anticorps monoclonaux protéines de fusion...
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Anticorps monoclonaux &
Protéines de fusion thérapeutiques
Héloïse FLAMENT
AHU
Université Paris Diderot
Centre de Recherche sur l’Inflammation
UMR1149 - Hôpital Bichat
L3 - DFGSM3
UE6 Immunologie
22 Mars 2018
Plan
Introduction – définition
Domaines d’application
Production des anticorps monoclonaux (AcM) murins
Limites des AcM murins en thérapeutique
Humanisation des AcM murins
– AcM chimériques /humanisés /complètement humains
Nouvelles technologies
– Anticorps bispécifiques
– CAR T-cells
Définition
Anticorps monoclonal (AcM)
– Population homogène
d ’anticorps issus d ’un
« seul et unique »
clone de cellules B
Avantage
– Spécificité
– Affinité
– Production massive et
constante
Différence entre sérum polyclonal et anticorps monoclonal
G. Köhler (1946-1995) et C. Milstein (1927-2002)
1975: premier article décrivant la génération d’un anticorps monoclonal (Acm) ayant une spécificité définie
Technique des hybridomes
Prix Nobel de médecine en 1984 avec N.K. Jernes – "for theories concerning the specificity in development and control
of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies"
Applications des anticorps monoclonaux
Immunologie fondamentale – Etude des lignées cellulaires (CD = cluster de différenciation)
– Etudes des cellules pathologiques
– Protéomique, drug discovery
Diagnostic – Cytométrie en flux, immunohistochimie, immunofluorescence…
– Imagerie médicale
Thérapie – Traitement des rejets de greffes
1er AcM murin mis sur le marché en 1986: anti-CD3 humain
(Muromomab)
– Traitement de cancer
– Traitement de maladies auto-immunes
Immunothérapie passive par les AcM
Fixation par la partie Fab et inhibition de l’interaction
récepteur / ligand
Serum immun dans la prévention/traitement de maladies
infectieuses (serum anti-diphtérique, début du 20e siècle)
Avantage des AcM
– Plus efficace
– Reproductible
– Absence de contaminants
Exemple :
– Mab anti cytomégalovirus (agent pathogène responsable de pneumonie)
– Mab anti synticial virus (responsable de maladie chez les jeunes enfants)
– Mab anti rhésus (prophylaxie de l'allo-immunisation fœto-maternelle)
Immunothérapie active par les AcM
Fixation par la partie Fab et
recrutement d’effecteurs
immuns par la partie Fc
Destruction de la cible
ADCC (cytotoxicité
cellulaire dépendante des
anticorps)
CDC (cytotoxicité médiée
par le complément)
Opsonisation et
phagocytose
1-Immunisation
2-Hybridation
3-Clonage
4-: criblage des
hybridomes sécrétant
(ELISA)
5-Sous-clonage
Etapes de production des anticorps monoclonaux
6-Production de l’AcM
Exemple de calendrier de production
General Procedure
Step Time (month)
1 2 3 4 5 6 7 8
Immunisation of animals
Develop and test screening method
Fusion, selection and screening
Cloning and isotyping
Delivery of clones
http://www.covalab.co.uk
Les animaux
Immunisation
L'immunisation
– Les sources d'antigènes
degré de pureté: élimination des contaminants
haptènes, protéines porteuses
– L'immunisation de l'animal
dose et forme de l ’antigène
adjuvants
voie et nombre d ’injection
Immunisation: adjuvants
Augmentation de l’intensité de la réponse immunitaire
Accroissement de l’effet mémoire
Stimulants non spécifiques de la réponse immunitaire
3 composantes principales:
– huile minérale/eau : protection de l ’antigène, transport de
l ’antigène
– particules : agrégation de l ’antigène, dépôt antigénique
– parois de bactéries : réaction inflammatoire
Adjuvant complet de Freund (FCA)
Composition
– Mélange d’huile non métabolisable
L ’émulsion permet une grande répartition de l ’antigène
Effet de dépôt
– Surfactant : Arlacel A
– Mycobactéries : M.tuberculosis, M. butyricum
Immuno stimulation non spécifique importante
Considéré comme le plus efficace
Cause des inflammations chroniques, abcès,
ulcération, nécroses
Autres adjuvants
Adjuvant incomplet de Freund (FIA)
– Idem FCA, sans les parois bactériennes
– Utilisé dans les deuxièmes injections.
Montanide® ISA (SEPPIC)
– mélange de surfactants (manide oléate) et d ’huile non
métabolisable
– Aussi efficace que le FCA
– Beaucoup moins toxique
– Émulsions eau/huile, huile/eau, eau/huile/eau
Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome (1)
Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome (2)
Lignée cellulaire murine de myélome non sécrétant
– Ex: P3X63Ag8.653, Sp2/0
– Déficientes en HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase)
Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG)
– fusion des membranes cytoplasmiques
Fusion physique : Electrofusion
– Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques
– technique onéreuse
– moins destructrice
Sélection des hybridomes sur milieu sélectif HAT
2 voies de synthèse des acides nucléiques
– De novo (inhibée par l’aminoptérine)
– Voie de sauvetage (en présence d’HGPRT, d’hypoxanthine et thymidine)
Milieu HAT: Hypoxanthine Aminopterine Thymidine
LB non
fusionnés
Ne survivent pas
en culture
x x
Hybrides
HGPRT+
Plasmocytes
non fusionnés
HGPRT-
Aminoptérine Inhibition de la synthèse
de novo des nucléotides
Voie de sauvetage
Mort cellulaire Survie Mort cellulaire
Criblage des hybridomes sécrétant
Résumé de la technique des hybridomes
Ag
1
2 4
3
Epitopes Rate
Lymphos B
Plasmocytes
Cellules de
myélome
4
2
3
1
Fusion
Hybridomes
Acs 1 Acs 2 Acs 4 Acs 3
1
2
4
3
Sélection et Clonage par dilutions limites
Acs Monoclonaux
Y
Y
Antisérum polyclonal contenant des Acs de différentes spécificités.
1 1
1
2
2
2
3
3
3
4
4 4
Production des AcM in vivo en ascites
Hybridomes cultivés in vivo
Injection des hybridomes dans le péritoine de souris
Développement d’une tumeur liquide : ascite
Prélèvement des anticorps par ponction de liquide
d’ascite
Purification du liquide d’ascite nécessaire
Rendement élevé 20 g/l
Production des AcM in vitro
Production en batch
– flacons, ou plaques de cultures cellulaires
– 40 à 100ml
– rendement faible de de l ’ordre de 1µg/ml
– production relativement pure
– contamination par les composants du milieu de culture
Techniques de microencapsulation
– Capture des hydridomes dans des billes d ’alginate
– pas de contamination
– purification simplifiée
– meilleur rendement de l’ordre de 100µg/ml
Production des AcM in vitro
Production en bioréacteurs
– Basé sur la technologie des fibres creuses (dialyse)
– Diminution des coûts, du temps.
– Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté
– Pas ou peu de contaminant
Production in vivo
Avantages
– Concentration élevée en
AcM
– Pas d’intermédiaire
industriels
Inconvénients
– Utilisation de l’animal
– Présence de protéines
murines
– Contaminant
– Stress de la souris
Production in vitro
Avantages
– Pas d’utilisation d ’animal
– Production de grandes
quantité d’anticorps
– Pas de contraintes légales
à l’utilisation d’animaux
– Pas de personnel
d’animalerie
– Pas de contaminant
Inconvénients
– Tous les hybridomes ne prolifèrent pas en réacteur
– Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal
– Productions moins concentrées.
– Contamination par les hybridomes morts
– Mab de plus faible affinité
– Plus chère pour de petites production
Purification des liquides contenant les AcM
Chromatographie d’affinité
– spécifique du Fc (protéine A,
protéine G) pour les IgG
– spécifique de l’antigène
Chromatographie
échangeuse d’ions
– Pour les IgM
Ligand
Analyte
Impuretés
Critères de qualité pour un AcM
Spécificité
– Reconnaissance d’un seul motif antigénique
– Réactions croisées, non-spécifiques.
– Maintient de l’activité après modification chimique (couplage à
des fluorochromes, enzymes)
L'affinité
– Élevée
– Constante et contrôlée
Avantages de ce type de production
– Constante
– Reproductible
AcM murins en thérapeutique
Très peu d’AcM murins thérapeutiques sur le marché
Anti-huCD20 (Ibritumomab) marqué à l'yttrium–90 (lymphomes B)
Anti-huCD3 (OKT3®,Muromomab)
– Cible les lymphocytes T
– Indication: prévention du rejet aigu d’allogreffes rénales, hépatiques et
cardiaques.
Limites des AcM murins en thérapeutique
La souris ne reconnaît pas tous les motifs antigéniques →
répertoire immunologique limité
Immunogénicité: l’infusion d’AcM de souris chez l’homme conduit
à l’apparition d’anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA)
– Réactions allergiques
– Neutralisation et clairance accélérée de l’AcM
– Chute de l’efficacité
Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de
l’immunité de façon optimale chez l’homme :
– Faible activation du complément
– Mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc: faible ADCC
Vers l’obtention d’AcM humains…
Difficulté pour obtenir des AcM humains
– Immortalisation des cellules B humaines très difficile
– Volet éthique de la manipulation de cellules humaines
Solution: supprimer les parties immunogènes murines qui ne
participent pas à la reconnaissance de l’Ag et les remplacer par
des séquences humaines
Production dans des lignées cellulaires de mammifères,
bactéries ou champignons
Les moyens actuels
Immunologie fondamentale
– Connaissance du génome des immunoglobulines
Génie génétique, clonage, systèmes d ’expression
– E.coli sécrétion périplasmique
– Levure Pichia pastoris
– Cellules d’insectes
Création de banques de données de gènes d’immunoglobulines
– Phage display Library
Développement de techniques d’indentification performantes
Industries pharmaceutiques et sociétés biotechnologies
– Sanofi Aventis, Genovac, GenmAb, etc
FDA, AFFSAPS
Gènes des immunoglobulines
Anticorps monoclonaux chimériques
Humanisation partielle
Régions constantes humaines
Régions variables de souris
65% de régions humaines
Risque d’immunisation réduit
Quelques AcM chimériques approuvés: Infliximab (anti-TNFα), Rituximab (anti-CD20), Abciximab (Fab
anti-GPIIbIIIa)
Anticorps monoclonaux humanisés
Parties hypervariables - CDRs d’origine murine (5 à
10 % de la structure)
Parties constantes d’origine humaine
– Spécificité et affinité murine
– Immnunogénicité humaine
Avantages
– Peu immunogènes
– Demi-vie augmentée
les anticorps humanisés constituent la majorité des
anticorps thérapeutiques approuvés sur le marché.
Anticorps monoclonaux humains
100% de séquences humaines
La production d’AcM humains repose sur l’utilisation
de
– banques combinatoires de phages +++
– souris transgéniques + hybridomes de souris
1er AcM humain mis sur le marché en 2003 Adalimumab (anti-TNFα) pour la polyarthrite
rhumatoïde
Production des AcM humains
Production d’AcM humains
Banque combinatoire de
phages
Hybridomes souris transgéniques
Principe d’obtention d’une banque combinatoire de phages « Phage Display Library »
Isolement d’ARNm de lymphocytes B
humains (sang, tissus lymphoïdes)
Rétrotranscription en ADNc des gènes
d’immunoglobulines
Clonage dans des phages filamenteux
Expression à la surface des phages des
Fab humains sous forme de peptides de
fusion sur la protéine gIII (“banque”)
Sélection des clones spécifiques d’un Ag
Introduction dans un système d’expression
Mise en culture
Extraction des anticorps sécrétés
Principe d’obtention d’une banque combinatoire de phages « Phage Display Library »
Avantages
Plus efficace que la technique des hybridomes
Culture bactérienne moins onéreuse et plus simple
que les cellules de mammifères
Pas d’immunisation, pas d’animaux
Banque de 108-109 anticorps fonctionnels
Production des AcM humains
Hybridomes de souris transgéniques “humanisées”
Transgènes codant les chaines lourdes et légères
d’immunoglobulines humaines
Expriment un répertoire d’Ac humains de différents isotypes
Avantages:
– Non immunogènes chez l’homme
– Production par méthode conventionnelle d’hybridomes murins
Résumé
Nomenclature des AcM
Nom Type Exemples
xxmomab Mouse (souris) Muromomab anti-CD3
Ibritumomab anti-CD20
xxximab Chimeric (chimérique) Rituximab anti-CD20
Cetuximab anti-EGFR
xxzumab Humanized (humanisé) Trastuzumab anti-HER2
Alemtuzumab anti-CD52
xxmumab Fully human (humain) Panitumumab anti-EGFR
Adalimumab anti-TNFα
AcM chimériques, humanisés et humains
Peu immunogènes
Production d’ADA (anti-drug antibodies): Ac anti-
idiotypes
½ vie comparable aux Ig humaines naturelles
Interaction efficace avec les effecteurs
(complément, cellules NK, phagocytes)
Distribution dans les compartiments vasculaire et
extravasculaire
Exemple Anti-CD52: 1re génération – IgM de rat
Développement d’AcM anti-lymphocytes – Greffe de moelle osseuse (MO)
– Greffe d’organes
– Leucémies et lymphomes
– Maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde, sclérose en plaque)
– …
CD52: forte expression sur LT et LB, non exprimé sur les progéniteurs
médullaires
1980: CAMPATH-1M
– IgM de rat anti-HuCD52 , fixe le complément humain
– Prévention de la GVHD par déplétion des LT du donneur in vitro avant
greffe de MO
– En présence du sérum du donneur (source de complément)
Exemple Anti-CD52: 2nde génération – IgG2b de rat
Développement d’un AcM anti-CD52 actif in vivo
– IgM (CAMPATH-1M) et IgG2a de rat anti-CD52 inefficaces pour dépléter des cellules
leucémiques in vivo
– L’isotype IgG2b de rat est le plus efficace pour induire la lyse cellulaire (ADCC)
1986: CAMPATH-1G
– IgG2b de rat anti-HuCD52
– Déplétion des cellules leucémiques réfractaires aux isotypes IgM et IgG2a
– Utilisation combinée de CAMPATH-1M et CAMPATH-1G dans la greffe de MO en
prévention de la GVHD et du rejet autorisant un conditionnement allégé (non myéloablatif)
Exemple Anti-CD52: 3ème génération – Ac humanisé
CAMPATH-1M et CAMPATH-1G sont immunogènes
L’isotype IgG1 humain est le plus efficace pour induire la lyse cellulaire
(ADCC)
1987: CAMPATH-1H (IgG1 humanisé Alemtuzumab)
– Premier AcM humanisé
– Greffe des parties hypervariables de rat (CDR) sur une charpente d'Ig humaine
– Traitement de la leucémie lymphoïde chronique, sclérose en plaque
Résumé des modes d’action des AcM à usage thérapeutique
Activation de mécanismes effecteurs innés via la région Fc
(CD20, CD52)
– ADCC (cytoxicité cellulaire dépendante des anticorps)
– CDC (cytotoxicité dépendante du complément)
– Phagocytose, production de cytokines et chimiokines
Neutralisation de l’interaction ligand soluble/ récepteur (TNF)
Blocage de l’activation d’un récepteur (récepteur du VEGF)
Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules
membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle
(CTLA-4)
Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a)
Induction de l’apoptose (CD20)
Ciblage d’une drogue
AcM thérapeutiques: répartition par pathologie
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ca
nce
rA
llogra
ft r
eje
ctio
nP
sori
asi
sR
heum
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Ast
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L
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Multip
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cle
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HIV
Auto
imm
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Toxic
sho
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RS
VM
yoca
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l In
farc
tion
Cro
hn's
Anticorps thérapeutiques : anti cancer
Utiliser le système immunitaire pour détruire des tumeurs
– Toxicité contre les cellules tumorales (Rituximab, anti-CD20)
– Inhibition de la néoangiogénèse (Bevacizumab, anti-VEGF)
– Inhibition de la croissance tumorale (Trastuzuma, antagoniste anti-HER-2-récepteur)
– Stimulation de la réponse T (T cell checkpoint blockade anti-CTLA-4, anti-PD1)
– Vectorisation de molécules ciblant a tumeur
Radio-isotopes (anti-CD20 90Y, 131I)
Agents cytotoxiques (anti-CD30-aurisatine, lymphomes)
L’anticorps doit atteindre les cellules tumorales dans tout l’organisme
– Problème des tumeurs volumineuses
Aspects industriels défavorisant
Faible marché
– Très grande variabilité des cancers
– Investissement très important pour la recherche clinique
– Plusieurs anticorps pour une même pathologie
– Besoin de grandes quantité de réactifs
– Propriété intellectuelle
Maladies auto-immunes
Diabète
Arthrite rhumatoïde
Sclérose en plaque
Polyarthrite rhumatoïde
Anti CD25 – Spécifique des cellules T activées
Anti CD4 – Blocage des cellules T helper
Anti CD18 – Inhibition de la migration des leucocytes du sang vers les
zones d’inflammation
Ig récepteur au TNF – Chimère :récepteur membranaire du TNF associé à un Fc
d’IgG1
– Blocage du TNF dans les phénomènes d’inflammation
Limites des AcM humanisés / humains
Immunogénicité faible mais persistante
– Épitopes les plus immunogènes: idiotypes (parties variables
et hypervariables des Fab)
– Tous les AcM même humains peuvent induire des Ac anti-
idiotypes
La formation d’ADA accélère leur élimination et
diminue la réponse thérapeutique
Protéines de fusion thérapeutiques
Principe : mimer un mécanisme de régulation physiologique ce qui est le
cas pour l’étanercept et l’abatacept dans la polyarthrite rhumatoïde
Etanercept
– Protéine recombinante humaine dimérique composée de la portion extracellulaire du
récepteur de type 2 (TNFR2) du TNF fusionnée à un fragment Fc d’une IgG1 humaine
– Mime partiellement l’effet du récepteur TNFR2 soluble qui est un antagoniste naturel du TNF
TNF soluble
Protéines de fusion thérapeutiques
Abatacept
– Protéine recombinante humaine composée d’un
dimère des domaines extracellulaires du CTLA-4
(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) fusionnés aux
fragments Fc modifiés d’une IgG1
– Les modifications du fragment Fc sont des
mutations qui permettent la fixation aux
récepteurs des fragments Fc (FcγR) sans
induction de cytotoxicité par ADCC ou CDC
– L’abatacept permet d’inactiver les lymphocytes T car il entre en compétition avec CD28
pour la liaison aux molécules B7 (B7.1 et.2) exprimées par les cellules présentatrices de
l’antigène
– L’abatacept permet de reproduire ce phénomène inhibiteur physiologique, ce qui est mis
à profit dans des maladies auto-immunes caractérisées par une activation lymphocytaire
excessive.
CTLA-4
Induction d’une réponse lymphocytaire T
AcM en monothérapie ne permettent pas toujours de
rejeter les tumeurs en l’absence d’une réponse T
Importance de la réponse lymphocytaire T surtout
cytotoxique dans la lutte antitumorale
Permet d’activer les LT indépendamment du CMH et
de leur spécificité antigénique
Nouvelles technologies:
– Anticorps bispécifiques
– CAR T cells
Anticorps bispécifiques: Triomab
Catumaxomab (2009)
– AcM hybride de rat/souris anti-EpCAM
(molécule d'adhésion cellulaire épithéliale) /
anti-CD3
– Production par un hybridome hybride (fusion
d’un hybridome de souris et un hybridome de
rat)
– Trifonctionnel: se fixe sur les cellules
carcinomateuses (EpCAM), les lymphocytes
T (CD3) et les cellules effectrices innées
macrophages, NK et cellules dendritiques
(FcR)
– Induit l'activation des lymphocytes T et de
l’immunité innée (ADCC, CDC et phagocytose)
et aboutit à la destruction des cellules
tumorales
– Traitement d’ascites malignes chez les patients
atteints de carcinomes EpCAM-positifs (cancer
gastrique, ovarien)
Chaine lourde +
chaine légère de rat
Chaine lourde + chaine
légère de souris
Dérivés d’anticorps: fragments et Ac bispécifiques
Anticorps bispécifiques: BiTE
Blinatumomab (Blincyto®) (2014)
– BiTE: Bi-specific T-cell engager
– 2 domaines scFv (single-chain variable
fragment): anti-CD3 / anti-CD19
– Induit la formation d'une synapse cytolytique
entre le lymphocyte T et la cellule tumorale
– Induction d’une réponse T cytotoxique et
cytokinique
– Faible poids moléculaire (60 KDa) → ½ vie
courte, nécessité d’injections continues
– Mise au point de formes tétramériques avec
plus forte affinité pour le CD3 et ½ vie
augmentée permettant 1 injection / semaine
(AFM11)
Avantages
Fragment de liaison minimal – taille variable et adaptable
– Facilite la pénétration dans les cellules tumorales
– Taux de dissémination plus rapide
Augmentation de la valence – valence supérieure à 2
Liaison à deux antigène différents
Augmentation de l’avidité – vitesse de réaction augmentée
Flexibilité augmentée – facilitation de la liaison avec l ’antigène
Anticorps bispécifiques: autres indications
Tumeurs (anti-CD3/)
– Hématologiques (leucémies aigues) CD33, CD123
– Solides HER2, EpCAM, CEA
Ostéoporose
– Anti-sclerostin/anti-Dkk1 bloque la voie Wnt, augmente la
formation d’ostéoblastes et la croissance de l’os
Hémophilie A sévère
– Anti-FIXa/anti-FX permet leur interaction
Maladies auto-immunes
– Anti-IL-17/anti-TNFα (polyarthrite rhumatoïde)
Avantage des anticorps bispécifiques
Dirigent des cellules effectrices cytotoxiques vers la
tumeur
Meilleure spécificité que les AcM monospécifiques
lorsqu’ils reconnaissent 2 épitopes différents sur la
même surface antigénique
Meilleure efficacité anti-proliférative en combinant
deux récepteurs de croissance sur la même cellule
tumorale
Réduit le risque d’apprition de résistances
Coût réduit par rapport à l’association de 2 AcM
monospécifiques
Chimeric Antigen Receptor “CAR” T cells
Lymphocytes T modifiés exprimant un récepteur chimérique associant la
partie variable scFv d’une immunoglobline et les parties
transmembranaires/ cytoplasmiques de facteurs d’activation et de
costimulation
Réponse effectrice T maintenue dans le temps (cytokines)
Activation: chaine zeta du
CD3
Costimulation:
CD28 (Yescarta®)
4-1BB (Kymriah®)
Chimeric Antigen Receptor “CAR” T cells
CAR-T cell anti-CD19: 90% de réponse complète dans les LAL-B
en rechute ou réfractaire
Production complexe et onéreuse 400.000$ par injection