AREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

MATERIA MICROBIOLOGA AMBIENTAL

PROFESORA

DR. ROSY RICO MATA

ACTIVIDAD

PRESENTAN FLORES OJEDA EDUARDO EMMANUEL

GONZALEZ MARTINEZ BLANCA FABIOLA ORNELAS RODRGUEZ NATALY

PEREZ SERNA AIDE SARAHI TORRES BARCO ALMA VIRIDIANA

GENERACIN: 2014-2016 LEN, GUANAJUATO. 9 DE JUNIO DE 2015

Reporte de diagnstico microbiolgico en sitio alterado Presa Blanca: Puente 1 de

acuerdo a la NMX-AA-042/1-SCFI-2008 y NMX-AA-042-SCFI-1987.

ANTECEDENTES

La Presa Blanca se ubica en el estado mexicano de Guanajuato en el

municipio de Len, localizado en una altura de 1784 metros sobre el nivel del mar.

Tiene una latitud (decimal) de 21.091667 y la longitud en el sistema decimal es -

101.699444. En el sistema DMS la latitud es 210530 y la longitud es -1014158.

(Pacheco, Maldonado & Pea, 2005).

En Len se cuenta con una presa de aguas negras y residuales (Presa Blanca)

donde desembocan todo tipo de desechos industriales y domsticos, el agua de

dicha presa se conduce a travs de un canal a cielo abierto, hacia las

Comunidades de Santa Rosa, Plan de Ayala y San Pedro del Monte y su destino

final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas estn fuertemente

contaminadas qumica y bacteriolgicamente, al no sufrir ningn tratamiento de

remediacin (Secretaria de Seguridad Publica, 2010).

RELATORIA

PROCEDIMIENTOS

MUESTREO MICROBIOLOGICO EN AGUA Y SUELO

MATERIAL Y REACTIVOS:

5 cajas petri con agar rojo bilis violeta

10 hisopos estriles

1 esptula estril

3 jeringa

Hielera

Hielos

Bolsa ziploc

Papel absorbente

Marcador permanente

Cinta

Cmara digital

Frascos de vidrio

2 frascos de vidrio boca ancha 500mL para muestra de suelo

2 frascos de vidrio 500 mL muestra de agua

Barrena

Pala

Guantes

Bata

Botas de seguridad

PROCEDIMIENTO PARA AGUA:

1. la muestra se tomar lo ms lejos posible de la orilla, procurando no remover el fondo y evitando los remansos o zonas estancadas

2. sujetar el frasco por el fondo en posicin invertida, sumergindolo completamente y dndole la vuelta en sentido contrario a la corriente del ro o desplazndolo horizontalmente en direccin de la boca del frasco.

3. Evitar que slidos suspendidos se incorporen a la muestra 4. En todos los casos la muestra no se deber llenar completamente el frasco,

siendo necesario dejar un espacio aproximado de 5 cm, para facilitar su homogenizacin

PRUEBA INSITU:

1. Tomar una de las cajas petri con el medio estril (agar rojo bilis violeta) y tomar una alcuota de la muestra de agua usando una jeringa estril, retirar la jeringa de la misma y usar

2. Vaciar el contenido de la jeringa a la caja petri sujetndola por los bordes y evitando la contaminacin de la misma por agentes externos

3. Cerrar inmediatamente y preservar a 3C con la ayuda de la hielera.

PROCEDIMIENTO PARA SUELO:

Emplear los envases de vidrio estriles y de boca ancha para recolectar una muestra de suelo

Tomar 2 muestras a diferentes profundidades como se muestra en imagen 1.

La primera ser superficial apenas pasando los 3 cm, donde ya no haya presencia de hierbas o zacate.

La segunda ser a los 30 cm de profundidad, para ambos se tomara una cantidad de 300 g.

Preservar a 4C y cerrar perfectamente el frasco de vidrio.

PRUEBA INSITU:

Tomar un hisopo estril para realizar el frotis en el suelo e inmediatamente sembrar en la caja petri con el medio de cultivo rojo bilis violeta.

Sembrar en la caja petri empleando el mtodo del sic zac, empezando de arriba hacia abajo en forma de estras cubriendo toda la zona

Girar hacia el sentido de las manecillas del reloj 90 y repetir la misma accin, hasta completar 3 giros de 90como se muestra en la imagen 2

Preservar la muestra a 4C y resguardar en la hielera. Imagen 2. Tecnica de sembrado por estrias

Primera muestra de suelo. 3

cm de profundidad, tomar

con hisopo y sembrar

inmediatamente en caja petri.

30 cm

Segunda muestra de suelo. 30

cm de profundidad, tomar

con hisopo y sembrar

inmediatamente en caja petri.

Imagen 1. Distribucin de los puntos de muestreo del suelo en funcin de la profundidad deseada.

PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES POR EL MTODO DE NMP

MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS:

18 Tubos de cultivo

2 Pipeta 10 mL

2 Agitador

1 Esptula

2 Matraz Erlenmeyer

1 Vidrio de reloj

1 Balanza analtica

3 Soportes universal

1 Olla de presin

Guantes de asbesto

1 Gradilla

2 mecheros Fisher

1 Incubadora

Caldo lactosado Bd bioxon

Composicin del medio caldo lactosado:

Caldo lactosado

Extracto de carne 4,5 g Peptona de gelatina 7,5 g Lactosa 7,5 g Agua destilada 1000,0 ml

Preparacin del medio caldo lactosado utilizando el polvo deshidratado de Bd bioxon

Doble concentracin (si pusimos una abreviacin):

Para la preparacin del caldo lactosado a doble concentracin se disolvieron 1.82 g de caldo lactosado en 70 mL de agua destilada, siguiendo las especificaciones del fabricante.

Simple concentracin:

Para la preparacin del caldo lactosado a doble concentracin se disolvieron 1.69 g de caldo lactosado en 130 mL de agua destilada, siguiendo las especificaciones del fabricante.

Procedimiento para llevar a cabo la prueba:

1. Se realiz los clculos correspondientes para la preparacion del caldo

lactosado Bd bioxon 2. Se pesa el cado lactosado Bd bioxon para la concentracin doble y simple 3. Se vierte a un matraz erlenmeyer y se le agregan los militros de agua destilada

correspondientes. 4. Se agita hasta que el caldo sea homogneo. 5. Se le pone un capucho de algodn y aluminio a los tubos de cultivo y a los

matraces que contienen el caldo lactosado. 6. Se estirilizan los matraces que contienen el caldo lactosado y los tubos de

cultivo. 7. Transferir volmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 ml de

caldo lactosado de mayor concentracin y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentracin sencilla o caldo laurilsulfato triptosa con prpura de bromocresol.

8. Incubacin. Incubar los tubos a 35 C. Examinar a las 24 2 h y observar si hay formacin de gas o la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 2 h.

Fundamento

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

PRUEBA CONFIRMATIVA ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES

MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS:

Tubos de cultivo

Campanas Durham

Incubadora

Caldo lactosa bilis verde brillante

PREPARACIN Caldo lactosa bilis verde brillante(Caldo para la produccin de gas).

Peptona 10 g

Lactosa 10 g

Bilis Ox deshidratada 20 g

Verde brillante (solucin acuosa 1 % masa)

13 mL

Agua destilada 1000 mL

Disuelva la peptona en 500 mL de agua destilada Agregue los 20 g de bilis ox deshidratada en 200 mL de agua destilada. Esta solucin debe tener un pH entre 7,0 y 7,5. Complete a aproximadamente 975 mL con agua destilada. Agregue la lactosa y ajuste el pH a 7,4. Agregue la solucin verde-brillante y complete a 1000 mL con agua destilada. Distribuya volmenes de 5 mL en tubos de prueba conteniendo un tubo de Durham invertido y esterilice a 115 C por 10 min. PROCEDIMIENTO:

Para confirmar la presencia de organismos coliformes:

1. incube un tubo de lactosa bilis verde brillante ya sea a 35 C o a 37 C 2. examine la produccin de gas en un periodo de 48 horas.

EXPRESIN DE RESULTADOS Con el nmero de tubos del medio de aislamiento y las pruebas confirmatorias que hayan dado reacciones positivas, calcule el nmero ms probable en 100 ml de muestra de organismos coliformes.

Fundamento La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del

Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo

microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a

35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales

biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase

confirmativa.

Prueba confirmativa E. COLI PRESUNTIVA

MATERIALES

Pipeta

Perilla

Tubos

Papel de estraza

Plumn indeleble

Guantes de ltex

Guantes de asbesto

Campana para manipulacin de equipos estriles

Esptula

Laminillas de peso

Agitador

Algodn

Gasas

Matraz Erlenmeyer

EQUIPOS

Incubadora

Autoclave

Balanza analtica

REACTIVOS

Triptona

Kovacs

Alcohol

PREPARACIN DE REACTIVOS Y SOLUCIONES

Agua de triptona

Ciertas peptonas que dan resultados satisfactorios en la prueba a 35 C o 37 C no son satisfactorias para la prueba de indol a 44 C. La Triptona ha sido encontrada satisfactoria y es recomendada.

Triptona 20 g

Cloruro de sodio 5 g

Agua destilada 1000 mL

Disuelva los ingredientes y distribuya en volmenes convenientes. Esterilice en autoclave a 121 C 1 C por 15 min. El pH final debe ser 7,0 0,1.

Reactivo de Kovacs

Para-dimetil-amino-Benzaldehdo............................. 1 g

Alcohol amlico butlico......................................... 80 mL

Acido clorhdrico qumicamente puro...................... 20 mL

PREPARACIN:

1. Disolver el para-dimetil-amino-benzaldehdo en alcohol butlico amlico.

2. Aadir el cido clorhdrico.

3. Conservar en un frasco mbar con tapn de vidrio, en sitio oscuro.

4. tambin se sugiere que esta solucin se refrigere.

PROCEDIMIENTO:

a) Incuba un tubo de agua de triptona para formacin de indol, a 44 C por 24 horas.

b) Adicionar de 0,2 mL a 0,3 mL de reactivo de Kovacs al tubo de agua de triptona

c) Se confirma cuando al agitar el tubo de manera suave se desarrolla un color rojo esto denota la presencia de indol. (Imagen A).

Fundamento

La concentracin de Escherichia coli (o bien de coliformes termotolerantes) se mide, por lo general, en muestras de 100 ml de agua. Para ello existen diversos procedimientos relativamente sencillos basados en la produccin de cido y gas a partir de la lactosa o en la produccin de la enzima -glucuronidasa. Los procedimientos incluyen la filtracin del agua con una membrana que despus se incuba en medios selectivos a 4445 C; transcurridas 24 h, se realiza un recuento de colonias. Otros posibles mtodos son los procedimientos de nmero ms probable, en los que se utilizan tubos de ensayo o placas de microvaloracin y pruebas de P/A, algunas con volmenes de agua mayores que 100 ml. Existen equipos de anlisis para uso sobre el terreno.

Imagen A. E. Coli en Agua de Triptona,

prueba positiva (derecha)

PROCEDIMIENTO PARA LA PRUEBA DE INDOL

MATERIAL

Agitador

Pipeta volumtrica de 5 mL

Parrilla

Tubos

Tubos de fermentacin ( Durhan)

Autoclave REACTIVOS

Triptona

Cloruro de sodio (NaCl) 5.0 g

Agua para aforar a 1000 ml

Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4) 2.75 g

Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) 2.75 g

Lauril sulfato de sodio (NaCl12 H25 SO4) 0.1 g

L (-) triptfano 0.2 g

Manitol 5.0 g

PROCEDIMIENTO:

1. Disolver los componentes de agua y ajustar a pH 7.5. distribuir en volmenes de 5 mL y colocar en autoclave a 1150C durante 10 minutos.

2. Aadir la triptosa, el cloruro de sodio, el manitol, los fosfatos y el tiptona al agua y calentar para disolver.

3. Anadir el sulfato de sodio y mezclar suavemente para evitar la formacin de espuma.

4. Ajustar a pH de 6.8 + 0.2.

5. Hacer distribucin en volmenes de 5 mL en tubos conteniendo un tubo de fermentacin invertido(Durham) colocar en autoclave a 1150C durante 10 minutos

RECOLECCIN, PRESERVACIN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS

El anlisis bacteriolgico debe efectuarse inmediatamente despus de su recoleccin, se recomienda que de no efectuarse as el anlisis se incide dentro de las 6 horas prximas a la recoleccin de la muestra y en ningn caso, este lapso debe exceder de 24 horas, se debe conservar la muestra a 40C.

Fundamento

Evala la presencia en las bacterias de la enzima triptofanasa, mediante la cual, ocurre la hidrlisis y desaminacin oxidativa del triptfano, con formacin de indol. El indol se evidencia al aadir el revelador: reactivo de Kovacs (p-dimetilamino benzaldehdo) que al condensarse con el indol, forma un anillo de color rojo o fucsia. (Rodrguez,2012)

PRUEBA DE OXIDASA

Material

Cajas de Petri

Papel filtro

Asa bacteriolgica

Agitador de vidrio Reactivos

Reactivo de oxidasa

Preparacin de reactivos

Reactivo de oxidasa

Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina................... 0.1 g Agua destilada................................................... cbp 1000 mL PREPARACIN:

1. Disolver el reactivo en el agua destilada. NOTA: Este reactivo no es estable y por consiguiente debe prepararse para utilizarlo en pequeas cantidades cada vez que se necesite. Las bacterias que se encuentran en el agua pueden conforman los organismos coliformes, estos son capaces de producir gas a partir de lactosa solo a temperaturas abajo de 37 C. Dan resultados negativos en las pruebas confirmativas de rutina para organismos coliformes, y su presencia en agua no es considerada como significativa. Las especies de Aeromonas, las cuales es natural que estn presentes en agua, interfieren con la determinacin slo a temperatura de 37 C o menor, se requiere la prueba confirmativa de la oxidasa solo cuando se estn determinando coliformes totales.

PROCEDIMIENTO:

La prueba de la oxidasa se lleva a cabo con subcultivos puros de organismos fermentadores de lactosa, desarrollados en medio de agar nutritivo, de la siguiente manera:

1. Coloque dos o tres gotas de reactivo de oxidasa en un papel filtro colocado sobre una caja Petri.

2. Con una varilla de vidrio o asa metlica de platino de punta redonda, unte una pequea porcin del crecimiento sobre el papel filtro preparado.

3. Dara como resultado un color azul-morado profundo en 10 segundos como una reaccin positiva.

4. Cada ocasin en que se utilice el reactivo de oxidasa, deben realizarse pruebas control con cultivos de organismos que se sabe dan reaccin positiva (Pseudomona aeruginosa) y una reaccin negativa (E. coli).

Fundamento

La catalasa es una enzima que descompone el peroxido de Hidrogeno (H2O2) en agua y oxgeno. El peroxido de Hidrogeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule resulta letal para la clula bacteriana. La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la familia Micrococaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.