ANTİ HLA ANTİKORLARI ve TAYİN YÖNTEMLERİ

Yrd. Doç.Dr. Hilmi TozkırTrakya Üniversitesi Tıp Fakültesi

KONULAR ve AKIŞ PLANI

NEDİR?

NASIL OLUŞUR?

NELERE NEDEN OLUR?

CEVAP ARANAN SORULAR?

NELER YAPILABİLİR?

NASIL TESPİT EDERİZ?

ANTİ-HLA ANTİKORU NEDİR?

İNSAN LÖKOSİT ANTİJENLERİNE (Human leucocyte Antigens – HLA) KARŞI OLUŞMUŞ OLAN ANTİKORLARA ANTİ-HLA ANTİKORU veya PANEL REAKTİF ANTİKOR (PRA) DENİR.

Panel Reaktif Antikor (PRA) oluşması nedenleri

Kan TransfüzyonuGebelik (Özellikle Multiparlarda)

Doku veya organ transplantasyonları(2. veya 3. transplantasyona

hazırlanan hastalar)** PRA duyarlılığının nedeni bilinmeyen bir hastagrubunun da varlığı, diğer olası faktörlerinaraştırılmasına yol açmıştır.

Yüksek PRA oluşumu ve nedenleri(1)

PRA %85’ in üzerinde olan hastalara” high immune” hastalar denilmektedir.Bu hastalarda organ bulma şansları diğer hastalara göre düşüktür. Çünkü birçok antijene karşı antikor taşıdığı için cross-match testi pozitif çıkmaktadır.

Yüksek PRA oluşumu ve nedenleri(2)

Bazı hastalar geniş spektrumda antikor üretmeye meyillidir. Bu hastalar özellikle nadir doku grupları (A29, A33, B37, B70, CW3) taşıyan hastalardır.BW4 ve BW6 homozigot hastalar

Kan transfüzyonuna bağlı anti-HLA antikorları oluşma nedenleri(I)

Transplantasyon öncesi renal yetmezlikli hastalarda sıklıkla hemoglobin %6-8 mg, hematokrit ise %20-25 dolayındadır.

Eritropoetin sentez ve serbestleşmesinin bozulması ile hastalarda anemi gelişmektedir.

Kan transfüzyonuna bağlı anti-HLA antikorları oluşum nedenleri (2)

Yapılan Kan transfüzyonlarında HLA uyumu olmadığı için bu hastalarda HLA antijenlerine karşı antikorlar oluşmaktadır. Bu antikorlar da olası organ transplantasyonuna engel oluşturabilmektedir.Son yıllarda rekombinant insan eritropoetinin kullanımı ile hastaların anemileri tedavi edilmekte

ancak çok mecbur kalındığı durumlarda kan transfüsyonlarına baş vurulmaktadır.

Antikoru oluşturan neden çocuğa babadan geçen HLA antijenleridir.Fetus normalde anne için immunojeniktir. Çünkü

babadan gelen antijenler anne için yabancı sayılır.

Birinci gebelikte bu antijenlere karşı IgM antikorlarıgelişirken, ikinci ve sonraki gebeliklerde IgG

antikorları bol miktarda yapılır.

Multipar Kadınlarda Antikor Oluşma Nedenleri

Böbrek bekleme listesindeki hastalarda

oranı ülkeden ülkeye değişmekle birlikte

ortalama %10-25 arasında presensitize (PRA

pozitif) hasta vardır.

Yüksek panel reaktif antikor (PRA) düzeyi olanhastalar, transplantasyon bekleme listelerinde giderek artmaktadır. Bu nedenle PRA sensitizasyonunu etkileyen faktörler üzerinde durulmaktadır.

Renal transplantasyon hikayesine ek olarak HD süresinin PRA sensitizasyonunda etkilibir faktör olduğu gösterilmiştir.

Bu bulgu, HD süresi uzadıkça, hastanın PRA sensitizasyonuna yol açacak kan, kan ürünleri, ilaçlar, bio uyumsuz membranlar gibi eksternal antijenlerle karşılaşmış olma riskinin artmasıyla açıklanabilir.

CEVAP ARANAN SORULAR?

On üniteden fazla kan transfüzyonu almış olmasına rağmen PRA titresinin negatif veya2 ünite kan transfüzyonu olan bireylerde PRA pozitifliği

Hiç transfüzyon, hamilelik veya transplantasyon hikayesi olmadan PRA titresinin yüksek olduğu bir hasta grubunun saptanması,

İnsan lökosit antijen (HLA) gen dağılımı ve PRA duyarlılığı arasındaki ilişki halen araştırılan bir konudur. Rekombinan human eritropoetin (r-HuEPO) tedavisinin, kan transfüzyon ihtiyacını azaltarak PRA pozitiflik oranını düşürebilir.

Hepatitis C virus (HCV) enfeksiyonuna sekonder olarak gelişen pek çok immünolojik bozukluk bildirilmiştir. Bu nedenle,HCV enfeksiyonu ve PRA pozitifliği arasında bir ilişki olabileceği öne sürülebilir.

Hayatlarında hiç kan transfüzyonu yapılmamış veya organ

nakli olmamış sağlıklı erkeklerin serumlarında

anti-HLA antikorlarının varlığı bulunmuştur.

Bu HLA antikorları mikroorganizmalarda ve allerjenlerde

Bulunan cross-reaktif epitoplara karşı oluştuğu

düşünülmektedir.

Örnek olarak HLA-B27’nin Klebsiella pneumoniae,

Shigella ve Yersinia ile cross-reaktivitesi rapor edilmiştir.

Presensitize hastanın dezavantajları���� Daha az organ bulma şansı, çünkü:

- pozitif Cross-Match

���� Daha kötü greft sağkalımı, çünkü:Genel olarak daha yüksek alloreaktivite

- Donor-spesifik antikorların çok görülmesi

PRA düzeyinin akut rejeksiyon atağıriskinin ve transplantasyon sonrası HD ihtiyacının belirlenmesinde, graft sürvisiuzunluğu ile ilgili prediktif değeri vardır

Anti-HLA antikorlarına sahip diyaliz hastalarında bu antikorların seviyesini azaltmak veya ortadan kaldırmak önemlidir. Bunun için bugün başvurulan metodlar; 1. Plazmaferez, 2. Protein A immunoadsorpsiyon, 3. İntrovenöz immunoglobulin, 4. B-Hücre spesifik ajanlar ile İmmünosüpressiyon 5. Kombinasyonlar.

Plazmaferez ve düşük doz introvenöz immunuglobulin (100mg/vucut ağırlığı, her bir doz için) en yaygın ve etkili metoddur.Plazmaferez ile birlikte düşük doz intravenöz immunoglobulin dönörü olan hastalar için (living dönor) en sık başvurulan yöntemdir.Yüksek doz intravenöz immunoglobulin kadavradanyapılacak Tx da önemlidir

Bu tanımlanan anti-HLA antikorlarının seviyesini azaltıcı veya ortadan kaldıran metodlar, morbitide ve mortaliteye de sebebiyet verdiği bilinmektedir.

Bunlara ilave olarak Tx dan sonra humoralrejeksiyon oranının da yüksek olduğu rapor edilmiştir [9,10].

Vericiye özgü antikor (donor specifik antibody-DSA) saptanırsa; bunların IgG mi yoksa IgM mi olduğu, hangi hedef hücreye (T, B) mi özgü olduğunun bilinmesi önemlidir.

Nakilden önce bu antikorların saptanması, rejeksiyon riski olan nakillerin belirlenmesine yardım eder. Çünkü lenfositler HLA antijenlerini yüksek oranda eksprese eder ve DSA’larınbelirlenmesi için hedef hücre olarak seçilirler

Organ Transplantasyonlarında;

Cross-Match’in negatif olması akut rejeksiyon için yeterli değildir.

Hastada daha önceden donöre karşı PRA gelişip gelişmediği bilinmelidir.

PRA pozitifliğinin bilinmesinde hastanın avantajları

PRA pozitifliği olan hastada anti-HLA antikoru tanımlanırsa, bu HLA antijenini taşıyan donörlerden organ transplantasyonu yapılmaz.

PRA pozitifliği olan hastaya Cross-Match negatif olan donör bulunduğunda bu verici ile yapılacak transplantasyon öncelik kazanır. Hastada, donörün HLA antijenlerine karşı önceden gelişmiş PRA pozitifliği var ise, transplantasyondan vazgeçilir.

HLA antijenleri ile karışabilen oto antikorların ayırt edilmesi

Teste DTT ilave edildiğinde, IgM antikorlarının yapısı bozulur ve Cross-Match negatif olur.Bu antikorlar transplante edilen organ için zarar oluşturamazlar.Özellikle viral enfeksiyonlarda ve Lupus Eritematosus’ da görülürler.

Grafttaki uyumsuz HLA antijenlerine karşı hümoral immün cevap farklı alloantikorların üretilmesine sebep olabilir. Bu antikorlarınbazıları sınıf I, bazıları ise sınıf II antijenlerinin ortak veya özel yapılarına özgü olabilir.

Bazı literatürlerde de, HLA sınıf I DSA’lar erken graft yetmezliği ile ilişkili iken HLA sınıf II DSA’ların ise uzun dönem graftyetmezliği ile ilişkili olduğu açıklanmıştır.

Antikorlar doğrudan grafta bağlanarakaktive olan verici endotel hücrelerinde rejeksiyonu başlatabilir.

Antikorların üretiminin akut rejeksiyon ataklarından çok organ fonksiyonu ve sağkalımı üzerindeki etkisinin daha kötü olduğubelirtilmektedir.

Kronik graft yetmezliğinin gelişiminde en önemli risk faktörlerinden biri erken akut rejeksiyon ataklarının ve DSA’ların oluşumudur

Böbrek nakli sonrasında DSA’larınsaptanması rejeksiyon tedavisine başlanması için bir gösterge olabilmektedir.

Böbrek Transplantasyonuna Aday olan Hastalara PRA Testi bir kere yapılmaz.Dializ Hastalarına:Her kan transfüzyonunu takiben 3 hf. sonraYılda 4 kez büyük panel ile yapılmalı

NASIL TESPİT EDERİZ?

Panel Reaktif Antikor (PRA) aranması

Screening Testi

Cross-Match’i pozitif olan veya olmayan hastalarda, herhangi bir HLA antijeni veya antijenlerine karşı antikor olup olmadığınıbelirlemek için yapılır.

PRA Tayin Yöntemleri

CDCELİSAFlow-cytometriLuminex-Lifematch Fluroanalyser

CDC TESTİ

Tamamen canlı hücreye dayanır..

ELİSA ile PRA antikorlarının saptanması

40 donor plateletlerinden elde edilen I. Sınıf HLA glikoproteinler kuyular üzerine immobilize edilmiş olarak kullanılır.- Kuyular yıkama solusyonu ile rehidrate edilir - Dilue edilmiş hasta serumu ve kontroller eklenir.- Enzim işaretli anti-IgG antikoru eklenir- Enzim aktivitesi kromojenik sustrat eklenerek ölçülür.

HLA Sınıf I ve Sınıf II antijenleri ile kaplı mikroboncuk ( bead ) havuzu kullanılarak HLA antikorlarının Flow Sitometri aracılığıyla taranmasıdır.

FLOW-PRA

FLOW-PRA’nın ÖZELLİKLERİ

Düşük yoğunluktaki HLA Sınıf I antikorlarının ve Sınıf II antikorlarının saptanmasını sağlar.Aktivasyonu komplemana bağlı olan antikorların (IgG1, IgG3) yanısıra, aktivasyonu komplemana bağlı olmayan antikorların (IgG2,IgG4) tesbit edilmesinde rol oynar.

FLOW-PRA TESTLERİ

PRA screening-FlowTest serumunda bulunan HLA antikorlarının

yüzde miktarını verir.

PRA spesifik-FlowBu antikorların hangi HLA antijenine spesifik

olduğunu belirler.

FLOW-PRA SCREENİNG TESTİ

Flow -PRA Sınıf I Screening TestiFlow -PRA Sınıf II Screening TestiFlow -PRA Sınıf I ve Sınıf II Screening TestiKONTROLLERNegatif KontrolSınıf I Pozitif Kontrol Sınıf II Pozitif Kontrol

FlowPRA I boncuklarının FSC-SSC nokta alanı FlowPRA II boncuklarının FSC-SSC nokta alanı

FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ

Sınıf I ve Sınıf II boncuklarının ayırt edildiği FL2 histogramı

FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ

FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TANIMLANMASI

FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TANIMLANMASI

FLUOROANALİZÖR YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARINTESPİTİ VE TANIMLANMASI

LUMINEX TECHNOLOGY

Amplicon labeled with Biotin during PCR is mixed with the bead mix and it will

bind to a complementary probe during hybridization.

Allele DRB 1 *0101

Allele DRB 1 *07

Allele DRB 1 *0101

Allele DRB 1 *0101

Allele DRB 1 *07

Allele DRB 1 *0101

* *

Allele DRB 1 *07

*

*

Allele DRB 1 *07

*

*

*

*

LUMINEX TECHNOLOGY

Detection of Signal

*

*

* *

*

*

*

*

*

*

Red Laser determinesbead set

*

Green laser quantify Captured amplicon

Two different lasers are directed on the flow cell

Flow

Sample will be taken up by the instrument and will pass the lasers.

DSA?

Yüksek Oranlı PRA olan hastalar için öneriler

Iyi bir HLA uyumu

Hassas cross-match

Spesifik peri-operatif uygulamalar

Plazmaferez/Immun-adsorbsiyon

± IvIg

± Rituximab

Özet olarak

Graft Sağkalım

HLA Uyumu

Soğuk iskemi zamanı

İmmunsupresyon

Alıcı YaşıVerici yaşı

Akut rejeksiyon

Gecikmiş graftfonksiyonuPRA

Sonuç olarak solid organ nakillerinde, özellikle en sık yapıldığı için renal Tx’da greft sağ kalımı ve greft ömrü göz önüne alındığındacross matchlerin kesin negatif ve anti-HLA antikorlarınında olmaması Tx’un başarısında en önemli faktörlerden birisidir.