpiruvato
Oxalacetato
Piruvato/Lactato
PEPCK
Glucosa-6-P
Gliceraldehido-3-P
Glucosa
HKII
Dihidroxiacetonafosfato
Fosfoenolpiruvato
Oxalacetato
Piruvato/Lactato
PEPCK
Glucosa-6-P
Gliceraldehido-3-P
Glucosa
HKII
Glicerol-3-P
Figura 6. Producción de glicerol-3-P por el adipocito. Se considera la existencia de dos vías de síntesis de glicerol-3-P en el tejido adiposo: (A) Durante los periodos de ayuno a partir de precursores gluconeogénicos, como el piruvato y lactato a través de la gliceroneogénesis. (B) Durante el periodo postpandrial a partir de la glucosa.
2.6.1.1. Producción de glicerol-3-fosfato.
Se considera la glucosa como la principal fuente de glicerol-3-P para el adipocito a
través de uno de sus intermediarios durante la glucólisis, la dihidroxiacetona fosfato (DHAP)
(Figura 6B). La mayor captación de glucosa por parte del adipocito se produce a través del
transportador de glucosa estimulado por la insulina (GLUT4). La glucosa captada se
metaboliza a través de las reacciones glucolíticas, siendo la primera de ellas su fosforilación
por una familia de enzimas, las hexoquinasas. La insulina también induce la expresión de la
hexoquinasa 2 (HKII), regulando tanto la captación como la fosforilación de glucosa por el
adipocito. Durante la glucólisis, a partir de la escisión de una hexosa, se produce la formación
de dos triosas, el gliceraldehido fosfato y la DHAP. Ambas triosas pueden isomerizarse la una
Introducción
24
en el otra, a través de la enzima triosafosfato isomerasa. La DHAP producida a partir de la
glucosa es isomerizada a gliceraldehido-P, ya que únicamente éste continuará a lo largo de las
restantes reacciones glucolíticas. No obstante, la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
(GPD) puede reducir la DHAP a glicerol-3-P, desviando parte de la DHAP producida hacia la
síntesis de triglicéridos.
Aunque ésta podría ser la principal forma de producir glicerol-3-P en tejido adiposo,
queda limitada a situaciones de excedencia energética (Figura 6B). Sin embargo, en periodos
de ayuno o aporte reducido de glucosa, el tejido adiposo blanco puede obtener glicerol-3-P a
partir del piruvato o del lactato, para sintetizar triglicéridos de una forma independiente de la
insulina y de la glucosa (Figura 6A). Esta vía metabólica, denominada gliceroneogénesis,
involucra a enzimas generalmente asociadas a la gluconeogénesis hepática, como la piruvato
carboxilasa (PC), la alanina y aspartato aminotransferasas y, sobretodo, la forma citosólica de
la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK-C). Aunque originalmente fue descrita en tejido
adiposo blanco, la gliceroneogénesis también se produce en hígado (Botion et al., 1995), en
tejido adiposo marrón (Brito et al., 1999) e incluso podría producirse en músculo e intestino
delgado (Hanson and Reshef, 2003). A pesar de su importancia en la síntesis de triglicéridos,
no está clara la implicación de la producción de glicerol-3-P en el desarrollo de la obesidad.
2.6.1.2. Reesterificación de ácidos grasos: papel de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa.
Una parte de los ácidos grasos procedentes de la lipólisis en el tejido adiposo es
reesterificada nuevamente por el mismo gracias a la gliceroneogénesis. Actualmente, se
considera que la reesterificación de FFAs en WAT funciona como un sistema que limita la
liberación de FFAs, evitando su salida masiva hacia la circulación, especialmente cuando la
lipólisis está estimulada. De esta forma, puede mantenerse constante el porcentaje de FFAs
liberados, independientemente que la lipólisis está estimulada o no (Forest et al., 2003;Reshef
et al., 2003). Tanto la gluconeogénesis hepática como la gliceroneogénesis en tejido adiposo e
Introducción
25
hígado están reguladas por la PEPCK. La PEPCK es una enzima que interviene en la segunda
etapa de la reacción que convierte el piruvato en fosfoenolpiruvato (P-enolpiruvato),
fundamental para la gluconeogénesis y la gliceroneogénesis:
Piruvato carboxilasa (PC) PEPCK
Piruvato --------------------------> Oxalacetato -------------------> P-enolpiruvato + CO2 + GDP
+ GTP
Tras la carboxilación del piruvato a oxalacetato gracias a la PC y la posterior
descarboxilación oxidativa del oxalacetato a P-enolpiruvato, a través de la PEPCK, el P-
enolpiruvato es convertido en DHAP, y finalmente en glicerol-3-P (Hanson and Reshef, 2003).
Se han descrito dos isoformas de la PEPCK en mamíferos: la PEPCK-C, localizada a nivel
citosólico (Nordlie and Lardy, 1963) y la PEPCK-M, a nivel mitocondrial (Utter and Kurahashi,
1954). Aunque ambas se describieron primero en hígado, también se han descrito en tejido
adiposo (Ballard et al., 1967). La síntesis de ambas isoformas es independiente al estar
codificadas por dos genes independientes, Pck1 y Pck2 (citosólica y mitocondrial,
respectivamente). Aunque catalizan la misma reacción y presentan cinéticas muy similares, la
regulación de su actividad es distinta. PEPCK-M tiene una actividad constitutiva (Ballard et al.,
1967;Garber et al., 1972) mientras que la isoforma citosólica tiene una actividad modulada
por hormonas (Ballard et al., 1967).
Como la PEPCK-C es la principal enzima reguladora de la gliceroneogénesis y de la
gluconeogénesis, la determinación de la actividad PEPCK-C refleja el estado de ambas vías. Se
han realizado multitud de estudios sobre la regulación de la actividad PEPCK-C, especialmente
la hepática. Aún no se conoce ningún tipo de regulación post-traduccional, con lo que cambios
en su actividad reflejan directamente cambios en la expresión de su mRNA, ya sea en su
síntesis y/o en su degradación (Forest et al., 1997). El gen de la PEPCK-C de rata presenta un
tamaño aproximado de 7 kb y está formado por 9 intrones y 10 exones con un único promotor
(Yoo-Warren et al., 1983). Este gen codifica un mRNA de 2624 nucleótidos que se traduce en
una proteína de 621 aminoácidos, aproximadamente de 69 kDa de peso molecular. La
Introducción
26
expresión del gen Pck1 se produce principalmente en hígado, riñón y tejido adiposo, y en
menor proporción, en epitelio intestinal, glándula mamaria, pulmón, cerebro, colon, corazón y
músculo esquelético (Hanson and Garber, 1972). El gen Pck1 es único para todos los tejidos y
presenta un único inicio de transcripción, por lo que la expresión específica de tejido involucra
factores de transcripción específicos del tipo celular (Beale and Tishler, 1992).
La síntesis y actividad de PEPCK-C en tejido adiposo varía en estados de ayuno o de
realimentación, sugiriendo un papel importante durante estas situaciones fisiológicas. Durante
el ayuno y tras una inyección de noradrenalina, ambas están incrementadas (Hopgood et al.,
1973;Meyuhas et al., 1976;Reshef et al., 1970). Durante la realimentación, caracterizada por
una hiperinsulinemia, se produce una disminución de los niveles intracelulares de cAMP, y la
síntesis y actividad de PEPCK disminuyen (Beale and Tishler, 1992;Hopgood et al.,
1973;Meyuhas et al., 1976;Reshef et al., 1970). Los glucocorticoides producen una inhibición
de la expresión de PEPCK en tejido adiposo, situación contraria a la observada en hígado
(Franckhauser et al., 1995;Granner et al., 1983;Nechushtan et al., 1987;Reshef et al., 1970).
En adipocitos, la PEPCK-C también está regulada positivamente por ácidos grasos libres, en
especial ácidos grasos de cadena larga monoinsaturados y poliinsaturados (Antras-Ferry et al.,
1994;Forest et al., 1997). Éstos actúan sobre el promotor de la PEPCK-C a través del factor de
transcripción PPARγ, al igual que las tiazolidinedionas (Cadoudal et al., 2005;Duplus et al.,
2003).
Introducción
27
2.6.2. Función lipolítica del adipocito.
Dada la necesidad de energía para el resto de tejidos del organismo, durante el
ayuno se produce la degradación de los triglicéridos almacenados en el adipocito mediante la
lipólisis. La lipólisis consiste en la hidrólisis de la molécula de triglicérido hasta sus dos
componentes, el glicerol y los ácidos grasos libres. La reacción limitante de la lipólisis está
controlada principalmente por las enzimas triacilglicerol lipasas. La lipasa sensible a hormonas
(HSL) es la principal responsable de la regulación de la lipólisis estimulada/inhibida por
hormonas, aunque no la única (Raben and Baldassare, 2005). La HSL cataliza la hidrólisis de
los triglicéridos hasta monoglicéridos, molécula formada por una cadena de ácido graso junto
con el “esqueleto” del glicerol. Finalmente, los monoacilgliceroles o monoglicéridos son
hidrolizados por la monoacilglicerol lipasa, liberando así todos los ácidos grasos del glicerol.
Tras la lipólisis, tanto el glicerol como los FFAs difunden hasta la circulación sanguínea,
abasteciendo de sustratos energéticos al resto de tejidos. Los FFAs circulantes son captados
por el hígado y especialmente el músculo esquelético, y posteriormente oxidados hasta CO2
para obtener energía. Durante el ayuno, un 40% de los FFAs captados por el hígado es
convertido en CO2, y en cuerpos cetónicos que son liberados a la circulación como otra fuente
energética para tejidos periféricos. Sin embargo, el 60% restante es reesterificado a
triglicéridos a través de la gliceroneogénesis hepática y la fosforilación del glicerol captado por
la glicerol quinasa hepática. Estos triglicéridos producidos en hígado son empaquetados en
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y liberados nuevamente a la circulación sanguínea
para su transporte hacia el tejido adiposo y el músculo (Figura 7). De esta forma, el tejido
adiposo vuelve a almacenar el posible excedente de FFAs liberados durante el ayuno que no
hayan sido captados y oxidados por los tejidos periféricos (Beale et al., 2004).
Introducción
28
Figura 7. Ciclo de los ácidos grasos libres/triglicéridos entre el tejido adiposo blanco y el hígado durante el ayuno. FFA: Ácidos grasos libres; Glic-3-P: Glicerol-3-fosfato; TG: triglicéridos. Fuente: modificado de Reshef L et al., J Biol Chem 2003 (Reshef et al., 2003).
2.6.3. Función termogénica del adipocito marrón.
El mantenimiento de la temperatura corporal es vital para la supervivencia de las
especies mamíferas. Los más sensibles a la pérdida de calor son los mamíferos de menor
tamaño, como los roedores y las crías mamíferos más grandes. La presencia del tejido adiposo
marrón es crítica en estos casos, e irá desapareciendo a lo largo de la vida adulta en las
especies de mayor tamaño. El músculo esquelético y el tejido adiposo marrón son los
principales órganos responsables de la producción de calor o termogénesis. A nivel muscular
existe un tipo de termogénesis inducida por el frío, la termogénesis dependiente de los
escalofríos (shivering thermogenesis). Sin embargo, el tejido adiposo marrón es el principal
responsable de la termogénesis adaptativa o termogénesis independiente de los escalofríos
(non-shivering thermogenesis). Esta capacidad termogénica única del tejido adiposo marrón
está determinada por la presencia de la proteína desacopladora 1 (UCP1) (Cannon and
Nedergaard, 2004;Rosen and Spiegelman, 2000;Sell et al., 2004;Valverde et al., 2005).
Introducción
29
La cadena respiratoria está formada por un conjunto de proteínas localizadas en la
membrana mitocondrial interna (Figura 8). Estos complejos proteicos son los encargados de
aceptar los electrones generados durante la degradación de los sustratos energéticos,
transportados por el NADH y FADH2, hasta su aceptor final, el O2 (fosforilación oxidativa). A lo
largo de la cadena respiratoria, el transporte de electrones es acoplado al bombeo de
protones (H+) desde la matriz mitocondrial al espacio intermembranal, creando así un
gradiente electroquímico de H+. Este gradiente es utilizado por la enzima ATP sintasa para
formar ATP a partir de ADP y fósforo inorgánico. UCP1 se localiza en la membrana
mitocondrial interna de las mitocondrias de los adipocitos marrones. Su función es la de
disipar el gradiente electroquímico de H+, al transportar protones desde el espacio
intermembranal a la matriz mitocondrial para generar calor, desacoplándolo de la síntesis de
ATP (Figura 8).
calorATP∆µH+
I III IV
II
F0
F1
UCP1
H+ H+ H+
ATPsintasa
ADP
ATP
Acil-CoA
cadena respiratoria
β-oxidación
NADH FADH2
e-
mat
riz
mem
bra
na
mit
oco
nd
rial
inte
rna
Figura 8. UCP1 y la cadena respiratoria. La proteína UCP1 se localiza en la membrana mitocondrial interna donde desacopla la oxidación de sustratos de la síntesis de ATP. En este caso, el sustrato energético es la β-oxidación de ácidos grasos. Fuente: modificado de Sell H et al., Int J Biochem Cell Biol 36, pp2098-2104 (2004) (Sell et al., 2004).
Introducción
30
2.6.3.1. Regulación de la termogénesis en tejido adiposo marrón.
La presencia de UCP1 provoca la disminución de la eficiencia energética de la cadena
respiratoria, determinada como la síntesis ATP a partir de sustratos energéticos. Por ello, el
tejido adiposo marrón se activa in vivo bajo circunstancias particulares, como la exposición al
frío, la ingestión de dietas con alto contenido lipídico y durante el periodo perinatal (Valverde
et al., 2005). La expresión de UCP1 está regulada a nivel transcripcional por PPARγ y su
coactivador PGC-1α (Puigserver et al., 1998), aunque PPARδ también promueve su expresión.
La termogénesis y la expresión de UCP1 en tejido adiposo marrón está mediada por el
Sistema nervioso simpático mediante la liberación de noradrenalina (NA) (Sell et al., 2004). La
NA regula la proliferación y la diferenciación de los preadipocitos a adipocitos marrones a
través de los receptores β-adrenérgicos que expresan, β1 y β3 (Cannon and Nedergaard,
2004). Además, la estimulación de los receptores β3-adrenérgicos por la NA activa la lipólisis.
El incremento de FFAs no sólo incrementa la termogénesis por mayor disponibilidad de
sustrato, sino que también actúa incrementando la actividad UCP1 (Sell et al., 2004). La
activación crónica de los receptores β3-adrenérgicos puede incluso inducir la aparición de
adipocitos marrones en depósitos de tejido adiposo blanco (Cinti, 2005;Rosen and
Spiegelman, 2000). La sobrealimentación con dietas altas en lípidos también lleva a la
activación del tejido adiposo marrón, como un mecanismo compensatorio al incremento de la
ingesta energética denominado termogénesis inducida por la dieta (Cannon and Nedergaard,
2004;Portillo et al., 1998;Rippe et al., 2000;Rothwell and Stock, 1979). A diferencia del
adipocito blanco, el marrón acumula lípidos como almacén de ácidos grasos, principal sustrato
para su capacidad termogénica (Rousset et al., 2004). Gracias a UCP1, el tejido adiposo
marrón es capaz de oxidar sustratos rápidamente para producir calor sin incrementar la
síntesis de ATP y no almacenarlos. Por ello, el tejido adiposo marrón tiene una importantísima
implicación en el metabolismo lipídico, regulando la cantidad de lípidos corporales al poder
“quemarlos” y no acumulándolos.
Introducción
31
2.6.4. Función secretora del adipocito blanco y marrón.
En tan sólo una década, el adipocito se ha convertido en uno de los tipos celulares
que secreta más proteínas. Estas proteínas actúan como hormonas con acciones autocrinas,
paracrinas o endocrinas y son conocidas con el nombre genérico de adipoquinas o
adipocitoquinas. Las adipoquinas son capaces de regular la secreción y la acción de la insulina,
el metabolismo de la glucosa y de los lípidos en otros tejidos, el balance energético corporal e
incluso el sistema inmunitario y la función reproductiva (Mora and Pessin, 2002). El tejido
adiposo blanco se considera un gran órgano secretor, por la variedad de adipoquinas que
secreta, por su contribución a la masa corporal y por su amplia distribución. Sin embargo, el
tejido adiposo marrón se encuentra distribuido de forma restringida y representa un pequeño
tamaño corporal. Por este motivo, se cree que la capacidad secretora del adipocito marrón es
menos importante que la del blanco (Cannon and Nedergaard, 2004). Se ha descrito un
amplio listado de proteínas expresadas y secretadas por el tejido adiposo. En algunos casos
no se ha demostrado su expresión y secreción por el adipocito, aunque sí en macrófagos y
células de soporte presentes en el tejido adiposo. Los niveles circulantes de algunas de ellas
se encuentran alterados en la obesidad y resistencia a la insulina, indicando un posible papel
en el desarrollo o prevención de la diabetes de tipo 2 y otras complicaciones asociadas a la
obesidad.
2.6.4.1. Leptina.
La leptina fue la primera adipoquina descrita (Zhang et al., 1994) y descubrió al
adipocito como una célula secretora capaz de modular el metabolismo corporal. Mutaciones en
el gen de la leptina, gen ob, o en su receptor, gen OB-R o db, desencadenan la aparición de
obesidad mórbida y diabetes en ratones jóvenes, junto con una disminución del gasto
energético, hiperfagia e infertilidad (Ingalls et al., 1950). La leptina es una proteína secretable
producida específicamente por los adipocitos blancos, aunque se han detectado bajos niveles
Introducción
32
de expresión en músculo esquelético, placenta, cerebro, epitelio gástrico y mamario (Ahima
and Flier, 2000), incluso en tejido adiposo marrón (Cinti, 2002). De hecho, un incremento en
la expresión de leptina por el adipocito marrón es considerado un signo de inactividad y de
transdiferenciación hacia el blanco (Cinti, 2005). Los niveles circulantes de leptina se
correlacionan directamente con la masa de tejido adiposo (Maffei et al., 1995). Aunque todos
los depósitos de grasa la expresan, existen diferencias en los niveles de expresión según su
localización, estado del desarrollo y especie (Trayhurn et al., 1995;Trayhurn and Beattie,
2001). Se puede diferenciar dos principales lugares de acción de la leptina: el Sistema
nervioso central (SNC), principal tejido diana, y los tejidos periféricos. A nivel del SNC, la
leptina inhibe las neuronas productoras del neuropéptido Y (NPY) y el péptido relacionado con
el gen agouti (ARGP), ambos neuropéptidos orexigénicos. Además, la leptina estimula las
neuronas productoras de proopiomelanocortina (POMC) y el péptido inducible por cocaína
(CART), neuropéptidos anorexigénicos (Miner, 2004;Stephens et al., 1995). Por tanto, la
leptina ejerce un papel regulador negativo de la ingesta de alimentos. A través del
hipotálamo, la leptina también es capaz de estimular al sistema nervioso simpático (SNS),
induciendo cambios en el gasto energético y el depósito de grasa en los tejidos, de forma
independiente a la expresión de su receptor (Collins et al., 1996;Haynes et al., 1997).
También se han descrito efectos directos de la leptina sobre tejidos periféricos como la célula
β pancreática, hígado, músculo e incluso el propio adipocito (Fasshauer and Paschke, 2003).
Los efectos de la leptina en estos tejidos periféricos son debidos a la activación de la proteína
quinasa activada por el AMP (AMPK) (Lafontan, 2005;Minokoshi et al., 2002). La lipotoxicidad
se define como los efectos adversos causados por el depósito de grasa ectópico, es decir, en
aquellos tejidos no adiposos, como hígado, músculo esquelético y cardíaco e islotes
pancreáticos (Lee et al., 1994). La leptina disminuye los niveles de SREBP-1c (Shimomura et
al., 1999) e incrementa los niveles de PGC-1α (Kakuma et al., 2000) y de PPARα (Lee et al.,
2002). De este modo, la leptina incrementa la oxidación de ácidos grasos y disminuye la
lipogénesis en tejidos periféricos para prevenir el efecto lipotóxico del acúmulo de grasa
Introducción
33
intracelular (Unger, 2003). Otro aspecto importante referente a la acción de la leptina es la
posibilidad de que aparezca una resistencia a la leptina, tanto a nivel central como periférico
(Unger, 2003).
2.6.4.2. Adiponectina.
La adiponectina (o Acrp30, ApM1, AdipoQ, GBP28) es otra de las adipoquinas más
importantes que secreta el adipocito (Scherer et al., 1995). Se trata de una proteína de 30
kDa que presenta homología con el factor del complemento C1q y se expresa específicamente
tanto en el tejido adiposo murino como humano (Scherer et al., 1995). Además de expresarse
en grandes cantidades en el tejido adiposo, se encuentra en gran cantidad en el suero
representando hasta el 0.05% de las proteínas séricas. La administración de adiponectina
reduce los niveles séricos de glucosa, FFAs y triglicéridos (Fruebis et al., 2001;Yamauchi et al.,
2001). Los principales tejidos diana para la adiponectina son el músculo esquelético y el
hígado. La adiponectina incrementa la captación de glucosa y la oxidación de los FFAs a través
de la activación de la AMPK en músculo esquelético (Tomas et al., 2002;Yamauchi et al.,
2002). A nivel hepático, la adiponectina incrementa la sensibilidad a la insulina, disminuyendo
la síntesis de glucógeno. A diferencia de otras adipoquinas, los niveles de adiponectina
circulante están disminuidos en la obesidad humana y murina (Arita et al., 1999;Hu et al.,
1996). Además, la pérdida de peso en personas obesas incrementa la sensibilidad a la
insulina, tras la recuperación de los niveles circulantes de adiponectina (Bruun et al.,
2003;Lihn et al., 2004). Por tanto, la adiponectina es una adipoquina que incrementa la
sensibilidad a la insulina a través de sus efectos sobre los tejidos periféricos.
2.6.4.3. Factor-α de necrosis tumoral.
El adipocito produce factor-α de necrosis tumoral (TNF-α), citoquina expresada y
secretada especialmente por células del sistema inmunitario. Se ha descrito un incremento en
su expresión y secreción por el tejido adiposo, y el músculo esquelético, en modelos murinos
Introducción
34
de obesidad (Hotamisligil et al., 1993;Moller, 2000;Sethi and Hotamisligil, 1999) y su
reducción mejora la sensibilidad a la insulina (Hotamisligil et al., 1993;Uysal et al., 1997). En
humanos, también se ha correlacionado un incremento en sus niveles séricos con la obesidad,
la hiperinsulinemia y la disminución de la sensibilidad a la insulina (Kern et al., 1995;Kern et
al., 2001). Sin embargo, la expresión de TNF-α en el tejido adiposo de humanos es baja,
siendo los macrófagos sus principales productores. Por este motivo, al menos en roedores,
TNF-α es un importante regulador de la sensibilidad a la insulina, siendo no tan claro en
humanos (Sethi and Hotamisligil, 1999). La estimulación de sus receptores afecta a la cascada
de señalización de la insulina, reduciendo la sensibilidad a la hormona (Liu et al., 1998).
Además, TNF-α tiene efectos autocrinos/paracrinos sobre el adipocito, modulando su
metabolismo, su secreción de adipoquinas y su diferenciación (Xu et al., 2002a;Xu et al.,
2002b). TNF-α activa la lipólisis e inhibe la enzima lipoproteína lipasa (LPL), la expresión de
transportadores de ácidos grasos y la lipogénesis (Sethi and Hotamisligil, 1999). Por tanto,
TNF-α modula la señalización de la insulina e incrementa los lípidos circulantes, contribuyendo
a la hiperlipidemia asociada a la obesidad y a la resistencia a la insulina.
2.6.4.4. Interleuquina-6.
Aproximadamente el 30% de la interleuquina-6 (IL-6) circulante es producida por el
tejido adiposo blanco (Mohamed-Ali et al., 1997). IL-6 es una citoquina proinflamatoria cuyos
niveles plasmáticos se encuentran incrementados en la resistencia a la insulina y la obesidad,
tanto en modelos murinos como en humanos (Vozarova et al., 2001). Es más, sus niveles
basales se utilizan para predecir el riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2 (Pickup et al.,
1997;Pradhan et al., 2001). A nivel hepático, la administración de IL-6 induce la
gluconeogénesis (Tsigos et al., 1997) y la secreción de triglicéridos (Nonogaki et al.,
1995;Tsigos et al., 1997), e inhibe la síntesis de glucógeno inducida por la insulina (Rotter et
al., 2003;Senn et al., 2002). Además, IL-6 es capaz de inhibir directamente la señalización de
la insulina en adipocitos y hepatocitos (Rotter et al., 2003;Senn et al., 2002).
Introducción
35
3. HOMEOSTASIS DE LA GLUCOSA.
La glucosa es la principal fuente de energía para las células, siendo su concentración
sanguínea esencial para la supervivencia de los organismos superiores. La regulación de la
normoglucemia es fundamental, ya que tanto la aparición de periodos de hipoglucemia como
de hiperglucemia severa afectan seriamente a la supervivencia. En esta regulación
principalmente están implicadas la insulina y el glucagón, dos hormonas secretadas por el
páncreas (DeFronzo, 1997;Unger, 1991). Ambas hormonas son claves en el control de la
utilización y la producción de glucosa por los tejidos. Durante el ayuno, la captación de
glucosa se produce principalmente en los tejidos no dependientes de insulina, especialmente
el cerebro. La falta de insulina y el aumento del glucagón, junto con otros factores hormonales
y nerviosos, mantienen la normoglucemia durante el ayuno a través de un incremento en la
producción de glucosa, principalmente hepática. Este incremento en la producción hepática de
glucosa se produce mediante la estimulación de la gluconeogénesis y la glucogenolisis,
asegurando la captación basal de glucosa por el cerebro (Bajaj and DeFronzo, 2003). Sin
embargo, durante el periodo postprandial, la homeostasis de la glucosa depende básicamente
de tres procesos que ocurren simultáneamente. Tras la ingesta, se produce una hiperglucemia
transitoria que estimula la producción y secreción de insulina por las células β pancreáticas. El
incremento en los niveles circulantes de insulina, junto con la hiperglucemia transitoria, induce
la captación de glucosa por el hígado y, especialmente, por los tejidos periféricos, músculo
esquelético y tejido adiposo. El 80-85% de la captación de glucosa estimulada por la insulina
se produce en el músculo, mientras que el tejido adiposo puede ser responsable de hasta el
15%. Por último, la inhibición de la secreción de glucagón por las células α pancreáticas,
inducida por la insulina, suprime la producción hepática de glucosa. Pero además, la insulina
tiene importantes acciones a nivel del SNC y el tejido adiposo. El SNC procesa toda la
información que recibe de los tejidos periféricos sobre el estado nutricional del organismo, a
través de la insulina y otras hormonas como la leptina, e incluso a través de nutrientes. De
Introducción
36
este modo, el SNC controla el balance energético regulando la ingesta de alimentos, el gasto
energético de los tejidos periféricos e incluso la producción hepática de glucosa (Schwartz and
Porte, Jr., 2005). La insulina no sólo estimula la captación de glucosa por el tejido adiposo
sino que también tiene un potente efecto antilipolítico y lipogénico (Bajaj and DeFronzo,
2003).
La utilización de la glucosa como fuente de energía para las células requiere
primeramente su transporte hacia el interior. Una vez allí, las hexoquinasas la fosforilan a
glucosa-6-fosfato. La fosforilación de la glucosa permite su utilización a través de las distintas
vías metabólicas, como la glucólisis y la vía de las pentosas, o incluso su almacenamiento en
forma de glucógeno o lípidos.
3.1. LOS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA.
El transporte de glucosa a través de la membrana plasmática está mediado por dos
grandes familias de proteínas de membrana: la familia de los cotransportadores de glucosa
dependientes de sodio (SGLTs) y la familia de los transportadores de azúcares independientes
de sodio (SLC2A o GLUTs) (Joost and Thorens, 2001;Wright, 2001). Los SGLTs transportan
glucosa y galactosa mediante transporte activo, acoplando la entrada de sodio a la entrada
contragradiente de glucosa, en la luz del intestino delgado y túbulos proximales renales. Sin
embargo, los GLUTs se expresan en todas las células y transportan azúcares, principalmente
glucosa, a través de la membrana plasmática mediante transporte facilitado a favor de
gradiente. Esta familia engloba varios miembros, GLUT1-GLUT12 y el transportador de
mioinositol acoplado al transporte de protones (HMIT), clasificados en tres clases según la
similitud de secuencias y sus características (Joost and Thorens, 2001). Mientras que las
clases II y III no han sido tan estudiadas, la clase I (GLUT1-4) es la más conocida y
caracterizada. La distribución y función de los transportadores de glucosa de clase I se
resumen en la siguiente tabla (Tabla 1).
Introducción
37
GLUT1
Isoforma Distribución tisular Función
Eritrocitos, cerebro, riñón, placenta, colon
(ubicua)Captación basal de glucosa
GLUT3 Captación de glucosa (alta afinidad)Cerebro
GLUT4 Captación de glucosa estimulada por insulina
Corazón, músculo, WAT, BAT, cerebro
GLUT2Hígado Entrada y salida de glucosa
intestino, riñón Transporte glucosa absorbida a la sangre
“Sensor de la glucosa”páncreas (células β)
Tabla 1. Transportadores de glucosa de clase I. Distribución y función de los distintos miembros de la clase I de la familia de los transportadores de glucosa GLUTs.
3.2. LAS HEXOQUINASAS.
En la mayoría de las vías de metabolización de la glucosa, siendo la vía clásica de la
glucólisis la de mayor importancia, la primera reacción consiste en la fosforilación de la
glucosa, dependiente de ATP, a glucosa-6-fosfato. Esta reacción está catalizada por una
familia de enzimas, las hexoquinasas (HK):
R-CH2OH + MgATP2- R-CH2-O-PO32- + MgADP- + H+
En los tejidos de mamíferos podemos encontrar cuatro hexoquinasas diferentes,
codificadas por cuatro genes independientes, denominadas hexoquinasas de tipo I-IV o
hexoquinasas A-D, respectivamente (Gonzalez et al., 1964;Katzen and Schimke, 1965). Una
característica común a las cuatro isoenzimas es su capacidad para utilizar los mismos
sustratos, ya sea glucosa, manosa, fructosa o 2-deoxiglucosa, aunque la glucosa sea su
Introducción
38
principal sustrato fisiológico. Las cuatro isoenzimas pueden ser divididas en dos grupos, tanto
por sus características cinéticas como por su tamaño: las hexoquinasas con alta afinidad por la
glucosa (HKI, HKII y HKIII) y la hexoquinasa de baja afinidad por la glucosa (glucoquinasa).
Las hexoquinasas de alta afinidad presentan un tamaño molecular similar entre ellas, de
aproximadamente 100 kDa, muy distinto del de la glucoquinasa, cuyo tamaño es
aproximadamente la mitad (50kDa).
3.2.1. Las hexoquinasas I-III.
Las hexoquinasas HKI-III presentan una Km para la glucosa muy baja, 0.04 mM, 0.13
mM y 0.02 mM, respectivamente. Además, estas tres hexoquinasas son susceptibles de ser
inhibidas por el producto final de la reacción que catalizan, la glucosa-6-fosfato (G6P). La
hexoquinasa I (HKI) o isoenzima del cerebro se expresa en todos los tejidos, aunque
principalmente en cerebro y su expresión no parece estar afectada ni hormonalmente ni por
otros cambios fisiológicos. La hexoquinasa II (HKII), o isoforma inducible por la insulina, se
expresa principalmente en aquellos tejidos que responden a la insulina, como el músculo
esquelético y el tejido adiposo, aunque también en hígado y glándula mamaria (Sebastian et
al., 2001). La expresión de HKII se encuentra regulada por hormonas, como la insulina, y
otros cambios en el estado fisiológico como son la hipoxia y el ejercicio (Cusi et al., 2001;Vogt
et al., 2000). Por último, la hexoquinasa III (HKIII) se expresa mayoritariamente en células
blancas sanguíneas, detectándose también en bazo, pulmones y páncreas.
Introducción
39
3.2.2. La hexoquinasa IV o glucoquinasa.
Las características cinéticas de la glucoquinasa (GK) distan del resto de hexoquinasas
de mamíferos. La glucoquinasa muestra una baja afinidad por la glucosa al presentar una Km
mucho mayor que la del resto de HK, alrededor de 8 mM en humanos y entre 3-9 mM en
diferentes mamíferos. Además, la glucoquinasa muestra cooperatividad con la glucosa y la
manosa, pero no con la fructosa o la 2-deoxiglucosa. Otra de las características cinéticas de la
glucoquinasa es su ausencia de inhibición por su producto final, la G6P. Existe un punto de
inflexión en la reacción catalizada por la GK muy próximo a una concentración de glucosa de 4
mM. En este punto, la glucoquinasa presenta su máxima sensibilidad a cambios producidos en
la concentración del sustrato. Tanto roedores como humanos mantienen una glucemia muy
próxima a 5 mM, respondiendo rápidamente a pequeñas fluctuaciones para mantener estos
niveles constantes. La proximidad de estos niveles de glucosa a la máxima sensibilidad de la
enzima al sustrato, convierte a la glucoquinasa en el elemento clave en la homeostasis de la
glucosa.
La glucoquinasa se expresa principalmente en hepatocitos y en células de origen
neural/neuroendocrino. Entre las células de origen neural/neuroendocrino encontramos:
principalmente células β pancreáticas, células α pancreáticas, células intestinales de tipo L y K,
y ciertas neuronas del SNC, especialmente localizadas en hipotálamo. El gen de la
glucoquinasa es único, aunque contiene dos promotores diferentes que permiten una
expresión diferencial y una regulación transcripcional específica de tejido. La expresión
específica de la GK en hígado está controlada por el promotor de la región más cercana al
inicio de la transcripción, promotor “downstream”. Mientras, la expresión específica en células
neurales/neuroendocrinas sensibles a la glucosa, la célula β es la más estudiada y típica, está
controlada por el promotor “upstream” situado en una región más alejada. Además de esta
regulación específica de tejido a través de dos promotores distintos, la actividad de la enzima
Introducción
40
también sufre una regulación específica de tejido, bien sean hepatocitos o bien células β
pancreáticas.
3.2.2.1. Regulación de la glucoquinasa en hepatocitos.
El hígado ejerce un papel central en la homeostasis y el metabolismo de la glucosa,
siendo capaz de utilizarla o producirla, alternativamente. Por sus características cinéticas y por
su fuerte control de la regulación de la glucólisis, la GK facilita la utilización de la glucosa y la
síntesis de glucógeno por el hígado, en periodos de hiperglucemia o tras la ingestión de
alimento. Existe una fuerte regulación de su expresión y actividad en hepatocitos. Esta
regulación se realiza principalmente a través de dos mecanismos: una regulación
transcripcional y una regulación post-traduccional. El promotor específico para la expresión de
GK en hepatocitos contiene secuencias de unión a diversos factores de transcripción. Entre
estos transactivadores se encuentran: factores nucleares hepáticos (HNF-1, HNF-3β, HNF-4 y
HNF-6), factores estimuladores proximales (UPS), transductor de señal y activador de la
transcripción 5 (STAT5), C/EBPs y SREBP-1c. La expresión de GK ocurre en el momento en
que se produce el cambio de alimentación maternal a la adulta. SREBP-1c es el principal
responsable de la regulación transcripcional de la GK hepática según la disponibilidad de
nutrientes, a través de la regulación de la insulina y glucagón sobre este factor. La insulina
incrementa la transcripción de SREBP1c, induciendo la expresión de GK, mientras que el
glucagón, a través del cAMP, antagoniza el efecto de la insulina. A nivel post-transcripcional,
la principal regulación de la actividad GK en hígado se produce a través de su proteína
reguladora (GKRP). GKRP se expresa principalmente en hígado, aunque se detecta en
pulmones, neuronas del núcleo paraventricular (hipotálamo) y en islotes pancreáticos, donde
su importancia fisiológica no está clara. La GKRP es capaz de formar un complejo con la GK e
inactivarla. Además de ser competitiva con respecto a la glucosa, esta asociación se regula a
través de dos moléculas del metabolismo intermediario, la fructosa-1-fosfato (F1P) y la
fructosa-6-fosfato (F6P). Tanto la F1P como la F6P se unen a la GKRP en el mismo lugar, de
Introducción
41
forma competitiva. Así, la unión de la F6P a la GKRP permite su asociación con la GK,
inhibiendo por tanto la actividad GK. Sin embargo, la unión de F1P a la GKRP evita la
formación del complejo GK-GKRP, permitiendo que la GK sea activa. Es más, la GKRP también
influye en la localización celular de la GK. Mientras que la GK es una enzima citoplasmática, la
GKRP es una proteína mayoritariamente nuclear, aunque se detecta una pequeña proporción
citoplasmática. De esta forma, la GK queda retenida en el núcleo por la GKRP, evitando
además su degradación en aquellas condiciones que favorecen la formación del complejo,
como la baja concentración de glucosa y la ausencia de fructosa. Las condiciones
desfavorables para la formación del complejo GK-GKRP son la alta concentración de glucosa y
presencia de fructosa, mediada por la concentración de F1P. En estas condiciones, la GK
queda liberada de la GKRP y es exportada al citoplasma, donde realiza su actividad catalítica.
Existen otras proteínas que interaccionan con la GK pudiendo modular su actividad, como la
propionilCoA carboxilasa y la enzima 6-fosfofructo-2-quinasa/ fructosa-2,6-bifosfatasa
(PFK/FBPasa) (Argaud et al., 1995;Massa et al., 2004). Incluso los ácidos grasos de cadena
larga también son capaces de inhibir específicamente la actividad GK (Tippett and Neet,
1982). Finalmente, la GK puede ser fosforilada/desfosforilada, inhibiendo o incrementando su
actividad respectivamente (Munoz-Alonso et al., 2000).
3.2.2.2. Regulación de la glucoquinasa en célula β.
La GK forma parte del llamado “sensor de la glucosa” (glucose sensor) en aquellas
células sensibles a cambios en la concentración sanguínea de glucosa, como las células β del
páncreas. En estas células, la secreción de insulina estimulada por glucosa está
predominantemente determinada por el metabolismo del azúcar. Gracias a la GK, la célula β
puede responder al incremento en la glucemia secretando insulina para mantener los niveles
séricos de glucosa constantes. La regulación de la GK en las células β del páncreas también se
realiza a través de una regulación transcripcional y una regulación post-transcripcional. El
promotor específico para la expresión de GK en células β contiene secuencias reconocidas por
Introducción
42
factores de transcripción involucrados en la diferenciación del páncreas (Zhang et al., 2005).
También se ha descrito un lugar de unión para PPARγ. Además, la transcripción del gen está
incrementada por insulina, lactógeno fetal, biotina y ácido retinoico. A diferencia del
hepatocito, el aumento del cAMP producido por el péptido-1 similar al glucagón (GLP1)
incrementa la expresión de GK en célula β. Otra diferencia respecto a los hepatocitos es que,
a pesar de la presencia de la GKRP en islotes pancreáticos, la actividad GK no viene modulada
por ella. En este tipo celular, la GK se asocia a los gránulos de insulina de forma dinámica, y
esta asociación altera tanto su actividad como su conformación (Rizzo et al., 2002;Stubbs et
al., 2000;Toyoda et al., 1999). La unión de la GK a gránulos de insulina, a bajas
concentraciones de glucosa, la protege de su degradación y actúa como reservorio (Rizzo et
al., 2002;Stubbs et al., 2000;Toyoda et al., 1999). La GK pancreática también se asocia a la
PFK-FBPasa, donde puede tener más relevancia en su regulación post-transcripcional que en
el hígado.
III. OBJETIVOS.
Objetivos
43
La producción de glicerol-3-fosfato por el adipocito es fundamental para la
esterificación de los ácidos grasos libres y el depósito de lípidos. Esto sugiere que un aumento
en la síntesis de glicerol-3-fosfato por el adipocito podría incrementar su capacidad de
almacenar lípidos induciendo obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2. Se
considera que en condiciones fisiológicas, el adipocito obtiene glicerol-3-fosfato a partir de la
glucosa durante el periodo post-prandial, o a partir de precursores gluconeogénicos, como el
piruvato, durante el ayuno. Por tanto, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido
estudiar si alteraciones metabólicas primarias en el tejido adiposo que
incrementen la obtención del glicerol-3-fosfato pueden desencadenar obesidad y
diabetes de tipo 2.
Para ello, este objetivo general se dividió en los siguientes objetivos concretos:
1. Estudiar el efecto de un incremento de la gliceroneogénesis en tejido adiposo en el
desarrollo de la obesidad y de la resistencia a la insulina.
1.1. Generar ratones transgénicos que sobreexpresen en tejido adiposo la
principal enzima reguladora de esta vía, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, y estudiar los
cambios metabólicos asociados a dicha sobreexpresión.
1.2. Estudiar si el incremento en la reesterificación de ácidos grasos por el
tejido adiposo puede proteger de la resistencia a la insulina inducida por una dieta alta en
lípidos.
2. Estudiar el efecto de un incremento de la captación de glucosa en tejido adiposo
en la producción de glicerol-3-fosfato, la obesidad y la resistencia a la insulina.
2.1. Generar ratones transgénicos que expresen glucoquinasa en tejido
adiposo y estudiar los cambios metabólicos asociados a dicha expresión.
2.2. Estudiar si el incremento en la utilización basal de glucosa por el tejido
adiposo puede llevar a un mayor depósito de grasa y por tanto a obesidad.
IV. RESULTADOS.
PARTE I:
EFECTO DEL INCREMENTO DE LA
GLICERONEOGÉNESIS EN TEJIDO ADIPOSO EN EL
DESARROLLO DE OBESIDAD Y RESISTENCIA A LA
INSULINA
Parte I: Resultados
44
1.1. OBTENCIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBREEXPRESEN
PEPCK EN TEJIDO ADIPOSO.
A fin de estudiar si un incremento en la actividad PEPCK en el tejido adiposo llevaba
a un aumento de la gliceroneogénesis y a un incremento de la reesterificación de ácidos
grasos y del depósito de grasa, se obtuvo un ratón transgénico que expresaba el gen Pck1
(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, o PEPCK) de rata específicamente en adipocitos. Para
ello, se construyó un gen quimérico donde el gen de la PEPCK estaba bajo el control de un
promotor constitutivo y específico de adipocitos, el promotor del gen Fabp4 (adipocyte binding
protein P2, también denominado aP2). El gen aP2 codifica una proteína que pertenece a la
familia de proteínas intracelulares de unión a lípidos. Esta proteína es específica del tejido
adiposo en el que, además de ser muy abundante, se expresa de forma constitutiva (Graves
et al., 1992). Por este motivo, el promotor del gen aP2 ha sido comúnmente utilizado en la
manipulación genética del tejido adiposo, a pesar de que en los últimos años también se ha
descrito la expresión de la proteína en macrófagos (Makowski et al., 2001).
1.1.1. Construcción del gen quimérico aP2-PEPCK.
El gen quimérico aP2-PEPCK se obtuvo mediante la fusión del promotor del gen aP2
con el gen Pck1 de rata. Para ello, un fragmento ApaI-ApaI de 6 kb con la secuencia
codificante completa y la señal de poliadenilación del gen de la PEPCK de rata (Yoo-Warren et
al., 1983), que procedía del plásmido pB7.0, se introdujo en la diana SmaI del plásmido
pSKII+/prom.aP2, detrás del promotor del gen aP2 (Ross et al., 1990). El plásmido resultante
se denominó pSKII+/aP2-PCK1 (Figura 1).
Parte I: Resultados
45
prom. aP25.4 kb
Sma I
pSKII+/prom.aP2
ApaI ApaI
gen Pck1 rata6 kb
Digestión conSmaI
Ligación T4 DNA ligasa
Digestión conApaI
pPCK-B7.0
pSKII+/aP2-PCK111.4 kb
11.4 kb8.4 kb
prom. aP25.4 kb
gen Pck1 rata6 kb
Figura 1. Construcción del plásmido pSKII+/aP2-PCK1. El fragmento ApaI-ApaI de 6 kb, que contenía la secuencia codificante completa y la señal de poliadenilación del gen Pck1 de rata, que se encontraba insertado en el plásmido pB7.0, se introdujo en la diana SmaI del plásmido pSKII+/prom.aP2, detrás del promotor del gen aP2. Al plásmido resultante se denominó pSKII+/aP2-PCK1.
Parte I: Resultados
46
1.1.2. Obtención de los animales transgénicos aP2-PEPCK.
El plásmido pSKII+/aP2-PCK1 se digirió con las enzimas de restricción NotI y SalI
para obtener el fragmento NotI-SalI de 11.4 kb. Este fragmento contenía el promotor del gen
aP2 seguido de la secuencia completa del gen de la PEPCK de rata y su señal de
poliadenilación (gen quimérico aP2-PEPCK) (Figura 2). Este gen quimérico se purificó por
electroelución y se microinyectó en ovocitos fecundados de ratón B6SJLF1 por el Servei de
Biotecnologia Animal de la UAB, asociado a nuestro grupo de investigación. Posteriormente,
los embriones microinyectados se transfirieron a hembras receptoras CD-1.
promotor aP2 gen PEPCK rata
EcoRI
+1-5.4kb
EcoRI
+6kb
sondaSphI
EcoRI
SphI
EcoRI
Figura 2. Representación esquemática del gen quimérico aP2-PEPCK. El plásmido pSKII+/aP2-PCK1 fue digerido con las enzimas de restricción NotI y SalI. El fragmento de 11.4 kb resultante de esta digestión, el cual contenía el gen quimérico aP2-PEPCK en su totalidad, fue microinyectado a ovocitos fecundados de ratón.
A las tres semanas del nacimiento, el DNA genómico extraído de la cola de los
animales se digirió con la enzima de restricción EcoRI, y se analizó por Southern blot la
presencia del transgen en los ratones. Tras hibridar con una sonda específica de PEPCK
marcada radiactivamente, se detectaron cuatro animales transgénicos. A partir de estos
animales, se establecieron cuatro líneas independientes (Tg1-Tg4) de ratones transgénicos
aP2-PEPCK. Como puede observarse en la Figura 3, tras la hibridación con la sonda SphI-SphI
del gen de la PEPCK, los animales heterocigotos presentaban dos bandas específicas del
Parte I: Resultados
47
transgen, de aprox. 6.1 kb y 1.6 kb, además de las dos bandas endógenas presentes en los
animales controles (Figura 3).
A partir del cruce de animales fundadores con animales controles C57BL6SJL, se
obtuvo la primera generación de animales transgénicos heterocigotos (F1) de las diferentes
líneas. A partir de éstos se obtuvieron animales de la segunda generación (F2), los cuales se
utilizaron en la realización de este trabajo. Sin embargo, la línea escogida para la continuación
de los estudios y la obtención de animales transgénicos aP2-PEPCK homocigotos fue la línea
Tg1, ya que presentaba una mayor expresión del transgen y una mayor actividad enzimática
PEPCK (Figuras 4,5).
Tg Tg ConCon
1.6 kb
6.1 kb
Figura 3. Southern blot representativo de DNA genómico. Análisis por Southern blot del DNA genómico digerido con la enzima de restricción EcoRI de ratones controles (Con) y transgénicos heterocigotos (Tg) de la línea Tg1. La sonda utilizada correspondía al fragmento SphI-SphI de 3.85 Kb que contenía parte de la secuencia del gen Pck1.
1.1.3. Análisis de la expresión del transgen aP2-PEPCK.
La expresión del mRNA del transgen aP2-PEPCK se analizó en diferentes tejidos. Para
ello, se extrajo RNA total de tejido adiposo blanco (WAT), marrón (BAT), hígado y riñón, tanto
de animales controles como transgénicos heterocigotos y homocigotos, y se analizó la
presencia del transcrito de PEPCK mediante Northern blot. Tanto en animales controles como
en transgénicos (heterocigotos y homocigotos) se detectó la presencia del mRNA de 2.8 kb
Parte I: Resultados
48
correspondiente al gen de la PEPCK, transcrito resultante de la expresión tanto del gen de la
PEPCK endógeno como del transgen.
En el tejido adiposo blanco (WAT) se observó un incremento de dos veces en la
cantidad de mRNA de PEPCK en los animales transgénicos heterocigotos de las líneas Tg2-Tg4
(resultados no mostrados). En cambio, en la línea Tg1 se observó un elevado incremento
(más de cinco veces) en la cantidad de mRNA de PEPCK. Además, en el caso de los animales
transgénicos homocigotos de la línea Tg1 este incremento era de aproximadamente once
veces (Figura 4A y 4B). En el tejido adiposo marrón (BAT) de los animales transgénicos
heterocigotos y homocigotos de la línea Tg1 también se observó un incremento en el mRNA
de PEPCK de tres y cinco veces, respectivamente (Figura 4A y 4C). No obstante, los niveles de
mRNA de PEPCK no estaban alterados en el hígado ni en el riñón de los animales transgénicos
(Figura 4A). Este resultado estaba de acuerdo con el hecho de que el promotor aP2 es
específico de tejido adiposo.
Con Tg1 het
Tg1 hom
Hígado
Riñón
BAT
WAT
A
500
1000
1500
mR
NA
PEPC
K
(% r
espe
cto
cont
rol)
0
WAT
*
*
B
0
100
200
300
400
500
600
BAT
*
*
C
Tg1 homTg1 hetCon
Figura 4. Expresión del transgen en WAT y BAT. (A) Northern blot representativo del tejido adiposo blanco (WAT), tejido adiposo marrón interescapular (BAT), hígado y riñón de ratones ayunados controles (Con) y transgénicos heterocigotos (Tg1 Het) y homocigotos (Tg1 Hom) de la línea 1, hibridado con una sonda específica de PEPCK. (B) y (C) Cuantificación del RNAm de PEPCK en WAT y BAT. Los resultados se representan como medias ±SE de seis animales. *P<0.05.
Parte I: Resultados
49
1.1.4. Determinación de la actividad enzimática PEPCK en el tejido adiposo.
Se determinó la actividad PEPCK en extractos citosólicos del tejido adiposo blanco
epididimal (WAT) para valorar la funcionalidad del transgen aP2-PEPCK. En animales
transgénicos heterocigotos alimentados de las líneas Tg2-Tg4 se observó un incremento de
dos veces en la actividad PEPCK citosólica del WAT respecto a extractos de animales controles
(Figura 5A). En cambio, el incremento en la actividad PEPCK fue mayor (unas 3.5 veces) en
los animales transgénicos heterocigotos alimentados de la línea Tg1 (Figura 5A). Cuando se
determinó la actividad PEPCK citosólica de extractos de WAT procedentes de animales
ayunados, se observó que los animales transgénicos heterocigotos y homocigotos de la línea
Tg1 mostraban incrementos en la actividad PEPCK de 4 y 13 veces, respectivamente (Figura
5B). Como era de esperar, no se observaron cambios en la actividad PEPCK hepática en los
animales transgénicos heterocigotos y homocigotos (Figura 5B).
Act
ivid
ad P
EPC
K(%
res
pect
o c
ontr
ol)
0
100
200
300
400
AlimentaciónA
Con Tg1
*
Tg2
*
Tg3
*
Tg4
*
0
500
1000
1500
Tg1 homTg1 hetCon
WAT Hígado
Ayuno
Act
ivid
ad P
EPC
K(%
res
pect
o c
ontr
ol)
B*
*
Figura 5. Actividad PEPCK en ratones controles y transgénicos. (A) La actividad PEPCK se determinó en extractos citosólicos de tejido adiposo blanco epididimal obtenidos de animales alimentados. Se analizaron las cuatro líneas de transgénicos heterocigotos (Tg1-Tg4). Los resultados se expresan como porcentajes de la actividad PEPCK en ratones controles (3.9 mU/mg proteína). (B) También se determinó en extractos citosólicos de tejido adiposo blanco e hígado de animales controles (Con) y transgénicos heterocigotos (Tg1 Het) y homocigotos (Tg1 Hom) de la línea Tg1 ayunados. Los resultados se expresan como porcentaje de la actividad PEPCK en WAT de ratones controles ayunados (5.8 mU/mg proteína). Los datos representan la media ±SE de al menos seis animales por grupo.*P<0.05.
Parte I: Resultados
50
1.2. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES EN EL TEJIDO ADIPOSO CAUSADAS
POR LA SOBREEXPRESIÓN DE PEPCK EN DICHO TEJIDO.
En esta parte del trabajo, se estudiaron las posibles alteraciones metabólicas
causadas por la sobreexpresión de PEPCK en el tejido adiposo a lo largo del tiempo. Para ello,
utilizamos animales machos transgénicos heterocigotos y homocigotos de la línea Tg1.
1.2.1. Análisis del peso corporal, peso del tejido adiposo y contenido de
grasa corporal.
En animales machos de seis meses de edad se determinó el peso corporal, el peso
del tejido adiposo epididimal y el contenido de grasa corporal. Se detectó un pequeño
incremento en el peso corporal de ratones transgénicos heterocigotos, comparado con
animales controles hermanos de camada. Sin embargo, este incremento fue más exacerbado
en los animales transgénicos homocigotos, ya que presentaban un aumento de
aproximadamente un 33% (Figura 6A). Es más, también incrementó significativamente el peso
del tejido adiposo gonadal, tanto en animales heterocigotos (un 180%) como en homocigotos
(un 340%), en comparación con los animales controles (Figura 6B). Además, cuando se
determinó el contenido de grasa corporal, éste había incrementado en un 125% en animales
transgénicos heterocigotos y en un 200% en los homocigotos (Figura 6C).
Esto nos indicaba que la ganancia de peso corporal de los animales transgénicos
respecto los controles era probablemente debida a un incremento del depósito de grasa. A
pesar de ello, la ingesta de alimentos de los animales transgénicos era similar a la de los
animales controles (3.3 ± 0.1, 3.2 ± 0.1 y 3.4 ± 0.1 g/día para controles, Tg1 heterocigotos y
homocigotos, respectivamente). En la Figura 7 se puede observar el incremento del depósito
de grasa en la cavidad abdominal en los ratones transgénicos. Asimismo, el depósito de tejido
adiposo epididimal de un animal transgénico era mayor que el de un animal control (Figura 7).
Parte I: Resultados
51
Peso
cor
pora
l (g)
25
30
35
40
45
A
*
% g
rasa
cor
pora
l
0
5
10
15
C
**
*
Peso
gra
sa e
pidi
dim
al (m
g)500
1000
1500
2000
B
**
*
Diá
met
ro a
dipo
cito
(µm
)
0
25
50
75
100
D**
*
Tg1 homTg1 hetCon
Figura 6. Peso corporal, peso del tejido adiposo blanco epididimal (WAT), porcentaje de grasa corporal y diámetro de los adipocitos. (A) Peso corporal de machos de seis meses de edad. (B) Peso del tejido adiposo blanco epididimal (WAT). (C) Porcentaje de grasa corporal de machos de seis meses de edad. (D) Diámetro de los adipocitos del WAT epididimal. Los resultados se expresan como media ±SE de ocho animales por grupo. *P < 0.05; **P < 0.01. Controles (Con), transgénicos heterocigotos (Tg1 Het) y transgénicos homocigotos (Tg1 Hom).
Parte I: Resultados
52
Visión Ventral
Con Tg
Grasa Epididimal
Con Tg
Figura 7. Imágenes representativas de un ratón control y uno transgénico homocigoto. Se muestra una visión ventral de la cavidad abdominal abierta de un animal control y uno transgénico para mostrar la grasa visceral y epididimal. También se muestra el depósito de grasa epididimal unilateral junto con el epidídimo y el testículo.
1.2.2. Estudio histológico del tejido adiposo.
Los análisis histológicos del tejido adiposo de ratones de seis meses de edad, tanto
controles como transgénicos, mostraban los adipocitos del tejido adiposo blanco (WAT) con la
típica gran vacuola lipídica unilocular. Mientras, los adipocitos del tejido adiposo marrón
interescapular (BAT) de ambos animales presentaban multitud de pequeñas vacuolas lipídicas
multiloculares (Figura 8). No obstante, en los animales Tg1 heterocigotos y homocigotos, los
adipocitos del tejido adiposo blanco eran más grandes que los de un animal control, y el
depósito de lípidos también era mayor en los adipocitos del BAT (Figura 8). La hipertrofia del
WAT se cuantificó midiendo el diámetro de los adipocitos. Los adipocitos del WAT de los
animales Tg1 heterocigotos presentaban un mayor diámetro medio (aprox. de 2 veces)
respecto el diámetro medio de los adipocitos blancos de un animal control (Figura 6D).
Parte I: Resultados
53
Este incremento era todavía mayor (unas 3 veces) en los adipocitos del WAT de
animales Tg1 homocigotos y paralelo al incremento del peso del tejido adiposo (Figura 8),
indicando que la obesidad de estos animales transgénicos era probablemente debida a la
hipertrofia del tejido adiposo.
Tg1 het Tg1 homCon
WAT
BAT
Figura 8. Análisis histológico del tejido adiposo blanco epididimal (WAT) y del tejido adiposo marrón interescapular (BAT). Se representan secciones representativas del WAT (panel superior) y BAT (panel inferior) de animales controles y animales transgénicos (heterocigotos y homocigotos) teñidas con hematoxilina y eosina (x400).
Parte I: Resultados
54
1.2.3. Determinación de la gliceroneogénesis y reesterificación de ácidos
grasos libres.
Tanto la gliceroneogénesis como la reesterificación de los ácidos grasos libres se
estudiaron en el tejido adiposo blanco de los animales transgénicos aP2-PEPCK. La conversión
de 14C-piruvato a glicerol estaba incrementada (unas 2 a 2.5 veces) en el WAT de los animales
transgénicos respecto a los controles (Figura 9A). Esto indicaba que se había producido un
incremento en la gliceroneogénesis en el tejido adiposo blanco de los animales transgénicos
aP2-PEPCK. Por el contrario, la síntesis de novo de ácidos grasos no estaba significativamente
alterada en los animales transgénicos (control 32.4 ± 10 cpm/mg proteína vs. Tg1 het 25 ±
3.5 cpm/mg proteína). Además, la tasa de reesterificación de ácidos grasos libres también fue
mayor (2 veces) en el tejido adiposo blanco de los animales transgénicos respecto los
controles (Figura 9B). Estos resultados nos indicaban que en los ratones transgénicos aP2-
PEPCK, una mayor actividad enzimática de PEPCK en el tejido adiposo llevaba a un incremento
en la gliceroneogénesis y en la reesterificación de los ácidos grasos libres.
100
300
500
700
900
Con
vers
ión
14C
-Pir
uvat
o en
glic
erol
(cpm
/mg
prot
)
A
**
Tas
a re
este
rific
ació
n de
FF
As(
µmol
/mg
prot
)
B
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 *
*Tg1 homTg1 hetCon
Figura 9. Gliceroneogénesis y reesterificación de ácidos grasos libres (FFAs) en WAT de animales controles y transgénicos ayunados. La gliceroneogénesis (A) y la tasa de reesterificación de FFAs (B) se determinó en fragmentos del WAT epididimal in vitro de ratones controles y transgénicos, tal y como se indica en Materiales y Métodos. Los datos representan la media ±SE de al menos seis animales por grupo. *P < 0.05.
Parte I: Resultados
55
1.3. ESTUDIO DE LOS EFECTOS SISTÉMICOS PROVOCADOS POR LA
SOBREEXPRESIÓN DE PEPCK EN TEJIDO ADIPOSO.
1.3.1. Análisis de la glucemia e insulinemia.
La obesidad suele estar frecuentemente asociada a la diabetes tipo 2, un desorden
metabólico caracterizado por una resistencia a la insulina. Como ya se ha descrito
anteriormente los animales transgénicos homocigotos aP2-PEPCK eran obesos, por lo que
realizamos a continuación estudios sobre las implicaciones del incremento en la masa grasa a
nivel sistémico. A partir de animales de cuatro a seis meses de edad, se determinó la
concentración de glucosa y de insulina sanguíneas, tanto en animales Tg1 heterocigotos y
homocigotos como en animales controles, en estado de alimentación y de ayunas (Tabla 1).
En ninguna de las condiciones estudiadas se observaron diferencias en la glucemia
entre los animales transgénicos (heterocigotos y homocigotos) y los animales controles. De
igual forma, tampoco se encontraron diferencias en los niveles de insulina circulante, tanto en
alimentación como en ayunas.
AlimentadosConTg1 Het
AyunadosCon
Tg1 Het
Glucosa(mg/dl)
141 ± 6157 ± 10
87 ± 4
84 ± 5
Insulina(ng/ml)
1.10 ± 0.161.09 ± 0.08
Tg1 Hom 139 ± 6 1.04 ± 0.20
Tg1 Hom 90 ± 11
0.58 ± 0.08
0.50 ± 0.080.57 ± 0.04
Tabla 1. Niveles de glucosa e insulina circulantes. Las glucemias e insulinemias de animales de cuatro a seis meses de edad, ayunados y alimentados, se determinaron según se indica en los Materiales y Métodos. Los datos representan la media ±SE de ocho animales por grupo. Controles (Con), transgénicos heterocigotos (Tg1 Het) y homocigotos (Tg1 Hom).
Parte I: Resultados
56
1.3.2. Test de tolerancia a la glucosa.
Se realizó un test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa a animales de cuatro
meses de edad ayunados durante una noche. Los ratones Tg1 heterocigotos y homocigotos
presentaban glucemias similares a los animales controles, a los 30 minutos tras la inyección
intraperitoneal de 1 g glucosa/kg de peso corporal (Figura 10A). Transcurridos 180 minutos,
las glucemias regresaban a los niveles basales iniciales de forma similar en todos los grupos
de animales (Figura 10A). Esto nos indicaba que los animales obesos transgénicos aP2-PEPCK
mostraban una respuesta a la inyección intraperitoneal de glucosa similar a la de una animal
control, es decir, presentaban una tolerancia a la glucosa normal.
1.3.3. Test de tolerancia a la insulina.
Debido a la obesidad que presentaban los animales transgénicos aP2-PEPCK, se
determinó también la sensibilidad corporal a la insulina. Para ello, se realizó un test
intraperitoneal de tolerancia a la insulina a animales alimentados de cuatro meses de edad. La
glucemia inicial en alimentación de los animales controles y transgénicos (heterocigotos y
homocigotos) era similar y disminuyeron de forma pareja, a los 30 minutos tras la inyección
intraperitoneal de insulina (Figura 10B). Es más, los animales transgénicos aP2-PEPCK
homocigotos mostraban una tendencia a presentar niveles de glucosa circulantes inferiores a
los de un animal control, a los 45 y 60 minutos tras la inyección (Figura 10B). Este resultado
nos indicaba que no sólo los animales obesos transgénicos aP2-PEPCK no desarrollaban una
resistencia a la insulina, sino que la respuesta hipoglucemiante a la inyección de la hormona
incluso tendía a ser mayor.
Parte I: Resultados
57
40
60
80
100
Glu
cosa
(%)
0 15 30 45 60
Tiempo (min)
Tg1 homTg1 hetCon
B
Tiempo (min)
A
50
100
150
200
250
300
350
Glu
cosa
(mg/
dl)
0 60 120 180
Figura 10. Test intraperitoneal de tolerancia a glucosa y a la insulina. (A) Test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa. A animales controles (Con), Tg1 heterocigotos (Tg1 het) y homocigotos (Tg1 hom) de cuatro meses de edad, ayunados durante una noche, se les inyectó intraperitonealmente glucosa (1g/kg de peso). Las muestras de sangre fueron tomadas de la cola de los mismos animales a los tiempos indicados y se determinó la concentración de glucosa. Los resultados se presentan como medias ±SE de al menos seis animales por grupo. (B) Test intraperitoneal de tolerancia a la insulina. Se inyectó intraperitonealmente insulina (0.75 U/kg peso) (Humulina Regular, Eli Lilly, Indianapolis, IN) a animales controles y transgénicos alimentados despiertos. Las muestras de sangre fueron tomadas de la cola de los mismos animales a los tiempos indicados y se determinó la glucosa sanguínea. Los resultados fueron calculados como porcentaje de la glucemia inicial a tiempo 0 para cada animal y expresados como media ±SE de al menos seis animales por grupo.
1.3.4. Utilización de glucosa in vivo por el músculo esquelético.
A fin de corroborar que los ratones transgénicos obesos no habían desarrollado
resistencia a la insulina, también se determinó la captación y utilización de la glucosa
estimulada por la hormona por el músculo esquelético in vivo. La captación basal de [2-3H]-
deoxiglucosa fue similar en los animales Tg1 homocigotos y los animales controles (Figura
11). Cuando se inyectó insulina, la captación de [2-3H]-deoxiglucosa por el músculo
esquelético incrementó unas 2.5 veces tanto en los animales controles como en los
transgénicos homocigotos (Figura 11). Estos resultados nos sugerían que la sobreexpresión de
PEPCK no alteraba el metabolismo de la glucosa en el músculo esquelético. Además nos
Parte I: Resultados
58
indicaban que, a pesar de que los animales transgénicos homocigotos eran obesos, éstos no
desarrollaban resistencia a la insulina.
0
100
200
300
Util
izac
óngl
ucos
a(%
res
pect
o co
ntro
l)
ConTg1 hom
ConTg1 hom
Insulina
Figura 11. Índice de la utilización de la glucosa por el músculo esquelético. La captación de glucosa se determinó en el músculo esquelético (gastrocnemio y cuadríceps) de animales controles y Tg1 homocigotos alimentados, tratados y no tratados (basal) con insulina inyectada intraperitonealmente, tal y como se indica en los Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como porcentaje de la utilización basal de glucosa por el músculo de animales controles (20 pmol x mg proteína-1 x min-1). Los resultados representan la media ± SE de cuatro animales por grupo.
1.3.5. Determinación de otros metabolitos sanguíneos y hormonas
circulantes.
También se estudiaron otros parámetros sanguíneos que pudieran alterarse por la
sobreexpresión de PEPCK a nivel del tejido adiposo, especialmente aquellos que pudieran
resultar del incremento en la masa adiposa que presentaban los animales transgénicos aP2-
PEPCK.
Parte I: Resultados
59
1.3.5.1. Triglicéridos y lactato séricos.
En primer lugar, se determinaron los niveles de triglicéridos y lactato sanguíneos en
alimentación y en ayunas (Tabla 2). Como se puede observar, no existían diferencias entre los
animales controles y transgénicos en la concentración sérica de triglicéridos. Aunque el lactato
es otro de los substratos de la gliceroneogénesis, los niveles circulantes de lactato eran
similares en los animales controles y en los transgénicos.
Triglicéridos(mg/dl)
Lactato(mM)
AlimentadosConTg1 Het
Ayunados
137 ± 24138 ± 23
5.29 ± 0.19n.d.
Tg1 Hom 140 ± 18 5.33 ± 0.17
Con
Tg1 Het99 ± 14
103 ± 12
Tg1 Hom 116 ± 6
n.d.n.d.n.d.
Tabla 2. Niveles circulantes de triglicéridos y lactato. Los triglicéridos y lactato séricos de animales de cuatro a seis meses de edad ayunados y alimentados se determinaron según se indica en Materiales y Métodos. Los datos representan la media ± SE de ocho animales por grupo. Controles (Con), transgénicos heterocigotos (Tg1 Het) y homocigotos (Tg1 Hom). n.d.: no determinado.
1.3.5.2. Ácidos grasos libres y glicerol séricos.
En animales alimentados, la mayor parte de los FFAs circulantes proceden de la
comida ingerida, ya que la lipólisis de los triglicéridos en el tejido adiposo está inhibida por la
insulina. Así, en condiciones de alimentación, se observó que las concentraciones de FFAs
eran similares en los animales controles y transgénicos (Figura 12A). En cambio, en los
animales controles ayunados, debido al incremento de la lipólisis en tejido adiposo, los niveles
séricos de FFAs incrementaban unas 4 veces en relación a los controles alimentados (Figura
12A). Esto contrastaba con los animales transgénicos ayunados, tanto heterocigotos como
Parte I: Resultados
60
homocigotos, ya que sólo se observaba un incremento de dos veces respecto a los
transgénicos alimentados (Figura 12A). Este resultado nos indicaba que la liberación de FFAs
por el tejido adiposo estaba marcadamente disminuida en los animales transgénicos aP2-
PEPCK. Sin embargo, tanto en condiciones de alimentación como en ayunas, se observaron
niveles séricos de glicerol similares en los tres grupos de animales estudiados (Figura 12B).
Ello indicaba que la lipólisis era la misma en los animales controles y transgénicos.
La liberación de ácidos grasos libres desde el tejido adiposo está generalmente
incrementada en la obesidad. No obstante, nuestros resultados indicaban que los niveles
circulantes de FFAs estaban incluso más bajos en los ratones obesos transgénicos que en los
animales controles no obesos. Ello probablemente era el resultado de un incremento en la
velocidad de reesterificación de FFAs por el tejido adiposo.
0
0.5
1
1.5
AyunadosAlimentados
Áci
dos g
raso
s lib
res
(mM
)
A
**
0
50
100
150
200
250
Glic
erol
(mg/
dl)
AyunadosAlimentados
B
Tg1 homTg1 hetCon
Figura 12. Niveles séricos de ácidos grasos libres y glicerol en animales transgénicos aP2-PEPCK. Los ácidos grasos libres (A) y el glicerol (B) se determinaron en el suero de animales alimentados o ayunados de seis meses de edad, tal y como se indica en los Materiales y Métodos. Los datos representan la media ±SE de al menos ocho animales por grupo.*P < 0.05. Controles (Con), Tg1 heterocigotos (Tg1 Het) y homocigotos (Tg1 Hom).
Parte I: Resultados
61
1.3.5.3. Determinación de leptina y de TNF-α.
La producción de leptina y TNF-α por parte del tejido adiposo están incrementadas
durante la obesidad y pueden afectar a la homeostasis de la glucosa. Dado que los animales
transgénicos eran obesos, se determinó los niveles de leptina circulante y la expresión del
mRNA de TNF-α en el tejido adiposo. Así, se observó que en el tejido adiposo blanco de los
animales obesos transgénicos, los niveles de expresión de TNF-α eran similares a los de un
animal control (resultados no mostrados). Asimismo, en animales alimentados de 6 meses de
edad, no se encontraron alterados los niveles circulantes de leptina (control, 5.4 ± 0.4; Tg1
heterocigotos, 5.4 ± 0.6 y Tg1 homocigotos 5.4 ± 0.4 ng/mL, n=8). Estos resultados sugerían
que el incremento en la masa de tejido adiposo en ausencia de un incremento en los niveles
circulantes de FFAs no alteraba los niveles circulantes de leptina ni la expresión de TNF-α.
Por tanto, nuestros resultados indicaban que un aumento de la actividad PEPCK en
tejido adiposo llevaba a un incremento en la gliceroneogénesis, resultando un aumento de la
reesterificación de FFAs y del depósito de grasa en este tejido. Además, aunque los animales
transgénicos aP2-PEPCK eran obesos no mostraban resistencia a la insulina, probablemente
debido a la ausencia de un incremento en los niveles séricos de FFAs (Figura 26).
Parte I: Resultados
62
1.4. ESTUDIO DEL EFECTO DE UNA DIETA ALTA EN LÍPIDOS EN LOS
ANIMALES TRANSGÉNICOS aP2-PEPCK.
Con el fin de estudiar si un incremento en la reesterificación de ácidos grasos era
capaz de contrarrestar el incremento en los niveles séricos de FFAs y la resistencia a la
insulina inducida por una dieta alta en lípidos (HFD), estos animales transgénicos homocigotos
se alimentaron este tipo de dieta durante seis semanas.
1.4.1. Efecto de la dieta alta en lípidos sobre el peso corporal.
Animales machos de tres meses de edad, controles y transgénicos homocigotos, se
alimentaron con una dieta alta en lípidos durante seis semanas. Durante este periodo, los
ratones controles alimentados con una dieta estándar apenas modificaban su peso corporal.
Sin embargo, los animales transgénicos homocigotos en dieta estándar incrementaban su
peso aproximadamente un 10% respecto al peso al inicio del experimento (Figura 13A). En
cambio, mientras que los ratones controles alimentados con una dieta HFD incrementaban
aproximadamente un 20% su peso corporal inicial, los transgénicos ganaban un 40% (Figura
13A). Además, este mayor incremento en la ganancia de peso en los ratones transgénicos no
era debido a una mayor ingesta de alimento, ya que no se observaron diferencias en la
cantidad de alimento ingerido entre los controles y los transgénicos en dieta HFD (Figura
13B). De hecho, un resultado similar se había observado en animales alimentados con una
dieta estándar.
Parte I: Resultados
63
AG
anan
cia
de p
e so
( %)
semanas
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6
Tg HFDCon HFDTg stdCon std
B
0
1
2
3
4
Inge
sta
a lim
ent o
(g/d
ia)
Con Tg
Figura 13. Evolución del peso corporal de animales machos de tres meses de edad durante las seis semanas del estudio. (A) Tanto animales controles (Con) como transgénicos homocigotos (Tg) fueron alimentados con una dieta estándar (std) o una dieta alta en lípidos (HFD) durante seis semanas. A partir del peso inicial de cada animal, se determinó la ganancia de peso corporal a lo largo de las seis semanas. Los resultados se expresan como porcentaje de ganancia de peso. Los datos se representan como las medias ±SE de al menos doce animales por grupo. (B) Ingesta de alimento en los ratones controles y transgénicos homocigotos sometidos a una dieta alta en lípidos. Los resultados se expresan como la ingesta diaria de alimento por animal (g de alimento/día/animal). Los datos se representan como las medias ±SE de al menos diez animales por grupo.
1.4.2. Efecto del consumo de la dieta HFD en el tejido adiposo blanco.
A continuación se determinó el peso del tejido adiposo blanco epididimal (WAT) y la
expresión de la PEPCK en el WAT. También, se realizaron estudios histológicos del WAT a fin
de determinar si el incremento de peso corporal era el resultado de un aumento en la masa
grasa como consecuencia de la sobreexpresión de PEPCK.
Parte I: Resultados
64
1.4.2.1. Análisis del peso del tejido adiposo blanco epididimal y
expresión de PEPCK tras la dieta HFD.
Como se ha descrito previamente, los animales transgénicos en dieta estándar
mostraban un incremento en el peso del WAT (Figura 14A, tiempo 0). Tras seis semanas en
dieta alta en lípidos, los animales controles mostraban un incremento en el peso del WAT de
un 300% respecto a los controles en dieta estándar (Figura 14A). Tras ese mismo periodo de
tiempo, los ratones transgénicos presentaban un incremento en el peso del WAT de un 600%
respecto a los controles en dieta estándar. En cambio, aunque los animales transgénicos
mostraban un incremento en el peso del WAT respecto a los transgénicos en dieta estándar
(alrededor del 40%), este incremento era mucho menor que en el caso de los animales
controles (Figura 14A). A pesar de ello, el peso del WAT de los transgénicos en dieta alta en
lípidos continuaba siendo significativamente superior al de los controles en dicha dieta (Figura
14A). Por tanto, los animales transgénicos desarrollaban una obesidad severa tras las seis
semanas en dieta alta en lípidos, y este incremento en la cantidad de grasa acumulada
probablemente era la causa de la mayor ganancia de peso observada.
Además, se determinó la expresión de la PEPCK en el WAT tras la dieta alta en
lípidos. Los ratones transgénicos aP2-PEPCK en dieta estándar mostraban un incremento de
seis veces en la expresión del mRNA de la PEPCK en el WAT respecto a los controles (Figura
14B). Tras la dieta, se observó un incremento similar en los niveles de PEPCK en los
transgénicos respecto a los controles (Figura 14B). Finalmente, se determinó los niveles de la
proteína PEPCK en el tejido adiposo blanco de los animales controles y transgénicos
alimentados, tras la dieta (Figura 14C). Mientras que no se detectó la presencia de la proteína
PEPCK en los ratones controles alimentados, los animales transgénicos continuaban
expresándola tras la dieta HFD. Estos resultados indicaban que la sobreexpresión de PEPCK en
tejido adiposo no era alterada por la dieta alta en lípidos.
Parte I: Resultados
65
A
0
0.5
1.0
1.5
2.0
Peso
tejid
o ad
ipos
o (g
)
0 6semanas
* §
*
*
B
WATPEPCK
18S
Std HFD
Con Tg Con Tg
C
WAT
TgHFDConHFD
PEPCK
Figura 14. Estudio del tejido adiposo blanco epididimal de animales alimentados con una dieta alta en lípidos. (A) Peso del WAT de animales controles (columna blanca) y transgénicos (columna negra) antes (semana 0) y después de las seis semanas de dieta HFD (semana 6). A partir de estos animales, se determinaron tantos los niveles de expresión (B) como los niveles de la proteína PEPCK en el tejido adiposo blanco (C), tal y como se describe en los Materiales y Métodos. El Northern blot del tejido adiposo blanco epididimal se hibridó tanto con una sonda específica para la PEPCK como para el mRNA del 18S. Los datos se representan como las medias ±SE de al menos diez animales por grupo. *P≤0.01 vs controles en dieta estándar, §P≤0.01 vs controles en dieta alta en lípidos.
1.4.2.2. Análisis histológico del tejido adiposo blanco epididimal tras
una dieta alta en lípidos.
A continuación se realizaron cortes histológicos del WAT epididimal, tanto en
animales controles como en transgénicos homocigotos, sometidos a dieta estándar o a dieta
alta en lípidos. Tal y como ya se ha descrito previamente, los adipocitos blancos de los
animales transgénicos en dieta estándar mostraban un incremento del tamaño respecto a los
de los controles (Figura 15). Tras la dieta alta en lípidos, los adipocitos blancos de ambos
grupos incrementaban de tamaño, especialmente en los animales transgénicos donde se
podían observar adipocitos con un gran acúmulo de triglicéridos (Figura 15). Estos resultados
Parte I: Resultados
66
sugerían que un incremento en la gliceroneogénesis y en la reesterificación de ácidos grasos
desencadenaba una obesidad severa en los animales transgénicos.
Con
Tg
Std HFD
Figura 15. Cortes histológicos representativos del tejido adiposo blanco epididimal. Se muestran secciones del WAT de animales machos controles (Con) y transgénicos homocigotos (Tg) de 3 meses de edad, en dieta estándar (Std) y tras 6 semanas en dieta alta en lípidos (HFD). Los cortes histológicos han sido teñidos con hematoxilina y eosina (x400).
Parte I: Resultados
67
1.4.3. Estudio de los efectos sistémicos de la dieta alta en lípidos en los
animales aP2-PEPCK.
1.4.3.1. Determinación de la glucemia e insulinemia.
Al inicio del experimento, los animales transgénicos y controles presentaban
glucemias similares, tanto en alimentación como en ayunas (Figura 16A, semana 0). Sin
embargo, se observó un incremento significativo en la glucemia de ambos grupos seis
semanas después, tanto en alimentación como en ayunas. La hiperglucemia debida al efecto
de la dieta era mayor cuando los controles y transgénicos se ayunaban (Figura 16B). No
obstante, no se observaron diferencias en los niveles circulantes de glucosa entre controles y
transgénicos en ninguna de las dos condiciones (Figura 16A-16B).
En cuanto a la insulinemia en alimentación, no existían diferencias en los niveles
circulantes de la hormona entre los animales controles y transgénicos en dieta estándar
(Figura 16C). A pesar de la corta exposición a la dieta diabetogénica, los ratones controles
alimentados ya mostraban un ligero, pero significativo, incremento (de 1.5 veces) en su
insulinemia. En cambio, los transgénicos en dieta HFD presentaban un incremento mucho
mayor que los controles (aproximadamente 14 veces) (Figura 16C). Estos resultados sugerían
que los ratones transgénicos eran mucho más sensibles al efecto diabetogénico de la dieta
alta en lípidos, ya que desarrollaban una gran hiperinsulinemia. Además, ello sugería que los
animales transgénicos en dieta HFD eran más resistentes a la insulina que los controles, ya
que necesitaban una secreción mayor de la hormona para mantener unos niveles similares de
glucosa circulante.
Parte I: Resultados
68
A
0
50
100
150
200
Glu
cem
ia(m
g/dl
)Alimentación
0 6semanas
**Ayuno
B
0
50
100
150
200
Glu
cem
ia(m
g/dl
)
**
0 6semanas
Insu
linem
ia (n
g/m
l)
C
0
5
10
15
20
*§
*0 6semanas
Tg homCon
Figura 16. Glucemias e insulinemias de animales controles y transgénicos, antes y después de la dieta. Glucemias en ratones machos controles y transgénicos alimentados (A) y ayunados durante 15 horas (B). (C) Niveles circulantes de insulina en animales alimentados, antes y tras seis semanas de dieta alta en lípidos. Todos los datos se representan como las medias ±SE de doce animales por grupo. *P≤0.01 vs controles en dieta estándar, §P≤0.01 vs controles en dieta alta en lípidos.
1.4.3.2. Test intraperitoneal de tolerancia a la insulina.
A continuación se realizó un test de tolerancia a la insulina para confirmar si los
animales transgénicos habían desarrollado resistencia a la hormona. Tras la inyección
intraperitoneal de la insulina exógena, los controles en dieta estándar reducían su glucemia
inicial aproximadamente en un 60%. En cambio, los controles en dieta rica en lípidos la
reducían en un 50% y a lo largo del test mantenían niveles séricos de glucosa por encima de
los controles en dieta estándar (Figura 17A). Por contra, los animales transgénicos en dieta
alta en lípidos tan sólo reducían un 30% su glucemia inicial y recuperaban los niveles de
glucosa circulante iniciales más rápido que el resto de grupos de animales (Figura 17A). Por
tanto, aunque seis semanas en dieta alta en lípidos era suficiente para inducir una ligera
resistencia a la insulina en los ratones controles, abolía la respuesta hipoglucemiante de la
hormona exógena en los animales transgénicos.
Parte I: Resultados
69
1.4.3.3. Test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa.
También se realizó un test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa tras un ayuno
nocturno a animales controles en dieta estándar y ratones controles y transgénicos en dieta
alta en lípidos. Tras el periodo en dieta, los animales transgénicos presentaban glucemias
superiores a los controles y eran incapaces de recuperar los valores basales de glucosa a los
150 minutos después de la inyección intraperitoneal de glucosa (Figura 17B). Por el contrario,
los ratones controles en dieta alta en lípidos presentaban una respuesta similar a los controles
en dieta estándar (Figura 17B). Estos resultados indicaban que los ratones transgénicos no
sólo eran más resistentes a la insulina que los controles, sino que también habían desarrollado
una mayor intolerancia a la glucosa. En cambio, los animales controles en dieta alta en lípidos,
aunque eran ligeramente resistentes a la insulina, aún presentaban una tolerancia a la glucosa
similar a la de los controles en dieta estándar.
20
40
60
80
100
Glu
cosa
(%)
A
0 15 30 45 60
*§
*
*§*§
*§
* *
Tiempo (min)
Tg HFDCon HFDCon std
Glu
cosa
(mg/
dl)
B
0
100
200
300
400
500
0 30 60 90 120 150
Tiempo (min)
*§*§
*§
*§
Figura 17. Test intraperitoneal de tolerancia a la insulina y a la glucosa en animales controles y transgénicos tras seis semanas en dieta alta en lípidos. (A) Test intraperitoneal de tolerancia a la insulina. A animales despiertos se les inyectó intraperitonealmente insulina (0.75 U/kg peso). Los resultados se calcularon como porcentaje de la glucemia inicial a tiempo 0 para cada animal. (B) Test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa. Se inyectó intraperitonealmente glucosa (1g/kg de peso) a animales despiertos, tras ser ayunados una noche. Las muestras de sangre fueron tomadas de la cola de los mismos animales a los tiempos indicados y se determinó la concentración de glucosa. Los resultados se expresan como la media ±SE de al menos seis animales por grupo. Animales controles en dieta estándar (Con std), animales controles y transgénicos en dieta alta en lípidos (Con HFD y Tg HFD, respectivamente).*P≤0.01 vs controles en dieta estándar, §P≤0.01 vs controles en dieta alta en lípidos.
Parte I: Resultados
70
1.4.3.4. Determinación de los niveles circulantes de triglicéridos y
ácidos grasos libres.
Los animales transgénicos en dieta alta en lípidos mostraban una obesidad severa,
acompañada de una gran resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa. Dado que,
asociado a la obesidad también se suele encontrar un incremento en los niveles circulantes de
triglicéridos y FFAs, se determinaron los niveles séricos de ambos en animales controles y
transgénicos sometidos a la dieta HFD. Tal y como ya se ha descrito anteriormente, los
animales transgénicos en dieta estándar, a pesar de ser obesos, mostraban niveles circulantes
de triglicéridos similares a los de un animal control (Figura 18). Sin embargo, tras la dieta alta
en lípidos, los ratones transgénicos presentaban hipertrigliceridemia, mientras que los
controles mostraban unos niveles circulantes de triglicéridos similares a los de un control en
dieta estándar (Figura 18).
Tri
glic
érid
os(m
g/dl
)
0
50
100
150
200
250
0 6semanas
* §
Figura 18. Niveles circulantes de triglicéridos en animales alimentados, antes y tras la dieta alta en lípidos. Los resultados son expresados como las medias ±SE de al menos seis animales por grupo. Los controles se representan en la columna blanca mientras que los transgénicos en la columna negra. *P≤0.01 vs controles en dieta estándar, §P≤0.01 vs controles en dieta alta en lípidos.
Parte I: Resultados
71
También se determinaron los niveles séricos de FFAs en los animales controles y
transgénicos en dieta alta en lípidos, tanto en condiciones de alimentación como en ayunas.
Los ratones controles y transgénicos alimentados mostraban un incremento similar en los
niveles circulantes de FFAs respecto a los animales en dieta estándar (Figura 19). Este
incremento en los niveles séricos de FFAs era probablemente debido al efecto de la dieta alta
en lípidos y al desarrollo de resistencia a la insulina en el tejido adiposo, lo que llevaría a una
mayor lipólisis. Aunque en dieta estándar los animales transgénicos ayunados mostraban unos
niveles circulantes de FFAs disminuidos respecto a los controles, no se observaron diferencias
entre los controles y transgénicos tras la dieta, tanto en ayunas como en alimentación (Figura
19). A pesar de la obesidad severa que presentaban los animales transgénicos en dieta alta en
lípidos, no mostraban un mayor incremento en los niveles circulantes de FFAs respecto a los
controles, probablemente debido a la mayor reesterificación en el tejido adiposo. Es más, la
ausencia de un mayor incremento en los niveles séricos de FFAs en los transgénicos en dieta
HFD respecto a los controles, descartaba a los FFAs como la causa de su mayor grado de
resistencia a la insulina observado.
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
Áci
dosg
raso
slib
res(
mM
)
Alimentación
0 6semanas
* *
A Ayunas
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
Áci
dosg
raso
slib
res(
mM
)
B
* *
* §*
0 6semanas
Figura 19. Niveles circulantes de FFAs en animales alimentados y ayunados, antes y después de administrarles una dieta alta en lípidos durante seis semanas. Los resultados son expresados como las medias ±SE de doce animales por grupo. Los controles se representan en la columna blanca mientras que los transgénicos en la columna negra. *P≤0.01 vs controles en dieta estándar alimentados, §P≤0.01 vs controles en dieta estándar ayunados.
Parte I: Resultados
72
1.4.3.5. Determinación de los niveles circulantes de adipoquinas.
Dado que los animales transgénicos mostraban una obesidad y resistencia a la
insulina severas tras la dieta, se determinaron las concentraciones séricas de interleuquina-6
(IL-6), TNF-α, leptina y adiponectina. Los niveles circulantes de IL-6 y TNF-α eran
indetectables, tanto en controles como en transgénicos, antes y después de la dieta
(resultados no mostrados). Ello indicaba que la resistencia a la insulina observada en los
ratones transgénicos en dieta HFD no era debida probablemente a alteraciones en la
concentración sérica de estas hormonas. En cambio, los niveles séricos de leptina
incrementaron de forma similar entre los animales controles y transgénicos, cuando ambos
grupos fueron alimentados con una dieta alta en lípidos (Figura 20A). Por otro lado, los niveles
circulantes de adiponectina en los ratones transgénicos en dieta estándar eran más altos que
en los controles. Este incremento en la adiponectina sérica que mostraban los transgénicos
obesos en dieta estándar probablemente contribuía a la ausencia de resistencia a la insulina
(Figura 20B). Al someter los ratones controles a una dieta alta en lípidos, se observó un
aumento en los niveles séricos de adiponectina de unas tres veces respecto a los controles en
dieta estándar (Figura 20B). Sin embargo, en los animales transgénicos en dieta alta en lípidos
tan sólo se producía un incremento del 30% en los niveles circulantes de adiponectina. Por
ello, los ratones transgénicos en dieta HFD alcanzaban unos niveles séricos de la hormona un
30% más bajos que los de los animales controles en dieta diabetogénica (Figura 20B).
Estos resultados sugerían que el importante incremento en los niveles circulantes de
adiponectina en los controles en dieta HFD probablemente contribuiría a prevenir el desarrollo
de una mayor resistencia a la insulina. Sin embargo, los bajos niveles de adiponectina sérica,
junto con el incremento en los niveles séricos de leptina en los ratones transgénicos en dieta
alta en lípidos, contribuirían al desarrollo de la importante resistencia a la insulina observada
en estos animales.
Parte I: Resultados
73
A
Lep
tina
(ng/
ml)
0
20
40
60
80
0 6semanas
**
Adi
pone
ctin
a (µ
g/m
l)
B
0
10
20
30
40
0 6semanas
* §
*
*
Figura 20. Niveles séricos de adipoquinas en animales alimentados, antes y después de administrarles una dieta alta en lípidos durante seis semanas. (A) Los niveles circulantes de leptina se determinaron mediante ELISA, tal y como se indica en Materiales y Métodos. (B) Los niveles circulantes de adiponectina se determinaron mediante RIA, tal y como se indica en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como las medias ±SE de doce animales por grupo. Los controles se representan en la columna blanca mientras que los transgénicos en la columna negra *P≤0.01 vs controles en dieta estándar alimentados, §P≤0.01 vs controles en dieta alta en lípidos alimentados.
1.4.4. Estudio de los efectos de la dieta diabetogénica a nivel hepático en
los animales transgénicos.
Se ha descrito que una resistencia a la insulina a nivel hepático contribuye a la
hiperglucemia, debido a la falta de inhibición de la producción hepática de glucosa por la
hormona, y a la hiperinsulinemia que resulta de la disminución en la eliminación de la insulina
circulante por el hígado. Por ello, se estudiaron las alteraciones metabólicas en el hígado de
los animales tras la exposición a una dieta alta en lípidos.
Parte I: Resultados
74
1.4.4.1. Análisis histológicos del hígado de animales en dieta alta en
lípidos.
Se realizaron cortes histológicos de los hígados de animales controles y transgénicos,
antes y tras una dieta alta en lípidos. En secciones teñidas con hematoxilina y eosina, no se
observaron diferencias morfológicas entre el hígado de animales controles y transgénicos en
dieta estándar (Figura 21). En cambio, ambos grupos de animales alimentados con una dieta
HFD mostraban un mayor acúmulo de grasa en el hígado, respecto a los ratones controles en
dieta estándar (Figura 21). Aunque los animales controles en dieta alta en lípidos mostraban
un ligero acúmulo de lípidos en sus hepatocitos, los ratones transgénicos desarrollaban una
gran esteatosis hepática (Figura 21).
Con
Tg
Std HFD
Figura 21. Cortes histológicos representativos del hígado de animales machos alimentados. Se muestran secciones del hígado de animales controles (Con) y transgénicos homocigotos (Tg), en dieta estándar (Std) y en dieta alta en lípidos (HFD). El acúmulo de lípidos en el interior de los hepatocitos se observa como un incremento del número y del tamaño de las vacuolas lipídicas (x400).
Parte I: Resultados
75
1.4.4.2. Contenido de triglicéridos en el hígado.
También se determinó el contenido de triglicéridos en los hígados de los animales
controles y transgénicos. De acuerdo con la alteración morfológica observada en los cortes
histológicos, el contenido hepático de triglicéridos estaba incrementado unas tres veces en los
ratones controles en dieta HFD respecto a los controles en dieta estándar (Figura 22).
Además, el contenido de triglicéridos hepáticos estaba incrementado unas siete veces en los
transgénicos en dieta rica en lípidos respecto a los transgénicos en dieta estándar, y unas dos
veces en comparación con los controles en dieta HFD (Figura 22). Estos resultados
confirmaban la mayor esteatosis hepática observada microscópicamente en los transgénicos
en dieta alta en lípidos. Ello sugería que un incremento en la reesterificación de FFAs en el
tejido adiposo, asociado con una dieta alta en lípidos, llevaba a una hipertrigliceridemia y a un
mayor acúmulo de grasa en el hígado, contribuyendo al desarrollo de la resistencia a la
insulina observada en estos ratones transgénicos.
Tri
glic
érid
os(m
g/g)
0
20
40
60
80
100
120
0 6semanas
*§
*
Figura 22. Contenido de triglicéridos en el hígado de animales alimentados, antes y tras seis semanas en dieta alta en lípidos. El contenido hepático de triglicéridos se determinó según se indica en Materiales y Métodos. Los resultados son expresados como la cantidad de triglicéridos por gramo de hígado. Los datos representan las medias ±SE de al menos seis animales por grupo. Los controles se representan en la columna blanca mientras que los transgénicos en la columna negra. *P≤0.01 vs controles en dieta estándar alimentados, §P≤0.01 vs controles en dieta alta en lípidos alimentados.
Parte I: Resultados
76
1.4.5. Estudio de los efectos de la dieta alta en lípidos a nivel del tejido
adiposo marrón en los animales transgénicos aP2-PEPCK.
Dado que los animales transgénicos aP2-PEPCK también sobreexpresan la PEPCK en
BAT, se estudió si un incremento de la reesterificación de FFAs en el BAT de animales
transgénicos asociado a una dieta alta en lípidos podría contribuir a la resistencia a la insulina.
1.4.5.1. Análisis histológicos del BAT de animales tras la dieta alta en
lípidos.
Se realizaron cortes histológicos del BAT de animales controles y transgénicos, antes
y tras la dieta alta en lípidos. En el análisis microscópico del BAT de los animales en dieta
estándar, mientras que los adipocitos marrones de los controles presentaban las vacuolas
lipídicas multiloculares características, se podía apreciar un mayor acúmulo de lípidos en los
adipocitos marrones de los transgénicos (Figura 23). Ello era probablemente debido al
incremento en la reesterificación de FFAs en el BAT de los animales transgénicos por la
sobreexpresión de la PEPCK.
Tras las seis semanas en dieta HFD, tanto en los animales controles como en
transgénicos, se observó un incremento del depósito de grasa en el BAT (Figura 23). Sin
embargo, el tamaño de las vesículas lipídicas multiloculares seguía siendo mayor en los
animales transgénicos (Figura 23). Es más, algunos adipocitos marrones acumulaban lípidos
de forma unilocular, similar a la de un adipocito blanco (Figura 23). Por tanto, el incremento
en la reesterificación de FFAs, junto con el efecto de una dieta alta en lípidos, incrementaba el
depósito de grasa en los adipocitos marrones, los cuales adoptaban una apariencia de
adipocito blanco.
Parte I: Resultados
77
Con
Tg
Std HFD
Figura 23. Cortes histológicos representativos del tejido adiposo marrón interescapular de animales machos alimentados. Se muestran secciones del BAT de animales controles (Con) y transgénicos homocigotos (Tg) en dieta estándar (Std) y en dieta alta en lípidos (HFD). Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (x400).
1.4.5.2. Análisis de la expresión génica en BAT.
Dado que los adipocitos marrones de los animales transgénicos en dieta acumulaban
más lípidos que los controles, se estudió la expresión de los genes claves en el gasto
energético de este tejido. Uno de los genes más importantes es el gen Ucp1, el cual codifica la
proteína desacopladora-1 (UCP-1), proteína expresada exclusivamente en el BAT y
responsable de su capacidad termogénica. En el BAT de los animales transgénicos en dieta
alta en lípidos se observó una disminución del 40% en los niveles de mRNA del gen Ucp1,
respecto a los controles en dieta diabetogénica (Figura 24). Para profundizar en los
Parte I: Resultados
78
mecanismos moleculares responsables de la disminución en la expresión de UCP-1, también se
determinó la expresión de dos reguladores positivos del gen Ucp1, los genes Pparg y
Ppargc1a, los cuales codifican el factor de transcripción PPARγ y su coactivador PGC-1α,
respectivamente. Los ratones transgénicos mostraban una disminución del 40% en la
expresión de PPARγ y una disminución del 30% en la expresión de PGC-1α (Figura 24).
Exp
resi
ónde
l mR
NA
(% r
espe
cto
el c
ontr
ol)
Ucp1
0
20
40
60
80
100
120
Con Tg
*
Pparg
Con Tg0
20
40
60
80
100
120
*
Ppargc1a
*
Con Tg0
20
40
60
80
100
120
Figura 24. Expresión de los genes claves en el gasto energético del tejido adiposo marrón. Se realizaron Northern blots a partir del RNA del BAT de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados con dieta alta en lípidos. Los Northern blots se hibridaron con sondas específicas para UCP-1, PPARγ, PGC-1α y 18S, tal y como se describe en los Materiales y Métodos. Las intensidades de las bandas obtenidas en las películas radiográficas se cuantificaron y se normalizaron por la cantidad de 18S. Los resultados se expresan como porcentaje respecto las cantidades de RNA de los animales controles en dieta alta en lípidos (100%). Los datos representan las medias ±SE de al menos ocho animales por grupo. *P≤0.05 vs controles en dieta alta en lípidos alimentados.
1.4.5.3. Análisis del nivel de proteínas en BAT.
La disminución en la expresión génica de UCP-1, PPARγ y PGC-1α se comprobó
mediante la detección de sus niveles proteicos en el tejido adiposo marrón de los animales
transgénicos en dieta alta en lípidos. Al igual que sucedía con los niveles de expresión de
UCP1, los animales transgénicos presentaban una reducción en los niveles de la proteína UCP1
respecto el tejido adiposo marrón de los controles (Figura 25). De igual modo, esta
disminución en los niveles proteicos de UCP1 estaba acompañada de una reducción tanto en
Parte I: Resultados
79
los niveles de PPARγ como de PGC-1α (Figura 25). Por tanto, la disminución en la expresión y
nivel de proteína de PPARγ y PGC-1α podrían ser las responsables de la reducción en los
niveles de expresión y proteína de UCP-1 en los ratones transgénicos alimentados con la dieta
diabetogénica. Ello sugería que la mayor acumulación de lípidos en el tejido adiposo marrón
de los animales transgénicos provocaba un defecto en la termogénesis inducida por la dieta
alta en lípidos. Este defecto en la termogénesis inducida por la dieta probablemente contribuía
al desarrollo de la resistencia a la insulina en los animales transgénicos.
Con Tg
UCP-1
PGC-1α
PPARγ
Figura 25. Análisis de los niveles de proteínas en tejido adiposo marrón. Western blots representativos del tejido adiposo marrón de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados con una dieta alta en lípidos. Los anticuerpos utilizados y los Western blots se realizaron tal y como se describe en Materiales y Métodos.
En resumen, cuando los ratones transgénicos obesos aP2-PEPCK eran alimentados
con una dieta alta en lípidos mostraban obesidad y resistencia a la insulina severas, a
diferencia de los transgénicos obesos en dieta estándar que eran sensibles a la hormona. Por
tanto, la dieta diabetogénica en presencia de la sobreexpresión de PEPCK en tejido adiposo
parecía saturar su capacidad de almacenar grasa. Ello probablemente dificultaba su papel
como tamponador del flujo de lípidos circulantes, induciendo el depósito de grasa en hígado y
tejido adiposo marrón, hipertrigliceridemia y resistencia a la insulina (Figura 26). Es más, la
acumulación de grasa en BAT reducía la termogénesis inducida por la dieta, contribuyendo a
la obesidad y resistencia a la insulina. En definitiva, los resultados de los animales
Parte I: Resultados
80
transgénicos aP2-PEPCK, tanto en dieta estándar como en dieta alta en lípidos, sugieren que
la regulación de la capacidad del tejido adiposo para almacenar lípidos es crucial para el
mantenimiento de la sensibilidad a la insulina.
Obesidad
Sensibilidad a la insulina
Dieta controlada
Obesidad
Resistencia ala insulina
TEJIDO ADIPOSO BLANCO
Contenido de grasadel tejido adiposo blanco
Ácidos grasoslibres séricos
Defecto capacidadtamponadora de lípidos
Contenido de grasadel WAT
Saturacióndepósito de grasa
Ácidos grasos libres,triglicéridos séricos
Depósito de lípidostejidos no adiposos
Dieta alta en lípidos
Reesterificación(sobreexpresión PEPCK)
Lipólisis y/o
UCP1
Contenido de grasa del BAT
termogénesis
Figura 26. Efectos de la saturación de la capacidad de almacenar grasa del tejido adiposo blanco en el mantenimiento de la sensibilidad a la insulina. Un incremento en la reesterificación de ácidos grasos, como el caso de los ratones transgénicos aP2-PEPCK, y/o una reducción en la capacidad lipolítica del tejido adiposo provoca un incremento en su depósito de grasa y una disminución en los niveles circulantes de ácidos grasos libres. Aunque ello induce obesidad, se mantiene la sensibilidad a la insulina. Al mantenimiento de la sensibilidad a la insulina o al desarrollo de resistencia, también contribuye la secreción de adipoquinas “estimuladoras de la sensibilidad a la insulina” como la adiponectina en nuestro caso, o “inductoras de la resistencia a la insulina”. En esta situación, la administración de una dieta alta en lípidos induce una obesidad severa con un masivo depósito de grasa en tejido adiposo, que le lleva a la pérdida de su capacidad tamponadora de lípidos circulantes. Esta pérdida aumenta los niveles circulantes de lípidos y el depósito de grasa en tejidos no adiposos, como hígado, páncreas y músculo. Tanto el incremento en los lípidos circulantes como el depósito ectópico de grasa contribuyen al desarrollo de resistencia a la insulina. Además, el balance adipoquinas “beneficiosas”/”nocivas” también contribuye en ello, como la ausencia del incremento en la adiponectina circulante observado en ratones aP2-PEPCK en dieta alta en lípidos respecto a los controles.
PARTE II:
EFECTO DEL INCREMENTO DE LA CAPTACIÓN DE
GLUCOSA POR EL TEJIDO ADIPOSO EN LA
PRODUCCIÓN DE GLICEROL-3-FOSFATO, OBESIDAD
Y RESISTENCIA A LA INSULINA
Parte II: Resultados
81
2.1. OBTENCIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESEN
GLUCOQUINASA EN TEJIDO ADIPOSO.
Un aumento en la fosforilación de la glucosa por el tejido adiposo podría incrementar
su producción de glicerol-3-fosfato y ello, a un aumento de la esterificación de ácidos grasos y
del depósito de grasa. Con este fin se obtuvo un ratón transgénico que expresaba el cDNA de
la glucoquinasa de rata específicamente en tejido adiposo. Para ello, se construyó un gen
quimérico donde el cDNA de la glucoquinasa (GK) estuviera bajo el control del promotor aP2.
2.1.1. Construcción del gen quimérico aP2-GK.
El gen quimérico aP2-GK se obtuvo mediante la fusión del promotor del gen aP2 con
el cDNA de la GK de rata, junto con la cola de poliA del virus simio 40 (SV40). Para la
obtención de este gen quimérico se utilizaron dos plásmidos. Un primer plásmido,
pSKII+/prom.aP2, contenía el promotor del gen aP2 (Ross et al., 1990) mientras que el
segundo plásmido, pPCK2.4-rGK-SV3', contenía la secuencia codificante de la GK de rata junto
con la cola de poliA del SV40 (Ferre et al., 1996). Ambos plásmidos se digirieron con las
enzimas de restricción NotI y XmaI. Tras la digestión enzimática del vector de expresión
pPCK2.4-rGK-SV3', se obtuvo un fragmento de 3.1 kb XmaI/NotI que contenía el cDNA de la
GK de rata y la cola de poliA del SV40. Posteriormente, este fragmento se ligó al plásmido
pSKII+/prom.aP2 que también había sido digerido por las enzimas de restricción NotI y XmaI.
De esta forma se obtuvo el vector de expresión pSKII+/prom.aP2-rGK-SV3', de 11.5 kb, que
contenía el gen quimérico aP2-GK (Figura 27).
Parte II: Resultados
82
Digestión conXmaI+Not I
Ligación T4 DNA ligasa
pSKII+/prom.aP2-rGK-SV3´11.5 kb
pSKII+/prom.aP2
prom. aP25.4 kb
Xma INot I
8.4 Kb
Digestión conXmaI+Not I
pPCK2.4-rGK-SV3´8.2 Kb
prom. Pck2.4 kb
Xma I Not I
3.1 kbrat cDNA GK SV40
prom. aP25.4 kb 3.1 kb
rat cDNA GK SV40
Figura 27. Construcción del plásmido pSKII+/aP2-rGK-SV3’. Un fragmento XmaI-NotI de 3.1 kb procedente del plásmido pPCK2.4-rGK-SV3´, que contenía la secuencia codificante completa del gen Gck de rata y la señal de poliadenilación del SV40, se introdujo en el plásmido pSKII+/prom.aP2 entre las dianas XmaI y NotI, detrás del promotor del gen aP2. A este plásmido se le denominó pSKII+/prom.aP2-rGK-SV3´.
Parte II: Resultados
83
2.1.2. Obtención y genotipado de los animales transgénicos aP2-GK.
El vector de expresión pSKII+/prom.aP2-rGK-SV3' se digirió con la enzima de
restricción Asp718, obteniéndose así el fragmento Asp718-Asp718 de 8.5 kb (gen quimérico
aP2-GK). Este fragmento contenía el promotor del gen aP2, seguido de la secuencia completa
del cDNA del gen Gck de rata y la señal de poliadenilación del virus SV40, cuya función es la
de dotar de mayor estabilidad al mRNA resultante (Figura 28). El gen quimérico se purificó por
electroelución y se microinyectó en ovocitos fecundados de la cepa B6SJLF1 de ratón.
Posteriormente, los ovocitos fecundados microinyectados se transfirieron a hembras
receptoras (CD-1).
sondaBamHI
EcoRI
Bgl I
EcoRI
Rat GK cDNA
+1-5.4kb 3.1kb
prom. aP2
-1.7kb 2.3kb
EcoRI EcoRI
PolyA SV40
Figura 28. Representación esquemática del gen quimérico aP2-GK. El plásmido pSKII+/prom.aP2-rGK-SV3 se digirió con la enzima de restricción Asp718 y el fragmento de 8.5 kb resultante de esta digestión, el cual contenía el gen quimérico aP2-GK en su totalidad, se microinyectó a ovocitos fecundados de ratón.
A las tres semanas del nacimiento, los animales se analizaron mediante análisis por
Southern blot para detectar la presencia del transgen aP2-GK. Tras hibridar con la sonda
marcada radiactivamente, se detectaron dos ratones machos transgénicos, a partir de los
cuales se establecerían dos líneas independientes de ratones transgénicos aP2-GK (Tg1 y
Parte II: Resultados
84
Tg2). En la realización de este trabajo se utilizaron animales transgénicos heterocigotos de la
segunda generación de descendientes (F2) de los animales fundadores.
Todos los animales se analizaron mediante análisis por Southern blot. Tras la
hibridación con la sonda específica, los animales transgénicos heterocigotos de ambas líneas
presentaban tres bandas específicas del transgen, cuyos tamaños eran de 3.7 kb, 2.3 kb y 1.7
kb respectivamente (Figura 29). Los ratones transgénicos heterocigotos de la línea 2 (Tg2)
presentaban un mayor número de copias del transgen respecto a los de la línea 1 (Tg1).
M C+ Con Tg1 Tg2
1.6 kb 1.7 kb2 kb
3.7 kb
Figura 29. Southern blot representativo de DNA genómico. Análisis por Southern blot del DNA genómico digerido con EcoRI de ratones controles (Con) y transgénicos heterocigotos de las líneas 1 (Tg1) y 2 (Tg2). La sonda específica para el transgen correspondía al fragmento BamHI-Bgl I de 3.5 kb que contenía las últimas 2 kb de la secuencia del promotor del gen aP2 y las primeras 1.5 kb de la secuencia del cDNA de la GK. (M) Marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder, (C+) Digestión del plásmido pSKII+/prom.aP2-rGK-SV3 con la enzima EcoRI (control positivo).
Parte II: Resultados
85
2.1.3. Análisis de la expresión del transgen aP2-GK.
La expresión del transgen aP2-GK se analizó mediante Northern blot en diferentes
tejidos de ambas líneas de transgénicos. Para ello, se extrajo el RNA total del tejido adiposo
blanco epididimal (WAT), tejido adiposo marrón interescapular (BAT) e hígado, tanto de
animales controles como transgénicos heterocigotos Tg1 y Tg2 (Figura 30). Tras hibridar los
Northern blot, se observó que tan sólo en el tejido adiposo (blanco y marrón) de ambos
ratones transgénicos se detectaba la presencia de un transcrito de 3.1 kb, correspondiente al
transgen (cDNA de la GK rata más la cola de poliadenilación del SV40). Por el contrario, el
tejido adiposo blanco y marrón de los ratones controles no mostraban la presencia de ningún
transcrito de la GK (Figura 30). Las dos líneas de ratones transgénicos presentaban diferentes
niveles de expresión del transgen, siendo los ratones transgénicos Tg2 los que mostraban una
mayor expresión, tanto en WAT como en BAT (Figura 30). Por tanto, además de presentar un
mayor número de copias integradas del transgen, los Tg2 presentaban una mayor expresión
de la GK en tejido adiposo. No se observaron cambios en los niveles del mRNA de la GK en
hígado (Figura 30).
Con Tg1 Tg2
WAT
BAT
Hígado
Figura 30. Expresión del transgen en WAT y BAT. Northerns blot representativos del tejido adiposo blanco (WAT), tejido adiposo marrón interescapular (BAT) e hígado de ratones alimentados controles (Con) y transgénicos heterocigotos (Tg1 y Tg2), hibridados con una sonda específica para la GK. Para los Northerns blot del WAT y BAT se analizaron 10 µg de RNA, mientras que se analizaron 20 µg de RNA para el del hígado.
Parte II: Resultados
86
2.1.4. Determinación de la presencia de glucoquinasa en tejido adiposo
blanco.
A continuación se realizó un análisis por Western blot para determinar la presencia de
la proteína GK en tejido adiposo blanco. Para ello, se extrajeron las proteínas totales del WAT
epididimal y del hígado, tanto de controles como de transgénicos Tg2. Para la detección de la
proteína, se utilizó un anticuerpo específico contra la proteína GK hepática murina. En el WAT
de los ratones transgénicos Tg2 se detectó la presencia de una proteína de 52 kDa de
tamaño, correspondiente a la GK hepática, ausente en el WAT de los animales controles
(Figura 31). Sin embargo, la cantidad de proteína GK producida por el WAT era sensiblemente
inferior a los niveles hepáticos de la proteína endógena. Además, los niveles de GK endógena
en el hígado de los ratones transgénicos no estaban alterados por la presencia de la GK en
WAT (Figura 31).
Con Tg2
Glucoquinasa(52 kDa)
Con Tg2
Hígado WAT
Figura 31. Expresión de la proteína GK en WAT e hígado. Western blot representativo del tejido adiposo blanco (WAT) e hígado de machos alimentados controles (Con) y transgénicos heterocigotos de la línea 2 (Tg2), utilizando un anticuerpo de oveja específico para la GK hepática murina. La proteína transgénica presenta el mismo tamaño que la GK hepática endógena (52 kDa).
Parte II: Resultados
87
2.2. ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LA EXPRESIÓN DE GK EN EL TEJIDO
ADIPOSO.
2.2.1. Utilización basal de glucosa in vivo por el tejido adiposo blanco y
músculo esquelético.
En animales alimentados, se determinó la captación y utilización de la glucosa in vivo
por el WAT epididimal y músculo esquelético, en condiciones basales. Se observó que los
ratones transgénicos presentaban un incremento significativo, de unas 3 veces, en la
captación y utilización basal de [2-3H]-deoxiglucosa por el WAT (Figura 32). Sin embargo, los
ratones transgénicos mostraban una captación y utilización basal de [2-3H]-deoxiglucosa por
el músculo esquelético similar a los controles, ya fuera el músculo cuadríceps o el
gastrocnemio (Figura 32). Estos resultados sugerían que la expresión de GK en tejido adiposo
blanco incrementaba su utilización basal de glucosa, sin alterar el metabolismo basal de la
glucosa por el músculo esquelético.
Util
izac
ión
gluc
osa
(% r
espe
cto
cont
rol)
A
TgCon0
100
200
300
400 WAT
*
BMúsculo esquelético
Cuadriceps Gastrocnemio
0
100
200
TgCon TgCon
Util
izac
ión
gluc
osa
(% r
espe
cto
cont
rol)
Figura 32. Índice de la utilización de la glucosa en tejido adiposo blanco y músculo esquelético. La captación de glucosa se determinó en WAT epididimal y músculo esquelético (gastrocnemio y cuadríceps), tal y como se describe en Materiales y Métodos. (A) Utilización basal de glucosa por el WAT. Los resultados se expresan como porcentaje de la utilización basal de glucosa por el WAT de animales controles (302.13 pmol x mg proteína-1 x min-1). (B) Utilización basal de la glucosa por el cuadríceps y gastrocnemio. Los resultados se expresan como porcentaje de la utilización basal de glucosa por el cuadríceps y gastrocnemio de animales controles (86.04 pmol x mg proteína-1 x min-1 y 117.31 pmol x mg proteína-1 x min-1, respectivamente). Todos los resultados representan la media ±SE de cuatro animales por grupo. * P< 0.05.
Parte II: Resultados
88
2.2.2. Análisis del peso corporal, peso del tejido adiposo epididimal y
contenido de grasa corporal.
En animales de cuatro meses de edad se determinó el peso corporal, el peso del
tejido adiposo blanco epididimal y el contenido de grasa corporal. En ninguno de estos
parámetros estudiados se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los
ratones transgénicos y controles (Figura 33). A pesar de la mayor capacidad de utilizar la
glucosa que presentaba el tejido adiposo de los animales transgénicos, no se alteraba ni la
cantidad de grasa acumulada ni el peso corporal en estos animales.
A
Peso
cor
pora
l (g)
0
10
20
30
40
TgCon
B
Peso
WA
T e
pidi
dim
al (m
g)
TgCon0
100
200
300
400
500
600
C
% g
rasa
cor
pora
l
TgCon0
2
4
6
Figura 33. Peso corporal, peso del tejido adiposo blanco epididimal (WAT) y porcentaje de grasa corporal. (A) Peso corporal de machos de cuatro meses de edad controles (Con) y transgénicos heterocigotos (Tg). (B) Peso del tejido adiposo epididimal (WAT) de machos controles y transgénicos. (C) Porcentaje de grasa corporal de controles y transgénicos. Los resultados se expresan como media ±SE de al menos ocho animales por grupo.
2.2.3. Estudio histológico del tejido adiposo blanco.
Los análisis histológicos del tejido adiposo blanco epididimal no mostraban
diferencias de tamaño entre los adipocitos blancos de los animales transgénicos y los de los
controles (Figura 34). Para profundizar en el estudio, se realizó un estudio morfométrico en
Parte II: Resultados
89
ambos grupos de animales. No sólo se determinó el tamaño de los adipocitos blancos sino la
distribución del tamaño de éstos en un histograma (Figura 34). No se observaron diferencias
en el tamaño medio de los adipocitos blancos epididimales entre animales transgénicos y
controles (940 ± 743 µm2 y 1024 ± 812 µm2, respectivamente). Como se muestra en el
histograma, los adipocitos blancos epididimales de un animal control se distribuyeron de forma
que el 80% presentaba un tamaño menor a 2000 µm2, siendo los más abundantes los
comprendidos entre 1000-2000 µm2 (el 30%). En los animales transgénicos se observó una
distribución de los tamaños de los adipocitos muy similar a los controles (Figura 34).
Con
Área superficie celular (µm2)
Con
% c
élul
as to
tale
s
10
20
30
<100 5001000
20003000
40005000
>5000
A
Tg
Tg
10
20
30
% c
élul
as to
tale
s
<100 5001000
20003000
40005000
>5000
Área superficie celular (µm2)
B
Figura 34. Análisis histológico y morfométrico del tejido adiposo blanco epididimal. Secciones representativas del WAT epididimal de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados teñidas con hematoxilina y eosina (x100). (A) Análisis morfométrico de los adipocitos blancos epididimales de animales controles. (B) Análisis morfométrico de los adipocitos blancos epididimales de animales transgénicos. Los adipocitos analizados se agruparon según su área (µm2). El histograma representa el porcentaje de los distintos grupos de adipocitos respecto al total analizado. Los resultados se obtuvieron a partir del análisis morfométrico de 3748 adipocitos controles y 5015 adipocitos transgénicos.
Parte II: Resultados
90
2.2.4. Determinación de la producción de glicerol-3-fosfato y síntesis de
novo de lípidos a partir de la glucosa.
Dado que el tejido adiposo blanco de los animales transgénicos presentaba una
mayor utilización de la glucosa, se estudió la síntesis de lípidos y la producción de glicerol-3-P
a partir de la glucosa en fragmentos de WAT epididimal de animales controles y transgénicos
aP2-GK. La conversión de D-[U-14C]-glucosa a lípidos en los animales transgénicos era similar
al de los animales controles (Figura 35). Además, tampoco se observó ningún cambio
significativo en la conversión de D-[U-14C]-glucosa a glicerol-3-P en los animales transgénicos
(Figura 35). A pesar del incremento en la utilización basal de glucosa por el tejido adiposo
blanco de los animales transgénicos aP2-GK, estos resultados indicaban que su síntesis de
novo de lípidos y la producción de glicerol-3-P a partir del azúcar no se modificaban en estos
animales.
Sínt
esis
de n
ovo
de
lipíd
os(c
pm/µ
g pr
ot/h
)
A
0
2
4
6
8
10
12
TgCon
B
Con
vers
ión
14C
-glu
cosa
en
glic
erol
(cpm
/µg
prot
/h)
0
2
4
6
8
10
12
TgCon Figura 35. Síntesis de novo de lípidos y producción de glicerol-3-P a partir de la glucosa. A partir de fragmentos de WAT epididimal de animales controles y transgénicos alimentados, se determinó la producción de lípidos (A) y de glicerol-3-P (B) a partir de D-[U-14C]-glucosa, tal y como se indica en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como cpm x µg proteína-1 x hora-1. Los datos se representan como la media ±SE de cuatro animales por grupo.
Parte II: Resultados
91
2.2.5. Análisis por resonancia magnética nuclear del destino de la glucosa
en WAT.
A continuación se utilizó la técnica de la resonancia magnética nuclear (RMN) para
estudiar el destino de la glucosa en el WAT de animales transgénicos. Para ello, se inyectó [1-
13C]-glucosa intraperitonealmente a ratones controles y transgénicos y se realizó la RMN de
13C a partir de los extractos perclóricos del WAT. Cualitativamente, se observó que el espectro
de 13C de los extractos acuosos del WAT epididimal de los animales transgénicos presentaba
una mayor intensidad en la posición 21 ppm, respecto el espectro de los animales controles.
Esta posición corresponde al Carbono 3 del lactato (C3 del lactato) (Figura 36). En ambos
grupos se determinó la relación entre las intensidades de los diferentes compuestos existentes
en WAT, especialmente [3-13C]-lactato y [1-13C]-glucosa, y se estandarizó por la cantidad de
WAT epididimal utilizada en ambos extractos. Tras la estandarización, se observó que el WAT
de animales transgénicos presentaba un incremento, de aproximadamente 2.2 veces, en la
producción de lactato a partir de la glucosa con respecto a los controles (0.0109 x gramo-1 en
transgénicos por 0.0049 x gramo-1 en controles). En la RMN no se observó un incremento en
la cantidad de glucosa captada por el WAT de los ratones transgénicos (0.668 x gramo-1 en
transgénicos respecto 0.805 x gramo-1 de controles), a pesar del mayor índice de utilización de
glucosa por el WAT observado anteriormente (Figura 32). Mientras que el análogo de la
glucosa [2-3H]-deoxiglucosa se acumula en los tejidos una vez fosforilado, la [1-13C]-glucosa
se metaboliza rápidamente, sin acumularse. Así, la ausencia del incremento en la cantidad de
[1-13C]-glucosa en WAT de animales transgénicos observada en la RMN podría significar que el
WAT de estos ratones metabolizaba rápidamente la glucosa que captaba, a pesar de que
captaran más. Ello sugería una mayor capacidad de fosforilación de la glucosa en los animales
transgénicos debida a la expresión de la glucoquinasa en este tejido.
Parte II: Resultados
92
ppm20406080100
Tg
Con
≈ ≈ ≈0.31 0.49 1
0.005
[3-13C]Lac
Diox
[1-13C]Glc
β α
≈ ≈ ≈0.25 0.41 1
0. 011
Diox
[1-13C]Glc
β α
[3-13C]Lac
ppm20406080100
ppm20406080100 20406080100
Tg
Con
≈ ≈ ≈0.31 0.49 1
0.005
[3-13C]Lac
Diox
[1-13C]Glc
β α
[1-13C]Glc
β α
≈ ≈ ≈0.25 0.41 1
0. 011
Diox
[1-13C]Glc
β α
[1-13C]Glc
β α
[3-13C]Lac
Figura 36. Resonancia magnética nuclear del tejido adiposo blanco epididimal. Tras la inyección intraperitoneal de [1-13 C]-glucosa, se realizó una RMN de 13C a partir de los extractos acuosos del WAT epididimal de animales controles (A) y transgénicos (B) alimentados. Cada uno de los espectros se obtuvo a partir de la mezcla de los extractos correspondientes a cinco animales por grupo, tal y como se describe en Materiales y Métodos. Las posiciones de las diferentes moléculas en el espectro son: C3 del lactato (21 ppm), dioxano (compuesto de referencia, 67.4 ppm), α [1-13 C]-glucosa (92 ppm) y β [1-13 C]-glucosa (96 ppm). Se remarca la posición del C3 del lactato en el espectro de los animales transgénicos. Los números indican la relación entre las intensidades de las distintas moléculas respecto al dioxano.
A partir de la RMN de 13C de una solución estándar se determinó la concentración de
lactato intracelular en el tejido adiposo blanco epididimal de ambos grupos de animales. El
tejido adiposo blanco epididimal de ratones transgénicos presentaba un incremento, de
aproximadamente dos veces respecto a los controles, en la producción de lactato a partir de la
glucosa captada (Tabla 3). Este aumento en la concentración intracelular de lactato en
animales transgénicos era similar al incremento en la utilización de glucosa por el tejido
adiposo observado anteriormente. Por tanto, estos resultados sugerían que el destino de la
mayor captación y utilización basal de glucosa por el tejido adiposo blanco de ratones
transgénicos era la síntesis de lactato, tal y como se muestra en el esquema (Figura 37)
Parte II: Resultados
93
Con
Tg
Glucosa(nmol/g)
444.81
368.80
Lactato(nmol/g)
2.59
5.75
Tabla 3. Concentración de lactato intracelular en tejido adiposo blanco epididimal. A partir de los espectros de RMN de 13C de extractos acuosos del tejido adiposo blanco de animales controles (Con) y transgénicos (Tg), se determinó la concentración de lactato intracelular mediante la utilización de un espectro de una solución estándar. Los resultados se expresaron como nanomoles x gramo de tejido-1. Los datos representan el valor total de cinco animales por grupo.
321
[3-13C] Lac
321123 [3-13C] Pyr+
12CO2
ciclo TCA
13CO2 + 3 12CO2
123456 [1-13C] Glc
Glucólisis
321
Figura 37. Esquema de las vías metabólicas y el destino de la [1-13C]-glucosa. A través de la glucólisis, el 13C de la [1-13C]-glucosa aparece como carbono en posición 3 de una de las moléculas de piruvato ([3-13C]-Pyr). Posteriormente, éste puede ser transformado en lactato, apareciendo el 13C en la posición 3 del lactato ([3-13C]-Lac) o bien entrar en el ciclo tricarboxílico (TCA), donde finalmente es liberado en forma de 13CO2 en alguna de las descarboxilaciones del ciclo. Según los resultados obtenidos en la RMN del WAT de animales controles y transgénicos, los ratones transgénicos presentaban un incremento, de aproximadamente dos veces, en la glucólisis anaerobia (formación de lactato).
Parte II: Resultados
94
2.2.6. Consumo de glucosa y producción de lactato in vitro por el tejido
adiposo blanco epididimal.
Para confirmar los resultados de la RMN se determinó la producción de lactato in
vitro a partir de glucosa por el tejido adiposo blanco epididimal, incubándolo en un medio con
dos concentraciones diferentes de glucosa, 2 mM y 20 mM. La concentración de glucosa 2 mM
se utilizó como concentración basal de glucosa, ya que a esta concentración tan sólo son
activas las hexoquinasas I y II. Sin embargo, a una concentración de 20 mM de glucosa, la
hexoquinasa más activa es la glucoquinasa. En ambas concentraciones se observó una
disminución de los niveles de glucosa del medio en animales controles y transgénicos. Cuando
la concentración de glucosa del medio era de 2 mM de glucosa, no se observaron diferencias
entre los animales transgénicos y controles, tanto en el consumo de glucosa como en la
producción de lactato liberado al medio (resultados no mostrados). Por el contrario, con una
concentración de 20 mM y transcurridos 30 minutos de incubación, se observó un incremento
significativo de casi dos veces en el consumo de glucosa del medio por el tejido adiposo
blanco de los animales transgénicos (Figura 38A). Además, la liberación de lactato al medio
por el tejido adiposo era significativamente mayor en los animales transgénicos, tanto en el
minuto 30 de incubación como en el 90. Así, la producción de lactato por el tejido adiposo
estaba incrementada significativamente unas tres veces en los animales transgénicos a los 30
minutos de incubación (Figura 38B). Este incremento se mantenía a los 90 minutos de
incubación (Figura 38B.
Parte II: Resultados
95
Estos resultados in vitro sugerían que el tejido adiposo blanco aislado de los animales
transgénicos aP2-GK producía y liberaba más lactato al medio a partir de un mayor consumo
de glucosa. Además, este incremento en la producción de lactato tan sólo ocurría a
concentraciones elevadas de glucosa en el medio, condiciones en las que se produce la
activación de la glucoquinasa (Km>8 mM).
% g
luco
sa d
el m
edio
A
80
90
100
90 min
TgCon
30 min
Con Tg
*
0 min
TgCon
B
Prod
ucci
ón d
e la
ctat
o (n
mol
/mg)
0
1
2
3
4
Con
30 min
Tg
*
Con
90 min
Tg
*
Con
0 min
Tg
Figura 38. Consumo de glucosa y producción de lactato in vitro por el tejido adiposo blanco epididimal. La incubación del tejido adiposo blanco de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) se realizó tal y como se indica en Materiales y Métodos. Se determinó el consumo de glucosa (A) y la liberación de lactato al medio (B) por el tejido adiposo blanco a los 30 y 90 minutos de incubación, cuando el tejido adiposo blanco era incubado a 20 mM de glucosa. El consumo de glucosa del medio se expresa como porcentaje de la concentración inicial de glucosa y la liberación de lactato al medio como nanomoles de lactato x mg WAT-1. Ambos resultados se representan como la media ±SE de al menos cinco animales por grupo. *P< 0.05.
Parte II: Resultados
96
2.3. ESTUDIO DE LOS EFECTOS SISTÉMICOS DE LA EXPRESIÓN DE GK EN EL
TEJIDO ADIPOSO.
2.3.1. Determinación de los niveles circulantes de lactato.
Dada la mayor producción de lactato por el tejido adiposo blanco de los ratones
transgénicos observada in vitro, se determinaron los niveles circulantes de lactato en animales
controles y transgénicos, tanto en condiciones de alimentación como en ayunas (Figura 39).
Se observó un incremento significativo, alrededor del 50%, en la concentración de lactato
circulante en condiciones de alimentación en los animales transgénicos respecto a los
controles (Figura 39). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en los niveles
circulantes de lactato en ayunas, aunque se observó una tendencia a estar incrementada en
los ratones transgénicos (Figura 39).
Lac
tato
plas
mát
ico
(mM
)
0
2
4
6
8
10
12
TgCon TgCon
Alimentación Ayunados
*
Figura 39. Determinación de los niveles circulantes de lactato. A partir de la vena de la cola de ratones controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados y ayunados, se recogió sangre y se determinaron los niveles plasmáticos de lactato tal y como se describe en los Materiales y Métodos. Los datos representan la media ±SE de al menos seis animales por grupo. *P<0.05.
Parte II: Resultados
97
2.3.2. Test de tolerancia a la glucosa.
Se realizó un test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa para valorar si un
incremento en la utilización basal de glucosa por el tejido adiposo blanco en los animales
transgénicos podría incrementar su tolerancia al azúcar. Tras la inyección intraperitoneal de 1
gramo de glucosa por kg de peso, los ratones transgénicos mantenían siempre su glucemia
por debajo de la alcanzada por los controles (Figura 40A). Incluso si se administraban 2
gramos de glucosa por kg de peso, los animales transgénicos mantenían una eliminación más
rápida de la glucosa respecto a los controles (Figura 40B). Ello indicaba que los animales
transgénicos aP2-GK presentaban una mayor tolerancia a la glucosa, probablemente debido al
incremento en la utilización del azúcar por el tejido adiposo blanco como consecuencia de su
expresión de glucoquinasa.
A
Glu
cem
ia(m
g/dl
)
Tiempo (min)
100
200
300
400
500
0 30 60 90 120 150
**
** ** *
B
Tiempo (min)0 30 60 90 120 150
Glu
cem
ia(m
g/dl
)
ConTg
100
200
300
400
500
*
*** *
Figura 40. Test intraperitoneal de tolerancia a la glucosa. El test de tolerancia a la glucosa se realizó en ratones controles y transgénicos, tal y como se describe en los Materiales y Métodos. Se inyectó intraperitonealmente 1 gramo de glucosa por kg de peso (A) o 2 gramos de glucosa por kg de peso (B) y se determinó la glucemia en los animales a los tiempos indicados. Los resultados se presentan como medias ±SE de al menos ocho animales por grupo. *P<0.05, **P<0.01.
Parte II: Resultados
98
2.3.3. Test de tolerancia a la insulina.
También se estudió la sensibilidad a la insulina en los animales transgénicos aP2-GK.
Para ello, se inyectó intraperitonealmente una dosis de insulina (0.75 U/kg) a animales
alimentados despiertos (Figura 41A). Se observó que la glucemia inicial de animales controles
y transgénicos alimentados era similar (Figura 41A). En los controles, la inyección de la
hormona provocaba una rápida disminución de la glucemia inicial. A los 30 minutos, ésta
alcanzaba unos niveles de aproximadamente el 40 % de la inicial, y aún se mantenía por
debajo a los 60 minutos (Figura 41A). En los transgénicos, la respuesta a la insulina era
similar a los controles (Figura 41A). Para determinar si los animales transgénicos eran más
sensibles a la hormona, se les inyectó una dosis de 0.375 U insulina/kg. Esta dosis provocaba
una reducción de la glucemia inicial, similar a la dosis anterior, pero una rápida recuperación
de los niveles basales en los controles (Figura 41B). Aunque los animales transgénicos
mostraron una reducción de la glucemia similar, su recuperación era más lenta (Figura 41B).
Ello sugería que los animales transgénicos mostraban un incremento en la sensibilidad a la
insulina, probablemente debido a una mayor utilización basal de la glucosa por el WAT.
ConTg
A
Glu
cem
iain
icia
l(%
)
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
Tiempo (min)
B
0 15 30 45 60
Tiempo (min)
Glu
cem
iain
icia
l(%
)
20
40
60
80
100
***
*
Figura 41. Test intraperitoneal de tolerancia a la insulina. El test de tolerancia a la insulina se realizó en animales controles y transgénicos, tal y como se describe en Materiales y Métodos. Se inyectó intraperitonealmente 0.75 U de insulina por kg (A) o 0.375 U de insulina por kg de peso (B) y se determinó la glucemia en los animales a los tiempos indicados. Los resultados se presentan como porcentaje respecto la glucemia a tiempo 0 para cada animal y se presentan como medias ±SE de al menos ocho animales por grupo. *P<0.05, **P<0.01.
Parte II: Resultados
99
2.3.4. Análisis de los metabolitos sanguíneos.
También se determinó la concentración de diferentes metabolitos sanguíneos en
animales controles y transgénicos, tanto en condiciones de alimentación como en ayunas
(Tabla 4). A pesar del incremento en la utilización basal de glucosa por el tejido adiposo
blanco de los animales transgénicos, no se observaron diferencias en la glucemia respecto a
los animales controles, tanto en condiciones de alimentación como en ayunas (Tabla 4).
Además, los animales transgénicos mostraban unos niveles séricos de triglicéridos y de ácidos
grasos libres (FFAs) similares a los de un animal control en ambas condiciones (Tabla 4).
Tampoco se observaron diferencias significativas entre ambos grupos en la concentración
sérica de cuerpos cetónicos, determinada como niveles circulantes de D-3-hidroxibutirato
(Tabla 4).
AlimentadosConTg
AyunadosConTg
Glucosa(mg/dl)
134 ± 9128 ± 5
73 ± 569 ± 3
FFAs(mM)
0.9 ± 0.151.1 ± 0.08
1.9 ± 0.151.8 ± 0.14
D-3-H(mM)
1.04 ± 0.170.79 ± 0.11
n.d.n.d.
TG (mg/dl)
136 ± 25113 ± 31
95 ± 894 ± 10
Tabla 4. Determinación de los niveles circulantes de diferentes metabolitos. A partir de la vena de la cola de ratones controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados y ayunados, se recogió sangre y se determinaron los niveles de metabolitos circulantes, tal y como se describe en los Materiales y Métodos. Los datos representan la media ±SE de al menos seis animales por grupo. TG: Triglicéridos; FFAs: ácidos grasos libres; D-3-H: D-3-hidroxibutirato.
Parte II: Resultados
100
2.3.5. Determinación de los niveles circulantes de hormonas.
A continuación se determinaron los niveles circulantes de insulina y de dos
adipoquinas, la leptina y la adiponectina. Los animales transgénicos aP2-GK presentaban una
insulinemia similar a la de los controles, tanto en ayunas como en alimentación (Tabla 5).
Además, los animales transgénicos aP2-GK no mostraron cambios en los niveles séricos de
leptina y adiponectina respecto a los niveles de los animales controles alimentados. Estos
resultados sugerían que la expresión de la glucoquinasa en el tejido adiposo blanco no
alteraba su secreción de estas adipoquinas. Ello estaría de acuerdo con el hecho de que los
ratones transgénicos no desarrollaron obesidad.
AlimentadosConTg
AyunadosConTg
Insulina(ng/ml)
0.73 ± 0.040.74 ± 0.14
0.24 ± 0.040.15 ± 0.05
Leptina (ng/ml)
4.6 ± 1.175.3 ± 1.76
n.d.n.d.
Adiponectina (µg/ml)
5.24 ± 0.435.81 ± 0.65
n.d.n.d.
Tabla 5. Determinación de los niveles circulantes de hormonas. Se determinó la insulina y las adipoquinas leptina y adiponectina, en animales controles (Con) y transgénicos (Tg), tal y como se describe en los Materiales y Métodos. Los resultados representan la media ±SE de al menos ocho animales por grupo.
Parte II: Resultados
101
2.4. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EL TEJIDO ADIPOSO BLANCO
DE ANIMALES TRANSGÉNICOS.
Con el fin de determinar los posibles mecanismos moleculares que pudieran estar
alterados por la expresión de glucoquinasa en tejido adiposo blanco, se realizaron análisis de
la expresión génica en este tejido mediante real-time PCR semicuantitativa. Para ello, se
cuantificaron los niveles de expresión de diferentes genes involucrados en tres rutas
metabólicas importantes para el tejido adiposo: el metabolismo de la glucosa, el metabolismo
lipídico y el metabolismo mitocondrial.
2.4.1. Cambios en la expresión de genes involucrados en el metabolismo de
la glucosa.
Se determinaron los niveles de expresión de diferentes enzimas que regulan la
metabolización de la glucosa a través de la glucólisis. El transportador GLUT4 es determinante
en la captación de glucosa tanto por el tejido adiposo como por el músculo esquelético. No se
observaron diferencias en la expresión del gen Slc2a4 (GLUT4) entre el tejido adiposo blanco
de animales transgénicos y controles (Figura 42). Aunque los animales transgénicos
expresaban otra hexoquinasa en tejido adiposo (glucoquinasa), no se alteró la expresión de la
hexoquinasa 2 inducible por la insulina (gen Hk2) (Figura 42). La enzima fosfofructoquinasa
(PFK) es una de las importantes reguladoras de la glucólisis. Tampoco se observaron
diferencias en los niveles de expresión del gen Pfkm entre el tejido adiposo de ambos
animales (Figura 42). Uno de los principales metabolitos intermediarios de la glucólisis es el
piruvato, el cual puede proseguir su metabolización a través del ciclo de Krebs o a través de la
glucólisis anaeróbica, según la disponibilidad de oxígeno entre otras situaciones. La síntesis de
piruvato y su entrada al ciclo de Krebs en forma de acetil-CoA están reguladas por dos
enzimas glucolíticas, la piruvato quinasa (PK) y la piruvato deshidrogenasa (PDH),
Parte II: Resultados
102
respectivamente. Los niveles de expresión de los genes Pklr, gen que codifica la isoforma
hepática y eritrocitaria de la PK, y el gen Pdha1, gen codificante de la subunidad α de la PDH,
eran similares en ambos genotipos (Figura 42). Ello estaba de acuerdo con el hecho de que la
glucosa se metabolizaba hasta lactato en estos animales transgénicos. La enzima lactato
deshidrogenasa (LDH) es la principal reguladora de la vía glucolítica anaeróbica, siendo la
responsable de la formación de lactato a partir del piruvato (Figura 42). El tejido adiposo
blanco de los animales transgénicos mostraba un ligero incremento en la expresión del gen
Ldh1, codificante de la cadena A de la LDH (Figura 42). Estos resultados sugerían que el
metabolismo de la glucosa en el tejido adiposo blanco de los animales transgénicos parecía
dirigir la glucosa hacia la producción de lactato, confirmando los resultados anteriormente
observados tanto in vitro como in vivo.
Niv
eles
mR
NA
rela
tivos
Metabolismo glucosa
Slc2a4 Pfkm Hk2
1.0 1.0 1.00.9 1.0 1.40
1
2
0
1
2
0
1
2
Pklr Pdha1 Ldh1
1.0 1.0 1.01.0 1.2 1.50
1
2
0
1
2
0
1
2
Figura 42. Análisis de la expresión de genes involucrados en el metabolismo de la glucosa en el tejido adiposo blanco. A partir del cDNA del tejido adiposo blanco epididimal de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados, se cuantificó la expresión génica mediante real-time PCR semicuantitativa utilizando la tecnología SmartCycler®. Los cálculos se realizaron tal y como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como niveles de expresión relativos a los niveles de expresión génica de los controles. Los resultados representan la media ±SE de tres animales por grupo.
Parte II: Resultados
103
2.4.2. Cambios en la expresión de genes involucrados en el metabolismo de
los lípidos.
Para ello, se determinaron los niveles de expresión de diferentes enzimas claves en la
síntesis de ácidos grasos, como la acetil-CoA carboxilasa (ACC) y la ácido graso sintasa (FAS).
Los niveles de expresión de los genes Acaca (ACC) y Fasn (FAS) se duplicaron en el tejido
adiposo blanco de los animales transgénicos respecto a los controles (Figura 43). Los factores
de transcripción PPARγ y SREBP-1c regulan positivamente tanto la diferenciación del adipocito
como su acúmulo de grasa, a través del incremento en la expresión de las enzimas lipogénicas
ACC y FAS. En el tejido adiposo blanco de los ratones transgénicos se observó un incremento
en la expresión de los genes Pparg (PPARγ) y Srebf1 (SREBP-1c) (Figura 43). Además, este
incremento en la expresión de PPARγ y SREBP-1c era similar al detectado en las enzimas ACC
y FAS, aunque tan sólo era estadísticamente significativo en la expresión del gen Srebf1
(Figura 43). Para la síntesis de lípidos, el adipocito necesita captar e internalizar ácidos grasos
libres para posteriormente esterificarlos a triglicéridos. Una de las proteínas de membrana que
actúa como transportador de ácidos grasos hacia el interior del adipocito es la codificada por
el gen Cd36. Aunque el gen Cd36 también es un gen diana para el factor de transcripción
PPARγ, se observó una disminución significativa del 30% en su nivel de expresión en el tejido
adiposo blanco de los ratones transgénicos (Figura 43). La degradación de los lípidos
almacenados en el interior de los adipocitos está regulada por la actividad de las lipasas,
especialmente la lipasa sensible a hormonas (HSL). La expresión del gen Lipe (HSL) en el
tejido adiposo blanco de los animales transgénicos parecía estar incrementada (Figura 43).
Estos resultados sugerían un incremento en la síntesis de ácidos grasos y en la
adipogénesis en el tejido adiposo blanco de los animales transgénicos. Sin embargo, los
ratones transgénicos no mostraban un incremento en el acúmulo de grasa ni un incremento
en la síntesis de ácidos grasos a partir de la glucosa. Ello podría sugerir la existencia de
mecanismos compensatorios en el tejido adiposo blanco de los ratones transgénicos. Tanto la
Parte II: Resultados
104
reducción significativa en la expresión del transportador de ácidos grasos CD36 como la
tendencia a incrementar la lipólisis podrían formar parte de este mecanismo compensatorio.
Metabolismo lípidosN
ivel
es m
RN
Are
lativ
os
Acaca Fasn Pparg
0
1
2
1.0 1.0 1.11.7 2.0 2.00
1
2
0
1
2**
Srebf1 CD36 Lipe
1.1 1.02.0 1.70
1
2
0
1
2*
1.0 0.70
1
2
*
Figura 43. Análisis de la expresión de genes involucrados en el metabolismo de los lípidos en el tejido adiposo blanco. A partir del cDNA del tejido adiposo blanco epididimal de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados, se cuantificó la expresión génica mediante real-time PCR semicuantitativa utilizando la tecnología SmartCycler®. Los cálculos se realizaron tal y como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como niveles de expresión relativos a los niveles de expresión génica de los controles. Los resultados representan la media ±SE de tres animales por grupo. *P<0.05.
2.4.3. Cambios en la expresión de genes involucrados en el metabolismo
mitocondrial.
Para profundizar en el estudio de la producción y consumo energético de las
mitocondrias del tejido adiposo blanco de los animales transgénicos, se determinaron los
niveles de expresión de genes involucrados en estos procesos mitocondriales. La expresión de
proteínas involucradas en la β-oxidación de los lípidos en el interior de las mitocondrias está
regulada por el factor de transcripción PPARα. Entre éstas, el transportador de la membrana
interna mitocondrial CPT1 es el encargado de regular la entrada de lípidos al interior de la
Parte II: Resultados
105
matriz mitocondrial. No se observaron cambios ni en los niveles de expresión del gen Ppara
(PPARα) ni en los del gen Cpt1a, que codifica la isoforma hepática de la CPT1, en el tejido
adiposo blanco de los animales transgénicos (Figura 44). Las proteínas que conforman la
cadena de la fosforilación oxidativa, como la proteína COX IV, son responsables de regular la
producción de ATP, mientras que las proteínas desacopladoras, como UCP2 y UCP3, regulan la
eficacia de esta producción en el tejido adiposo blanco. En el tejido adiposo blanco de los
animales transgénicos se observó un incremento significativo, de aproximadamente dos veces,
en la expresión del gen Cox4i2 (COX IV) (Figura 44). También se observó un incremento en la
expresión del gen Ucp2 en los animales transgénicos (Figura 44). Sin embargo, los niveles de
expresión del gen Ucp3 eran similares en ambos grupos (Figura 44). El coactivador de los
PPARs, PGC-1α, además de modular la actividad de éstos, está involucrado en la transcripción
de genes importantes para la biogénesis y la funcionalidad mitocondrial. Los animales
transgénicos mostraban niveles similares de expresión del gen Ppargc1a (PGC-1α) respecto a
los controles (Figura 44).
Estos resultados sugerían un incremento en la cadena respiratoria en el tejido
adiposo blanco de los animales transgénicos, junto con una disminución en su eficacia.
Además, estas alteraciones no eran debidas a cambios en la expresión génica de los factores
de transcripción involucrados en la funcionalidad mitocondrial ni en un incremento en la β-
oxidación de ácidos grasos. Por tanto, el incremento en la metabolización anaeróbica de la
glucosa podría ser la responsable de las alteraciones en la funcionalidad mitocondrial,
probablemente al reducir la utilización aeróbica del piruvato procedente de la glucólisis.
Parte II: Resultados
106
Metabolismo mitocondrial
Niv
eles
mR
NA
rela
tivos
Cpt1a Ppara Ppargc1a
1.0 0.8 1.0 1.0 1.0 1.40
1
2
0
1
2
0
1
2
Ucp2 Ucp3 Cox4i2
1.1 2.1 1.0 0.7 1.0 2.1
*
0
1
2
0
1
2
0
1
2
Figura 44. Análisis de la expresión de genes involucrados en el metabolismo mitocondrial en el tejido adiposo blanco. A partir del cDNA del tejido adiposo blanco epididimal de animales controles (Con) y transgénicos (Tg) alimentados, se cuantificó la expresión génica mediante real-time PCR semicuantitativa utilizando la tecnología SmartCycler®. Los cálculos se realizaron tal y como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como niveles de expresión relativos a los niveles de expresión génica de los controles. Los resultados representan la media ±SE de tres animales por grupo. *P<0.05.
2.5. ESTUDIO DEL METABOLISMO HEPÁTICO EN LOS ANIMALES
TRANSGÉNICOS aP2-GK.
Dado el incremento en los niveles circulantes de lactato observado en los animales
transgénicos alimentados, se determinaron varios metabolitos hepáticos tanto en alimentación
como en ayunas (Tabla 6). No se observó ningún cambio en la cantidad de glucógeno ni en la
concentración de lactato en el hígado de los ratones transgénicos alimentados respecto a los
controles (Tabla 6). Los animales transgénicos también presentaban niveles hepáticos de
glucosa-6-fosfato similares a los de un animal control alimentado (Tabla 6). Sin embargo, los
ratones transgénicos alimentados mostraban un incremento del 40% en la cantidad de
triglicéridos hepáticos respecto a los controles, aunque inferiores a los niveles de un animal
ayunado (Tabla 6). En ayunas tampoco se observaron cambios en el depósito de triglicéridos
Parte II: Resultados
107
ni ninguna alteración en los niveles hepáticos de glucosa-6-fosfato y lactato entre animales
transgénicos y controles (Tabla 6). No obstante, los animales transgénicos ayunados
presentaban un incremento significativo en el acúmulo de glucógeno hepático, aunque sus
niveles seguían siendo comparativamente muy inferiores a los de animales alimentados (Tabla
6).
AlimentadosCon
TgAyunados
ConTg
Glucógeno(mg glucosa/g)
24.61 ± 4.5520.27 ± 2.16
0.22 ± 0.120.81 ± 0.13**
Lactato(µmol/g)
1.13 ± 0.241.06 ± 0.07
1.37 ± 0.371.86 ± 0.30
TG(mg/g)
4.5 ± 0.76.3 ± 0.4*
24.1 ± 4.119.0 ± 2.5
Glucosa-6P (µmol/g)
1.30 ± 0.201.13 ± 0.14
0.30 ± 0.080.20 ± 0.04
Tabla 6. Metabolismo hepático en animales controles (Con) y transgénicos (Tg). Los diferentes parámetros hepáticos se determinaron tal y como se indica en los Materiales y Métodos. Todos los resultados se expresan como cantidad por gramo de hígado. Los resultados representan la media ±SE de al menos cinco animales por grupo. TG: Triglicéridos.*P<0.05, **P<0.01.
Los resultados indicaban que la expresión de GK en tejido adiposo incrementaba su
utilización basal de glucosa, mejorando la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina
en los animales transgénicos. Sin embargo, este incremento en la utilización de glucosa no
llevaba a un aumento en la producción de glicerol-3-fosfato ni a un mayor depósito de grasa.
En cambio, el tejido adiposo blanco de los ratones transgénicos mostraba un incremento en la
producción de lactato, lo cual incrementaba sus niveles circulantes. El aumento del lactato
circulante durante la alimentación probablemente era captado por el hígado y utilizado en la
síntesis de triglicéridos, aunque no desarrollaban esteatosis hepática.
V. DISCUSIÓN.
Discusión
108
La primera parte de este estudio demuestra que la sobreexpresión constitutiva de
PEPCK en tejido adiposo incrementa la gliceroneogénesis, la reesterificación de ácidos grasos
libres y el depósito de lípidos en tejido adiposo blanco y marrón. Estos resultados concuerdan
con trabajos previos que sugieren que PEPCK es clave en la obtención de glicerol-3-P por el
adipocito durante el ayuno, la cual permite mantener la síntesis de triglicéridos a través de la
reesterificación de ácidos grasos libres (Hanson and Reshef, 1997;Reshef et al., 1970). De
hecho, la ausencia de PEPCK específicamente en tejido adiposo a través de mutaciones de su
promotor, en la región responsable de la expresión específica de tejido, lleva a lipodistrofia y
resistencia a la insulina en ratones (Devine et al., 1999;Olswang et al., 2002). Es más, se han
descrito mutaciones puntuales en esta región asociadas a la severidad de la hiperglucemia en
humanos obesos y diabéticos de tipo 2 (Duplus et al., 2003). Sin embargo, aún se desconoce
el papel de un incremento en la actividad PEPCK en tejido adiposo en la obesidad humana.
En el estudio de la obesidad, se han generado numerosos modelos murinos obesos
que presentan alteraciones primarias a nivel del tejido adiposo. Al igual que los animales aP2-
PEPCK, la sobreexpresión de GLUT4 en adipocitos de ratones transgénicos provoca un
incremento de glicérido-glicerol y de la síntesis de triglicéridos (Shepherd et al., 1993b;Tozzo
et al., 1995). Estos ratones también son obesos debido a una mayor captación de glucosa por
el tejido adiposo asociada a la sobreexpresión de GLUT4, aunque sus adipocitos presentan
hiperplasia y no hipertrofia (Shepherd et al., 1993b). Esta ausencia de hipertrofia podría ser
debida a la compensación entre el aumento en la lipogénesis y el incremento en la lipólisis,
favorecida por los menores niveles de insulina sanguínea (Tontonoz et al., 1995). Sin
embargo, el incremento en el depósito de grasa en los animales transgénicos aP2-PEPCK esta
asociado a hipertrofia de los adipocitos blancos. De acuerdo con estos resultados, la activación
del PPARγ en tejido adiposo a través de las tiazolidinedionas aumenta la transcripción de los
genes GLUT4 y PEPCK e incrementa el acúmulo de grasa, tanto por hipertrofia como
hiperplasia del adipocito (Desvergne and Wahli, 1999;Tontonoz et al., 1995;Wu et al., 1998).
Discusión
109
No obstante, la mayor parte de las formas de obesidad se caracterizan por hipertrofia de los
adipocitos, aunque formas más severas también muestran hiperplasia de células adiposas
(Hirsch and Batchelor, 1976).
Otros modelos murinos de obesidad hipertrófica, como los ratones ob/ob (Chen and
Garg, 1999), los ratones “yellow agouti” (Yen et al., 1994) o los ratones deficientes para el
receptor de la serotonina (Nonogaki et al., 1998), son el resultado de alteraciones en la
ingestión de energía o en el gasto energético. Además de ser obesos, estos animales
presentan resistencia a la insulina. En cambio, los ratones transgénicos obesos aP2-PEPCK no
presentan resistencia a la insulina y muestran una ingesta y unos niveles circulantes de leptina
similares a los animales controles. La obesidad está generalmente asociada a la resistencia a
la insulina, favoreciendo el desarrollo de diabetes de tipo 2. Se han propuesto varios
mecanismos que pueden relacionar el incremento de la masa adiposa con la resistencia a la
insulina (Kahn and Flier, 2000). En humanos, existe una correlación positiva entre la cantidad
de grasa visceral y el grado de resistencia a la insulina (Jensen, 1997a). Así, el incremento en
la lipólisis de este depósito de grasa, y el resultante aumento en los FFAs circulantes
característico de la obesidad, pueden ser los responsables del desarrollo de la resistencia a la
insulina (Jensen, 1997b). De hecho, se ha descrito que el nivel excesivo de ácidos grasos
circulantes induce efectos tóxicos en diferentes tejidos (Unger, 1995). Éstos incluyen la
reducción en la captación de insulina por el hígado (Hennes et al., 1990), hipersecreción de
insulina por las células β (McGarry and Dobbins, 1999), aumento de la gluconeogénesis
hepática e inhibición de la captación de glucosa estimulada por insulina en músculo
esquelético (Boden et al., 1994;Saloranta et al., 1991). Todo ello contribuye a la
hiperinsulinemia e hiperglucemia características de la resistencia a la insulina y diabetes de
tipo 2. Los ratones aP2-PEPCK son obesos pero normoglucémicos, normoinsulinémicos y no
muestran alteraciones en la tolerancia a la glucosa ni en la sensibilidad a la insulina. Además,
la captación de glucosa por parte del músculo esquelético, tanto basal como estimulada por
insulina, están inalteradas indicando que este tejido sigue siendo sensible a la insulina. Ello
Discusión
110
probablemente es debido a que la sobreexpresión de PEPCK disminuye los niveles circulantes
de FFAs al incrementar su reesterificación por el tejido adiposo. De hecho, se ha propuesto
que la reesterificación de ácidos grasos libres puede actuar como un mecanismo de feedback
negativo que regula la salida de FFAs del tejido adiposo, especialmente en condiciones
lipolíticas (Forest et al., 2003;Reshef et al., 2003). Así, la sobreexpresión de PEPCK en tejido
adiposo proporciona un buen modelo animal para estudiar el papel de la reesterificación de
ácidos grasos en la obesidad. Además, este modelo sugiere que la ausencia de un incremento
en los niveles sanguíneos de FFAs durante la obesidad puede proteger de la resistencia a la
insulina. En este sentido, los ratones deficientes en TNF-α (TNF-α-/-) desarrollan obesidad tras
una dieta alta en lípidos, pero no sólo no presentan hiperinsulinemia sino que son más
sensibles a la insulina que los animales obesos controles (Uysal et al., 1997). Los menores
niveles de FFAs circulantes que presentan los animales TNF-α-/- pueden explicar la ausencia de
resistencia a la insulina inducida por una dieta alta en lípidos (Uysal et al., 1997). Pero no sólo
los casos de obesidad se relacionan con niveles elevados de lípidos circulantes y resistencia a
la insulina, ya que también se observan en las deficiencias de tejido adiposo o lipodistrofias
(Seip and Trygstad, 1996). Los ratones lipodistróficos A-ZIP/F-1 desarrollan una resistencia a
la insulina severa y un incremento en los niveles circulantes de FFAs y un mayor depósito de
lípidos en hígado (Moitra et al., 1998). El transplante de grasa a este modelo restablece la
sensibilidad a la insulina, probablemente al recuperar tanto la capacidad del tejido adiposo de
almacenar lípidos como su secreción de adipoquinas (Gavrilova et al., 2000).
La secreción de adipoquinas por el adipocito influye tanto en el metabolismo glucídico
y lipídico como en la sensibilidad a la insulina, relacionando también obesidad con diabetes de
tipo 2 (Dandona et al., 2004;Fasshauer and Paschke, 2003). Así, la sensibilidad a la insulina
en ratas y ratones controles puede ser mejorada por un tratamiento con leptina (Fruhbeck
and Salvador, 2000). Además de regular la ingesta, la leptina actúa como una hormona que
previene el depósito de lípidos en células no adiposas, incrementando la oxidación de ácidos
grasos y disminuyendo la lipogénesis (Unger, 2003). La leptina también ha sido descrita como
Discusión
111
un sensor para el almacenamiento de triglicéridos en el tejido adiposo (Fruhbeck and
Salvador, 2000). Así, los modelos murinos de obesidad generalmente presentan
hiperleptinemia (Fruhbeck and Salvador, 2000), aunque el desarrollo de resistencia a la acción
de la hormona puede impedir sus efectos protectores frente a la lipotoxicidad (Unger, 2003).
La ausencia de hiperleptinemia en los animales obesos aP2-PEPCK concuerda con los
resultados que demuestran una estimulación de la secreción de leptina por un incremento de
FFAs circulantes (Fabris et al., 2001). TNF-α es una adipoquina que interfiere la señalización
de la insulina, pudiendo jugar un papel importante en el desarrollo de resistencia a la insulina
en la obesidad (Sethi and Hotamisligil, 1999). Sin embargo, los animales transgénicos obesos
aP2-PEPCK no muestran un incremento en los niveles de TNF-α, al igual que otros estudios
(Bluher et al., 2001;Koistinen et al., 2000). Además, estos ratones transgénicos aP2-PEPCK
presentan un aumento en los niveles séricos de adiponectina, adipoquina con acción
sensibilizadora a la insulina (Fruebis et al., 2001;Yamauchi et al., 2001), lo cual puede
contribuir al mantenimiento de la sensibilidad a la hormona. Ello también refuerza la idea de
que la disminución de la adiponectina está más íntimamente ligada a la resistencia a la
insulina que a la obesidad (Abbasi et al., 2004). Los resultados de los ratones transgénicos
aP2-PEPCK sugieren que una alteración primaria en el depósito de grasa no acompañada de
elevados niveles circulantes de FFAs ni alteraciones en leptina y TNF-α séricas, junto con un
aumento de la adiponectina, no induce resistencia a la insulina.
Dado que el incremento en la reesterificación de ácidos grasos por el tejido adiposo
induce obesidad pero protege del desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes, los
animales transgénicos obesos aP2-PEPCK se alimentaron con una dieta diabetogénica.
Ratones controles alimentados con una dieta alta en lípidos muestran hiperlipidemia y un
mayor depósito de grasa tanto en tejido adiposo como otros tejidos, desarrollando obesidad y
diabetes de tipo 2 (Surwit et al., 1988). Asimismo, los ratones transgénicos aP2-PEPCK
presentaron obesidad mórbida y una mayor hiperinsulinemia, resistencia a la insulina e
intolerancia a la glucosa respecto a los controles en dieta alta en lípidos. Sin embargo, esta
Discusión
112
mayor susceptibilidad a desarrollar obesidad y resistencia a la insulina inducida por la dieta no
es debido a niveles circulantes de FFAs y adipoquinas, como TNF-α e IL-6, superiores a los
que presentan los controles en dieta. Esta mayor susceptibilidad en los transgénicos puede ser
debida al mayor depósito de grasa en tejidos no adiposos, ya que ello está correlacionado con
el desarrollo de resistencia a la insulina (Raz et al., 2005). La acumulación de lípidos en el
hígado inhibe su metabolismo de la glucosa y disminuye su eliminación de la insulina
circulante, contribuyendo así a la hiperglucemia e hiperinsulinemia (Browning and Horton,
2004;Goto et al., 1995). Es más, la esteatosis hepática o enfermedad del hígado graso no
alcohólica en humanos también está asociada a resistencia a la insulina a nivel hepático,
hiperinsulinemia en ayunas e hipertrigliceridemia (Seppala-Lindroos et al., 2002). Por tanto, la
ausencia del depósito de grasa en tejidos no adiposos en los ratones transgénicos obesos aP2-
PEPCK alimentados con dieta estándar probablemente también contribuye a mantener su
sensibilidad a la insulina. Sin embargo, los transgénicos en dieta diabetogénica no sólo
acumulan más grasa en el tejido adiposo blanco, sino que muestran una severa esteatosis
hepática y del tejido adiposo marrón, asociadas a una hipertrigliceridemia. Se conocen otros
modelos animales que presentan esteatosis hepática, hipertrigliceridemia y resistencia a la
insulina, como los ratones que sobreexpresan glucoquinasa en hígado a largo plazo (Ferre et
al., 2003). Es más, también se observan en las lipodistrofias (Moitra et al., 1998;Seip and
Trygstad, 1996), las cuales pueden ser revertidas mediante el transplante de tejido adiposo
(Gavrilova et al., 2000). Se ha descrito que el tratamiento con adiponectina disminuye el
contenido de lípidos en el hígado de ratones obesos (Yamauchi et al., 2001). Aunque los
niveles de adiponectina circulante generalmente disminuyen en la obesidad (Hotta et al.,
2000), nuestros resultados muestran que la corta exposición a una dieta diabetogénica en
ratones controles induce un incremento de la adiponectina. Ello ya ha sido descrito
previamente en ratas y considerado un mecanismo compensatorio a la obesidad y a la
resistencia a la insulina inducida por este tipo de dieta (Li et al., 2002;Lopez et al., 2004). A
diferencia de los animales controles, esta respuesta compensatoria está prácticamente
Discusión
113
ausente en los transgénicos sometidos a la dieta alta en lípidos. Probablemente, ello no sólo
contribuye a su severa resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa, sino también a su
gran esteatosis hepática.
Otro de los mecanismos compensatorios descritos en la obesidad y resistencia a la
insulina inducidas por este tipo de dietas diabetogénicas es la termogénesis inducida por la
dieta. Ésta consiste en un incremento y activación del tejido adiposo marrón por aumento de
UCP1 (Cannon and Nedergaard, 2004;Lowell and Bachman, 2003). No obstante, los ratones
transgénicos aP2-PEPCK sometidos a esta dieta alta en lípidos muestran una reducción tanto
en la expresión como en la proteína UCP1, indicando un posible déficit en esta termogénesis
compensatoria. En este sentido, los ratones genosuprimidos en todos los subtipos de
receptores β-adrenérgicos (β1, β2 y β3) también muestran una disminución de UCP-1
(Bachman et al., 2002). Estos ratones presentan una disminución de la termogénesis y del
gasto energético, aumentando su susceptibilidad a la obesidad y a la resistencia a la insulina
inducida por dietas diabetogénicas (Bachman et al., 2002). La expresión de UCP-1 está
regulada por PPARγ y PGC-1α (Puigserver et al., 1998;Sears et al., 1996). Coincidiendo con
ello, los transgénicos aP2-PEPCK en dieta alta en lípidos presentan una reducción en la
expresión de PGC-1α y PPARγ, incluso una disminución en los niveles proteicos de PGC-1α.
Además de una disminución en UCP-1, los ratones transgénicos aP2-PEPCK en dieta alta en
lípidos muestran un mayor depósito de grasa en el tejido adiposo marrón. De la misma forma,
se ha relacionado una reducción de UCP-1 con el aumento en el tamaño de las vacuolas
lipídicas observado tras la activación crónica de PPARγ mediante el tratamiento con
tiazolidinedionas (TZDs) (Kelly et al., 1998). Todo ello sugiere que el déficit de la
termogénesis inducida por la dieta observado en los ratones transgénicos aP2-PEPCK,
probablemente debido al acúmulo excesivo de grasa en tejido adiposo marrón, contribuye a
su severa obesidad y resistencia a la insulina.
En el tratamiento de la diabetes, actualmente se está utilizando las TZDs, ya que
mejoran la tolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina, tanto en pacientes como en
Discusión
114
modelos animales (Hauner, 2002;Olefsky, 2000;Saltiel and Olefsky, 1996). Además, las TZDs
inducen una redistribución del tejido adiposo, desde la región visceral a la subcutánea, lo cual
ayuda a mejorar la sensibilidad a la insulina (Akazawa et al., 2000;Kawai et al., 1999;Kelly et
al., 1999;Mori et al., 1999). Las TZDs son agonistas de PPARγ, factor transcripcional que
regula diferentes genes, entre ellos el gen de la PEPCK (Devine et al., 1999;Glorian et al.,
2001;Tontonoz et al., 1995). Además de los efectos ya descritos, estos fármacos reducen los
niveles circulantes de FFAs e inducen ganancia de peso, probablemente al incrementar la
reesterificación de FFAs a través de la activación de PEPCK, principalmente, y de la glicerol
quinasa (Guan et al., 2002;Tordjman et al., 2003). Ello concuerda con los resultados
obtenidos en el ratón transgénico aP2-PEPCK, indicando que la PEPCK está involucrada en el
almacenamiento de triglicéridos en tejido adiposo donde ejerce un papel crucial en la
regulación del depósito de grasa. Sin embargo, el fenotipo mostrado por los ratones aP2-
PEPCK sometidos a dieta alta en lípidos alerta de los posibles efectos nocivos del tratamiento
crónico con las TZDs si se satura la capacidad del tejido adiposo de almacenar lípidos (Figura
26). Ello sugiere la existencia de un umbral en el crecimiento de la masa grasa, crucial para el
mantenimiento de la sensibilidad a la insulina al actuar como probable regulador de la
aparición del depósito de lípidos en tejidos no adiposos (Heilbronn et al., 2004).
La segunda parte de este estudio muestra que la expresión de GK específicamente
en tejido adiposo de ratones transgénicos lleva a un incremento en la utilización de glucosa,
aumentando su sensibilidad a la insulina y su tolerancia al azúcar, sin incrementar el depósito
de grasa. En este sentido, los ratones transgénicos que sobreexpresan GLUT4 en tejido
adiposo muestran una mayor tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina debido a un
aumento en el captación del azúcar, tanto en condiciones basales como estimuladas por
insulina (Shepherd et al., 1993b). Sin embargo, esta mayor sensibilidad a la insulina ocurre a
pesar de que estos ratones son obesos y presentan niveles circulantes de FFAs elevados y
niveles séricos de adiponectina bajos (Shepherd et al., 1993a). El aumento en el número de
Discusión
115
adipocitos de pequeño tamaño, más sensibles a la insulina, responsable de la obesidad de
estos animales, podría contribuir al incremento en la sensibilidad a la hormona (Shepherd et
al., 1993b;Tozzo et al., 1995). A diferencia de los ratones que sobreexpresan GLUT4, los
animales que expresan GK en tejido adiposo no son obesos y no presentan ni alteraciones en
el número ni en el tamaño de los adipocitos. Además, tampoco se observaron cambios en los
niveles circulantes de hormonas involucradas en la homeostasis de la glucosa, como la
insulina, adiponectina o leptina. Las discrepancias entre ambos modelos murinos transgénicos
en respuesta al incremento en la captación de glucosa podrían ser debidas a diferencias en la
magnitud de este aumento y/o a variaciones en parámetros que podrían afectar al fenotipo
mostrado, como el fondo genético, la dieta,... Más aún, un mayor flujo glucolítico provocado a
distinto nivel podría haber llevado a la acumulación de metabolitos de la glucosa diferentes,
induciendo distintas respuestas en la señalización del azúcar. Ello estaría de acuerdo con los
resultados de la sobreexpresión de la enzima limitante de la biosíntesis de hexosaminas, la
glutamina-fructosa-6-fosfato aminotransferasa específicamente en adipocitos (Hazel et al.,
2004). A pesar de la mayor captación de glucosa que presentan sus adipocitos, estos animales
son obesos hipertróficos y muestran intolerancia al azúcar y resistencia a la insulina a nivel
muscular, probablemente debido al aumento de leptina y disminución de adiponectina
circulantes (Hazel et al., 2004;McClain et al., 2005).
Uno de los efectos del incremento en la captación de glucosa en el adipocito en los
ratones que sobreexpresan GLUT4 es el aumento en la síntesis de novo de ácidos grasos,
aunque ello tan sólo representa un pequeño porcentaje del azúcar captado (Shepherd et al.,
1993b). Ello probablemente es debido a que una mayor utilización de la glucosa puede regular
enzimas lipogénicas y glucolíticas, tanto en hígado como en tejido adiposo, a través de la
glucosa-6-P (Girard et al., 1997;Towle et al., 1997). De acuerdo con esto, los ratones que
expresan GK muestran un incremento en la expresión de enzimas lipogénicas, como FAS y
ACC, probablemente debido a la inducción de la expresión de los factores de transcripción
SREBP1 y PPARγ. Sin embargo, el tejido adiposo de estos animales no presenta un aumento
Discusión
116
en la síntesis de triglicéridos. Estos resultados coinciden con la baja proporción de glucosa
convertida a ácidos grasos en los transgénicos que sobreexpresan GLUT4, reforzando la idea
que el tejido adiposo juega un papel minoritario en la síntesis de ácidos grasos. Además, en
los animales aP2-GK, la inhibición de la expresión de CD36 en los adipocitos de estos animales
podría disminuir la captación de ácidos grasos procedentes de la dieta, compensando la
inducción de la lipogénesis.
A concentraciones fisiológicas de glucosa, la producción de lactato es el destino
mayoritario del azúcar captado por el tejido adiposo en los animales que sobreexpresan GLUT4
(Tozzo et al., 1995). De acuerdo con esto, los resultados de la expresión de GK en tejido
adiposo demuestran que el incremento en su flujo glucolítico promueve un aumento en la
expresión de la enzima lactato deshidrogenasa y en su producción de lactato. De hecho, ello
coincide con el fenotipo observado en los ratones transgénicos que muestran un incremento
en el flujo glucolítico por expresión GK en músculo esquelético y en aquellos que
sobreexpresan la enzima a nivel hepático. La expresión de GK en músculo lleva a un aumento
en los niveles circulantes de lactato, y su sobreexpresión hepática incrementa tanto sus niveles
séricos como su contenido hepático (Ferre et al., 1996a;Ferre et al., 1996b;Otaegui et al.,
2000). Es más, el aumento en la glucólisis por sobreexpresión hepática del proto-oncogen c-
myc o por altos niveles circulantes del factor-2 de crecimiento similar a la insulina (IGF-II)
promueven tanto la síntesis de glucógeno como de lactato (Rossetti et al., 1996;Valera et al.,
1995). Este incremento en la producción de lactato por los hepatocitos que sobreexpresan GK
tiene lugar únicamente a altas concentraciones de glucosa (Ferre et al., 1996b). Ello
concuerda con lo observado en los ratones que expresan GK en adipocitos, donde el
incremento en los niveles circulantes de lactato se produce en condiciones de alimentación y
su producción de lactato in vitro a altas condiciones de glucosa. Esto probablemente refleja la
potente activación de la actividad glucoquinasa por la glucosa (Printz et al., 1993).
El fenotipo de los animales transgénicos aP2-GK está de acuerdo con la visión del
tejido adiposo como una significativa fuente de producción de lactato in vivo e in vitro
Discusión
117
(Jansson et al., 1990;Marin et al., 1987). Esta producción de lactato está regulada por la
insulina, epinefrina, concentración de glucosa, e incluso varía con la región anatómica, tamaño
del adipocito y el estado nutricional (Crandall et al., 1983;Crandall et al., 1986;King and
DiGirolamo, 1998). Es más, estudios de microdiálisis han reflejado una liberación neta de
lactato por el tejido adiposo tras la ingesta de glucosa, sugiriendo que el aumento en los
niveles circulantes de lactato en el período post-prandrial no sólo sería debido al metabolismo
muscular (Hagstrom et al., 1990). El paradójico incremento de este precursor gluconeogénico
podría estar relacionado con el posible papel del lactato como importante precursor de
glucógeno o triglicéridos (Katz et al., 1993). De acuerdo con esto, la mayor liberación de
lactato por el tejido adiposo en los ratones alimentados transgénicos aP2-GK promueve el
depósito de triglicéridos en hígado. Además, esto sugiere que el ciclo de Cori, en el cual el
lactato liberado por el músculo es convertido de nuevo en glucosa por el hígado, también se
da entre tejido adiposo e hígado (Thacker et al., 1987). Aunque éste tendría un papel
minoritario en condiciones fisiológicas, podría ser relevante en condiciones como obesidad o
resistencia a la insulina (Faintrenie and Geloen, 1996;Watford and Fried, 1991). De hecho, la
obesidad, diabetes y la edad son factores que incrementan la liberación de lactato por la masa
grasa (DiGirolamo et al., 1992;Newby et al., 1990). El incremento en la liberación de lactato
por el adipocito se ha relacionado con la diabetes tipo 2 en humanos y su infusión con la
resistencia a la insulina en ratas (Sandqvist et al., 2001;Vettor et al., 1997). No obstante, en
los ratones transgénicos aP2-GK, un aumento en los niveles circulantes de lactato no se asocia
ni a obesidad ni a resistencia a la insulina. Ello sugiere que el incremento crónico en los
niveles circulantes de lactato no es suficiente para aumentar la glucemia e inducir resistencia a
la insulina. En este sentido, aunque los niveles plasmáticos de lactato se encuentran
incrementados en humanos obesos, estos pacientes muestran una marcada disminución en la
capacidad de generar lactato de forma aguda tras la sobrecarga oral de glucosa (Lovejoy et
al., 1990;Lovejoy et al., 1992).
Discusión
118
En condiciones post-prandiales, se ha considerado que el depósito de lípidos en tejido
adiposo depende principalmente de la captación de glucosa estimulada por la insulina para
generar glicerol-3-fosfato, necesario en la esterificación de ácidos grasos. De forma
inesperada, a pesar de su mayor captación de glucosa por el tejido adiposo, los ratones que
expresan GK no presentan un acúmulo de grasa, sugiriendo que este incremento en la
utilización del azúcar no es suficiente para aumentar la síntesis de glicerol-3-fosfato y de
lípidos. Existe una vía alternativa, llamada gliceroneogénesis, capaz de proporcionar glicerol-3-
fosfato a partir de piruvato o lactato durante el ayuno, permitiendo la reesterificación de los
ácidos grasos liberados por la lipólisis (Forest et al., 2003;Reshef et al., 2003). Estudios in
vitro han descrito el lactato y el piruvato como precursores preferenciales en la síntesis de
triglicéridos en el adipocito, por encima de la glucosa (Francendese and DiGirolamo, 1981).
Ello está de acuerdo con la ausencia de una mayor producción de glicerol en los animales que
expresan GK en tejido adiposo. Es más, estos resultados sugieren que la contribución de la
glucosa a la síntesis de triglicéridos en el tejido adiposo podría haber sido sobreestimada. En
este sentido, a través de la utilización de isótopos de glucosa, se ha descrito que la
incorporación de los carbonos de la glucosa a la grasa corporal es menor del 4% del azúcar
administrado (Marin et al., 1987). Por tanto, futuros estudios deberían determinar la
contribución relativa de la glucosa, piruvato o lactato a la síntesis de triglicéridos como
precursores del glicerol durante la alimentación.
Así pues, a diferencia de los ratones que expresan GK en tejido adiposo, los animales
transgénicos que sobreexpresan PEPCK muestran un incremento en la producción de glicerol-
3-fosfato a través de la inducción de la gliceroneogénesis. En estos ratones, un incremento en
la gliceroneogénesis lleva a una mayor reesterificación de FFA, hipertrofia del adipocito y
obesidad, como ya se ha descrito previamente. Por tanto, estas discrepancias sugieren que la
PEPCK y la gliceroneogénesis son cruciales en la regulación de la síntesis de triglicéridos en el
adipocito, mientras que el lactato, y no el glicerol-3-fosfato, es el principal producto de la
mayor utilización de glucosa inducida por expresión de GK en este tejido (Figura 45).
Discusión
119
SOBREEXPRESIÓN DE PEPCK
Glicerol-3-PFFAs FFAs
Glicerol Lipolisis
Lactato Piruvato
reesterificaciónácidos grasos
TG
gliceroneogénesis
EXPRESIÓN DE GK
Glucosa
Glicerol-3-P
Glucosa
FFAs
TG
FFAsesterificaciónácidos grasos
GLUT4
Glicerol Lipolisis
reesterificaciónácidos grasos
HSL
Lactato
glucólisis anaerobia
Lactato
PRODUCCIÓN GLICEROL-3-P POR EL ADIPOCITO
Glucosa
Glicerol-3-Pglucólisis
HK
Glucosa
FFAs
TG
FFAsesterificaciónácidos grasos
GLUT4
Glicerol Lipolisis
Lactato
reesterificaciónácidos grasos
PEPCKgliceroneogénesis
HSL
Lactato
Piruvato
Figura 45. Producción de glicerol-3-fosfato por el tejido adiposo blanco. La sobreexpresión de la PEPCK en el adipocito lleva a un incremento en la gliceroneogénesis, la reesterificación de ácidos grasos y la síntesis de triglicéridos (panel superior izquierda). Sin embargo, un incremento en la utilización basal de glucosa por el tejido adiposo, a través de la expresión de la GK, no lleva a un aumento en la obtención de glicerol-3-fosfato ni en la esterificación de ácidos grasos, sino que induce una mayor producción de lactato por el adipocito (panel superior derecha). Estos resultados sugieren que la gliceroneogénesis y la PEPCK son cruciales en la obtención de glicerol-3-P por el adipocito, mientras que su síntesis a partir de la glucosa podría haber sido sobreestimada, siendo el lactato uno de los principales metabolitos producidos a partir del azúcar (panel inferior).
VI. CONCLUSIONES.
Conclusiones
120
Parte I
1. La sobreexpresión constitutiva de PEPCK en tejido adiposo lleva un aumento en la
gliceroneogénesis, reesterificación de ácidos grasos y depósito de lípidos, tanto en tejido
adiposo blanco como marrón.
2. Los ratones transgénicos aP2-PEPCK en dieta estándar son obesos hipertróficos
aunque sensibles a la insulina. Ello probablemente es debido a la ausencia de niveles elevados
de FFAs, leptina y TNF-α circulantes, junto con la ausencia de depósito de grasa en tejido no
adiposos y altos niveles de adiponectina sérica.
3. Mientras que los ratones controles alimentados con una dieta diabetogénica
durante un corto período presentan obesidad y una ligera hiperinsulinemia y resistencia a la
insulina, los ratones transgénicos aP2-PEPCK desarrollan obesidad mórbida, hiperinsulinemia,
intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina severas.
4. El gran depósito de lípidos en el tejido adiposo marrón de estos ratones lleva a
una reducción de UCP1, y por tanto de su capacidad termogénica, lo cual contribuye a su
mayor sensibilidad a la obesidad inducida por la dieta alta en lípidos.
5. Estos animales también presentan una severa esteatosis hepática asociada a la
hipertrigliceridemia. Esta esteatosis puede ser responsable de la importante hiperinsulinemia,
por defecto en la eliminación de la insulina circulante, y de la severa resistencia a la insulina.
6. Por tanto, los efectos combinados de la dieta alta en lípidos y el incremento en la
reesterificación de ácidos grasos en tejido adiposo blanco probablemente saturan la capacidad
de éste de almacenar lípidos, promoviendo el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes
de tipo 2 al incrementar los niveles circulantes de triglicéridos y el depósito de grasa en tejidos
no adiposos.
Conclusiones
121
Parte II
1. La expresión constitutiva de GK en los ratones transgénicos aP2-GK lleva a un
aumento en la utilización basal de glucosa y en la producción de lactato por el tejido adiposo
blanco, incrementando sus niveles circulantes de lactato.
2. Sin embargo, el incremento crónico del lactato circulante no lleva a resistencia a la
insulina ni a hiperglucemia, sino a una mayor tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la
hormona.
3. A pesar del aumento en la captación de glucosa en el tejido adiposo blanco por la
presencia de la GK en estos ratones transgénicos, no se observa un incremento en la
obtención de glicerol-3-fosfato ni en el depósito de triglicéridos.
4. Todos estos resultados sugieren que la PEPCK y la gliceroneogénesis son cruciales
en la regulación de la síntesis de triglicéridos en el adipocito, mientras que la mayor utilización
de glucosa por expresión de la GK en el tejido adiposo no es suficiente para aumentar la
síntesis de glicerol-3-fosfato y la esterificación de ácidos grasos.
VII. MATERIALES Y MÉTODOS.
Materiales y Métodos
122
1. MATERIALES.
1.1. ANIMALES.
Los animales utilizados en este trabajo, tanto los animales transgénicos aP2-PEPCK y
aP2-GK como los controles, eran ratones híbridos de la cepa B6SJL. Todos ellos estaban
alimentados ad libitum con una dieta estándar (Panlab, Barcelona, España) y se mantuvieron
en condiciones controladas de temperatura y luz (ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de
oscuridad, con luces a partir de las 9:00 a.m.). Cuando fue necesario, los animales se
ayunaron durante 16 horas. Las muestras se obtuvieron a primera hora de la mañana (9:00-
10:00 a.m.). Para el sacrificio de los animales, los ratones eran anestesiados mediante
anestésicos inhalatorios (Fluothane®) y sacrificados por decapitación. Sus tejidos y órganos
eran diseccionados, rápidamente congelados en nitrógeno líquido, y posteriormente se
mantuvieron a -80ºC hasta su procesamiento. En los experimentos se utilizaron ratones
machos de entre 3 y 6 meses de edad. Los procedimientos experimentales se aprobaron por
el Comité de Ética y de Experimentación Animal y Humana de la Universitat Autònoma de
Barcelona.
1.1.1. Obtención de los ratones transgénicos y establecimiento de sus
líneas.
Para la obtención de animales transgénicos se utilizó la técnica de microinyección de
DNA en el pronúcleo masculino de oocitos fecundados (Nagy A., 2002). Los oocitos
fecundados de ratón utilizados en la microinyección de DNA se obtuvieron a partir de hembras
donantes híbridas B6SJLF1, procedentes del cruce de animales de las cepas genéticas
C57BL/6J y SJL/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA). Los genes quiméricos se
purificaron por electroelución y se microinyectaron en estos oocitos fecundados. Los oocitos
Materiales y Métodos
123
microinyectados se implantaron en hembras receptoras de la cepa CD-1. Estos procesos se
realizaron en el Servei de Biotecnologia Animal de la UAB.
Todos los animales nacidos tras la implantación de embriones se analizaron mediante
Southern blot para la detección de los posibles animales transgénicos, a partir del DNA
extraído de la cola. Los ratones transgénicos detectados se usaron como fundadores de las
líneas transgénicas. Para ello, los ratones fundadores se cruzaron con animales híbridos
B6SJLF1. Los animales transgénicos aP2-GK se mantuvieron como colonia transgénica en
heterocigosis. Sin embargo, a fin de establecer una línea de animales transgénicos aP2-PEPCK
homocigotos, se cruzaron entre ellos animales transgénicos aP2-PEPCK heterocigotos. Los
animales transgénicos aP2-PEPCK candidatos a presentar el transgen en homocigosis se
comprobaron a partir de varios cruces con controles B6SJLF1, analizando por Southern blot la
totalidad de su descendencia (toda debía ser transgénica). Se utilizaron hermanos de camada
como controles de los animales transgénicos en los diferentes experimentos.
1.2. CEPAS BACTERIANAS Y VECTORES PLASMÍDICOS.
La cepa bacteriana utilizada para la obtención de las diferentes construcciones
plasmídicas fue la cepa DH5α de E. coli. Las construcciones plasmídicas incluían el gen de la
resistencia a la ampicilina para su selección. Así, el crecimiento de estas bacterias se realizaba
a 37ºC en medio de cultivo LB (Miller´s LB Broth, Laboratorios CONDA, Madrid), con una
concentración de 50 mg/mL de ampicilina para su selección. Glicerinados de estas bacterias se
conservaron a -80ºC en medio LB con glicerol al 20% (vol/vol). Los vectores plasmídicos
utilizados en este trabajo fueron:
-pB7.0, que contenía el gen de la PEPCK de rata (gentileza del Dr. Hanson, Case
Western Reserve University, Cleveland, USA).
-pSKII+/prom.aP2, que contenía el promotor del gen aP2 (gentileza del Dr.
Spiegelman, Harvard Medical School, Boston, USA).
Materiales y Métodos
124
-pPCK2.4-rGK-SV3', que contenía el cDNA de la GK de rata, diseñado en nuestro
laboratorio (Ferre et al., 1996a).
1.3. SONDAS DE DNA.
Para detectar la incorporación de los transgenes aP2-PEPCK y aP2-GK en el genoma
de los animales se utilizaron las siguientes sondas de DNA:
-Para los animales transgénicos aP2-PEPCK: fragmento SphI-SphI de 3.85 kb que
contenía parte de la secuencia del gen PEPCK.
-Para los animales transgénicos aP2-GK: fragmento BamHI-Bgl I de 3.5 kb que
contenía las últimas 2 kb de la secuencia del promotor del gen aP2 y las primeras 1.5 kb de la
secuencia del cDNA de la GK.
Para los Northern blot, las sondas utilizadas eran:
-Sonda PEPCK: fragmento SphI-SphI de 1.7 kb que contenía parte de la secuencia
del gen de la PEPCK, cedido por el Dr. Hanson (Case Western Reserve University, Cleveland,
USA).
-Sonda GK: fragmento EcoRI-EcoRI de 2.3 kb que contenía toda la secuencia del
cDNA de la GK de rata, cedido por el Dr. Iynedjian (University of Geneva, Geneva,
Switzerland).
-Sonda UCP1: sonda del cDNA de UCP1 de rata cedida por el Dr. Ricquier (Centre
Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS), Paris, France).
-Sonda PPARγ: sonda cedida por el Dr. Spiegelman (Harvard Medical School, Boston,
USA).
-Sonda PGC-1α: fragmento EcoRI-EcoRI de 0.7 kb que contenía parte de la
secuencia del cDNA de la PGC-1α, cedida por el Dr. Spiegelman.
-Sonda 18S: fragmento EcoRI-EcoRI de 5.7 kb del cDNA humano, cedida por el Dr.
Gamboa.
Materiales y Métodos
125
1.4. ANTICUERPOS.
Para la realización de los Western-blot presentes en esta tesis doctoral se utilizaron
los siguientes anticuerpos:
-Anticuerpo de oveja contra la proteína GK de rata, cedido por el Dr. Magnuson
(Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, USA). Se utilizó una dilución 1:1000.
-Anticuerpo de conejo contra la proteína PEPCK de Abgent (Abgent, San Diego, CA,
USA). Se utilizó una dilución 1:500.
-Anticuerpo de conejo contra la proteína UCP1 de Abcam (Abcam, Cambridge, UK).
Se utilizó una dilución 1:1000.
-Anticuerpo de conejo contra la proteína PPARγ de Abcam (Abcam, Cambridge, UK).
Se utilizó una dilución 1:2000.
-Anticuerpo de conejo contra la proteína PGC-1α de Chemicon (Chemicon
International, Temecula, CA, USA). Se utilizó una dilución 1:2000.
Para la inmunodetección, se utilizaron diversos anticuerpos secundarios con marcaje
no radiactivo:
-Anticuerpo secundario de cabra contra las inmunoglobulinas de oveja, biotinilado de
Dako (DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Se utilizó una dilución 1:2000.
-Anticuerpo secundario de cabra contra las inmunoglobulinas de conejo, conjugado
con peroxidasa de Dako (DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Se utilizó una dilución 1:2000.
Materiales y Métodos
126
2. MÉTODOS.
2.1. OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE DNA.
2.1.1. Preparación DNA plasmídico.
Para obtener pequeñas cantidades de DNA plasmídico se purificó a partir de unos 3-5
mL de medio de cultivo bacteriano, según el protocolo de lisis alcalina descrito originalmente
por Birnboim y Doly (Birnboim and Doly, 1979). Gracias a este método rápido, se obtienen
entre 3-4 µg de plásmido por mL de medio de cultivo. Este protocolo consiste en la
degradación de la pared bacteriana por la acción de la lisozima (solución de lisozima: Tris-HCl
25 mM pH 8, EDTA 10 mM, Glucosa 50 mM, Lisozima 5 mg/mL). Tras la acción de la lisozima,
se realiza una lisis alcalina del esferoplasto (solución de lisis: NaOH 0.2 M, SDS 1%) y una
precipitación selectiva del DNA genómico bacteriano y de las proteínas desnaturalizadas
mediante una solución concentrada de acetato potásico a pH ácido (Acetato potásico 3 M pH
4.8, ácido acético glacial 2 M). El DNA plasmídico (sobrenadante resultante) se purifica
mediante la precipitación con isopropanol y el lavado con etanol al 75%. Para degradar el RNA
bacteriano, se recomienda añadir RNAsa A a la solución de lisozima (concentración final 100
µg/mL).
Sin embargo, para la obtención de cantidades mayores de DNA, se realizaron
purificaciones a partir de 250-500 mL de medio de cultivo. Aunque se utiliza el mismo
principio de obtención (lisis alcalina), la purificación del DNA se realiza mediante columnas
comerciales QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN Sciences, Maryland, USA).
Materiales y Métodos
127
2.1.2. Enzimas de restricción.
Las endonucleasas de restricción son enzimas purificadas de bacterias o de hongos,
que presentan una marcada especificidad frente a secuencias cortas de DNA y actúan sobre
ellas rompiendo los enlaces fosfodiésteres y por tanto, la cadena de DNA. Estas enzimas son
comerciales y están resuspendidas en soluciones que contienen un 50% de glicerol. Su
actividad enzimática puede ser afectada por la composición del tampón de restricción,
especialmente pH y concentración de iones, la temperatura de incubación o si el DNA está
metilado o no. De forma general, el DNA se digiere en una proporción de 1 unidad de enzima
por µg de DNA, evitando superar el 5% de glicerol en el tampón de restricción. El tiempo de
digestión oscila, entre 1-2 horas para el DNA plasmídico y toda una noche para el DNA
genómico. Los productos de restricción son analizados en geles de TAE/agarosa.
2.1.3. Aislamiento y purificación de fragmentos de DNA.
2.1.3.1. Geles de agarosa.
La electroforesis en geles de agarosa es una técnica muy útil utilizada para la
separación analítica o preparativa de fragmentos de DNA de un tamaño superior a 100 pb.
Tras la digestión del DNA con enzimas de restricción, la visualización de los fragmentos de
DNA se consigue mediante la incorporación de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) al gel de
agarosa. El bromuro de etidio es capaz de intercalarse entre las cadenas de DNA y aparece
como una banda de color naranja cuando se somete a iluminación ultravioleta (300 nm).
Gracias al bromuro de etidio podemos detectar cantidades de DNA superiores a 5 ng. En este
trabajo se han utilizado geles de agarosa al 1% en tampón TAE (Tris-acetato 40 mM pH 8.3,
EDTA 1 mM). Para determinar el tamaño de las diferentes bandas de DNA se utilizaron
diferentes marcadores de peso molecular (Marker X de Roche y DNA ladder 1 kb de
Invitrogen).
Materiales y Métodos
128
2.1.3.2. Purificación de los fragmentos de DNA.
Para la purificación de los fragmentos de DNA de los geles de agarosa se utilizó el
producto comercial QIAEX II® Gel Extraction kit (QIAGEN Sciences, Maryland, USA) siguiendo
el protocolo comercial. Éste es un método rápido basado en la disolución del fragmento de
agarosa, que contiene la banda deseada, en un agente caotrópico. En este caso, el agente
caotrópico es una solución saturada de NaI. Estas condiciones permiten una adsorción
selectiva del DNA a una matriz de sílice. Posteriormente, el DNA se lava y se eluye en
condiciones de baja fuerza iónica que favorecen la separación del DNA de la matriz de sílice.
2.1.4. Construcción de moléculas híbridas de DNA.
Los fragmentos de DNA purificados, se combinaron y trataron con la enzima DNA
ligasa del bacteriófago T4 de GIBCO BRL (Invitrogen, San Diego, CA, USA) siguiendo el
protocolo comercial. Gracias a la ligasa, los diferentes fragmentos son fusionados por sus
extremos compatibles, ya sean cohesivos o romos. El plásmido resultante se introduce en
bacterias competentes DH5α de E. coli mediante el protocolo de transformación. Las bacterias
que han incorporado el plásmido son seleccionadas mediante la adición del antibiótico
adecuado, y posteriormente confirmando la obtención de la molécula híbrida, mediante
análisis del DNA plasmídico.
2.1.4.1. Subclonaje de los fragmentos de DNA.
Las técnicas de subclonaje son ampliamente utilizadas con diferentes finalidades.
Consisten en la digestión del DNA mediante las enzimas de restricción y la ligación de los
fragmentos deseados con vectores plasmídicos, digeridos también con enzimas de restricción.
Estas técnicas han sido utilizadas en la obtención de los dos genes quiméricos aP2-PEPCK y
aP2-GK utilizados en este estudio.
Materiales y Métodos
129
2.1.4.2. Transformación de las células de E. coli.
Las bacterias DH5α de E. coli utilizadas se hicieron competentes mediante el método
de Hanahan (Hanahan, 1983). Este método utiliza MgCl2 y CaCl2 como agentes
permeabilizadores de la membrana, permitiendo que las bacterias incorporen el plásmido
deseado. El método de transformación utilizado consistió en la incubación de las bacterias
competentes con el DNA plasmídico durante 10 minutos en hielo, inmediatamente se
incubaron a 42ºC durante 45 segundos y se mantuvieron nuevamente en hielo durante 5
minutos. Tras este tratamiento, se añadió medio de cultivo (200 µL de LB) a las bacterias y se
dejaron en agitación a 37ºC durante 40 minutos. Finalmente, el cultivo se centrifugó a 2000xg
para concentrar las bacterias. Resuspendiendo el sedimento bacteriano con un volumen
mínimo de medio de cultivo residual, se hicieron extensiones sobre una placa de LB con
ampicilina (50 µg/mL LB) para seleccionar aquellas bacterias transformadas con el plásmido
deseado. Aquellos clones resistentes (clones positivos) se volvieron a crecer en 3-5 mL de
medio LB/ampicilina para amplificarlos y analizar la presencia de la molécula híbrida deseada.
2.1.5. Marcaje radioactivo de las sondas de DNA.
Las sondas utilizadas tanto en los Southern blot como en los Northern blot se
marcaron radiactivamente con [α-32P]-dCTP (3000 Ci/mmol; Amersham Corp., Arlington
Heights, Ill.). Para el marcaje, se utilizó el kit comercial Ready-To-Go® DNA labelling Beads
(Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Una vez marcadas radiactivamente, las sondas se filtraron a través de columnas de Sephadex
G-50 (Probe Quant® G-50 Micro Columns, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg,
Germany). Gracias a la gel filtración de las sondas marcadas, se separaban los nucleótidos
radiactivos no incorporados a las sondas, reduciendo la radiactividad inespecífica.
Materiales y Métodos
130
2.2. DETECCIÒN DE LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS.
2.2.1. Obtención del DNA genómico.
La detección del transgen, tanto de los animales transgénicos aP2-PEPCK como de
los transgénicos aP2-GK, se realizó mediante Southern blot. Para la obtención de DNA
genómico se siguió una adaptación del método de De Wet (de Wet et al., 1987), en la cual se
precipita el DNA del homogenado por salinidad y utilización de isopropanol. Finalmente es
lavado con etanol al 75% y resuspendido en agua o TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH
8).
Fragmentos de cola de entre 0.5-1 cm de animales de tres semanas de edad se
homogenizaron en una solución de lisis tamponada (SDS 0.2%, proteinasa K 10 mg/mL 1%,
NaCl 200 mM, EDTA 5 mM pH 8, Tris-HCl 100 mM pH 8.5) y se incubaron a 56ºC toda la
noche. Esta incubación permite la digestión del tejido por la proteinasa K, liberando el DNA
genómico de las células. Tras la digestión, se añadieron 250 µL de NaCl saturada, se
centrifugó durante 15 minutos a 12000xg y se recuperó el sobrenadante. A partir de este
sobrenadante se precipitó el DNA genómico con isopropanol y se centrifugó durante 15
minutos a 12000xg. En este punto, el DNA aparece en forma de precipitado blanquecino o
pellet. Se descartó el sobrenadante mediante aspiración. Posteriormente, se lavó el pellet de
DNA con etanol al 75%, se volvió a centrifugar durante 10 minutos a 16000xg y se descartó
nuevamente el sobrenadante por aspiración. Tras dejar evaporar los restos de etanol 5
minutos a temperatura ambiente, se resuspendió el DNA en 55 µL de agua o de TE,
previamente calentada a 56ºC para favorecer la resuspensión. Finalmente, el DNA así
obtenido se analizó mediante Southern blot.
Materiales y Métodos
131
2.2.2. Análisis del DNA mediante Southern blot.
2.2.2.1. Digestión y electroforesis del DNA genómico.
Los animales se genotiparon en controles y transgénicos aP2-PEPCK o aP2-GK
mediante Southern blot. Para ambas genotipaciones se realizó una digestión enzimática de 10
µg de DNA genómico con la enzima de restricción EcoRI a 37ºC durante toda la noche. Tras la
digestión, se añadió tampón de carga 10x (Glicerol 50%, EDTA 100 mM, SDS 1% y azul de
bromofenol 0.1%) al DNA genómico digerido y se sometió a electroforesis en gel de TAE con
un 1% de agarosa y 0.5 µg/mL de bromuro de etidio. En las electroforesis de DNA se utilizó
un marcador de peso molecular (DNA Molecular Weight Marker X, Roche Diagnostics Corp.,
Indianapolis, IN). Tras la electroforesis (4-5 horas a 45-65 voltios), el gel de agarosa se trató
con HCl 0.25 M durante 15 minutos en agitación a temperatura ambiente. El tratamiento ácido
se utiliza para despurinizar el DNA y asegurar que los fragmentos de elevado peso molecular
sean transferidos correctamente desde el gel a la membrana. Tras el tratamiento ácido, el gel
se trató con solución alcalina (NaCl 1.5 M, NaOH 0.5 M) durante 15 minutos en agitación a
temperatura ambiente, para desnaturalizar la doble cadena de DNA. Finalmente, el gel se
trató con una solución neutralizante (Tris 1 M, NaCl 3 M) durante 30 min en agitación a
temperatura ambiente, para neutralizar el pH del gel y volver a cargar negativamente el DNA.
2.2.2.2. Transferencia del DNA desde el gel a una membrana.
Tras el tratamiento del gel de agarosa, se realizó la transferencia del DNA desde el
gel a membranas de nylon cargadas positivamente (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis,
IN). El método de transferencia utilizado fue el sistema Turboblotter® (Schleicher & Schuell,
Keene, New Hampshire). Este sistema consiste en la capilaridad por presión negativa en el
tampón de alta fuerza iónica SSC 10x (NaCl 1.5M, citrato sódico 0.15 M pH 7.4) a través de
papeles absorbentes GB002 y GB004 (Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire).
Transcurrido un mínimo de dos horas de transferencia, el DNA se fijó a la membrana de nylon
Materiales y Métodos
132
mediante la irradicación de 120000 µJ de luz ultravioleta en 25-50 segundos, con el sistema
UV-Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) con el fin de crear uniones covalentes entre el
DNA y la membrana.
2.2.2.3. Prehibridación/Hibridación de la membrana.
Una vez el DNA se fijó a la membrana de nylon, ésta se prehibridó con la solución de
prehibridación/hibridación (Na2HPO4 0.25 mM pH 7.2, SDS 20%, EDTA 1mM, Blocking reagent
0.5%) durante un mínimo de dos horas a 65ºC en agitación rotacional. Esta solución bloquea
la membrana que no contiene DNA fijado, gracias al detergente SDS, los fosfatos y el blocking
reagent (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). Bloqueando la membrana se reduce la
hibridación inespecífica cuando se hibrida con sondas marcadas radiactivamente. Tras la
prehibridación, las membranas se hibridaron con la sonda radiactiva correspondiente al
Southern blot a realizar, en agitación rotacional a 65ºC durante toda la noche.
2.2.2.4. Lavados de la membrana y revelado.
Tras la hibridación, las membranas se lavaron con soluciones astringentes para
eliminar el exceso de sonda y la radiactividad inespecífica que pudiera unirse a la membrana
mediante uniones débiles. Para ello, se realizaron tres lavados consecutivos con dos
soluciones de diferente astringencia. Los dos primeros lavados se realizaron con solución de
baja astringencia (NaCl 300 mM, citrato sódico 30 mM, SDS 0.1%) durante 15 minutos a 30ºC
en agitación rotacional. El último lavado se realizó con solución de alta astringencia (NaCl 15
mM, citrato sódico 1.5 mM, SDS 0.1%) durante 30 minutos a 65ºC en agitación rotacional. Si
los lavados son efectivos, tan sólo la sonda radiactiva que haya reconocido y se haya unido a
su fragmento de DNA complementario permanece en la membrana, reduciendo así la
radiactividad inespecífica (background). Finalmente, las membranas se expusieron en una
película fotográfica para obtener la señal que permitiera la genotipación de los animales.
Materiales y Métodos
133
2.3. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DEL RNA.
2.3.1. Extracción del RNA total.
La obtención de RNA total se realizó a partir de los diferentes tejidos congelados en
nitrógeno líquido mediante el uso de la solución TriPure® Isolation Reagent (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) o de la solución QIAzol® Lysis Reagent (QIAGEN
Sciences, Maryland, USA), en ambos casos siguiendo el protocolo comercial. El método se
basa en la separación del RNA mediante fenol-cloroformo y la protección del RNA gracias a la
solución de guanidina tiocianato, que actúa como inhibidor de ribonucleasas. Este método fue
descrito por Chomczynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi, 1987). La diferencia existente
entre las dos soluciones comerciales es el tipo de tejido para el que está recomendado su uso.
Mientras que el TriPure® se puede utilizar para multitud de tejidos, para los tejidos con
elevada cantidad de grasa es recomendable el QIAzol®. Así, se utilizó el QIAzol® para la
extracción de RNA total del WAT y BAT y también del hígado de los animales alimentados con
dieta HFD. Sin embargo, se utilizó TriPure® para la extracción de RNA total del hígado de los
animales alimentados con dieta estándar. Tras la precipitación del RNA con isopropanol y los
posteriores lavados con etanol al 75%, el RNA se resuspendió en agua con DEPC
(Dietilpirocarbonato, otro inhibidor de ribonucleasas) calentada a 56ºC. El volumen en el que
se resuspendió el RNA dependía del tejido. Mientras que para el hígado se utilizó un volumen
mayor (100-150 µL), para el WAT y el BAT se utilizaron volúmenes menores (30-40 µL)
concentrando al máximo la cantidad de RNA total extraído. Finalmente se determinó la
concentración de RNA de las diferentes muestras.
Materiales y Métodos
134
2.3.2. Electroforesis del RNA en geles desnaturalizantes de
agarosa/formaldehído.
A partir de RNA total extraído de los diferentes tejidos, se realizó la electroforesis en
geles de MOPS/agarosa al 1% (MOPS/EDTA 10x, H2O estéril, agarosa) con 2.2 M de
formaldehído. Antes de la carga de las muestras de RNA en el gel de agarosa, se añadió a la
cantidad de RNA un tampón de carga desnaturalizante 5x (formamida desionizada,
MOPS/EDTA 10x, formaldehído, H2O estéril, glicerol y azul de bromofenol y xilencianol como
colorantes). Posteriormente, las muestras de RNA se calentaron a 65ºC durante 15 minutos,
tras los cuales se cargaron inmediatamente en el gel de agarosa. Este tratamiento térmico
permite la desnaturalización de la estructura secundaria del RNA, y la presencia del
formaldehído, tanto en el gel como en el tampón de carga, evita su renaturalización. Como
tampón de electroforesis se utilizó una solución de MOPS/EDTA 1x (MOPS 20 mM, acetato
sódico 5 mM, EDTA 1 mM pH 7). Gracias a todas estas condiciones de electroforesis, el RNA
permanece desnaturalizado, permitiendo la separación de los diferentes RNA mensajeros
según su peso molecular. Además, para evitar la degradación enzimática del RNA por las
ribonucleasas, todas las soluciones utilizadas, tanto para la formación del gel como el tampón
de carga y el de electroforesis, se prepararon en condiciones libres de contaminación y se
autoclavaron, excepto la solución de MOPS/EDTA 10x que se filtró.
2.3.3. Análisis del RNA mediante Northern blot (hibridación DNA-RNA).
Una vez cargado el gel de agarosa con las muestras desnaturalizadas de RNA, se
dejó correr la electroforesis 4-5 horas entre 30-50 voltios. A continuación se transfirió a una
membrana de nylon con el sistema Turboblotter®, de la misma manera que en el Southern
blot, excepto que en este caso no se trataron con las soluciones ácida, alcalina y
neutralizante. Tras la transferencia, el RNA se fijó a la membrana de nylon mediante luz
Materiales y Métodos
135
ultravioleta. Para visualizar el estado de los RNAs y descartar las membranas con RNAs
degradados, las membranas se teñían con una solución colorante de azul de metileno. Para
esta tinción, la membrana se trató previamente con ácido acético al 5% (2-5 minutos) y
posteriormente teñida con una solución de azul de metileno (acetato sódico 150 mM, azul de
metileno 0.02%, H2O). Tras la tinción, las membranas se lavaron con agua destilada hasta
visualizar las bandas 28S y 18S del RNA total. Si las muestras de RNA no estaban degradadas,
las membranas se prehibridaron, hibridaron, lavaron y expusieron en una película fotográfica
de igual forma que en el Southern Blot. Las bandas se cuantificaron mediante densitometría
de los diferentes mRNAs y valor obtenido normalizado por la densitometría de la carga de RNA
(18S).
2.4. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS.
2.4.1. Extracción de proteínas totales.
Las proteínas totales se obtuvieron mediante la homogenización de los fragmentos
de tejidos congelados, de unos 100 mg, en 1 mL de tampón de homogenización, utilizando un
homogenizador de tipo Polytron®. La composición del tampón de homogenización fue la
siguiente: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, Sacarosa 240 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, NaF 50 mM,
β-glicerofosfato sódico 10 mM, Tampón fosfato 5 mM, Tritón X-100 al 1%. Una vez preparado
se filtró con un filtro de 0.22 µm y se conservó a 4ºC. Para la preparación del tampón fosfato
(0.5 M pH 7): Na2HPO4 x 12H2O 0.5 M, NaH2PO4 x 2H2O 0.5 M. Se añadió el NaH2PO4 x 2H2O
sobre el Na2HPO4 x 12H2O hasta conseguir el pH 7. Este tampón también se filtró con un filtro
de 0.22 µm y se conservó a 4ºC.
Inmediatamente antes de usar el tampón de homogenización, se añadieron los
inhibidores de proteasas (Complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets de
Roche Diagnostics GMBH, Germany). Se utilizó una pastilla de la mezcla de inhibidores de
Materiales y Métodos
136
proteasas por cada 10 mL de tampón de homogenización. Una vez añadidos los inhibidores de
proteasas, el tampón de homogenización se mantuvo siempre en hielo, al igual que el extracto
resultante en los sucesivos pasos. Tras homogenizar los tejidos, el extracto se mantuvo en
agitación a 4ºC durante 1-2 horas, y posteriormente se centrifugó a 16000xg durante 20
minutos a 4ºC. A partir del sobrenadante, se determinó la concentración de proteínas de los
extractos mediante el método Bradford y se realizaron diferentes alícuotas que se guardaron
congeladas hasta su utilización.
2.4.2. Determinación de la concentración de proteínas.
Para la determinación de la concentración de proteínas se utilizó el método de
Bradford, basado en el cambio de color del colorante azul brillante de coomassie cuando
forma complejos con las proteínas. Este cambio de color produce un cambio en el máximo de
absorbancia de este cromóforo (de 465 nm a 595 nm). A partir de una solución de albúmina
sérica bovina (BSA) a 1 mg/mL se realizó una recta patrón entre 0 y 20 µg de BSA. El
volumen de la reacción era de 1 mL, de los cuales 800 µL eran agua con los estándares de la
recta patrón, y 200 µL del reactivo de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad, Manchen,
Germany). La misma reacción se realizó con las muestras de los diferentes extractos. En el
caso de los extractos musculares y hepáticos se realizó una dilución de 1:50, mientras que no
era necesario diluir los extractos del tejido adiposo. Tras añadir el reactivo de Bradford, las
muestras se agitaron y se incubaron durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se determinó la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 595
nm. La concentración de proteína de los diferentes extractos se obtuvo a partir de la
interpolación de sus absorbancias en la recta patrón calculada.
Materiales y Métodos
137
2.4.3. Análisis de las proteínas mediante Western-blot.
2.4.3.1. Separación de proteínas por electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida.
El análisis de las proteínas se realizó mediante la electroforesis de las muestras
proteicas en geles de poliacrilamida al 10% y en presencia de SDS (Laemmli, 1970). El gel de
poliacrilamida SDS-PAGE se formó por la fusión de dos geles:
-Gel compilador o stacking, el cual contenía un 3.9% de poliacrilamida y se situó al
inicio del gel, formando los pocillos donde se depositan las muestras (parte superior del gel).
-Gel separador o resolving, el cual contenía un 10% de poliacrilamida y se situó al
final (parte inferior del gel).
Las muestras proteicas (-20ºC) se descongelaron en hielo. La cantidad de proteínas a
cargar se mezcló con ½ volumen de tampón de carga Laemmli 2x (Tampón fosfato 20 mM.
Glicerol 20%, SDS 4%, 2-β-mercaptoetanol 2% y azul de bromofenol como colorante). Tras
desnaturalizar las proteínas a 95ºC durante 5 minutos, las muestras se cargaron
inmediatamente al gel SDS-PAGE. Como tampón para la electroforesis se utilizó el siguiente:
Tris base 5 mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1% (peso/vol). La electroforesis se realizó a 45 mA
mientras las muestras atravesaban el gel compilador, cambiando a 60 mA cuando salieron de
él y atravesaban el gel separador. En la electroforesis se utilizaron marcadores de pesos
moleculares para proteínas preteñidos (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).
2.4.3.2. Electrotransferencia de proteínas a membrana e
inmunodetección.
La electrotransferencia de las proteínas desde el gel a las membranas Immobilon-P
(Millipore, Billerica, MA, USA) se realizó con un aparato Transblot modelo 2051 de
LKB/Pharmacia a 250 mA durante dos horas en tampón de electrotransferencia (Tris 25 mM,
Glicina 150 mM, Metanol 20%). Tras la transferencia, las membranas se bloquearon con TBS-
Materiales y Métodos
138
T (Tris-HCl 25 mM, NaCl 137 mM, Tween 20 0.05%) con leche desnatada en polvo al 5%
durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se incubaron con
los anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo a 4ºC durante toda la noche. Las
membranas se lavaron con TBS-T (3 lavados de 5-10 minutos) y se incubaron una hora a
temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios, biotinilados o conjugados con la
enzima peroxidasa, diluidos 1:2000 en solución de bloqueo. En el caso del anticuerpo
secundario biotinilado, las membranas se trataron con el producto comercial ImmunoPure®
ABC Peroxidase Staining kit Standard (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL, USA).
Finalmente las membranas se lavaron con TBS-T (3x5-10 minutos). La inmunodetección se
realizó mediante el producto comercial ECL® Western Blotting analysis system (Amersham
Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany) siguiendo el protocolo del fabricante. La
membrana tratada con el ECL® se expuso en un film fotográfico para la visualización de la
señal.
2.5. TÉCNICAS IN VIVO.
2.5.1. Dieta alta en lípidos.
Para este experimento, se administró una dieta alta en lípidos (HFD) (TEKLAD, TD
88137, Madison, Wisconsin, USA) ad libitum durante seis semanas a un grupo de ratones
machos controles y transgénicos aP2-PEPCK de tres meses de edad. A otro grupo de animales
controles y transgénicos aP2-PEPCK se les siguió administrando la misma dieta estándar
utilizada para el mantenimiento de los animales (Panlab, Barcelona, España). Dado su alto
contenido lipídico, la dieta HFD es muy sensible a la oxidación y se almacena a 4ºC fuera del
alcance de la luz. Para evitar que la dieta HFD se oxidara, disminuyendo su palatabilidad, la
dieta HFD se renovó cada 3-4 días aunque quedara parte de ella.
Materiales y Métodos
139
2.5.2. Determinación del consumo de alimento.
El consumo de alimento o ingesta, tanto de dieta estándar como de dieta alta en
lípidos, se determinó en animales previamente individualizados. La cantidad de comida
ingerida se obtuvo de la diferencia entre la cantidad inicialmente adicionada y la cantidad
remanente, trascurrida una semana para la dieta estándar, o 3-4 días para la dieta HFD. El
resultado se expresó como la ingesta de alimentos en gramos por día y animal.
2.5.3. Test de tolerancia la glucosa.
Esta prueba se utiliza para determinar si el individuo es capaz de responder
correctamente a una sobrecarga de glucosa, valorando el nivel de tolerancia al azúcar.
Aquellos que presentaron unos niveles circulantes de glucosa por encima de lo normal y no
recuperaron sus niveles basales del azúcar durante el tiempo de duración del test se
consideraron intolerantes a la glucosa. Se determinó la glucemia basal en ratones despiertos y
ayunados durante una noche (aprox. 16 horas) a partir de una gota de la vena de la cola
mediante el sistema Glucometer Elite®. Tras la inyección intraperitoneal de una dosis de 1
gramo o 2 g de glucosa por kg de peso vivo, se determinó la evolución de la glucemia a lo
largo del tiempo. Los resultados se expresaron como las glucemias en mg/dL en los diferentes
puntos del experimento.
2.5.4. Test de tolerancia a la insulina.
Esta prueba permite valorar la sensibilidad corporal a la insulina de un individuo,
considerándose resistentes a la insulina aquellos que muestran una reducida respuesta
hipoglucemiante a la hormona. Tras retirar la comida a los animales, se determinó
inmediatamente la glucemia basal en ratones despiertos a partir de una gota de la vena de la
Materiales y Métodos
140
cola, mediante el sistema Glucometer Elite®. Posteriormente, se inyectó intraperitonealmente
una dosis de 0.75 U o 0.375 U de insulina por kg de peso vivo y se determinó la evolución de
la glucemia a lo largo del tiempo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de los
niveles circulantes de glucosa en los diferentes puntos del experimento, respecto a los niveles
basales previos a la inyección de la hormona (100%).
2.5.5. Determinación del índice de utilización de la glucosa in vivo.
Para la determinación del metabolismo de la glucosa in vivo en los tejidos, se utilizó
un método derivado de la técnica de Sokoloff (Sokoloff et al., 1977). Este método se basa en
las propiedades bioquímicas del análogo no metabolizable de la glucosa, 2-deoxi-D-[1-3H]-
glucosa (2-DG; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) (Ferre et al., 1985). Una vez la
2-DG circulante es captada por los tejidos a través de los mismos transportadores que la
glucosa, es fosforilada por las hexoquinasas presentes en el tejido, iniciándose así su entrada
en las vías metabólicas. Pero la forma fosforilada de la 2-DG, 2-DG-6-fosfato,
mayoritariamente no puede proseguir su metabolización y se acumula en los tejidos. Así, la
determinación intratisular de 2-DG-6-fosfato es un parámetro que nos ayuda a valorar la
capacidad de captación y utilización de la glucosa por los tejidos, siempre que su degradación
por la glucosa-6-fosfatasa (G-6Pasa) sea negligible. La actividad G-6Pasa es alta en los tejidos
gluconeogénicos (hígado y riñón) pero muy baja en el resto de tejidos (Lackner et al., 1984).
Para la determinación del índice de utilización basal de la glucosa in vivo en el músculo
esquelético y en el WAT, se inyectó intravenosamente 1 µCi de 2-DG a animales machos
controles y transgénicos aP2-PEPCK y aP2-GK alimentados. Para la determinación del índice
de utilización de la glucosa in vivo estimulada por insulina, se inyectó intraperitonealmente
0.75 IU de insulina/kg de peso vivo (Humulina Regular®; Eli Lilly, Indianapolis, IN) a los
ratones a tiempo 0. Los ratones se anestesiaron y se les inyectó 2-DG a través de la vena
yugular. La eliminación específica de 2-DG de la circulación se determinó según el método de
Materiales y Métodos
141
Somogyi (Somogyi M., 1945), a partir de 25 µL de sangre extraída de la cola a los tiempos 1,
15 y 30 minutos después de la inyección. Transcurridos 30 minutos, los animales se
sacrificaron, y el WAT epididimal y los músculos esqueléticos gastrocnemio y cuadriceps se
extrajeron rápidamente. El índice de utilización de la glucosa se determinó como la medida de
la acumulación de compuestos radiomarcados en músculo esquelético y WAT (Ferre et al.,
1985). La cantidad de 2-DG-6-fosfato por miligramo de proteína del tejido se dividió por la
disponibilidad de 2-DG circulante para los tejidos, calculada como la integral de la relación
entre la concentración de 2-DG y la glucosa no marcada en la sangre. Como los valores no
estaban corregidos por la “constante de discriminación” de la 2-DG en las vías metabólicas de
la glucosa, los resultados se expresaron como el índice de utilización de la glucosa, en
picomoles por miligramo de proteínas por minuto.
2.6. TÉCNICAS IN VITRO.
2.6.1. Determinación de la gliceroneogénesis y de la síntesis de novo de
ácidos grasos a partir del piruvato.
Para la determinación de la síntesis de glicerol-3-P y la síntesis de novo de ácidos
grasos a partir del piruvato, se incubó in vitro el tejido adiposo blanco epididimal con [2-14C]-
piruvato (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany). Los ratones se
anestesiaron, se sacrificaron y se diseccionó el tejido adiposo blanco epididimal (WAT).
Fragmentos de WAT de aproximadamente 200 mg de peso se incubaron a 37ºC durante 2
horas en 3 mL de tampón Krebs-Ringer Bicarbonato HEPES (KRBH) a pH 7.4 y conteniendo
3% de BSA (libre de ácidos grasos), junto con 5 mmol/L de piruvato y 0.3 µCi de [2-14C]–
piruvato. Tras la incubación, los lípidos se extrajeron del tejido mediante cloroformo:metanol
(2:1) según el método de Folch (Folch et al., 1957). De los lípidos totales extraídos, se
separaron los ácidos grasos libres (FFAs) y el glicerol (glicerido-glicerol) siguiendo el método
Materiales y Métodos
142
de Hanson (Hanson, 1965). Este método consiste en hidrolizar los lípidos extraídos mediante
saponificación y separar las diferentes fracciones con éter de petróleo (40-60ºC). La mayor
fracción lipídica está formada por los triglicéridos, formas lipídicas saponificables. Para separar
los FFAs del glicerol, este método utiliza una propiedad física de los FFAs. Tras la
saponificación, los FFAs son solubles en agua en condiciones alcalinas pero insolubles en
condiciones ácidas, mientras que el glicerol es soluble en condiciones ácidas. Se determinó la
cantidad de 14C, procedente del [2-14C]-piruvato, en las diferentes fracciones lipídicas
separadas (lípidos totales, FFAs y glicerol). La cantidad de 14C en la fracción de los FFAs refleja
la síntesis de novo de ácidos grasos a partir del piruvato. Sin embargo, la cantidad de 14C en
la fracción del glicerol refleja la síntesis de glicerol a partir del piruvato (gliceroneogénesis).
Los resultados se expresaron como cpm de 14C divididas por la cantidad de proteínas que
tenía el tejido que se incubó y el tiempo de incubación (cpm x µg proteínas-1 x hora-1). La
concentración de proteínas del WAT incubado se determinó mediante el método Bradford.
2.6.2. Determinación de la producción de glicerol-3-P y de la síntesis de
novo de lípidos a partir de la glucosa.
Para la determinación de la síntesis de glicerol-3-P y la síntesis de novo de lípidos a
partir de la glucosa, se incubó in vitro el tejido adiposo blanco epididimal con D-[U-14C]-
glucosa (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany). Esta determinación se
realizó de la misma forma que la de la gliceroneogénesis y la síntesis de ácidos grasos a partir
del piruvato. La única diferencia consistió en incubar los fragmentos de WAT con 5 mmol/L de
glucosa y 0.3 µCi de D-[U-14C]-glucosa, en vez de 5 mmol/L de piruvato y 0.3 µCi de [2-14C]-
piruvato. La extracción de lípidos y la separación del glicerol de los FFAs se realizó de la forma
anteriormente descrita. Se determinó la cantidad de 14C, procedente de la D-[U-14C]-glucosa,
en las diferentes fracciones lipídicas separadas (lípidos totales, FFAs y glicerol). La cantidad de
14C en la fracción del glicerol refleja la síntesis de glicerol-3-P a partir de la glucosa. Los
Materiales y Métodos
143
resultados se expresaron como cpm de 14C divididas por la cantidad de proteínas que tenía el
tejido que se incubó y el tiempo de incubación (cpm x µg proteínas-1 x hora-1). La
concentración de proteínas del WAT incubado se determinó mediante el método Bradford.
2.6.3. Determinación de la reesterificación de los ácidos grasos.
Para la determinación de la reesterificación de los ácidos grasos libres por el tejido
adiposo in vitro se utilizó el método descrito por Vaughan (Vaughan, 1962). Al igual que en la
determinación de la gliceroneogénesis, fragmentos de WAT epididimal se incubaron in vitro a
37ºC durante 2 horas en 3 mL de tampón Krebs-Ringer Bicarbonato HEPES (KRBH) a pH 7.4 y
conteniendo 3% de BSA (libre de ácidos grasos), junto con 5 mmol/L de piruvato. Otros
fragmentos de WAT se procesaron sin la incubación previa con piruvato para la determinación
del contenido de FFAs y glicerol a tiempo cero. Los lípidos se extrajeron del tejido, antes y
después de la incubación con piruvato, mediante cloroformo:metanol (2:1) según el método
de Folch (Folch et al., 1957). Posteriormente, a partir del extracto lipídico, se separaron los
ácidos grasos libres (FFAs) y el glicerol siguiendo el método de Hanson (Hanson, 1965). Los
FFAs y el glicerol se determinaron, tanto en el tejido como en el medio, antes y después de la
incubación. La tasa de reesterificación de FFAs se calculó como la diferencia entre la cantidad
teórica de FFAs liberados por el tejido adiposo a partir de triglicéridos (lipólisis), y la cantidad
real de FFAs liberados al medio tras la incubación más la cantidad de FFAs presente en el
tejido adiposo a tiempo cero. La cantidad teórica de FFAs liberados a través de la lipólisis se
calculó a partir de la cantidad de glicerol producido, asumiendo que 3 moles de FFAs son
producidos por cada mol de glicerol. La cantidad de glicerol producido es un fiel reflejo de la
tasa lipolítica del WAT (Vaughan, 1962). La cantidad de glicerol producido se determinó como
la diferencia entre la cantidad de glicerol en el tejido adiposo a tiempo cero, y la cantidad de
glicerol presente en el tejido adiposo incubado más la cantidad de glicerol en el medio de
incubación.
Materiales y Métodos
144
2.6.4. Consumo de glucosa y producción de lactato por el WAT epididimal.
Para la determinación del consumo de glucosa y la producción de lactato por el tejido
adiposo blanco, fragmentos de WAT se incubaron a 37ºC durante 2 horas en 3 mL de tampón
Krebs-Ringer Bicarbonato HEPES (KRBH) a pH 7.4 y conteniendo 3% de BSA (libre de ácidos
grasos), junto con dos concentraciones de glucosa diferentes: glucosa 20 mM y glucosa 2 mM
(Ferre et al., 1996b). Se utilizaron dos concentraciones de glucosa, una basal (2 mM) que
activa otras hexoquinasas presentes en WAT (HKI y HKII), y una concentración alta (20 mM)
para activar preferentemente la enzima glucoquinasa. Durante ambas incubaciones, se
tomaron alícuotas de 100 µL de medio de incubación a lo largo del tiempo para determinar la
concentración de glucosa remanente y la producción de lactato. Tanto la concentración de
glucosa del medio como la de lactato, se determinaron mediante el autoanalizador PENTRA
400 de ABX, tal y como se describe posteriormente. El consumo de glucosa en los diferentes
tiempos se expresó como porcentaje respecto a la glucosa inicial que se añadió (100%). La
producción de lactato se expresó como la cantidad de lactato producido en nanomoles/L por
miligramo de WAT incubado.
2.7. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PEPCK CITOSÓLICA.
La actividad PEPCK citosólica en el tejido adiposo e hígado se determinó siguiendo el
método de Chang and Lane (Chang and Lane, 1966). Este método se basa en la carboxilación
del fosfoenolpiruvato (P-enolpiruvato) a partir de HCO3- y de inosin difosfato (IDP). Además,
utiliza la enzima malato deshidrogenasa (MDH) para reducir el oxalacetato producido por la
PEPCK a malato, un compuesto más estable a pH ácido.
PEPCK MDH
PEP -----------------> Oxalacetato --------------------> Malato
+IDP+ HCO3- +NADH
Materiales y Métodos
145
Las muestras de hígado y tejido adiposo se homogenizaron en 10 volúmenes de
tampón homogenado (Glicin-glicina 50 mM, KCl 120 mM, DTT 1 mM, Aprotinina 20U/mL,
PMSF 0.1 mM) por peso de muestra para el hígado, y en 5 para el tejido adiposo, para
conseguir una concentración de proteínas de aproximadamente 10 mg/dL. Los homogenados
se centrifugaron a 10000xg durante 10 minutos a 4°C y, a partir del sobrenadante, se
determinó la actividad enzimática y la concentración de proteínas por el método Bradford.
En un volumen de 450 µL de solución de reacción (Imidazol HCl 0.5 mM pH 6.6, IDP
25 mM, MnCl2 20 mM, DTT 20 mM, NADH 50 mM, MDH 125U/mL, 14CO3HNa (0,2 µCi/µmol)
50 mM, P-enolpiruvato 1.25 mM) se añadieron 50 µL del sobrenadante del homogenado de
hígado o de tejido adiposo, y se dejó incubar 10 minutos a 30°C. La reacción se paró
añadiendo un volumen de HCl 2 N. Unos 800 µL de la reacción se calentaron durante una
hora a 80ºC con el fin de evaporar la muestra. El residuo se resuspendió en 500 µL de agua,
se le añadieron 4.5 mL de líquido de centelleo y se determinó la cantidad de malato
radioactivo producido. La actividad enzimática PEPCK se expresó en mU por mg de proteína, y
se representó como porcentaje respecto a la actividad enzimática PEPCK de los animales
controles (100%).
2.8. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR A PARTIR DE EXTRACTOS.
Para estudiar las diferentes vías metabólicas que pudieran estar alteradas en los
ratones transgénicos aP2-GK, se utilizó la técnica de la resonancia magnética nuclear (RMN)
en extractos tisulares enriquecidos con 13C-glucosa. Este experimento se realizó en
colaboración con el laboratorio del Dr. Cerdán (Instituto de Investigaciones Biomédicas
“Alberto Sols”, CSIC, Universidad Autónoma de Madrid). Para ello, se inyectó
intraperitonealmente una dosis de 3 gramos de [1-13C]-glucosa (99.9% 13C) por kg de peso
vivo a cinco ratones controles y cinco transgénicos aP2-GK alimentados y anestesiados.
Transcurridos 30 minutos, los ratones aún anestesiados se sacrificaron mediante una
Materiales y Métodos
146
irradiación, de 2 segundos a 5 kW, focalizada en el cerebro con un microondas (Muromatsi Co,
Tokio, Japan). Posteriormente, se extrajo el tejido adiposo blanco epididimal y el hígado de
estos animales y se mantuvieron a -80ºC hasta su procesamiento. La extracción acuosa de
ambos tejidos se realizó con ácido perclórico (HClO4 al 10%) (Cerdan et al., 1986;Cerdan et
al., 1990). Los extractos acuosos se neutralizaron, se liofilizaron y se mantuvieron congelados
a -20ºC hasta su análisis por RMN de 13C. Justo antes del análisis por RMN de los extractos, el
liofilizado se resuspendió en un volumen final de 0.5 mL agua deuterada (99.9% 2H2O),
ajustando su pH a 7.2. Dado que la cantidad de metabolitos en el extracto acuoso del WAT
epididimal era muy baja, se mezclaron los cinco extractos acuosos del WAT de cada grupo.
2.8.1. Espectroscopia de la RMN de 13C.
Los espectros del desacoplo de protones de la RMN de 13C se obtuvieron gracias a un
espectrómetro de RMN (Bruker AVANCE 500WB), utilizando una sonda comercial de 1H y 13C
de 5 mm, optimizada para la detección directa de la RMN de 13C. Las condiciones a las que se
sometieron las muestras para obtener el espectro fueron: 11.9 Tesla, 125.13 MHz a 25ºC y pH
7.2. Las condiciones de adquisición de los espectros fueron: π/3 pulsos, un ancho de espectro
de 30.0 kHz, un tiempo de adquisición de 1.09 segundos, un tiempo de reciclado de 6.0
segundos y los datos se exportaron como tabla de datos de 64 k. El desacoplamiento de los
protones se registró únicamente durante el tiempo de adquisición, utilizando una secuencia de
desacoplamiento pulsátil compuesta de banda ancha (Shaka AJ, 1983). Los desplazamientos
químicos se calibraron gracias a un compuesto de referencia externo, el dioxano (10%
vol/vol). La asignación de los diferentes picos obtenidos en la resonancia a los diferentes
compuestos se basó en los valores de la literatura y la adición de estándares internos (Cerdan
et al., 1990). Los espectros obtenidos y las múltiples estructuras se analizaron utilizando el
programa informático de RMN para PC MestRe-C (Mestrelab Research, Santiago de
Compostela).
Materiales y Métodos
147
2.8.2. Asignaciones de las posiciones de la RMN de 13C del WAT y cálculos.
Una vez asignada la referencia externa (dioxano) como la estructura múltiple con
mayor intensidad del espectro, se posicionó el resto de estructuras respecto su posición (67.4
ppm). Gracias a la literatura y al asesoramiento del Dr. Cerdán, se asignaron y se posicionaron
diferentes compuestos, entre ellos el C3 del lactato (21 ppm) y los isómeros α y β de la [1-13
C]-glucosa (92 ppm y 96 ppm, respectivamente). El C3 del glicerol-3-P (65.6 ppm) no pudo
asignarse dado su presencia indetectable en los espectros de WAT, tanto en ratones controles
como en transgénicos aP2-GK. Cualitativamente se comparó el espectro obtenido a partir del
WAT epididimal de cinco ratones aP2-GK con el espectro obtenido de cinco ratones controles.
Para cuantificar los resultados, se calculó la relación entre las distintas intensidades de las
estructuras asignadas respecto la intensidad del dioxano. La intensidad del dioxano sólo
depende del tipo de capilar utilizado. Se utilizó el mismo tipo de capilar para todas las
muestras para que la intensidad del dioxano fuera independiente de la cantidad de muestra
“inyectada” en el espectrómetro de RMN. Sin embargo, la intensidad de los diferentes
compuestos sí dependía de la cantidad de muestra. Así, las relaciones de intensidades
compuesto/dioxano calculadas se normalizaron por la cantidad, en miligramos, de tejido
adiposo procesado en cada grupo. La cantidad de [1-13 C]-glucosa presente en el WAT se
obtuvo a partir de la suma de los isómeros de la [1-13 C]-glucosa, α yβ.
Para determinar la concentración de cada uno de los metabolitos asignados en los
espectros, se realizó una RMN de 13C a partir de una solución estándar que contenía 20 mM de
glucosa, 20 mM de glicerol-3-P y 20 mM de lactato. Como la abundancia de 13C es del 1.1%
entre el carbono de la naturaleza, en realidad la solución estándar contenía 0.22 mM de [13C]-
glucosa, 0.22 mM de [13C]-glicerol-3-P y 0.22 mM de [13C]-lactato. A partir del espectro de
RMN de 13C de esta solución estándar, se cuantificaron las concentraciones de glucosa y
lactato intracelulares presentes en el WAT epididimal de animales controles y transgénicos
Materiales y Métodos
148
aP2-GK. Las concentraciones de ambos metabolitos se expresaron como nanomoles x gramo
de WAT-1 y se obtuvieron a partir de los extractos perclóricos de 5 animales por cada grupo.
2.9. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE GRASA CORPORAL.
Para determinar el contenido de grasa corporal se utilizó la carcasa de los ratones
siguiendo el método de Salmon y Flatt (Salmon and Flatt, 1985). Para la obtención de la
carcasa, los ratones se pesaron, se sacrificaron, y se separaron los intestinos y el estómago,
pesando finalmente la carcasa. Las carcasas de los animales se digirieron en 50 mL de
solución de KOH etanólica al 10% durante 48 horas a 60°C. Tras la digestión, las muestras se
pesaron y se tomaron alícuotas de 500 µL de la digestión. A estas alícuotas se les añadió 50
µL de MgCl2 5 M y se mantuvieron en hielo durante 10 minutos. Posteriormente se
centrifugaron a 16000xg durante 10 minutos. A partir del sobrenadante resultante se
determinó la concentración de triglicéridos. Tras determinar la cantidad de grasa corporal total
de cada animal, en gramos de triglicéridos, se representó en porcentaje de grasa corporal
respecto el peso total de la carcasa previa a la digestión.
2.10. DETERMINACIÓN DE METABOLITOS HEPÁTICOS.
Para la determinación de los metabolitos hepáticos, las muestras hepáticas se
obtuvieron mediante freeze-clamp. Para ello, los ratones controles y transgénicos se
anestesiaron mediante la inyección intraperitoneal de una solución anestésica. Para la
preparación de 10 mL de la solución anestésica, se mezcló 0.5 mL de Rompun® (hidroclorato
de xylacina al 2%, Bayer, Leverkusen, Germany) con una solución de 2 mL de Imalgene®
(hidroclorato de ketamina al 0.5%, Merial, Lyon, France) y 7.5 mL de suero fisiológco. Esta
solución anestésica se preparó inmediatamente antes de su uso. Para anestesiar los animales,
se inyectó intraperitonealmente 10 µL de solución anestésica por gramo de peso. Mientras el
Materiales y Métodos
149
animal estaba anestesiado, se abrió la cavidad abdominal y las muestras hepáticas se
congelaron inmediatamente mediante pinzas enfriadas con nitrógeno líquido (rapid freeze-
clamp). Así, se evitaron al máximo las alteraciones post-mortem en las concentraciones
intrahepáticas de los metabolitos, gracias a la inmediata congelación del tejido mientras aún
estaba anestesiado el animal. Tras la recogida de las muestras hepáticas, éstas se
mantuvieron a -80ºC hasta su procesamiento y determinación de los distintos metabolitos.
2.10.1. Determinación del contenido de glucógeno, glucosa-6-fosfato y
lactato.
A partir de la misma muestra hepática se determinaron el glucógeno, la glucosa-6-
fosfato y el lactato. Fragmentos de hígado de aproximadamente 100 mg se homogenizaron en
10 volúmenes de ácido perclórico frío (HClO4) al 10% mediante un homogenizador de tipo
Polytron®. Tras centrifugar el extracto ácido del hígado a 6000xg durante 5 minutos a 4ºC, se
recuperó el sobrenadante. A partir de este sobrenadante, se realizaron dos alícuotas de 400
mL cada una. A partir de una alícuota se determinó la cantidad de glucógeno hepático y a
partir de la otra, la concentración hepática de lactato y de glucosa-6-fosfato.
2.10.1.1. Determinación del contenido de glucógeno.
El contenido de este polisacárido se determinó mediante el método descrito por
Keppler y Decker (Keppler D. and Decker K., 1974). Este método se basa en la utilización de
la enzima α-amiloglucosidasa para degradar los enlaces del glucógeno, liberando las
moléculas de glucosa. La glucosa liberada por esta enzima se determinó
espectrofotométricamente mediante el autoanalizador PENTRA 400 de ABX, utilizando el
producto comercial Glucose HK CP (ABX Diagnostics, Montpellier, France).
Se añadió una gota de indicador universal a los extractos hepáticos para visualizar el
pH del extracto y poder ajustarlo a pH 5 con diluciones de HClO4 10% y K2CO3 5M. Los tubos
Materiales y Métodos
150
que contenían los 400 µL y la gota del indicador, se pesaron antes y después de ajustar el pH,
para determinar así el grado de dilución provocado al ajustar el pH, asumiendo una densidad
igual a 1. Una vez ajustado el pH a 5, se tomaron dos alícuotas de 100 µL. A una de ellas, se
le añadió 100 µL de solución de α-amiloglucosidasa (10 U/mL en tampón acetato sódico 0.4 M
pH 4.8), mientras que a la otra se le añadió 100 µL de solución de tampón acetato sódico 0.4
M pH 4.8. Ambas alícuotas se incubaron durante dos horas en un baño a 50ºC y se añadió
250 mL de HClO4 al 10% para parar la reacción. Finalmente, las muestras se centrifugaron
16000xg durante 10 minutos a 4ºC y se determinó la concentración de glucosa en el
sobrenadante recuperado. La cantidad de glucógeno hepático se calculó como la diferencia en
la concentración de glucosa entre las muestras incubadas con α-amiloglucosidasa respecto a
las que no, por peso de hígado y teniendo en cuenta la dilución provocada al ajustar el pH.
2.10.1.2. Determinación del contenido de glucosa-6-fosfato y
lactato.
El contenido hepático de estos metabolitos se determinó espectrofotométricamente
mediante el autoanalizador PENTRA 400 de ABX. En el caso del lactato hepático, se utilizó el
producto comercial Lactic Acid de ABX (ABX Diagnostics, Montpellier, France), mientras que
para la glucosa-6-fosfato (G6P) se adaptó el método descrito por Michal al autoanalizador
PENTRA 400 de ABX (Lang G and Michal G., 1974).
Se añadió una gota de indicador universal a los extractos hepáticos para visualizar el
pH del extracto y poder ajustarlo a pH 7 con diluciones de HClO4 10% y K2CO3 5M. Los tubos
que contenían los 400 µL y la gota del indicador, se pesaron antes y después de ajustar el pH,
para determinar así el grado de dilución provocado al ajustar el pH. Una vez ajustado el pH a
7, las muestras se centrifugaron a 16000xg durante 10 minutos a 4ºC y se determinó la
concentración de G6P y lactato en el sobrenadante recuperado. Ambas cantidades se
expresaron por peso de hígado, teniendo en cuenta la dilución provocada al ajustar el pH.
Materiales y Métodos
151
2.10.2. Determinación del contenido de triglicéridos hepáticos.
A partir de las muestras hepáticas obtenidas mediante freeze-clamp, se determinó la
cantidad de triglicéridos hepáticos utilizando el método descrito por Carr et al. (Carr et al.,
1993). Los triglicéridos se extrajeron del tejido siguiendo el método de Folch utilizando la
mezcla cloroformo:metanol (2:1) (Folch et al., 1957). Para ello, fragmentos congelados de
hígado de aprox. 100 mg se pesaron y se homogenizaron en 15 mL de cloroformo:metanol
(2:1). Las fases acuosas y lipídicas se separaron mediante la adición de 3 mL de H2SO4 al
0.05% y mantenidas a 4ºC durante toda una noche. Una vez separadas ambas fases, se
eliminó la fase superior acuosa con una pipeta Pasteur y se recuperó 1 mL de la fase inferior
lipídica en un tubo de vidrio de 5mL. Se añadió 1 mL de una solución de cloroformo/TRITON
X-100 al 1% y posteriormente se incubó en un baño a 90ºC, para evaporar el cloroformo.
Gracias al cloroformo y al TRITON X-100, que es un sulfactante no iónico utilizado como
detergente para emulsionar los lípidos en fases acuosas, se eliminó de la fase lipídica
recuperada cualquier resto de fase acuosa que hubiéramos podido recuperar. Para concentrar
la muestra tras la evaporación, se pasó cloroformo por las paredes del tubo de vidrio y se
volvió a calentar a 90ºC para evaporar el cloroformo. Se repitió nuevamente la adición de
cloroformo y el calentamiento a 90ºC, para concentrar la muestra en el fondo del tubo de
vidrio. Una vez el sedimento estuvo completamente seco y concentrado, se resuspendió en
500 µL de H2O miliQ en un baño a 37ºC, y posteriormente se homogenizó totalmente con la
ayuda de la pipeta y/o por agitación. Tras la resuspensión, se determinó la cantidad de
triglicéridos y se expresaron en miligramos de triglicéridos por peso de tejido.
Materiales y Métodos
152
2.11. PCR SEMICUANTITATIVA EN TIEMPO REAL.
Se cuantificaron los niveles de expresión génica en el tejido adiposo mediante la
técnica semicuantitativa de la PCR en tiempo real. A partir las muestras congeladas de WAT
epididimal, se extrajo el RNA total siguiendo el protocolo comercial del QIAzol®, como ya se
ha descrito. La determinación de los niveles de expresión génica se realizó en dos pasos: un
primer paso para obtener el cDNA del WAT epididimal y un segundo paso, la PCR
semicuantitativa en tiempo real propiamente dicha. Con el RNA extraído del tejido adiposo, se
obtuvo la cadena complementaria de DNA (cDNA) de todos los RNAs mensajeros (mRNA)
presentes en las muestras mediante retrotranscripción del mRNA. En un volumen final de 20
µL y a partir de 1 µg de RNA total, se obtuvo el cDNA mediante el producto comercial
Omniscript RT® kit (QIAGEN Sciences, Maryland, USA). También se utilizó oligo-dT como
cebador de la reacción y el producto comercial Protector RNase Inhibitor como inhibidor de
RNasas, ambos de Roche (Roche Diagnotics GMBH, Mannheim, Germany).
Una vez obtenido el cDNA procedente del WAT epididimal, se determinó la expresión
génica semicuantitativa mediante PCR en tiempo real utilizando el sistema SmartCycler II®
(Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) y el producto comercial QuantiTect® SYBR® Green PCR
(QIAGEN Sciences, Maryland, USA). Cada reacción de 25 µL contenía 2 µL de una dilución
1:10 del cDNA, 12.5 µL de la QuantiTect® SYBR® Green PCR Master mix (MgCl2 2.5 mM) y el
par de oligonucleótidos o primers (forward y reverse), específicos para cada gen determinado,
a una concentración final de 0.4 µM (Tabla 1).
Materiales y Métodos
153
Genes Producto Primer 5‘ (forward) Primer 3‘ (reverse)
Slc2a4 GLUT4 TCAGGCATCAATGCTGTTTTCTAC TGGCACAGCCACACATGC
Hk2 HK2 GAAGGGGCTAGGAGCTACCA CTCGGAGCACACGGAAGTT
Pfkm
Pklr
LDH-a TGTCTCCAGCAAAGACTACTGT GACTGTACTTGACAATGTTGGGA
Ucp2 UCP2 ACTTTCCCTCTGGATACCGC ACGGAGGCAAAGCTCATCTG
Ucp3 UCP3 CTGCACCGCCAGATGAGTTT ATCATGGCTTGAAATCGGACC
Ppara PPARα TCGGCGAACTATTCGGCTG GCACTTGTGAAAACGGCAGT
Pparg PPARγ TCGCTGATGCACTGCCTATG GAGAGGTCCACAGAGCTGATT
Cpt1a L-CPT1 GCACTGCAGCTCGCACATTACAA CTCAGACAGTACCTCCTTCAGGAAA
Ppargc1a PGC-1α ATACCGCAAAGAGCACGAGAAG CTCAAGAGCAGCGAAAGCGTCACAG
36B4 36B4 GGCCCTGCACTCTCGCTTT TGCCAGGACGCGCTTGT
Pdha1
Ldh1
TCAAGGCAGGGATGAACATTG CACGGGTCTGTAGCTGAGTG
GAAATGTGACCTTCATCGGCT TGATCCGCCTTTAGCTCCATC
L-PK
PDHE1
Cox4i2 COX IV ACTACCCCTTGCCTGA GCCCACAACTGTCTTCCATT
CATCGCCGTGTTGACCTCTG ATCGGGCACTTCCAATCACPFKM
Acaca ACC TGACAGACTGATCGCAGAGAAAG TGGAGAGCCCCACACACA
Fasn FASN GCTGCGGAAACTTCAGAAAT AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT
Srebf1 SREBP-1c GGAGCCATGGATTGCACATT GCTTCCAGAGAGGAGGCCAG
CD36 CD36 GATGTGGAACCCATAACTGGATTCAC GGTCCCAGTCTCATTTAGCCACAGTA
Lipe HSL ATGGATTTACGCACGATGACACAG TAGCGTGACATACTCTTGCAGGAA
Tabla 1. Primers utilizados en la PCR en tiempo real semicuantitativa. Listado de los oligonucleótidos (forward y reverse) utilizados en la determinación de la expresión de los diferentes genes.
Las condiciones de tiempo y temperatura utilizadas en las PCRs fueron: un primer
ciclo de 15 minutos a 95ºC, seguido de 45 ciclos de amplificación (fase de desnaturalización:
15 segundos a 95ºC; fase apareamiento oligonucleótidos: 15 segundos a 60ºC; fase de
extensión: 30 segundos a 72 ºC). La reacción se realizó por triplicado a partir de las muestras
de cDNA independientes de tres animales por grupo control y transgénico. La tecnología
SmartCycler II® nos proporcionó, para cada gen analizado, el cálculo de las Cts de cada
muestra por cada triplicado. Las Cts corresponden al número de ciclo en que se produce el
incremento significativo de la fluorescencia de la reacción, el cual es proporcional al número
de moléculas de cDNA iniciales. A partir de estas Cts, se calculó el nivel de expresión génica
de los distintos genes analizados en ambos grupos de animales mediante la fórmula
matemática descrita por Pfaffl (Pfaffl, 2001). Para observar diferencias en la expresión génica
entre ambos grupos de animales, se estandarizó la expresión de los distintos genes mediante
Materiales y Métodos
154
la cantidad de cDNA total presente en cada muestra. Para determinar la cantidad de cDNA
total, se determinaron los niveles de expresión de un gen cuya expresión no fuera alterada
por el transgen, gen housekeeping. En nuestro calculo, se utilizó la expresión del gen 36B4
como gen housekeeping. Los resultados se expresaron como la relación entre el nivel de
expresión de un gen en los animales transgénicos y el de los controles, ambos estandarizados
por la expresión del gen 36B4 en cada uno (ratio= 2-∆Cts gen (Con-Tg)/ 2-∆Cts 36B4 (Con-Tg)). Así, los
datos se representaron como la expresión de mRNA de cada gen en los ratones transgénicos
relativa al nivel de expresión de los controles (ratio=1).
2.12. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS SANGUÍNEOS.
Para la obtención de suero, los animales se anestesiaron y se sacrificaron por
decapitación. Inmediatamente la sangre se recogió en tubos eppendorf no heparinizados y se
coaguló mantenida en hielo. Se obtuvo el suero tras la centrifugación de la sangre coagulada
a 6000xg durante 15 minutos a 4ºC. Para las determinaciones séricas o plasmáticas de
metabolitos u hormonas en que no era necesario un gran volumen de muestra, o
experimentos a lo largo del tiempo, se extrajeron pequeños volúmenes de sangre a partir de
la cola de los ratones vivos. En estos casos, a partir de animales despiertos, se extrajeron
unos 100 µL de sangre procedente de la vena de la cola del ratón. Este volumen se recogió en
tubos Microvette® CB300 (Sarstedt, St Laurent, QC, Canada). En el caso de las
determinaciones séricas, se utilizaron Microvette® CB300 impregnados con un activador de la
coagulación, mientras que para las plasmáticas (lactato y triglicéridos) se utilizaron
Microvette® CB300 impregnados con fluoride (NaF), un inhibidor de la glucólisis. En ambos
casos, los Microvette® CB300 se centrifugaron a 6000xg durante 15 minutos a 4ºC para
recuperar el suero o plasma, según el caso. Tanto el suero como el plasma se mantuvieron
congelados a -20ºC hasta el momento de la determinación de los diferentes parámetros.
Materiales y Métodos
155
2.12.1. Metabolitos sanguíneos.
2.12.1.1. Glucosa sanguínea.
La glucosa circulante se determinó a partir de una gota de sangre (5 µL) procedente
de la cola de los ratones, mediante el sistema Glucometer Elite® (Bayer, Leverkusen,
Germany). En el caso de la concentración de glucosa en el medio de incubación, se determinó
mediante el autoanalizador PENTRA 400 de ABX utilizando el producto comercial Glucose HK
CP de ABX (ABX Diagnostics, Montpellier, France).
2.12.1.2. Triglicéridos.
A partir de plasma sanguíneo, extractos hepáticos y extractos procedentes de la
digestión de la carcasa, se determinaron los triglicéridos espectrofotométricamente siguiendo
el método enzimático GPO-PAP (Fossati and Prencipe, 1982). Este método está basado en la
cuantificación del cromógeno quinoneimina (PAP), obtenido a partir de p-clorofenol y 4-
aminoantipirina (4-AAP) tras acoplar tres reacciones enzimáticas. Estas tres reacciones
enzimáticas están catalizadas por las enzimas glicerol quinasa, glicerol-3-fosfato oxidasa
(GPO) y la peroxidasa. En los diferentes ensayos se utilizó el producto comercial GPO-PAP
(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) adaptándolo al autoanalizador COBAS MIRA. Cuando
el volumen de muestra era demasiado reducido para el autoanalizador, se adaptó el protocolo
para realizarlo manualmente en placas de 96 pocillos y se utilizó un lector de ELISA para la
lectura de las absorbancias.
2.12.1.3. Ácidos grasos libres.
Los ácidos grasos no esterificados (FFAs) se determinaron mediante el método
enzimático de la acil-CoA sintetasa y acil-CoA oxidasa (ACS-ACOD) utilizando el producto
comercial NEFA C (Wako Chemicals, Neuss, Germany) adaptado al autoanalizador COBAS
MIRA. Los FFAs se determinaron tanto en suero como en extractos de tejido adiposo y medio
Materiales y Métodos
156
de incubación en los experimentos del tejido adiposo in vitro. En los casos de deficiencia en el
volumen de suero, se adaptó el protocolo para realizarlo manualmente en placas de 96
pocillos pocillos y se utilizó un lector de ELISA para la lectura de las absorbancias.
2.12.1.4. Glicerol.
La concentración de glicerol se determinó enzimáticamente mediante el producto
comercial de Roche Molecular Diagnostics adaptado al autoanalizador COBAS MIRA, en suero,
en extractos de tejido adiposo y en el medio de incubación.
2.12.1.5. Lactato.
Tanto la determinación del lactato hepático como la concentración de lactato del
medio de incubación se realizaron mediante la utilización del producto comercial Lactic Acid de
ABX (ABX Diagnostics, Montpellier, France) adaptado al autoanalizador PENTRA 400 de ABX.
En la determinación de los niveles plasmáticos de lactato se adaptó el protocolo, para
realizarlo manualmente en placas de 96 pocillos y se utilizó un lector de ELISA para la lectura
de las absorbancias.
2.12.1.6. Cuerpos cetónicos (β-hidroxibutirato).
Los niveles séricos de β-hidroxibutirato se determinaron mediante el autoanalizador
COBAS MIRA, utilizando el método colorimétrico del producto comercial D-3-Hydroxybutiric
acid de Roche (Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland).
Materiales y Métodos
157
2.12.2. Hormonas séricas.
Todas las determinaciones hormonales se realizaron a partir de muestras séricas.
2.12.2.1. Insulina.
La insulina circulante se determinó en 100 µl de suero mediante radioinmunoensayo
(RIA) con el producto comercial INSULIN-CT (CIS Bio International, Gif-Sur-Yvette, Cedex,
France). También se determinó la insulina circulante a partir de 5 µL de suero utilizando la
técnica del ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), mediante el producto
comercial Rat Insulin ELISA kit (Crystal Chemical, Chicago, IL). Los sueros procedentes de
animales alimentados con la dieta HFD se diluyeron 1:10 con el diluyente de muestras
proporcionado por el kit, ya que el rango de linealidad es de 0.156-10 ng/mL.
2.12.2.2. Leptina.
La concentración de leptina sérica se determinó en 5 µL de suero mediante ELISA
con el producto comercial Mouse Leptin ELISA kit (Crystal Chemical, Chicago, IL). Los sueros
procedentes de animales alimentados con la dieta HFD se diluyeron 1:10 con el diluyente de
muestras proporcionado por el kit, ya que el rango de linealidad es de 0.2-12.8 ng/mL.
2.12.2.3. Citoquinas: TNF-α e IL-6.
Los niveles circulantes de TNF-α e IL-6 también se determinaron mediante ELISA,
utilizando los productos comerciales Murine TNF-α ELISA y Murine IL-6 ELISA kit (ambos son
de Diaclone Research, Besançon, France distribuidos por Cell Sciences, Inc.). Para la
determinación de los niveles séricos de TNF-α e IL-6 se utilizaron 100 µL de suero. En los
ratones controles, los niveles circulantes de ambas citoquinas son muy bajos, siendo
difícilmente detectables.
Materiales y Métodos
158
2.12.2.4. Adiponectina.
Los niveles de adiponectina circulante se determinaron mediante RIA con el producto
comercial Mouse Adiponectin RIA kit (LINCO Research, St. Charles, Missouri, USA) a partir de
100 µL de muestra diluida. Como los niveles séricos de adiponectina son muy altos (µg/mL) y
el rango del ensayo es muy bajo (1-100 ng/mL), los sueros se diluyeron 1:1000.
2.13. ANÁLISIS HISTOLÓGICOS.
Tras el sacrificio de los animales, el tejido adiposo blanco (WAT) epididimal, el tejido
adiposo marrón (BAT) interescapular y el hígado se fijaron en formalina (formol al 10%)
durante 24-48 horas a 4ºC, incluidas en parafina y seccionadas (2-3µm). Posteriormente, los
cortes histológicos se desparafinaron y se tiñeron con hematoxilina/eosina. Para ello, las
secciones se tiñeron con hematoxilina, se lavaron y se tiñeron de nuevo con eosina. A
continuación, las muestras se deshidrataron y se aclararon para posteriormente montar los
portaobjetos. Los cortes histológicos se visualizaron al microscopio de campo claro (Nikon
Eclipse E800 microscope, Nikon Corp. Tokio, Japan). Se captaron diferentes imágenes por
campo en diferentes campos de las secciones de los distintos tejidos, mediante una
videocámara conectada a un monitor en color.
2.13.1. Análisis morfométricos.
A partir de cortes histológicos del WAT epididimal teñidos con hematoxilina y eosina,
se realizó un estudio morfométrico para profundizar en el estudio del tamaño de los adipocitos
blancos de este tejido. En el caso de los animales transgénicos aP2-PEPCK, se determinó
manualmente el diámetro de los adipocitos. Para ello, utilizando al menos tres ratones por
grupo control y tres por grupo transgénico, se tomaron imágenes de seis campos
microscópicos (10X) diferentes por animal. Se utilizó el programa informático analySIS®3.0
Materiales y Métodos
159
(Soft Imaging System Corp., Lakewood, CO, USA) y una cámara para la captación de
imágenes (IZASA SA, Barcelona, Spain). Se determinó uno a uno y manualmente, el diámetro
en µm de los adipocitos de cada campo. Sin embargo, en el caso de los animales transgénicos
aP2-GK, se determinó el tamaño de los adipocitos como el área calculada, utilizando un
método similar al de Chen y Farese (Chen and Farese, Jr., 2002). Para ello, utilizando al
menos tres ratones por grupo, también se tomaron imágenes de seis campos microscópicos
(10X) diferentes por animal. Mediante el programa informático analySIS®3.0, las imágenes
captadas se transformaron en imagen binaria negro/blanco y se calculó automáticamente el
área de los adipocitos presentes en cada campo (µm2). Se determinó el tamaño de los
adipocitos, y la distribución del tamaño de éstos en un histograma como porcentaje del
número total de adipocitos contados para cada categoría de tamaño.
2.14. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS.
Todos las valores utilizados en este trabajo están expresados como media ± error
estándar (SE). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el test de Student-Newman-
Keuls. Las diferencias se consideraron significativas con una p < 0.05.
VIII. BIBLIOGRAFÍA.
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