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“AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓN PRODUCTIVA Y DEL
FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACIÓN”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA
“ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO
HIDROALCOHÓLICO Y ETANÓLICO DE LA HOJA DE Mansoa alliacea
“Ajo Sacha”, SOBRE Escherichia coli y Staphylococcus aureus,
IQUITOS- PERÚ”
Presentado por:
BACH. FLORES METZGER, TANIA AILEEN.
BACH. SANGAMA ROMANI, ROSA YESENIA.
Asesores:
Q.F. SOSA AMAY, FRIDA ENRIQUETA
BLGO. ADRIANZEN JULCA, PEDRO MARCELINO.
Iquitos-Perú
2015
2
DEDICATORIA
A DIOS, porque está conmigo en cada paso que doy, guiándome y dándome
fortaleza, sabiduría y humildad para continuar. A mis padres DINA DEL
ROCIO y JUAN HUMBERTO porque son quienes a lo largo de mi vida
trabajaron muy duro para darme lo mejor y hacer de mí una mujer de bien, y porque
han depositado en todo momento su entera confianza en cada reto que se me
presentaba sin dudar ni un solo momento de mi inteligencia y capacidad. A mis
hermanitos JOHNNY ABDEL Y GIANELLA NORUSKA porque son mi
compañía y motivo de seguir adelante. A mi esposito JORGE LEANDRO que
siempre me acompañó y me dio fuerzas de seguir a pesar de los obstáculos que se
presentaban en el camino. Los amo con toda mi alma.
Tania Aileen Flores Metzger
Le agradezco a DIOS por haberme acompañado y guiado a lo largo de mi Carrera,
por ser mi fortaleza en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de
aprendizaje, experiencias y sobre todo felicidad. A mis padres FELIX IVAN y
ROSA BALVINA por apoyarme en todo momento, por los valores que me han
inculcado, y por haberme dado La oportunidad de tener una excelente educación en
el transcurso de mi vida. Sobre todo por ser un excelente ejemplo de vida a seguir. A
mis hermanos JUAN IVAN y a CARLOS IVAN por ser parte importante de mi
vida y representar La unidad familiar. A mi sobrinito FFELIX ROUNALDO y mi
precioso bebe MATIAS NASSER por llenar mi vida de alegrias y amor
incondicional. A mi novio VICTOR HUGO, por ser parte importante de mi vida,
por haberme apoyado en las buenas y em lãs malas, sobre todo por su paciencia y
amor incondicional.
Rosa Yesenia Sangama Romani
3
AGRADECIMIENTOS
Brindamos nuestro más sincero agradecimiento a todas las personas que hicieron posible
la realización y culminación de este Proyecto de Tesis.
En primer lugar agradecerte a ti Dios por bendecirnos y hacer realidad este sueño
anhelado.
A la Universidad Nacional de La Amazonia Peruana y a la Facultad de Farmacia y
Bioquímica, encaminado por la Dirección de Escuela de la misma, a cargo del Q.F. Luis
Vílchez Alcalá por la oportunidad de estudiar y ser un profesional Químico
Farmacéutico.
A nuestros Asesores de Tesis, Q.F. Frida Enriqueta Sosa Amay y el Blgo. Pedro
Marcelino Adrianzen Julca por su esfuerzo y dedicación, quienes con sus conocimientos,
su experiencia, su paciencia y su motivación han logrado que nosotros podamos terminar
nuestro proyecto de tesis con éxito.
Al Instituto de Medicina Tradicional (IMET-ESSALUD), por habernos prestado sus
instalaciones, para recolección de nuestra muestra a estudiar, asimismo brindarle
nuestra especial gratitud al Ing. Villacres, por darnos la información necesaria a cerca de
esta planta.
También, a todos nuestros profesores que durante toda nuestra carrera profesional han
aportado sus conocimientos para nuestra formación, con sus consejos, sus enseñanzas y
más que toda su amistad. De igual manera agradecer a nuestros Jurados de Tesis por la
visión crítica de muchos aspectos científicos, por su rectitud en su profesión como
docentes, por sus consejos que ayudan a formarnos como persona e investigadores.
4
“ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO Y ETANÓLICO
DE LA HOJA DE Mansoa alliacea “Ajo Sacha”, SOBRE Escherichia coli y Staphylococcus aureus,
IQUITOS- PERÚ”
Bach. FLORES MEZGER, TANIA AILEEN
Bach. SANGAMA ROMANI, ROSA YESENIA
RESUMEN
En la presente investigación se determinó la actividad antimicrobiana de los extractos:
hidroalcohólico y etanólico de Mansoa alliacea “ajo sacha” (familia Bignoniaceae)
frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. La especie fue recolectada en el
Jardín Botánico del Instituto de Medicina Tradicional (IMET-ESSALUD), Distrito de
San Juan Bautista-Iquitos, Se probaron diferentes concentraciones de los extractos en
estudio por el Método de Macrodilución, usando caldo Mueller Hinton. Los resultados
de no actividad por el crecimiento de las bacterias en todas las diluciones de los
extractos evaluados determinaron que se aceptan las hipótesis nulas y se rechazan las
alternativas. Se concluyó que la planta Mansoa alliacea “ajo sacha” no presenta
actividad antibacteriana.
Palabras claves: Actividad antibacteriana, Método de tubos múltiples, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Mansoa alliacea.
5
“ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF HYDROALCOHOLIC EXTRACT AND ETHANOLIC
LEAF Mansoa alliacea “Ajo Sacha” ON Escherichia coli AND Staphylococcus aureus,
IQUITOS - PERU
Bach. FLORES MEZGER, TANIA AILEEN
Bach. SANGAMA ROMANI, ROSA YESENIA
ABSTRACT
Hydroalcoholic and ethanolic Mansoa alliacea "ajo sacha" (family Bignoniaceae) against
Escherichia coli and Staphylococcus aureus: In this research the antimicrobial activity of
the extracts was determined. The species was collected in the Botanical Garden of the
Institute of Traditional Medicine (IMET-ESSALUD), District of San Juan Bautista-
Iquitos, different concentrations of the extracts were tested in the study by macrodilution
method using Mueller Hinton results no activity for the growth of bacteria in all
dilutions of the extracts evaluated determined that the null hypothesis is accepted and
alternatives are rejected. It was concluded that Mansoa alliacea "ajo sacha" plant no
antibacterial activity.
Key words: Antibacterial activity, Method of multiple tubes, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Mansoa alliacea.
6
INDICE
DEDICATORIA 2
AGRADECIMIENTO 3
RESUMEN 4
ABSTRACT 5
INTRODUCCIÓN 9
OBJETIVOS 11
General 11
Específicos 11
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO 12
1.1. ANTECEDENTES 13
1.2. MARCO CONCEPTUAL 17
1.2.1. ESPECIE BOTANICA: Mansoa alliacea “ajo sacha” 17
A. Clasificación Taxonómica de Mansoa alliacea (Ajo sacha) 17
B. Distribución Geográfica y Hábitat 18
C. Descripción Botánica 18
D. Distribución 18
E. Usos 19
F. Composición Fitoquímica 19
1.2.2. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS 19
1.2.3. MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE 20
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
1.2.4. MÉTODOS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA 20
A. Métodos de Difusión 20
A.1. Método del Antibiograma Disco-Placa (INS - 2002) 20
A.1.1. Indicaciones y Limitaciones 21
7
A.1.2. Materiales 22
A.1.3. Procedimiento 23
A.1.3.1. Preparación del inóculo 23
A.1.3.2. Inoculación de las placas 24
A.1.3.3. Dispensación de los discos 24
A.1.3.4. Lectura de los resultados 25
A.1.4. Antimicrobianos seleccionados 26
A.1.5. Control de calidad 26
A.1.6. Resultados 27
A.2. Método del Epsilon Test 29
A.2.1. Indicaciones y Limitaciones 29
A.2.2. Materiales 30
A.2.3. Procedimiento 30
A.2.3.1. Preparación del inoculo. 30
A.2.3.2. Inoculación de las placas. 31
A.2.3.3. Dispensación de las tiras. 31
A.2.3.4. Incubación. 31
A.2.3.5. Lectura de los resultados. 31
A.2.4. Control de calidad 33
A.2.5. Interpretación de Resultados 33
B. Métodos de Dilución 33
B.1. Dilución en agar 37
B.2. Dilución en caldo 40
B.2.1. Método de Macrodilución. 40
B.2.2. Método de Microdilución. 41
B.3. Correlación de los resultados. 44
B.4. Control de calidad. 44
B.5. Informe de Resultados 44
1.2.5. CEPAS DE REFERENCIA 45
1.2.5.1. Escherichia coli 46
1.2.5.2. Staphylococcus aureus 49
8
1.3. DEFINICIONES 50
1.4. HIPOTESIS 51
1.5. VARIABLES 51
1.5.1. Variable independiente 51
1.5.2. Variable dependiente 51
CAPITULO II
METODOLOGIA 52
2.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN 52
2.2. DISEÑO DE INVESTIGACIÓN 52
2.3. POBLACIÓN Y MUESTRA 53
2.4. MATERIALES 53
2.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 54
CAPITULO III
RESULTADOS 60
DISCUSIÓN DE RESULTADOS 63
CONCLUSIONES 65
RECOMENDACIONES 66
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 67
ANEXOS 72
9
INTRODUCCIÓN
Hay una relación establecida, pero compleja, entre el consumo humano de agentes
antimicrobianos y la prevalencia de la resistencia a las drogas en los patógenos. Varios
factores influyen en la frecuencia variable de la resistencia en diferentes ecosistemas,
tales como: notable plasticidad genética de los microorganismos, reservorios humanos o
ambientales donde pueden persistir o ser transmitidos genes de resistencia u organismos
resistentes, presiones selectivas por el uso aumentado e inapropiado de antibióticos, así
como cambios sociales y tecnológicos que afectan la transmisión de los organismos. Si a
esto se suma el aumento de pacientes inmuno comprometidos y de tratamientos con
drogas inmunosupresoras, es entendible el incremento y emergencia de infecciones
bacterianas y fúngicas (1).
Las infecciones es un problema de salud pública en los países en vía de desarrollo de
América Latina, donde las condiciones de vida son precarias, de manera que, dichas
enfermedades son favorecidas por muchos factores: ambientales como el clima,
deficiente saneamiento ambiental, hacinamiento y desnutrición, los cuales dependen de
las condiciones socioeconómicas y culturales de la población(2).
En el perfil de salud pública, la resistencia bacteriana es un tema de importancia; pues
dada la presencia en patógenos relacionados con enfermedades prevalentes, como son, la
enfermedad diarreica aguda (EDA), las infecciones respiratorias agudas (IRA) y las
infecciones intrahospitalarias, le dan un carácter de problema prioritario por la alta
resistencia de uso y abuso de los fármacos, por lo que es necesario la búsqueda de
nuevos principios activos con actividad antimicrobiana.
En la práctica de la medicina moderna es alarmante la resistencia de los
microorganismos a distintos antibióticos, esto crea la necesidad de encontrar nuevos
compuestos que puedan actuar de forma directa sobre la actividad microbiana,
inhibiendo los mecanismos de resistencia.
10
En las poblaciones rurales donde la accesibilidad o disponibilidad de antimicrobianos es
limitada, las personas suelen usar preparados caseros a partir de plantas medicinales. Las
plantas producen compuestos llamados metabolitos secundarios que poseen actividad
biológica, entre las que se encuentra la actividad antimicrobiana.
El Perú es un país de extraordinaria variedad de recursos vivos y ecosistemas, que hoy
se conoce como diversidad biológica o biodiversidad. La diversidad de recursos
genéticos es un logro de los grupos humanos aborígenes, que durante un proceso de al
menos 10 000 años han domesticado especies de la fauna y plantas nativas que han sido
seleccionados y adaptado a los pisos ecológicos. El Perú es uno de los mayores centros
mundiales de recursos genéticos, con unas 182 especies de plantas domesticadas, y es
reconocido como uno de los centros de origen de la agricultura. De la flora se calculan
que existen unas 25 000 especies (10% del total mundial), de las cuales un 30% son
endémicas.
La Amazonía Peruana cuenta con una riqueza cultural, referida a los conocimientos
sobre el uso etno-tradicional de plantas de uso terapéutico. Promisorias especies por su
contenido de metabolitos primarios y secundarios de uso difundido en enfermedades
agudas y crónicas, como Mansoa alliacea “ajo sacha”, que se usa en infecciones
urinarias, respiratorias y diarreicas que aquejan a la población de acuerdo a los reportes
etnobotánicos (3).
Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana de Mansoa
alliacea permitirá validar su uso y posteriormente orientará a la elaboración de
esquemas de tratamientos dentro de su uso popular, siendo la población de la Amazonía
los principales beneficiarios con los resultados, los mismos que serán socializados por
los comercializadores de recursos naturales terapéuticos tradicionales.
Por lo que en el presente trabajo se determinó la actividad antibacteriana del extracto
hidroalcohólico y etanólico de la hoja de Mansoa alliacea “ajo sacha”, sobre
Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
11
OBJETIVOS
General:
Determinar la actividad antibacteriana de los extractos:
hidroalcohólico y etanólico de Mansoa alliacea “ajo sacha”, sobre
Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Específicos:
Obtener extracto hidroalcohólico y etanólico de Mansoa alliacea “ajo
sacha”
Evaluar la actividad antibacteriana de los extractos hidroalcohólico y
etanólico de la hoja de Mansoa alliacea “ajo sacha” frente a
Escherichia coli y determinar la concentración mínima inhibitoria.
Evaluar la actividad antibacteriana de los extractos hidroalcohólico y
etanólico de la hoja de Mansoa alliacea “ajo sacha” frente a
Staphylococcus aureus y determinar la concentración mínima
inhibitoria.
12
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO
La región amazónica posee una gran biodiversidad y alberga varias especies de plantas
y muchas de ellas son utilizadas por la población amazónica como plantas medicinales.
Las enfermedades ocasionadas por diversos agentes patógenos e inadecuados estilos de
vida del hombre moderno, está creando la necesidad de buscar nuevas alternativas de
tratamiento con una tendencia de volver a las costumbres ancestrales del uso de plantas,
para la cura de sus enfermedades, debido a las múltiples ventajas que aporta al aspecto
medicinal.
Al respecto, la Organización Mundial de la Salud estima que más de la mitad de los
4000 millones de habitantes de la tierra, confía en la medicina tradicional para resolver
sus principales necesidades de salud y se puede decir que gran parte de las terapias
tradicionales entrañan el uso de extractos de plantas o de sus metabolitos secundarios
que ayudará a determinar la utilidad en la industria farmacéutica en beneficio de la
salud. (4)
Además, la aparición de cepas resistentes a los fármacos tradicionales ha dado origen a
una corriente competitiva por la fabricación de nuevos fitofármacos que sean eficaces en
el tratamiento de numerosas enfermedades que aquejan a la población mundial.
Debido a la necesidad de conocer las propiedades medicinales de las plantas y existiendo
poca información sobre los efectos antimicrobianos que tiene Mansoa alliacea “ajo
sacha” sobre los microorganismos como: Escherichia coli y Staphylococcus aureus que
son causantes de enfermedades infecciosas, en diferentes órganos y sistemas en nuestro
cuerpo, se considera importante la realización de este estudio de investigación, por lo
que se estudiará el método de macrodilución para el beneficio de la población y la
comunidad científica.
13
1.1. ANTECEDENTES
Olivera M .et al. (2013), evaluaron las propiedades fisicoquímicas y bioactivas in vitro
del aceite esencial de Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry, componente al cual se le
atribuye propiedades antioxidantes y bacterianas; el rendimiento del aceite esencial fue
de 0,64 % en 100 gramos de hojas frescas obtenido por hidrodestilación, de densidad
relativa de 0,85g/m, acidez expresado en ácido oleico es 9,71%; en la caracterización
química mediante cromatografía de gases, identificaron compuestos sulfurados siendo el
compuesto mayoritario aliltrisulfito con 67,94%. El aceite esencial presentó actividad
antibacteriana, frente a Staphylococcus aureus ATCC 6535 y Bacillus subtilis ATCC
6638 en las concentraciones de 10 y 20mg/mL respectivamente. (5)
Rev. La Insignia (2004), indica a nivel popular, que basta muchas veces con extraer los
principios activos de la manera más sencilla, como puede ser por medio de una infusión
o decocción. En cambio para analizar propiedades medicinales de una droga vegetal, en
muchos casos debe recurrirse a métodos de extracción más complejos que permitan
obtener métodos reproducibles, con cuantificación de principios en lo posible. (6)
ESSALUD (2004), identifico en Mansoa alliacea “ajo sacha”; allina, allicina,
estigmasterol, alcaloides, saponinas, flavones, pigmentos flavónicos, alil-disulfóxido,
sulfuro de di-metilo, sulfuro de di-vinilo, disulfuro propylalilo, 2-metoxilo-alfa-
lapachona y la hydroxy-alfa-lapachona. Además triterpenos esteroides, cumarinas,
fenoles, saponinas y taninos. (7)
Atayala (2004), al evaluar el efecto de los extractos de ajo sacha (Mansoa alliacea),
vaca chucho (Solanum mammosum) y salvea (Cornutia odorata) al 0.3 % en el control
preventivo del hongo Colletotrichum sp. Inductor de la “Antracnosis” del tumbo
(Pasiflora cuadrangularis) el extracto de Ajo sacha resultó ser el más efectivo (82.97),
resultando inclusive similar al fungicida dithiocarbamato (89.76) (8).
14
Villacres (2003), al evaluar el efecto de los extractos de ajo sacha y vaca chucho en el
control de Colletotrichum phomoides, inductor de la “Antracnosis” de los frutos del
tomate, encontró que el tratamiento de ajo sacha al 0.3 % manifestó una mejor eficacia
de control (69.8) y un mayor rendimiento (17.95 tn/ha) en comparación al testigo, como
consecuencia del posible accionar de sus compuestos principalmente azufrados como la
allina y la allicina sobre las estructuras propagativas del patógeno. (9)
OMS (2002), refirió que la medicina tradicional suele utilizarse para tratar o prevenir
dolencias y enfermedades crónicas y para mejorar la calidad de vida. Algunos datos
auguran resultados prometedores, mientras que los estudios realizados en todo el mundo
han demostrado que en muchos países, y con altos porcentajes, las poblaciones hacen
uso de esta medicina tradicional, como tratamiento de primera línea, usándola sola o
combinada con otras medicinas, para diversos síntomas o afecciones. Aun cuando la
mayor parte de la población emplee las diferentes plantas de manera artesanal, por no
considerar de esta forma de consumo una cuestión mayor: la toxicidad inherente, es
importante conocer científicamente los riesgos y beneficios que están implícitos. (10)
Rosales (2002), indica que a la luz de los modernos avances en botánica, fitoquímica,
farmacología, farmacocinética y toxicología, el conocimiento tradicional y popular sobre
las propiedades medicinales de las plantas debe ser constatado y validado para garantizar
una terapia adecuada, eficaz y con menor incidencia de ocasionar riesgos para el
paciente. (11)
Mostacero et al. (2002), indican que Mansoa alliacea (Lam) A. Gentry, llamado “ajo
sacha”, “Boens”, “Niaboens”, es una especie arbustiva frecuente en zonas no inundadas,
bosques primarios y también es cultivada. Las hojas y cortezas tienen marcado olor a
“ajo”. (12)
Mont (2002), hace referencia que el ajo Allium sativum tiene acción contra
fitopatógenos, debiéndose la acción al antibiótico Allicina; siendo el precursor de dicho
antibiótico el aminoácido Allina que es convertida por enzimas a Allicina, que es la
15
sustancia plaguicida primaria. También informa que el extracto acuoso de polvo de
bulbos de ajo, tiene la capacidad de inhibir a fitopatógenos como Erwinia, Botritis,
Gloeosporium, Colletotrichum, Puccinia y otros, los cuales han sido probados en frijol,
pepinillo, rabanito, espinaca, almendras, cerezas, y albaricoques en pruebas de
invernadero. Asimismo una solución acuosa de polvo de ajo al 10 – 20 % controló el
mildiú de pepinillo (Pseudoperonos poracubensis), la sarna del pepinillo (Cladosporium
cucumerinum), antracnosis del frijol (Colletotrichum lindemutianum), alternariosis en
girasol (Alternaria alternata), oidiosis en cucurbitáceas (Eryasiphecichora cearum) y
manchas en tomate y algodón (Fusarium sp. y Macrophomina phaseolina). (13)
Villacres (2001), registró como información etnobotánica a las especies Ajo sacha
(Mansoa alliacea), Sacha culantro (Eryngium foetidum), Vaca chucho (Solanum
mammonsum), Salvea (Cornutiao dorata), Pampa orégano (Lippia alba), Albaquilla
(Hyptisre curvata), Papaya (Carica papaya), Albaca (Ocinum basilicum), Anona (Anona
squamosa) como especies antifúngica. (14)
Staufferet al. (2000), reportaron que extractos de 98 especies vegetales pertenecientes a
46 familias botánicas monocotiledóneas; 46 dicotiledóneas; 1 conífera; y 2 pteridófitas
fueron probadas para determinar su posible efecto fungicida y/o bactericida con la
factibilidad de ser utilizados en el control de enfermedades en vegetales. Los extractos
han sido obtenidos mediante la cocción durante 20 minutos de 150 gramos de tejido
vegetal fresco, o 50 gramos de material seco en 400 ml de agua, y probados contra 9
especies de hongos y una bacteria por el método del disco de papel impregnado con el
extracto y colocado en Cajas de Petri sembradas con hongos o bacterias sobre medio de
cultivo Papa Dextrosa Agar (15). Este mismo autor indica que las evaluaciones fueron
realizadas a partir de las 48 horas, determinando la zona de inhibición en mm. De los 98
extractos vegetales probados, 9 de ellos demostraron inhibición de crecimiento de la
bacteria Xanthomonas campestri sp y campestris. Ellos son: Ajo, Cebolla, Quebracho
Colorado, Agrial, Palo Santo, Chirca, Guayaba, Eucalipto y Pino. Inhibición del
crecimiento fungoso, sólo se ha obtenido con el Ajo y la Cebolla (utilizados como
referencia), así como con el extracto de Mamón contra Colletotrichum sp. (15)
16
Ramos (2000), trabajó con Cercospora longissimma Sacc de la lechuga y con extractos
de “Ajo Sacha”, demostró la efectividad de varias concentraciones de extractos de
Mansoa alliacea “Ajo Sacha” en el cual comprobó su eficacia en el control de la
cercosporiosis, así mismo verificó que los mejores resultados los obtuvo utilizando una
frecuencia de aplicación de 6 días. (16)
Mejía (2000), indicó que la Medicina Tradicional, es una de las expresiones más
importantes de la memoria ancestral de los pueblos amazónicos, hacen uso, entre otras
prácticas de un gran número de especies vegetales para curar sus enfermedades y
síntomas; y el conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas está basado en
la observación, la experiencia y el conocimiento profundo del entorno. (17)
IPSS (1995), registró que la hojas del “Ajo Sacha” presenta: alildisulfóxido, alcaloides,
allina, allicina, disulfuro propylalilo, estigmasterol, flavonas, pigmentos flavónicos,
saponinas, sulfuro de dialil, sulfuro de dimetilo, sulfuro de divinilo,
Naftaquinonascitotóxicas: la 9-metoxi- a – lapachona y la 4 – hyddroxy – 9 metoxy – a –
lapachona. (18 y 19)
Brack (1999), mencionó que Mansoa alliacea “Ajo Sacha” es una alternativa a ser
aprovechada en la investigación biomédica, siendo popularmente reconocida por poseer
muchas aplicaciones medicinales, entre ellas analgésicas, antipirética, antiespasmódica y
antiinflamatoria. (20)
Hoss (1999), mencionó que la allicina es una sustancia de bajo peso molecular con 2
átomos de azufre dentro de la cadena alifática, extraída del ajo y de la cebolla, su efecto
inhibidor ha sido comprobado en una serie de enzimas que contienen el grupo funcional
– SH, a concentraciones de 5 x 10-4M, se ha usado contra Phytophthora infestans, pero
el fuerte olor inhibe la difusión amplia de productos con este principio activo. (21)
Ahmed et al. (1985), registran más de 2000 especies botánicas con actividad biológica
con organismos nocivos, entre ellas 1053 con efecto insecticida, 100 con actividad
17
antifúngica y solo cuatro antibióticos. Asimismo cita algunos ejemplos de compuestos
investigados: La allicina, pterocarpanes, vaticaffinol y canaliculatol. También otras
sustancias pertenecientes a las cumarinas, alcaloides, triterpenos, flavonoides y
quinonas. (22)
1.2. MARCO CONCEPTUAL
1.2.1. ESPECIE BOTANICA: Mansoa alliacea “ajo sacha”
A. Clasificación Taxonómica de Mansoa alliacea (ajo sacha)
La planta fue identificada por comparación con patrones que obran en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana y corresponde a la
taxonomía siguiente:
Reino : Plantae
Sub – Reino : Tracheobionta
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Lamiales
Familia : Bignoniaceae
Tribu : Bignonieae
Género : Mansoa
Especie : M.alliacea
Nombre Científico: Mansoa alliacea
Nombre Común : Ajo Sacha
18
B. Distribución Geográfica y Hábitat
Se encuentra en Sudamérica tropical, donde puede ser encontrado creciendo silvestre
en las pluviselvas tropicales de Brasil, Ecuador, Perú, las Guayanas, así como en
Costa Rica. Es especialmente abundante en los bosques al lado del Amazonas, en
Ucayali y en el Amazonas peruano.
Clima: Zonas tropicales con precipitación pluvial de 1 800 a 3 500 mm/año,
temperaturas entre 20 a 26ºC. Suelo: Arenoso o arcilloso con abundante materia
orgánica. Biotopo de poblaciones naturales: Habita en faldas de altura, alejada de
cuerpos de agua, chacras nuevas, áreas sombreadas o poco sombreadas tanto de
purmas como de bosque primario. No es resistente a la inundación. Comparte su
hábitat con las siguientes especies: aguaje, algodón, bijao, caña agria, carahuasca,
castaña, cedro, cetico, cordoncillo, charichuelo, chiricsanango, chuchuhuasi,
espintana, huacapú, huamansamana, huito, limón, patiquina, pijuayo, poma rosa,
pona, sangre de grado, sapohuasca, shapaja, ubos, umarí, uña de gato, uvilla, yarina,
zapote.
C. Descripción Botánica
Es una planta trepadora tropical de hoja perenne de que es originaria de la pluviselva
del Amazonas. Puede ser descrito como un arbusto o una liana dado que produce
numerosas vides leñosas desde la raíz que alcanza un tamaño de sólo 2-3 m altura.
El género Mansoa, consta de 6 especies para el Perú y a nivel de América Tropical 15
especies.
Las especies del género Mansoa según Gentry (1993), presentan como características
olor a ajos, usualmente con glándulas en el peciolo y zarcillos trífidos o simples.
D. Distribución
La Mansoa alliacea se encuentra en el Perú desde 0-500 m.s.n.m. y está distribuida
en los departamentos de Amazonas, Huánuco, Loreto y San Martín es de hábito
lianescente y con olor a ajos en todas sus partes.
19
E. Usos
La Mansoa alliacea conocida vulgarmente como ajo sacha dentro de la medicina
tradicional se le atribuye propiedad analgésica, antirreumática, antiartrítica,
antipirética, antitusígena; habiéndose observado su actividad antimalárica en personas
con reinfecciones frecuentes.
F. Composición Fitoquímica
Los estudios fitoquímicos del ajo sacha reportan presencia de alildisulfóxido,
alcaloides, allina, allicina, disulfuropropilalilo, estigmasterol, flavonas, sulfuro de
dialil, sulfuro de dimetilo, sulfuro de divinilo y dos naftaquinonascitotóxicas: 9-
matoxy&-lapachona y 4-hidroxy-9-metoxi.&-lapachona. (23)
1.2.2. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS
Con la detección cada vez de más casos de resistencia bacteriana a los antibióticos, en
terapéutica humana y animal debido al uso indiscriminado de antibióticos, muchos
países y especialmente los integrantes de la Unión Europea, han ido normando el uso de
los antibióticos, los mismos que se deben dispensar bajo receta médica, a fin de evitar su
mal uso.
Las bacterias de la microbiota endógena de los animales de consumo pueden colonizar y
transferir genes de resistencia a la microbiota endógena humana, incrementando con una
carga adicional al reservorio de resistencia ya presente en el hombre. A raíz de estos
problemas de transferencia de resistencia de antibióticos se han ido planteando diversas
alternativas a los ya clásicos promotores de crecimiento de naturaleza antibiótica,
resurgiendo algunos como los ácidos orgánicos que venían siendo utilizados como
antifúngicos, como es el caso del ácido propiónico. Otra alternativa es el empleo de
aditivos naturales, pero en general, se utilizan en menor escala que los ácidos orgánicos.
(23)
20
1.2.3. MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las
funciones más importantes de los laboratorios de microbiología. Su realización se
desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo
es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios
antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor
predictivo de la eficacia.
La farmacología del antimicrobiano, en particular en el lugar de la infección, y los
aspectos clínicos del paciente y de su infección, sustentan la elección de los
antimicrobianos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Asimismo, ofrece, en
su conjunto, elementos objetivos de actuación en los tratamientos empíricos.
El panorama actual de las resistencias de los microorganismos a los antimicrobianos
hace ineludible su determinación, incluso en aquellos casos en los que la sensibilidad se
considera universal y no se han descrito, por el momento, mecanismos de resistencia.
Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemente normalizados y sujetos a
procesos de control que aseguren su reproducibilidad. Por el momento no existe un
método universal que reproduzca las condiciones en las que se encuentra un
microorganismo produciendo una infección y, por tanto, la situación ideal en las que
deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad.
1.2.4. MÉTODOS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
A. Métodos de Difusión
A.1. Método del Antibiograma Disco-Placa (INS - 2002)
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby et at., es uno de los
métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos.
21
El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una
placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante
impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de
antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe
agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del
espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración.
Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona
de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en
crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima
a la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución. Sin
embargo, los métodos disco-placa no permiten una lectura directa del valor de la
CMI. Para cuantificarla, basta con haber contrastado previamente el sistema disco-
placa con un gran número de cepas de CMI conocidas que han estado previamente
determinadas por otros métodos de determinación de la sensibilidad a los
antimicrobianos (Ej. Método de Dilución). Esta determinación se realiza con cientos
de bacterias para minimizar errores. Se mide el diámetro de la 5ta zona de inhibición
obtenida por cada una de tales cepas y se grafica dicha medida frente a la CMI,
obteniéndose la línea de regresión o "recta de concordancia" que proporciona la
correspondencia entre las CMI y los diámetros de inhibición. Para determinar la CMI
de una cepa se procede a medir el diámetro de la zona de inhibición y luego
extrapolarlo en el gráfico para obtener la CMI. Existen, por tanto, unos diámetros de
inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura
de los halos de inhibición debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o
resistente (R) según las categorías establecidas por el NCCLS (Tablas 1-4).
A.1.1. Indicaciones y Limitaciones
El antibiograma está indicado cuando se aísla una bacteria responsable de un
proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe
que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos más
habituales.
22
Estas pruebas de sensibilidad también son útiles en estudios epidemiológicos ya
que el resultado del antibiograma puede ser considerado como el primer marcador
epidemiológico de que se dispone. El método de disco-placa es fácil de realizar,
rápido y barato. Es una metodología aplicable a una amplia variedad de bacterias,
fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rápido como
Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia,
Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp. Y
Enterococcusspp. Además, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a
Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y
Streptococcus spp.
A.1.2. Materiales
Tubos de ensayo con suero fisiológico (0,85 g de NaCl en 100 ml de agua
destilada estéril).
Escobillones estériles.
Medio de cultivo. Generalmente se utiliza agar Mueller-Hinton, regulado en su
concentración de iones divalentes, aunque existen excepciones que se describen
más adelante. El medio Mueller Hinton posee una concentración baja de iones
divalentes y debe ser suplementado para obtener concentraciones fisiológicas
(20 a 35 µg/litro de Mg2+ y 50 a 100 µg/litro Ca2+). Este medio es el
recomendado por la NCCLS porque en él crecen bien la mayor parte de las
bacterias patógenas, hay muy pocas diferencias entre los distintos lotes
comercializados, lo que ayuda a una estandarización entre laboratorios, y
además no contiene timina o timidina, que son inhibidores de sulfamidas y del
trimetoprim.
El pH del medio debe ajustarse entre 7,2-7,4, debe almacenarse a 2-8ºC y
utilizarse dentro de los 7 días siguientes a su preparación. El medio debe dejarse a
temperatura ambiente unas dos horas antes de utilizarlo. Si existe agua en la
superficie del agar, las placas pueden colocarse en la incubadora a 35ºC durante
unos 30 minutos con la tapa ligeramente entreabierta.
23
Discos de antibióticos. Se deben guardar a 4ºC y dejarlos a temperatura ambiente
una hora antes de utilizarlos. Los discos se congelarán si son antimicrobianos beta-
lactámicos y ha de transcurrir más de una semana hasta su utilización. Por regla
general, se recomienda reemplazar los discos de beta-lactámicos que están
refrigerados con aquellos que se encuentran congelados. El deterioro de los discos
ocurre si son sometidos a humedad o a frecuentes fluctuaciones de temperatura. En
el caso de utilizar dispensador, éste debe tener una tapa muy ajustada y un
desecante, que será substituido cuando por exceso de humedad cambie de color el
indicador.
El dispensador debe mantenerse refrigerado cuando no se vaya a utilizar.
A.1.3. Procedimiento
Para la determinación del antibiograma disco-placa en estafilococos, enterococos,
enterobacterias y bacilos Gram-negativos no fermentadores utilizamos el siguiente
procedimiento:
A.1.3.1. Preparación del inóculo
Método del medio de cultivo líquido: Coger de 3 a 5 colonias iguales de la
placa de cultivo de 18 a 24 horas y sembrarlas en 5 ml de un medio líquido
(Brain-Heart, Todd Hewitt, Tripticasa soja, etc.) e incubar en la estufa a 35ºC
durante 2 a 6 horas hasta conseguir o superar una turbidez del 0.5 de la escala
de McFarland. Si la turbidez es superior se realiza el ajuste necesario con suero
salino estéril.
Método de suspensión directa de colonias: A partir de una placa de cultivo de
18 a 24 horas coger varias colonias con un asa y ajustar el inóculo a una
turbidez equivalente al 0.5 de la escala de McFarland 0.5 en suero fisiológico.
Agitar en un agitador "vortex" durante 15-20 segundos.
24
Se recomienda utilizar el primer método si el cultivo tiene más de 24 horas de
incubación. El segundo método es el más adecuado para microorganismos de
crecimiento difícil en medios líquidos (Haemophilus spp., Neisseira
gonorrhoeae, Staphylococcus pneumoniae, estrepococos no enterococos,
Listeria, Moraxella y Corynebacterium spp.) y para estafilococos en los que se
quiera detectar la resistencia a oxacilina.
A.1.3.2. Inoculación de las placas
Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, introducir un
escobillón dentro de la suspensión y al retirarlo rotar varias veces contra la
pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de eliminar el
exceso de inóculo.
Inocular las placas de Mueller-Hinton completamente, sin dejar ninguna zona
libre. Esto se consigue deslizando el escobillón por la superficie del agar tres
veces, rotando la placa unos 60º cada vez y pasándola por último por la
periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5
minutos antes de depositar los discos.
A.1.3.3. Dispensación de los discos
Colocar los discos con los dispensadores o manualmente con pinzas estériles.
Debe asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo
que deben presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben
situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar distribuidos de
forma que no se produzca superposición de los halos de inhibición. Para placas
de 150 mm no se emplearán más de 12 discos y para las de 100 mm no más de
6.
Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores
a 5 placas, a 35°C en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos.
Las placas se incubarán 16-18 horas (con estafilococos sensibles a meticilina
25
debe prolongarse la incubación hasta 24 horas para confirmar la ausencia de
resistencia a la meticilina).
A.1.3.4. Lectura de los resultados
Después de 18 horas de incubación, leer el diámetro de las zonas de completa
inhibición con un pie de rey o regla. Si el microorganismo es un estafilococo o
un enterococo debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a la
oxacilina y vancomicina. Las zonas de los medios transparentes se miden sobre
el reverso de la placa y los medios que contienen sangre sobre la superficie del
agar. En las pruebas de sensibilidad a meticilina en estafilococos el halo
alrededor de la oxacilina debe observarse utilizando luz transmitida para
visualizar las colonias diminutas.
Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición, puede tratarse de
mutantes resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogéneas o cultivos
mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar otra vez el ensayo de
sensibilidad antimicrobiana.
Como regla general, no debe considerarse aquellas colonias diminutas que
aparecen en el halo de inhibición y que han sido visualizadas mediante luz
transmitida o con ayuda de una lupa, a excepción de estafilococos resistentes a
oxacilina o enterococos resistentes a vancomicina. La interpretación de los
resultados puede realizarse en función de las normas del NCCLS (Ver Tablas 1-
5).
26
A.1.4. Antimicrobianos seleccionados
Es evidente la imposibilidad de ensayar un gran número de antimicrobianos frente
a un microorganismo determinado. La selección final de qué antibióticos deben ser
estudiados dependerá del Laboratorio de Microbiología en sintonía con las
decisiones del Comité de Infecciones de cada hospital. En las Tablas 1 a 5 se
muestran los antimicrobianos recomendados por la NCCLS, agrupados en cuatro
grupos según el trabajo de Washington. En el grupo A se encuentran aquellos
antimicrobianos que se han de ensayar y que deben ser informados de forma
rutinaria. El grupo B está constituido por antimicrobianos que pueden ser
valorados de forma rutinaria, pero cuya información se efectuará de forma
selectiva; es decir, solamente se informarán si los del grupo A no son activos, no
son apropiados para un lugar determinado de la infección, o si se constata un fallo
terapéutico con el grupo A. En el grupo C están incluidos los antibióticos que
serán estudiados cuando aparezcan problemas específicos de resistencia, por
ejemplo, brotes epidémicos, en pacientes con alergia a otros antibióticos o en
infecciones inusuales. Finalmente, el grupo D, se destina a antimicrobianos
utilizados en infecciones del tracto urinario. El NCCLS y grupo MENSURA
(Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y Resistencia a los
Antimicrobianos) también establecen recomendaciones según el tipo de
microorganismo e infección.
A.1.5. Control de calidad
Es necesario emplear cepas control para supervisar la exactitud y fiabilidad de la
metodología, debido también al gran número de variables que pueden afectar los
resultados y que se han descrito anteriormente. Las cepas que se utilizan para el
control de calidad son las mencionadas en las Tablas 1-4. El NCCLS ha
establecido unos límites en los diámetros de las zonas de inhibición que son
aceptables para las cepas utilizadas en el control de calidad. Los problemas que
podamos encontrar en la determinación del halo de inhibición de las cepas de
control de calidad y su resolución se detallan en la Tabla 5.
27
Las cepas de control se mantienen en el congelador a –70ºC en alguno de los
medios descritos para la conservación de cepas, con el fin de preservar su
viabilidad y minimizar posibles modificaciones. Para resembrarlas debe utilizarse
un escobillón o asa con el que se rascará la superficie del material congelado (no
hace falta descongelar) y sembrará en una placa de agar sangre. Incubar a 35ºC, de
18 a 20 horas, realizar una nueva siembra que ya podrá emplearse para el ensayo.
Debe realizarse controles cada nuevo lote de medio de cultivo y cada nuevo lote de
antibióticos. La cepa ATCC 29212 sirve para detectar que el Mueller-Hinton
contiene los niveles correctos de inhibidores al ensayar el trimetoprim y/o
sulfametoxazol.
Control del inóculo: Se utiliza un McFarland 0.5. Para prepararlo se emplea 0.5 ml
de 0.048 M de BaCl2 (1,175% BaCl2+2H2O) en 99,5 ml de 0.18 M H2SO4 (1%
v/v) con agitación constante.
La absorción a 625 nm ha de estar entre 0.08 y 0.10 (comprobar cada mes).
Alícuotas de 4 a 6 ml se distribuyen en tubos con tapón de rosca y se guardan en la
oscuridad a temperatura ambiente.
A.1.6. Resultados
Interpretación: Comparando los diámetros del halo de inhibición con las
Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs), y estableciendo las
correspondientes rectas de regresión, se han fijado unos criterios para clasificar las
cepas estudiadas. De esta forma se han fijado tres categorías: sensible (S),
intermedia (I) y resistentes (R). Anteriormente se añadía la categoría
moderadamente sensible (MS) que tiende a eliminarse y los resultados
correspondientes a la misma se han situado en la categoría de intermedia.
Las interpretaciones seguirán las normas establecidas por el NCCLS (Tabla 1 a 5)
pero, por regla general, un diámetro de inhibición de 30 a 35mm es indicativo de
una cepa altamente sensible, mientras que diámetros de zona de inhibición
inferiores a 15 mm son los que presentan las cepas resistentes.
28
El término sensible indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se
ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibición puede tratarse de
forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en función del
tipo de infección y de la especie considerada.
El término intermedio indica que el halo de inhibición traducido en valores de
CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o
tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que
se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (Ej. orina) o cuando se
emplean dosis más elevadas de lo habitual. El NCCLS también incluye en esta
categoría aquellos casos de antimicrobianos con márgenes de toxicidad estrechos
en los que pequeños errores técnicos podrían suponer cambios de interpretación en
la categoría clínica.
El término resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por
las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del
correspondiente antimicrobiano, o aquellos microorganismos en los que existen
mecanismos de resistencias específicos para el agente estudiado en los que no ha
habido una adecuada respuesta clínica cuando se ha usado como tratamiento el
correspondiente antimicrobiano.
Reproducibilidad: el medio Mueller-Hinton, regulado en su concentración de
iones divalentes, presenta una buena reproducibilidad entre fabricantes. La
reproducibilidad está condicionada a la correcta estandarización de la metodología
y a la utilización de controles de calidad.
Comunicación: Como se ha mencionado anteriormente los resultados se
expresarán como sensible, intermedio o resistente. Como reglas importantes se
debe considerar las cepas de estafilococos resistentes a oxacilina como resistentes
a todos los beta-lactámicos, incluyendo la combinación beta-lactámico más
29
inhibidor de betalactamasas, todas las cefalosporinas, penicilinas y los
carbapenems.
A.2. Método del Epsilon Test
Es una expansión de la técnica de difusión en disco. En el método E-test (AB
Biodisk, Suecia) podemos, mediante lectura directa, determinar la concentración
inhibitoria mínima (CMI).
Consiste en una tira de plástico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que
incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones. El
protocolo para preparar el inóculo es el mismo que para la difusión en disco.
Siguiendo el método de difusión, una vez inoculado la placa de agar con el
microorganismo, se coloca la tira de Epsilon test sobre su superficie, produciéndose
de forma inmediata una difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar,
creándose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las
concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubación de las placas, se puede
observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica.
Después de la incubación la CMI será el valor obtenido en el punto en el que el
extremo de inhibición intersecciona con la tira.
A.2.1. Indicaciones y Limitaciones
En contra de lo que ocurre en la difusión en disco donde la orientación del disco no
importa, si colocamos la tira al revés no se observa elipse de inhibición ya que el
gradiente de concentraciones se sitúa solo sobre una de las caras de la tira. El
Epsilon test se ha utilizado para determinar la CMI de diversos antibióticos en una
amplia gama de bacterias, incluyendo Helicobacter pylori, Corynebacterium spp.,
estreptococos nutricionalmente deficientes, enterococos con resistencia elevada a
aminoglicósidos.
30
En algunos casos el antibiótico de vancomicina en el microorganismo
Staphylococcus pneumoniae, la CMI es más alta utilizando el Epsilon test que la
obtenida por los métodos de microdilución, produciendo resultados que se
encuentran en el rango superior de aislamientos susceptibles y con resultados de
control de calidad por encima de los límites aceptables.
El Epsilon test se considera como un método alternativo para el estudio cuantitativo
de la sensibilidad antimicrobiana del que cabe destacar su sencillez y buena
correlación con la técnica estándar de dilución en agar para el estudio de la CMI.
A.2.2. Materiales
Tubos de ensayo con suero fisiológico (0.85 g de NaCl en 100 ml de agua
destilada estéril).
Escobillones estériles.
Medio de cultivo. Generalmente se utiliza agar Mueller-Hinton o el apropiado
para la especie bacteriana que se desee ensayar. Los factores del medio de
cultivo que pueden condicionar la CMI son los mismos que se describieron
para la técnica del antibiograma disco-placa.
Tiras de Epsilon test. Deben almacenarse a -20ºC. Es importante tener en
cuenta la fecha de caducidad. En todo momento las tiras de E-test deben estar
protegidas de la humedad. Antes de utilizar se deben atemperar a temperatura
ambiente durante por lo menos 30 minutos.
A.2.3. Procedimiento
A.2.3.1. Preparación del inoculo.
Utilizar la misma metodología descrita en el apartado 4.1 de la técnica disco-
placa.
31
A.2.3.2. Inoculación de las placas.
Utilizar también la misma metodología descrita en la técnica disco-placa. Dejar
absorber el inóculo de 10 a 15 minutos para asegurarse que la superficie del agar
está completamente seca antes de aplicar las tiras. Este punto es crítico para
optimizar la realización del Epsilon test.
A.2.3.3. Dispensación de las tiras.
Tanto si se utiliza el aplicador de las tiras como las pinzas, debemos asegurar que
la escala de CMI está orientada hacia arriba y que la concentración máxima está
cercana al extremo de la placa de petri. Asegurarse que la tira contacta
completamente con la superficie del agar. Si es necesario, eliminar las gotas de
aire que puedan encontrarse por debajo de la tira presionándola ligeramente con
las pinzas.
Es importante no mover las tiras una vez que han sido colocadas en la superficie
del agar ya que el antibiótico empieza a difundir rápidamente. Cuando se utiliza
una placa de petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y poner la tira en
el centro de la placa, mientras que cuando se utiliza una placa de 150 mm no se
deben colocar más de 6 tiras y siempre en la disposición que muestra la Figura 1.
A.2.3.4. Incubación.
Por regla general las placas son incubadas inmediatamente aunque pueden
permanecer varias horas sin incubación sin que ello afecte significativamente en
la determinación de la CMI. Sin embargo, los organismos exigentes deben ser
incubados inmediatamente. La temperatura de incubación y la atmósfera
utilizadas deben ser óptimas para el crecimiento de la especie bacteriana.
A.2.3.5. Lectura de los resultados.
Después del período de incubación, leer la CMI en el punto de intersección entre
el extremo de inhibición de la elipse 10 y la tira de E-test. Cuando el crecimiento
tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa formación de la elipse de
32
inhibición, la CMI se informará como superior al valor máximo de la escala de
lectura y, por el contrario, cuando la elipse de inhibición se encuentre por debajo
de la tira debe ser informado como inferior al valor mínimo de la escala de
lectura.
Con ciertas combinaciones de bacterias-antibióticos, el extremo de la elipse de
inhibición puede ser difuso.
Debemos mencionar una serie de consideraciones sobre la lectura de los
resultados, a saber:
Cuando la CMI coincide entre dos marcas de la tira se informará el
resultado correspondiente al valor superior.
Si se observan intersecciones diferentes del crecimiento bacteriano en
ambas partes de la tira, debemos informar el valor de CMI más alto si la
diferencia entre los dos valores no es superior a la mitad de un paso de
dilución doble.
Por ejemplo, si la CMI en un lado de la tira es 8 y en el otro es 12,
deberemos informar 12. Sin embargo, si en un lado es 8 y en otro lado 16
debemos repetir la determinación.
Para Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus spp., pueden aparecer
colonias pequeñas en la zona de inhibición, por lo que se debe considerar
como resistente.
Cuando se lea la intersección de la elipse con las tiras de sulfamidas,
trimetoprim o cotrimoxazol, deberemos leer la intersección en la zona de
crecimiento denso y no considerar la existencia de crecimiento en la zona
poco densa.
Si se observan colonias grandes en la zona de inhibición puede
representar un cultivo mixto o variantes resistentes. Debemos repetir el
test a partir de colonias del cultivo primario. Si volvemos a observar el
mismo patrón, se tienen que sub-cultivar las colonias que crecen en la
zona de inhibición, identificarlas y volver a realizar el E-test.
33
Si obtenemos el mismo resultado y el cultivo es puro, debemos informar
como resistente.
Utilizando los puntos de corte actuales para Staphylococcus pneumoniae
y penicilina una cepa que es resistente por el método de dilución en agar
(CMI>2 µg/ml) puede ser categorizada comointermedia (CMI = 0,25 a
1,0µ g/ml) por Epsilon test. En estos casos cuando encontramos una cepa
con CMI de 1 µg/ml por el método Epsilon test, se recomienda confirmar
la CMI por un método alternativo.
A.2.4. Control de calidad
Las cepas de control utilizadas serán las recomendadas por la NCCLS para la
determinación de la CMI por métodos de dilución. Los valores de CMI esperados
deberán estar comprendidos entre los rangos mencionados para cada antibiótico
(Tabla 1-4).
A.2.5. Interpretación de Resultados
Como se ha observado una relación directamente proporcional entre los valores de
Epsilon test y los valores de referencia de la NCCLS obtenidos por dilución en agar,
los puntos de corte de la CMIs serán apropiados para categorizar la bacteria
estudiada como sensible, intermedia o resistente.
Información. Si los resultados con la(s) cepa(s) utilizadas como control de calidad
se encuentran dentro del rango aceptable, se realizará la información según los
criterios aplicados a los valores de CMI obtenidos por los métodos de dilución.
B. Métodos de Dilución
La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente
mediante alguna de las variantes de los métodos de dilución. Estos métodos se basan en
la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones
crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o
agar).
34
Las primeras determinaciones se realizaron empleando baterías de tubos con caldo de
cultivo con un rango determinado de antimicrobiano (macrodilución). Esta
metodología es muy engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones
necesarias para su realización. La aparición de un sistema de inoculación múltiple para
placas de agar popularizó el método de dilución en agar, en el que cada placa, con una
cierta concentración de antimicrobiano, permite inocular simultáneamente un gran
número de microorganismos. La utilización de micropipetas y de placas de
microtitulación facilitó la utilización del método de microdilución con caldo; en la
actualidad se han popularizado los métodos automatizados comerciales de
microdilución en caldo, fácilmente integrables en sistemas semi-automáticos de lectura
e interpretación de resultados, pero con el grave inconveniente del incremento en el
coste.
Tradicionalmente estos métodos se han venido usando para la determinación de la CMI
y la concentración mínima bactericida (CMB) de los antimicrobianos. En la mayoría de
los casos se preparan diluciones del antimicrobiano en progresión geométrica en base 2
utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente se inocula dicho medio y tras
la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del microorganismo se
realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición del crecimiento
del microorganismo. Si se realiza un sub-cultivo en medio sin antimicrobiano de los
medios sembrados previamente puede determinarse también la actividad bactericida.
Indicaciones y Limitaciones:
Se detallan los aspectos básicos y metodológicos de los métodos de dilución para su
aplicación a microorganismos de crecimiento no exigente (Staphylococcus spp,
Enterococcus spp, Listeria spp., enterobacterias, Pseudomonas spp., Acinetobacter
spp., Stenotrophomonas maltophilia.). Aun cuando muchos de estos aspectos son
aplicables también a los organismos fastidiosos (Haemophilus spp., Neisseria spp.,
Streptococcus spp.), más adelante se revisarán las particularidades propias de estos
otros microorganismos.
35
Los métodos de dilución se consideran de referencia para la determinación
cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos. Son los métodos indicados
cuando, además de la actividad inhibitoria, se quiere determinar también la actividad
bactericida.
La gran cantidad de variables (dependientes del microorganismo, del medio de
cultivo, del inoculo) que influyen en estos métodos son responsables de oscilaciones
en el resultado finalmente obtenido, por lo que para su correcta evaluación es
necesario que se realicen de forma estandarizada.
La determinación de la actividad antimicrobiana mediante técnicas de dilución se
realiza utilizando una escala discontinua (habitualmente concentraciones crecientes
en base 2) en vez de una escala continua (como sucede en el método de difusión), por
lo que los valores de CMI reales de un determinado antimicrobiano se encontrarán en
algún valor situado entre la CMI experimentalmente obtenida y la concentración
inmediatamente inferior. Desde el punto de vista clínico la diferencia entre los
valores real y experimental de CMI no suelen ser trascendentes cuando se trata de
concentraciones bajas, pero pueden tener importancia para las CMIs altas que se
acerquen a las concentraciones alcanzables in vivo.
En comparación con los métodos de difusión, los métodos de dilución son
técnicamente más complejos y casi siempre más caros, en particular cuando se
utilizan paneles comerciales de microdilución.
Preparación del antimicrobiano
Los antimicrobianos a usar en las técnicas de dilución pueden obtenerse de los
correspondientes fabricantes, o comprarse directamente a ciertas compañías
comerciales. Para los estudios in vitro no es adecuado utilizar las preparaciones de
uso clínico, sino que deben emplearse sustancias valoradas de las que se conozcan la
potencia (mg de sustancia pura por cada mg de sustancia valorada), la fecha de
caducidad y el lote de preparación. Las sustancias valoradas deben conservarse
36
siguiendo estrictamente las indicaciones del proveedor, por lo general en un
desecador que se mantiene en frigorífico o en congelador. En el caso de usar
desecadores para la conservación, hay que evitar la formación de agua de
condensación por lo que, tras sacarlos del frigorífico/congelador, se deben abrir sólo
cuando hayan alcanzado la temperatura ambiente.
La sustancia valorada debe pesarse en una balanza de precisión. Para conseguir una
determinada concentración, lo más sencillo es pesar con un ligero exceso una
cantidad de sustancia valorada y, posteriormente, añadir el volumen de diluyente
necesario. Como resulta obvio, para calcular una determinada concentración de
antimicrobiano hemos de considerar la pureza de la sustancia que se esté empleando
(que en la mayoría de casos no es del 100%). Las concentraciones de antimicrobianos
deben prepararse al menos 10 veces más concentradas que la concentración más alta
que se vaya a evaluar, y en todo caso superior a 1000 mg/l. En la Tabla 6 se indican
los diluyentes y solventes necesarios para la preparación de los antimicrobianos más
habituales. No es necesario esterilizar las soluciones de antimicrobianos porque la
contaminación de estas soluciones es muy infrecuente.
Las soluciones de antimicrobianos se deben emplear el mismo día de su preparación.
Alternativamente, se pueden congelar en alícuotas (usando tubos estériles de vidrio o
plástico). La temperatura ideal para la conservación de estas soluciones es de al
menos -60ºC, y en todo caso nunca superior a los -20ºC. Se acepta que a temperaturas
de -60ºC las soluciones madres de antimicrobianos son estables, con muy contadas
excepciones, durante al menos 6 meses. En la Tabla 7 se indica la estabilidad de
diluciones de antimicrobianos a otras temperaturas. En las Tablas 8a y 8b se recogen
esquemas de preparación de diluciones de antimicrobianos para usar en los métodos
de dilución en agar y de dilución en caldo, respectivamente.
El número de antimicrobianos a evaluar dependerá de las directrices de cada
laboratorio.
37
Debe recordarse que el antibiograma además de ofrecer información de interés
clínico puede también tener interés epidemiológico y para la identificación de
microorganismos, por lo que puede considerarse necesario incluir antimicrobianos
que no se utilizan habitualmente en clínica. En la Tabla 9 se recogen los
antimicrobianos que sería aconsejable evaluar para diferentes grupos de
microorganismos según el grupo MENSURA, y en la Tabla 10 los rangos de dilución
aconsejables desde un punto de vista clínico.
Algunos laboratorios han de estudiar la actividad de nuevos antimicrobianos o
realizar estudios comparativos sobre miembros de grupos/familias estrechamente
relacionados, pero en general, y teniendo en cuenta que el número de antimicrobianos
(de uso clínico) es enorme, no todos ellos se pueden estudiar de forma rutinaria. En
general, se escoge un representante de un grupo y se asume que la actividad de otros
antimicrobianos del mismo grupo, con igual mecanismo de acción y frente a los que
los mecanismos de resistencia bacteriana son similares, tendrá una actividad igual o
muy similar. Por otro lado, aun cuando el laboratorio estudie un amplio grupo de
antimicrobianos de forma rutinaria, muchos autores consideran innecesario informar
de todos ellos al clínico.
B.1. Dilución en agar
En estos métodos se incorpora el antimicrobiano a evaluar a un medio con agar. El
antimicrobiano se añade cuando el medio aún está fundido. Para lograr el rango de
dilución deseado se prepara una serie de placas, cada una con una determinada
concentración de antimicrobiano. Las placas se inoculan con un replicador una vez
que se haya solidificado el medio de cultivo. El número de placas de cada
concentración a preparar vendrá dado por el número de microorganismos que se vaya
a estudiar, teniendo en cuenta que la mayoría de los replicadores permiten inocular
entre 32 y 36 organismos.
38
Medio de cultivo: En la mayoría de los casos, el medio de cultivo a emplear es agar
Mueller-Hinton, pero en función de los microorganismos y de sus necesidades
nutritivas puede ser adecuado o necesario añadir algún suplemento a este medio, o
emplear un medio diferente. El medio se obtiene habitualmente de distribuidores
comerciales, que indican las condiciones para su preparación. Una vez esterilizado
debe dejarse enfriar a unos 50ºC antes de añadir suplementos (si es necesario) y las
soluciones con antimicrobiano. El pH del medio, una vez sólido y con los
suplementos que se requieran, ha de estar entre 7.2 y 7.4. El medio con
antimicrobiano se vierte cuanto antes (para evitar que el agar se solidifique) en placas
petri estériles, evitando la formación de burbujas que dificultarían la posterior
inoculación de las placas.
Para placas circulares de 90 mm de diámetro son necesarios 20 ml de medio con
antimicrobiano (habitualmente en la proporción 19 ml de medio por 1 ml de solución
de la correspondiente concentración de antimicrobiano).
Posteriormente se dejan solidificar las placas, que se usarán inmediatamente o se
almacenarán en frigorífico en bolsas de plástico. Para trabajos de referencia las placas
no se deben almacenar más de cinco días, sin olvidar que algunos antimicrobianos
(como ampicilina, meticilina, imipenem, ácido clavulánico, etc.) son poco estables a
4-8ºC y, por ello, las placas que los contienen se deben usar el mismo día de su
preparación. Tras sacar las placas del frigorífico, se deben dejar a temperatura
ambiente unos 30 minutos antes de proceder a su inoculación, comprobando que no
exista agua de condensación en la superficie de las mismas. Las placas húmedas se
pueden secar en estufa dejando las tapas entreabiertas. En cualquier caso, la
evaluación de los resultados obtenidos con placas almacenadas según las condiciones
indicadas sólo debe realizarse cuando los resultados con las cepas de control estén
dentro de los márgenes indicados.
Para cada serie de concentraciones se debe incluir al comienzo y al final de las
mismas sendas placas de medio sin antimicrobiano que servirán para controlar el
crecimiento y la posibilidad de contaminación durante el proceso de inoculación.
39
Preparación del inóculo.
Los replicadores suelen dispensar gotas (de aproximadamente 5 mm de diámetro) con
un volumen de 1 a 2 μL. El inóculo que debe contener cada una de estas gotas debe
ser de aproximadamente 104 UFC, por lo que la suspensión original a usar con el
replicador debe tener 107 UFC/mL Esta suspensión produce una turbidez difícil de
medir, por lo que habitualmente se prepara una suspensión de 108 CFU/mL que
posteriormente se diluye 1:10. En la mayoría de los laboratorios esta turbidez se
prepara por comparación visual (o espectrofotométrica) con la que corresponde al
estándar 0.5 de la escala de McFarland (densidad óptica de 0.08-0.10 a 625 nm,
equivalente a 1-2 x 108 CFU/ml para la mayoría de los microorganismos no
exigentes).
Una vez preparado, debe usarse antes de 15 minutos. Se pondrá una alícuota de cada
uno de los inóculos en los correspondientes pocillos del replicador. Para la
inoculación se deben preparar las series de placas de modo que se comience
inoculando un control sin antimicrobiano, se continúa inoculando a partir de la placa
con menor concentración de antimicrobiano y se finaliza sembrando una nueva placa
de control sin antimicrobiano. Cada uno de los inóculos se debe sembrar en
aislamiento en una placa sin antimicrobiano para comprobar posteriormente la pureza
de los mismos, y si fuera necesario disponer de un cultivo fresco tras la
correspondiente incubación. Las placas inoculadas se dejarán a temperatura ambiente
hasta que las gotas de inóculo estén secas. Posteriormente se incuban a 35ºC durante
16 a 20 horas y se procede a su lectura. La CMI es la menor concentración de
antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento bacteriano (no se considera
crecimiento la aparición de una colonia aislada o de un halo tenue debido al propio
inóculo). Ocasionalmente pueden verse algunas colonias o franco crecimiento en
concentraciones superiores a la CMI aparente; en estos casos se debe comprobar la
pureza del inóculo para descartar una contaminación; si esta última se confirma
deberá repetirse el estudio.
40
B.2. Dilución en caldo
El NCCLS recomienda para la mayoría de los microorganismos utilizar caldo
Mueller-Hinton, al que se añadirán los suplementos necesarios para asegurar el
crecimiento de organismos exigentes. El medio debe tener un pH de 7.2 a 7.4 y estar
ajustado con Ca2+ (20-25 mg/l) y Mg2+ (10-12.5 mg/l). Esta cantidad de iones
divalentes asegura la reproducibilidad de los valores de CMI de aminoglucósidos
frente a Pseudomona aeruginosa y de tetraciclinas frente a la gran mayoría de
microorganismos, al compararlos con los que se obtienen con agar Mueller-Hinton.
El ajuste de cationes del caldo Mueller-Hinton se hará en función de la cantidad basal
que contenga el mismo, habitualmente proporcionada por los fabricantes del medio.
Por cada 1 mg/l de incremento que sea necesario ajustar se añaden, al medio ya estéril
y a 4ºC, 0.1ml de una solución esterilizada por filtración que contiene 10mg de
Mg2+/ml (8.26 gramos de Cl2Mg.6H20 en 100 ml de agua desionizada) y 0.1ml de
solución estéril de 10 mg de Ca2+/ml (3.68 g de Cl2Ca.2H2O en 100 ml de agua
desionizada). Si el fabricante ofrece ya un medio con las cantidades suficientes de
cationes divalentes no es necesario ajuste alguno.
Existen dos modalidades de los métodos de dilución, en las que se utilizan tubos
(macrométodo) o placas de microtitulación (micrométodo).
B.2.1. Método de Macrodilución.
Se emplea por cada combinación microorganismo/antimicrobiano una batería de
tubos. Habitualmente se prepara la batería de tubos con 1ml de medio estéril sin
antimicrobiano.
Al primero de ellos se añade 1 ml de la solución inicial del tubo de antimicrobiano
hasta conseguir la concentración más alta a estudiar (teniendo en cuenta que este
primer paso supone la dilución a la mitad de la solución madre, y que una vez
inoculados los tubos, con 1 ml de inoculo, se diluirá nuevamente la concentración
de antimicrobiano a la mitad). Tras mezclar adecuadamente, se pasa 1 ml al
41
siguiente tubo; el proceso se repite tantas veces como diluciones se quieran
estudiar, eliminando del último tubo de la serie 1 mL de medio con
antimicrobiano, con objeto de mantener el volumen final de 1 mL.
Para cada paso de dilución se debe emplear una pipeta diferente. La serie de tubos
se completa con uno de control sin antimicrobiano que solamente tiene 1 mL de
caldo.
B.2.2. Método de Microdilución.
En el método de microdilución cada una de los pocillos de la placa de
microtitulación con pocillos de fondo en “U” representa uno de los tubos del
método de macrodilución. Las placas de microdilución con diferentes
concentraciones de antimicrobianos se pueden preparar en el propio laboratorio o
bien se pueden comprar a diferentes compañías que los suministran congelados,
deshidratados o liofilizados.
En muchos laboratorios el empleo de paneles comerciales se basa en la utilización
de sistemas semiautomáticos de incubación lectura-interpretación; esto facilita su
uso, pero tiene el inconveniente del incremento del gasto. Algunas compañías han
introducido en el mercado paneles en los que el medio de cultivo incluye un
indicador fluorescente que permite la obtención rápida (menos de 8 horas) de los
resultados; sin embargo, no existen aún datos suficientes que permitan aconsejar el
uso rutinario de este tipo de paneles. Varias compañías comerciales están
evaluando, también, sistemas expertos (programas informáticos) que facilitan la
interpretación clínica de los resultados obtenidos; es presumible que su uso se
generalizará en un futuro. No se discutirá el uso de estos sistemas comerciales; se
remite al lector a la información proporcionada por los propios fabricantes. En lo
sucesivo nos referiremos al método de microdilución preparando las placas en el
propio laboratorio.
42
Teniendo en cuenta que la mayoría de placas disponibles tienen 96 pocillos
(12x8), podemos estudiar con cada una de ellas, y para el mismo microorganismo
8 antimicrobianos y 11 diluciones (la última columna se suele utilizar como
control de crecimiento) o viceversa. En ocasiones se preparan placas con 12
diluciones de antimicrobiano y se utiliza una placa adicional para realizar los
controles. El volumen final de cada pocillo es habitualmente de 100 μL, por lo que
antes de la inoculación de la placa, cada pocillo debe contener 100 μL de caldo
con antimicrobiano (volumen de inóculo menor de 10 μL) o 50 μL (si se van a
usar también 50 μL para inocular la placa). En este último caso debe tenerse en
cuenta, a la hora de calcular la concentración inicial más alta, que tras añadir el
inóculo la concentración de antimicrobiano se diluirá a la mitad. Dependiendo,
pues, del volumen de inóculo final, las placas se rellenan utilizando una pipeta
multicanal con 100 ó 200μL de la solución más alta de antimicrobiano.
Posteriormente se añade un volumen de 50 o 100μL de caldo sin antimicrobiano
en los pocillos de las columnas 2 a 11 y se realiza la dilución en la forma habitual
empleando la pipeta multicanal, dejando los pocillos de la última columna como
controles (positivos - no antimicrobiano y negativos – no inoculo).
Inoculación
Si se van a añadir suplementos a los pocillos de las placas de microtitulación se
producirá una dilución del volumen final; en el caso de que el volumen añadido no
supere el 10% del volumen total no es necesario tener en cuenta este efecto.
El inóculo en los métodos de dilución en caldo se prepara a partir de suspensiones
del 0.5 de la escala de McFarland, empleando cualquiera de los dos métodos
(crecimiento o suspensión directa) indicados anteriormente. El inoculo final será
de 5 (se acepta de 3 a 7) x 105 CFU/mL, ó 5 x 104 CFU/pocillo en la técnica de
microdilución. En función de ello la suspensión inicial se diluirá en caldo Mueller-
Hinton dependiendo del método elegido. En el método de macrodilución se hará
una dilución 1:100 de forma que al añadir 1 ml a los tubos con 1 ml de medio con
antimicrobiano queden 106 CFU en 2 ml, es decir 5 x105 CFU/ml.
43
De forma análoga, en el caso de la microdilución se hará una dilución 1:10 (en el
caso de emplear un inóculo de 5 μL) o 1:100 (en el caso de emplear un inoculo de
50μl). El inóculo ya diluido debe usarse antes de 15 minutos tras su preparación.
Las placas de microdilución deben taparse o sellarse con adhesivo para evitar la
evaporación del medio de cultivo cuando se incuben. Es necesario controlar el
inóculo así preparado, sembrando alícuotas diluidas en medio sólido que, una vez
incubadas, permitan el recuento del inóculo realmente usado. Una forma sencilla
de realizar este recuento es diluir 10 μL del tubo o del pocillo de control positivo
en 10 ml de suero salino, sembrando posteriormente 100 μL de esta dilución. Para
un inoculo de 5 x 105 UFC/mL deben crecer 50 colonias en la placa de medio
sólido.
Los tubos de ensayo o placas petri se incubarán a 35ºC durante 16 a 20 horas, o en
las condiciones necesarias que se detallan posteriormente para casos especiales.
Para evitar diferencias de temperatura en la incubación de bloques de placas de
microtitulación no se deben apilar más de cuatro o cinco placas.
Tras la incubación se procede a la lectura de los resultados. La CMI se define
como la menos concentración de antimicrobiano que a simple vista inhibe
completamente (o el 80% en el caso de las sulfamidas) el crecimiento del
microorganismo estudiado. La interpretación de los resultados, que a veces resulta
compleja, se facilita tomando como referencia el crecimiento observado en los
tubos o pocillos usados como control positivo. En el caso de las placas de
microdilución dichos controles positivos deben presentar una clara turbidez o un
botón de al menos 2 mm de diámetro. Para observar el crecimiento de los pocillos,
a veces resulta necesario limpiar la parte inferior de la placa de microtitulación, lo
que puede realizarse con papel absorbente. La lectura es más sencilla utilizando un
lector con espejo (también usado en las técnicas de diagnóstico serológico) en el
que se refleja la parte inferior de la placa de microtitulación.
44
B.3. Correlación de los resultados.
En general, los valores de CMI obtenidos mediante microdilución son iguales o una
dilución menor a los que se obtienen por macrodilución.
B.4. Control de calidad.
Medio de cultivo: Cada lote de Mueller-Hinton se debe evaluar utilizando una serie
de cepas de control de calidad.
Uno de los problemas que pueden plantearse con el caldo de Mueller-Hinton es el
contenido en timidina que puede inducir a errores en la determinación de la CMI de
sulfamidas y de trimetoprim. Con la cepa control de Enterococcus faecalis ATCC
29212 los valores de CMI deben ser, respectivamente, ≤0.5 y ≤9.5 mg/l. La CMI de
gentamicina de Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 puede ser menor de la
esperada si el caldo Mueller-Hinton no contiene una cantidad adecuada de cationes.
B.5. Informe de Resultados
Cuando la determinación de la CMI tiene una finalidad clínica, no es aconsejable
presentar simplemente los valores absolutos obtenidos con cualquiera de los métodos
expuestos. Resulta más útil traducir, mediante una categorización cualitativa, estos
valores de CMI. La interpretación de estos resultados debe considerar también
aspectos farmacocinéticas, posibles mecanismos de resistencia y datos de eficacia
clínica. De esta forma se pueden distinguir tres categorías clínicas: sensible,
intermedio y resistente.
En la actualidad existen varios grupos de estudio que han establecido puntos de corte
que permiten establecer las tres categorías citadas, pero estos valores varían de unos
grupos a otros. En España, el grupo MENSURA ha establecido recientemente los
puntos de corte que definen las categorías de sensibilidad y resistencia y se recogen,
de forma comparativa, los puntos de corte establecidos por este grupo, NCCLS, CA-
45
SFM (Sociedad Francesa de Microbiología) y BSAC (Sociedad Británica de
Quimioterapia).
1.2.5. CEPAS DE REFERENCIA
Las cepas de referencia en métodos de dilución aconsejadas por el NCCLS son:
Staphylococcus aureus ATCC 29213: Control para antimicrobianos usados frente
a bacterias Gram-positivas.
Enterococcus faecalis ATCC 29212: Control para antimicrobianos usados frente a
bacterias Gram-positivas, y para control de trimetoprim/sulfametoxazol.
Escherichia coli ATCC 25922: Control de antimicrobianos usados frente a
bacterias Gram-negativas.
Escherichia coli ATCC 35218: Control para las combinaciones de betalactámicos
con inhibidores de betalactamasas.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: Control de antimicrobianos usados frente
a bacterias Gram-negativas y particularmente con aminoglucósidos.
Los valores aceptables para cada una de estas cepas se recogen en la Tabla 11.
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 desarrolla resistencia a carbenicilina cuando se
subcultiva sucesivamente. Si se observa este problema debe comenzar a usarse un nuevo
cultivo de la colección que se mantenga liofilizado o congelado.
Para el trabajo rutinario, las cepas se pueden mantener durante 2-4 semanas a 4-8ºC en
tubos con agar de soja tripticasa en lengüeta. Para almacenamiento a largo plazo se
deben mantener liofilizadas o congeladas al menos a -20ºC (o menos) utilizando un
agente estabilizante adecuado (ej. caldo de soja tripticasa con glicerol al 10-15%, caldo
con suero bovino fetal al 50%, sangre de oveja desfibrinada, o leche descremada).
Las cepas de referencia deben usarse para controlar cada lote de tubos, placas de agar, o
placas de microdilución. En caso de que los valores de CMI no se encuentren dentro de
los rangos recogidos en la Tabla 11 el lote se debe descartar. Este control se debe
46
realizar durante 30 días consecutivos sin que, para cada antimicrobiano, se obtengan más
de tres valores fuera de los rangos recogidos en la tabla 11.
Cuando se haya satisfecho este requisito el control será semanal. Si con esta
periodicidad se observa un error (no obvio) se hará una reevaluación durante 5 días y si
con ello no se llega a determinar la fuente del error se hará un control diario
nuevamente, durante 30 días, antes de volver al control semanal.
Tabla 12: Métodos de análisis de la sensibilidad antimicrobiana
Metodo Técnica Información
Cualitativo Antibiograma Difusión de Micro
discos
(Kirby-Bauer)
Resistencia
Valor Intermedio
Sensibilidad
Semi-cuantitativo Gradiente Antibiótico
(E-Test) Aproximación a la
Concentración
Mínima Inhibitoria
(CMI) Cuantitativo 1. Dilución de Caldo:
Macrodilución
en Tubo.
Microdilución
en Placa
2. Dilución en Agar
3. Sistemas Automatizados
(Vitek.)
Determinación de la
CMI
1.2.5.1. Escherichia coli.
Es una bacteria cuyo hábitat natural es el tracto entérico del hombre y de los animales de
sangre caliente, por ello, la presencia de este microorganismo en un producto indica
generalmente una contaminación directa o indirecta de origen fecal, pudiendo estar
presentes patógenos entéricos.
Hoy en día, Escherichia coli es el indicador de contaminación fecal más utilizado, pero
la presencia de Escherichia coli en un producto no constituye una connotación directa de
la presencia de algún patógeno, sino que implica únicamente un cierto riesgo de que
pudiera estar presente.
47
La no detección de Escherichia coli no garantiza la presencia de patógenos entéricos. Se
destruye a temperatura de Pasteurización y también durante su almacenamiento en frío,
por eso, la presencia de Escherichia coli en un producto tratado por calor, significa que o
bien ha ocurrido un fallo en el proceso o más frecuentemente ha ocurrido una
contaminación después del tratamiento térmico, a partir del equipo, empleados o de
producto no procesados (malas prácticas de fabricación).
La mayoría de cepas de Escherichia coli son comensales entéricos inocuos, pero algunas
pueden producir enfermedad. Las Escherichia coli patógenas intestinales se definen
como aquellas cepas capaces de causar una enfermedad diarreica en hombres y
animales. Las cepas de Escherichia coli importantes como posibles patógenos se
encuentran en las heces y pueden pasar a los productos de consumo, bien por prácticas
antihigiénicas o por materias primas contaminadas como el uso de aguas fecales.
Las cepas de Escherichia coli implicadas en enfermedades pueden incluirse en 6 grupos
basados en su virulencia y serología:
Escheria coli Enteropatogénica (ECEP): Son enteropatógenas, porque no producen
enterotoxinas, aunque pueden producir diarrea grave puesto que son capaces de
invadir células epiteliales. Las personas son un reservorio importante.
Escheria coli Enterotoxigénica (ECET): Cepas que son enterotoxigénicas, son la
causa principal de la diarrea infantil en los países en desarrollo y son los agentes
más típicos de la diarrea del viajero. Colonizan el intestino delgado y producen
toxinas que atraen la acumulación de líquido y una respuesta diarreica.
Escheria coli Enteroinvasiva (ECEI): Enteroinvasoras, porque no producen
toxinas, pero invaden y se multiplican en el interior de las células epiteliales del
colon.
48
Escheria coli Enterohemorrágica (ECEH): Enterohemorrágicas, producen toxinas
y factores citotóxicos que causan colitis hemorrágica. Destaca la cepa Escherichia
coli 0157:H7, produce una toxina denominada verotoxina, esta se identifica como
causa de colitis hemorrágica, que se asocia con la ingestión de carne picada vacuna
poco cocinada.
Escheria coli Enteroagresiva (ECEA): Solo encontrada en humanos, producen
hemolisina y una entorotoxina ST similar a la de las enterotoxigénicas, se le
asocian dos toxinas: toxina termoestable enteroagregante (EEAST); toxina
codificada por plasmidos (PET).
Escheria coli Adherencia Difusa (ECAD): Se adhiere a la totalidad de la superficie
de las células epiteliales y habitualmente causa enfermedad en niños
inmunológicamente no desarrollados o malnutridos.
Existen cepas de Escherichia coli de referencia en métodos de dilución aconsejadas por
el NCCLS:
Escherichia coli ATCC 25922: Control de antimicrobianos usados frente a
bacterias Gram negativas.
Escherichia coli ATCC 35218: Control para las combinaciones de beta-lactámicos
con inhibidores de betalactamasas.
Detección e identificación: Existen 3 métodos para la detección y recuento de
Enterobacterias
Método del NMP: usando caldos lactosados y posterior confirmación por siembra
en placa y en medio EMP.
Recuento por siembra en placa, usando el medio VRBG (agar bilis rojo violeta
con glucosa) o medio ENDO para coliformes totales, incubando a 37ºC.El medio
mFc (microfiltración para coliformes) para coliformes fecales cuando lo
49
incubamos a 44ºC. Muy usado es el VRBG que usa como agente selectivo las sales
biliares y el colorante cristal violeta. Otro medio es el Mac Conkey, que se puede
hacer en líquido (caldo) o placa.
Detección de enzimas presentes en este grupo mediante reacciones cromogénicas
o fluorogénicas, por ejemplo el reactivo MUG (4-metil- umbeliferil /J-D-
glucurónico), específico para E. coli, dando un componente fluorescente.
Para identificar Escherichia coli se realizan pruebas bioquímicas y/o fisiológicas. El
método más general de identificación y confirmación de enterobacterias, incluyendo a
Escherichia coli, es el que utiliza las pruebas bioquímicas IMV: C y la tinción Gram,
aunque hoy en día existen pruebas mucho más rápidas y completas como son las
famosas tiras API (Analytical Profile Index) y también hay pruebas serológicas, que son
importantes para la determinación de las cepas patógenas, como por ejemplo de
Escherichia coli, que no poseen las características típicas de las cepas de Escherichia
coli.
1.2.5.2. Staphylococcus aureus
Los miembros del genero Staphylococcus son cocos gran positivos, anaerobios
facultativos, inmóviles, que habitualmente forman agrupaciones irregulares. Son catalasa
positiva, oxidasa negativa, fermentan la glucosa de forma anaerobia, poseen ácido
teitoico en sus paredes celulares, un DNA con un contenido mucho más bajo en G+C
(30 a 39%). Los estafilococos residen normalmente en la piel, las glándulas cutáneas y
las mucosas de animales de sangre caliente.
La importancia de esta bacteria radica en su capacidad de producir enterotoxinas, las
cuales son resistentes a las proteasas del intestino y termoestables. Al ser ingeridas
producen gastroenteritis con nauseas, vómitos, diarreas y debilidad general,
constituyendo una intoxicación, ya que no requiere una multiplicación de la bacteria.
50
Descripción: Staphylococcus aureus es un coco Gram +, que forma agrupaciones
irregulares como consecuencia de la división celular en más de un plano, son catalasa +,
oxidasa - y anaerobios facultativos. Crece en medios sólidos, dando colonias de color
dorado o amarillo, destaca su capacidad para crecer en medios con elevado contenido de
sal (5-7'5%), de ahí que se emplee esta característica para su aislamiento. Su hábitat
principal es la piel, sus glándulas anejas y las mucosas de los animales de sangre
caliente. Por eso, cuando se encuentra un gran número de estas bacterias en un producto,
significa por lo general que las prácticas higiénicas de limpieza y desinfección y el
control de temperatura no han sido adecuados.
Existen cepas de Staphylococcus aureus de referencia en métodos de dilución
aconsejadas por el NCCLS: Staphylococcus aureus ATCC 29213: Control para
antimicrobianos usados frente a bacterias Gram positivas.
Detección e identificación: Staphylococcus aureus se detecta por análisis
microbiológicos clásicos, siembra en medios selectivos como los medios manitol salado
y o el Baird - Parker, luego se hace aislamiento e identificación. Para la identificación
existen pruebas comerciales como los API para estafilococos y para la detección de la
toxina se emplean anticuerpos específicos. El procedimiento de confirmación más
frecuente es el test de la coagulasa.
1.3. DEFINICIONES
Antibiograma, Se define a la actividad in vitro de un antibiótico frente a un
microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una
bacteria o población bacteriana.
51
1.4. HIPOTESIS
Ho. Las diferentes concentraciones del extracto hidroalcohólico de la hoja Mansoa
alliacea (ajo sacha) no presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus
aureus y Escherchia coli.
Ho. Las diferentes concentraciones del extracto etanólico de la hoja de Mansoa alliacea
(ajo sacha) no presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
Ha. Las diferentes concentraciones del extracto hidroalcohólico de la hoja de Mansoa
alliacea (ajo sacha) presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
Ha. Las diferentes concentraciones del extracto etanólico de la hoja Mansoa alliacea
(ajo sacha) presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
1.5. VARIABLES
1.5.1. Variable independiente
Extractos hidroalcohólico y etanólico de la hoja de Mansoa alliacea.
1.5.2. Variable dependiente
Actividad antibacteriana frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
52
CAPITULO II
METODOLOGIA
El estudio consistió en indagar la presencia de actividad antimicrobiana en las hojas de
Mansoa alliacea “ajo sacha”, especie vegetal de la familia Bignoniaceae. La
literatura científica no reporta ninguna información acerca de su actividad
antimicrobiana. Se trató de una investigación experimental donde se
combina el trabajo de campo para la recolección de la muestra, trabajo de
gabinete para la identificación botánica, para autentificar la especie vegetal,
procedimientos fitoquímicos y pruebas de sensibilidad microbiana para la
determinación bacteriana.
2.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
Tipo de estudio: El estudio es Prospectivo - Experimental. Prospectivo porque en
el registro de información se tomó en cuenta los hechos a partir del inicio de la
fecha de estudio. Experimental porque se empleó diferentes concentraciones de los
extractos hidroalcohólico y etanólico para ver la influencia de la actividad
antibacteriana.
2.2. DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
El diseño de investigación Experimental fue de enfoque cualitativo, porque se
obtuvo datos para medir el efecto de los extractos de 3 repeticiones de las plantas
sobre los microorganismos.
El estudio se realizó aplicando los ensayos de Sensibilidad Antimicrobiana
establecidas por la Farmacopea Británica (BP).
53
2.3. POBLACIÓN Y MUESTRA
Población:
Constituida por arboles de la Especie de Mansoa alliacea “ajo sacha”.
Muestra:
Arboles de la especie Mansoa alliacea “ajo sacha” que crecen en el jardín
botánico del Instituto de Medicina Tradicional (IMET- EsSalud), los cuales se
recolectó 3Kg de hoja.
La población bacteriana para evaluar la actividad estuvo conformada por 02
microorganismos: Staphylococcus aureus ATCC 29213, y Escherichia coli
ATCC 35218 los mismos que fueron ensayados frente a diferentes
concentraciones del extracto hidroalcohólico y etanólico.
Criterios de selección
Criterios de inclusión de la muestra
Hojas enteras que no recibieron daño de depredadores (insectos).
Se recogió la muestra 2 horas después de la salida del sol (8 a.m.).
Criterios de exclusión de la muestra
Se descartó hojas malogradas.
No se recogió hojas del suelo.
Individuos de la especie Mansoa alliacea “ajo sacha”, que crecen en otras
zonas.
2.4. MATERIALES
Materiales de laboratorio: Matraz de 250 mL, matraz de 100 mL, Probeta
graduada de 100mL, Tubos de ensayo con tapa rosca (150x15mm), Tubos de
ensayo con tapa rosca (75x10mm), Placas Petri, Pipetas lineales (10, 5 y 1mL),
Balón de destilación (500, 100 y 50 mL), Frascos con tapa rosca de 100 y 250 mL,
Vaso de precipitado de 100 mL, Gotero color ámbar, Varilla de vidrio.Gradilla, Asa
bacteriológica de punta, Asa bacteriológica de aro, Espátula de metal.
54
Reactivos y Medios de cultivos:Cloruro de Bario (BaCl2), Ácido Sulfúrico
(H2SO4), Agar Mueller Hinton, Caldo Mueller Hinton, Agar Tripticasa soja.
Equipos: Balanza digital, Autoclave, Baño María, Mechero de bunsen, Agitador de
tubos, Cocina eléctrica, Incubadora, Refrigeradora.
2.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Etapas:
Recolección de la Muestra:
Se recolectó las hojas en el Jardín Botánico del Instituto de Medicina Tradicional
(IMET-EsSaalud), se eligió un árbol de abundante follaje. .Se tomó 3 kg de hojas frescas
para el trabajo experimental y se recogió una rama con hojas, flores y frutos para su
identificación en el Herbarium Amazonense de la UNAP.
Identificación de la Muestra:
Se realizó en el Herbarium Amazonense de la UNAP.
Procesamiento de la Muestra
Secado:
3 kg de muestra se secó al aire libre en el laboratorio y se obtuvo 1.2 kg de muestra seca.
Molienda:
Las hojas molidas pasaron por tamiz 80 ASTM y se obtuvo 400 gramos, luego por tamiz
100 ASTM y se obtuvo 100 gr.
Obtención del extracto hidroalcohólico: El extracto hidroalcohólico se obtuvo por
maceración de la muestra por 10 veces consecutivas con etanol/agua durante 7 días cada
vez.
Para cada extracción se puso a maceración 1200 g de materia prima, la muestra vegetal
de Mansoa alliacea “ajo sacha”, en 3000 ml de etanol/agua, durante 7 días. La
concentración del extracto se realizó por eliminación del disolvente a presión reducida
en un rotavapor, a una temperatura de 600 C y a una presión de 690 mmHg. por espacio
55
de 3 horas aproximadamente, posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente por 3
días.
Obtención del extracto etanólico: El extracto etanólico se obtuvo por maceración de la
muestra por 10 veces consecutivas con etanol durante 7 días cada vez.
Para cada extracción se puso a maceración 50 g de materia prima, la muestra vegetal de
Mansoa alliacea “ajo sacha”, en 700 ml de etanol, durante 7 días. La concentración del
extracto se realizó por eliminación del disolvente a presión reducida en un rotavapor, a
una temperatura de 600 C y a una presión de 690 mmHg. por espacio de 3 horas
aproximadamente, posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente por 3 días.
Preparación de Medios de Cultivo y Reactivos
a) Caldo Mueller Hinton
Se vertió 22 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Se dejó reposar 5 minutos. Se
calentó con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto para disolución total; luego se
distribuyó en tubos apropiados y esterilizados en autoclave a 121°C por 15 minutos pH
FINAL: 7.3 ± 0.1.
Ajuste de cationes:
Preparación de la solución stock de cloruro de calcio: disolver 3,68 g de Ca Cl2. 2
H2O en 100 ml de agua desionizada. Concentración de Ca2+: 10 mg /ml.
Preparación de la solución stock de cloruro de magnesio: disolver 8,36 g de Mg
Cl2.6 H2O en 100 ml de agua desionizada. Concentración de Mg2+: 10 mg/ml.
Esterilización de las soluciones stock: mediante la técnica de filtración por
membrana. Conservar a 4°C hasta su uso.
Se suplementó el caldo Mueller Hinton preparado, esterilizado y a temperatura 4 ºC con
las soluciones stock. Agregado con agitación constante 0.1 ml de cada solución stock
por litro de caldo. Así se incrementó en 1 mg /l la concentración final de estos cationes.
56
b) Agar Tripticasa Soja (TSA)
Se añadió 40g en 1000ml de agua destilada, se llevó a ebullición, en autoclavar a 121°C
durante 15 minutos; luego se enfrió a 45 – 50°C y distribuyó en placas petri estériles.
Prueba de susceptibilidad y acción antimicrobiana de los extractos por el método
de Macrodilución.
Preparación del inoculo.
Para estandarizar la densidad del inóculo se usó una suspensión de sulfato de bario (0,5
de la escala de Mc Farland) como estándar.
El inoculo estándar, para Macrodilución en caldo, se puede obtener por crecimiento del
microorganismo hasta turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc Farland o por
suspensión directa de colonias, en caldo o solución fisiológica, hasta alcanzar dicha
turbidez. Una vez obtenido el inoculo de turbidez comparable al 0.5 Mc Farland, se
diluyó en caldo (Macrométodo) para ajustar el inoculo de manera tal, que luego de
colocado, cada tubo de ensayo para que contenga aproximadamente 5 x 105 UFC/ml. La
inoculación con la suspensión estandarizada se hizo dentro de los 15 minutos de
preparada la misma, para evitar que el número de microorganismos aumente por
duplicación. La concentración del inoculo ajustado puede variar dependiendo del
método de inoculación utilizado y del microorganismo en estudio, por lo tanto se debe
calcular para cada situación. Para realizar este cálculo decidió el volumen exacto y se
realizó la inoculación.
Colocación del inoculo en los tubos de ensayo.
Macrodilución en caldo (tubos de ensayo). Procedimiento
Se agregó 1 ml del inoculo estandarizado a cada tubo de ensayo de dilución de muestra y
al tubo de ensayo control de crecimiento y se homogenizó la mezcla. No transcurrió más
de 15 minutos entre la preparación del inoculo y su colocación en el tubo de ensayo. Se
tuvo en cuenta que tanto la muestra, como el inoculo sufrieron una dilución al medio.
Por ello es aconsejable realizar un control de pureza del inoculo sub-cultivando una
alícuota en un medio solido no selectivo.
57
El tiempo de incubación para la mayoría de los microorganismos es de 16 a 20 horas,
para la técnica de Macrodilución.
Lectura e interpretación de la CIM.
La CIM corresponde a la mínima concentración de antibiótico en donde no se observa
desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en µg/ml.
PREPARACIÓN Y CONTROL DE EXTRACTOS.
A. Método de Macrodilución en Caldo.
Figura 1. Diluciones en caldo para los extractos.
58
Se pesaran 640 mg del extracto en viales tipo Spendorff estériles, diluidos
en 1 mL de disolución metanol/agua (1:1) para alcanzar una concentración
de prueba de 640 mg/ml (solución madre o stock).
De la solución madre se sacaran 0.2 mL y será añadido al tubo de ensayo
N0 01 que contendrá 1.8 mL de caldo MuellerHinton.
Del tubo de ensayo N0 01 se sacara 1 mL para ser añadido al tubo de
ensayo N0 02 y así sucesivamente hasta llegar al tubo de ensayo N0 08.
Del tubo de ensayo N0 08 se sacara 1 mL que será desechado.
Después de este procedimiento se añadirá a todos los tubos de ensayos 1
mL de la suspensión bacteriana.
El volumen final mínimo, en cada tubo de ensayo, será de 2 mL.
Las concentraciones estarán comprendidas entre los rangos de 32 mg/mL a
0.25 mg/mL.
Los extractos que no se disolvieron por agitación serán mantenidos por
algunos minutos en baño maría (temperatura de 400C) y colocados
nuevamente en el vortex.
PREPARACIÓN DE CONTROLES.
Figura 2. Diluciones en caldo para el control
59
El control positivo empleado en la prueba será el antibiótico gentamicina
(160 mg/2 mL), del cual se utilizara 0.64 mL y se enrasara hasta 5 mL en
un tubo de ensayo estéril para obtener una solución madre o stock de 10
240 µg/mL.
De la solución madre se sacaran 0.2 mL y será añadido al tubo de ensayo
N0 01 que contendrá 1.8 mL de caldo Mueller Hinton.
Del tubo de ensayo N0 01 se sacara 1 mL para ser añadido al tubo de
ensayo N0 02 y así sucesivamente hasta llegar al tubo de ensayo N0 09.
Del tubo de ensayo N0 09 se sacara 1 mL que será desechado.
Después de este proceso se añadirá a todos los tubos de ensayo 1 mL de la
suspensión bacteriana.
Las concentraciones estarán comprendidas entre los rangos de 5120 µg/mL
a 20 µg/mL.
PLAN DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Los resultados obtenidos en los diferentes ensayos se expresaran en términos de valores
resultantes de cumplimiento para ensayos de dilución en tubos de ensayo de
Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
Tabla 13.Clasificación de la actividad antimicrobiana según la concentración inhibitoria mínima
(CIM).
Actividad antimicrobiana Concentración Inhibitoria Mínima
Inactivo ≥16mg/mL
Poco activo 6-15mg/mL
Moderado activo 1-5mg/mL
Buena actividad <1mg/mL
Fuente: Protocolo de estudio de la actividad antimicrobiana IMET – ESSALUD 2007 75
60
CAPITULO III
RESULTADOS
Los resultados de no actividad por el crecimiento de las bacterias en todas las diluciones
de los extractos evaluados determinan que se acepta las hipótesis nulas y se rechazan las
alternativas.
Foto N° 01: Grupos de ensayo de la actividad antimicrobiana por el método de los tubos
múltiples del extracto hidroalcohólico y etanólico de hojas de Mansoa alliacea (Lam.)
A. Gentry “Ajo Sacha” frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
61
Foto N° 02: Resultados en placa obtenidos en el ensayo de actividad antimicrobiana por
el método de los tubos múltiples del extracto hidroalcohólico y etanólico de hojas de
Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry “ajo sacha” frente a Escherichia coli.
Foto N° 03: Resultados en placa de los ensayo de actividad antimicrobiana por el
método de los tubos múltiples del extracto hidroalcohólico y etanólico de hojas de
Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry “Ajo Sacha” frente a Staphylococcus aureus.
62
Tabla14: Resultados del desarrollo bacteriano obtenidos en el ensayo de actividad
antimicrobiana por el método de los tubos múltiples del extracto hidroalcohólico y
etanólicode hojas de Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry “ajo sacha”fueron los mismos.
Tubo Escherichia coli Staphylococcus aureus
Conc (mg/mL) Desarrollo bacteriano Conc (mg/mL) Desarrollo bacteriano
1 512 Positivo 512 positivo
2 256 Positivo 256 positivo
3 128 Positivo 128 positivo
4 64 Positivo 64 positivo
5 32 Positivo 32 positivo
6 16 Positivo 16 positivo
7 8 Positivo 8 positivo
8 4 Positivo 4 positivo
9 2 Positivo 2 positivo
10 1 Positivo 1 positivo
Las fotos 2 y 3 muestras que al sembrar una asada de cada dilución de los tubos
múltiples luego de 24 hrs de incubación a 37°C muestran colonias, lo que indica que las
diferentes diluciones del extracto hidroalcohólico y etanólico no inhibieron el desarrollo
de Escherichia coli ni de Staphylococcus aureus.
De acuerdo a la tabla 14 el extracto hidroalcohólico y etanólico de hojas de Mansoa
alliacea (Lam.) A. Gentry “Ajo Sacha” no inhibió el desarrollo de Escherichia coli ni de
Staphylococcus aureus en ninguna de las diluciones lo que indica que el extracto
hidroalcohólico y etanólico es inactivo.
63
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Las hojas de Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry “ajo sacha” de popular muy difundido
en la etnomedicina en la Amazonia Peruana por sus diversas aplicaciones medicinales
atribuidas empíricamente dentro de las cuales esta su uso en enfermedades infecciosas.
Olivera M .et al. (2013) evaluó la actividad antibacteriana del aceite esencial de la
especie en estudio y encontró que era poco activo frente a Staphylococcus aureus ATCC
6535.Esta diferencia de resultados de actividad antibacteriana con el encontrado frente a
los extractos hidroalcohólico y etanólico en el presente estudio se debería a la diferencia
de componentes presentes. Por otro lado, Atayala y Villacres en el 2004 reportaron en
estudios similares que el extracto liofilizado de “ajo sacha” al 3% que presentó actividad
antifúngica, sin embargo en este estudio no se probó esta actividad.
Probablemente la contribución del “ajo sacha” al ser consumido para aliviar o recuperar
los problemas de salud se deba a otras actividades farmacológicas, como lo reporta
Brack 1999 que encontró que popularmente a la especie también se le reportan muchas
otras aplicaciones medicinales, entre ellas analgésicas, antipirética, antiespasmódica y
antiinflamatoria. (20) Sin embargo es necesario encontrar la verdadera actividad biológica
de Mansoa alliacea “ajo sacha”, que justifique su uso popular tan difundido sobre todo
entre los pobladores rurales de la Región Loreto y de otras partes de América.
Al Allium sativum “Ajo” se le atribuye la actividad antibacteriana y plaguicida a su
contenido de Allina que es convertida por enzimas a Allicina. En el IMET Es Salud
2004 identifico estos metabolitos secundarios en Mansoa alliacea “ajo sacha”, sin
embargo no se reporte el rendimiento por lo que la diferencia porcentual de contenido
entre ambas especies del género Mansoa pueda ser la causa de que el extracto en prueba
no presente efecto antimicrobiano. También podría ser que, por el contenido de fenoles y
taninos pueda presentar actividad antiséptica.
64
Los resultados hallados en el presente estudio no coinciden con los reportados por otros
investigadores es probable que la especie Mansoa alliacea “ajo sacha” presente
variaciones en sus componentes y en el porcentaje de los mismos según el suelos donde
se desarrolla y también podría deberse al desarrollo del individuo muestreado.
Es importante evaluar la actividad antibacteriana empleados extractos de diferente
polaridad y evaluar los diferentes métodos que miden la actividad antibacteriana, que
permita comparar los resultados obtenidos por los diferentes métodos.
65
CONCLUSIONES
En el presente estudio se encontró que los extractos etanólicos y acuoso de las hojas de
Mansoa alliacea “ajo sacha” no presentaron la esperada actividad antibacteriana frente a
la cepa referencial de Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus aureus ATCC
29213.
Los resultados mostraron una diferencia de resultados en la actividad con otros extractos
probados de la especie Mansoa alliacea “ajo sacha” recolectada también en la Amazonia
Peruana pero de Madre de Dios,frente a bacterias referenciadas reportadas por otros
investigadores, quienes encontraron que el aceite esencial presentaba actividad
antibacteriana, sin embargo comparando la CM reportado para Staphylococcus aureus
ATCC 6535 (10mg/mL) con la clasificación de la actividad antimicrobiana según la
concentración inhibitoria mínima, sería poco activo. Esta diferencia mínima de
resultados se debería a la diferente composición de los extractos.
Dentro de las diferentes actividades reportadas por los resultados obtenidos en la
presente investigación no se puede concluir que la actividad antibacteriana sea la
justificación de su uso tan difundido en la medicina tradicional.
66
RECOMENDACIONES
Por la diferencia de resultados en la actividad antibacteriana es importante realizar otros
estudios de actividad frente a otros microorganismos, no solo del extracto crudo
hidroalcohólico y etanólico, sino que se debe incluir extractos con otros solventes de
diferente polaridad, así como de fracciones sobretodo del aceite esencial.
Evaluación otros órganos de la especie Mansoa alliacea “ajo sacha” y por diferentes
métodos para obtener una información más precisa sobre la verdadera actividad.
67
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72
ANEXOS
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
ESQUEMA GENERAL DEL TRABAJO
1. Recolección.- Identificación Taxonómica
2. Acondicionamiento – Selección – Secado
3. Maceración de planta seca en diferentes solventes:
Hidroalcohólico y etanólico.
Filtrado y obtención de extracto hidroalcohólico y
etanólico seco (rota vapor)
RESULTADOS
Método de Macrodilución en
Caldo Mueller - Hinton
