antigen-antitelo reakcije
DESCRIPTION
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE. Plan. Ag-At reakcije (opšte osobine) Imunoaglutinacija Imunoprecipitacija Ag-At reakcije sa obeleženim reagensima Ag-At reakcije zavisne od komplementa. Ag-At reakcije su laboratorijske r eakcije između antigena i odgovarajućih specifičnih antitela. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
ANTIGEN-ANTITELOREAKCIJE
Plan
• Ag-At reakcije (opšte osobine)
• Imunoaglutinacija
• Imunoprecipitacija
• Ag-At reakcije sa obeleženim reagensima
• Ag-At reakcije zavisne od komplementa
Ag-At reakcije su laboratorijske reakcije između antigena i odgovarajućih specifičnih antitela
Tradicionalno se zovu i serološke reakcije
1. Kvalitativne
2. Kvantitativne
Ispituje se prisustvo ili antigena (korišćenjem poznatog antitela) ili antitela (korišćenjem poznatog antigena) u uzorku (npr. serumu)
TITAR je mera količine specifičnih antitela i predstavlja vrednost (recipročnu) najvećeg razblaženja seruma koji daje pozitivnu
reakciju
POZITIVAN
NEGATIVAN
Ag - KONCENTRACIJA (npr. 2 mg/ml)
At - TITAR (npr. 1/80)
Mogu da budu:
Rezultat:
IMUNOAGLUTINACIJA
IMUNOAGLUTINACIJA je reakcija između korpuskularnog
(nerastvorljivog) antigena i odgovarajućih specifičnih
antitela
Antigen je najčešće na površini ćelije (npr. bakterije) ili je
solubilan molekul vezan za inertnu nesolubilnu česticu
(nosač)
Rezultat reakcije je aglutinat, vidljiva struktura nastala
zgomilavanjem tj. aglutinacijom čestica
Optimalno stvaranje aglutinata javlja se u zoni
ostvarivanja
ekvivalentnog odnosa između antitela i antigena
VIŠAK ANTIGENAVIŠAK ANTITELA
EKVIVALENTAN(OPTIMALAN)
ODNOS
Ag-At KOMPLEKSI:
AGLUTINACIJA:
REZULTAT:
MALI
NE POSTOJI
NEPOUZDAN(LAŽNO NEGATIVAN)FENOMEN PROZONE
VELIKI
POSTOJI
POUZDAN(POZITIVAN)
MALI
NE POSTOJI
NEPOUZDAN(LAŽNO NEGATIVAN)
IMUNOAGLUTINACIJA
INDIREKTNA(pasivna)
DIREKTNA
Detekcija Ag
Detekcija At
Detekcija At (Ag vezan za nosač)
Detekcija Ag (At vezano za
nosač)
Krajnja identifikacijabakterija
(enterobakterije)
BAB test(brucele)
Lateks RF test(reumatoidni
faktor)
HBsAg test(hepatitis B virus)
Primena (Primer)
IMUNOPRECIPITACIJA
IMUNOPRECIPITACIJA je reakcija između solubilnog
(rastvorljivog) antigena i odgovarajućih specifičnih antitela
Antigen je najčešće neki produkt mikroorganizma (npr. toksin) ili
protein plazme i drugih telesnih tečnosti (imunoglobulini,
komponente komlementa itd.)
Rezultat reakcije je precipitat (talog), tj. dolazi do izdvajanja
antigen-antitelo komkpleksa u vidu taloga
Do formiranja precipitata dolazi u zoni ostvarivanja ekvivalentnog
(optimalnog) odnosa koncentracija antitela i antigena
Metodi imunoprecipitacije mogu da se odigravaju u:
tečnoj sredini
polučvrstoj sredini (gelu)
slobodnom difuzijom (talog se formira posle nekoliko minuta)
slobodnom difuzijom (talog se formira posle više dana)pomoću električne struje (talog se formira posle nekoliko sati)
IMUNOPRECIPITACIJA
U POLUČVRSTOJ SREDINI (GELU)
U TEČNOJ SREDINI
RING test(Kvalitativna)
Nefelometrija(Kvantitativna)
Dvostruka imunodifuzija(Kvalitativna)
RID test(Kvantitativna)
Askolijeva reakcija(antraks)
određivanje koncentracije
proteina u serumu(Ig, komponente C‛)
Elekova proba(difterija)
PRIMER
određivanje koncentracije
proteina u serumu(Ig, komponente C‛)
Interfacijalni (interfazni) test prstena – RING test(princip)
Nefelometrija(princip)
Dvostruka imunodifuzija u gelu – Elekova proba (princip)
RID
IgG
1
2
3
4 5
Jednostruka radijalna imunodifuzija – RID test(princip)
1 standard poznate koncentracije
2 standard poznate koncentracije
3 standard poznate koncentracije
4 uzorak pacijenta
5 uzorak pacijenta
At u gelu
Ag u rupice:
Jednostruka radijalna imunodifuzija – RID test(princip)
Ag – koncentracija (g/l)
D2 (mm2)
1
2
3
4 5
ANTIGEN-ANTITELOREAKCIJE SA OBELEŽENIM
REAGENSIMA
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE SA OBELEŽENIM ANTITELIMA
M
Fc
Fab
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) - marker ENZIM
IMUNOFLUORESCENCIJA (IF) - marker FLUORESCENTNA BOJA
RADIOIMMUNO ASSAY (RIA) - marker RADIOAKTIVNI IZOTOP
AtM - marker
Fab
Enzimski imuno-test(ELISA)
Marker je enzim, a obeleženo je primarno At (specifično za antigen) ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Obavlja se u pločama za mikrotitraciju (pločama sa 96 rupica)
Signal se detektuje kolorimetrijski (pomoću spektrofotometra)
Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili antitela (tipično u serumu)
Bazira se na principu promene boje supstrata pod dejstvom enzima
Može da bude kvalitativna ili kvantitativna
ELISA(ploča sa pozitivnim uzorcima – primer 1)
ELISA(ploča sa pozitivnim uzorcima – primer 2)
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
neobeleženaAg-specifičnaAt
uzorak(serum)Ag
Inkubacija
12
6
Ispiranje
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
Inkubacija
12
6
Ispiranje
E
EE
E
E
obeleženaAg-specifičnaAt
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
Kolorimetrijska detekcija
12
6 E E
dodavanje supstrata
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)
Antigen kojim je obložena ploča
Ispitivani serum
InkubacijaIspiranje
6
12
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)
ObeleženaIg-specifična At
EE
E
E
E
E
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)
Inkubacija
EE
E
E
E
E
12
6
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)
Ispiranje
EE
E E
EE
E
E
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)
E
E E
E
12
6
Kolorimetrijska detekcija
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)
Imunofluorescencija(IF)
Marker je fluorescentna boja (fluorohrom), a obeleženo je primarno At (specifično za antigen) ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Obavlja se obično na mikroskopskim pločicama
Signal se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa
Koristi se za detekciju antigena u čvrstim uzorcima (npr. na ili u ćeliji/tkivu) ili antitela (tipično u serumu)
Bazira se na principu emitovanja boje pod dejstvom UV svetla
Može da bude samo kvalitativna i eventualno semi-kvantitativna
IMUNOFLUORESCENCIJA
INDIREKTNA (IIF)(obeleženo sekundarno At)
DIREKTNA (DIF)(obeleženo primarno At)
Detekcija Ag u/na ćelijama i tkivima
Detekcija Ag u/na ćelijama i tkivima
Detekcija At u serumu
specifičnost
osetljivost
Imunofluorescencija(primer 1)
Helicobacter pylori Borrelia burgdorferi
Imunofluorescencija(primer 2)
Neutrofili
Imunofluorescencija(primer 3)
Glomerulonefritis
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
FF
F
fiksiraniuzorak
obeleženaAg-specifična
At
F
FF
F
InkubacijaIspiranje
12
6
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F F
Ekscitacija
Fluorescencija
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
fiksiraniuzorak
neobeleženaAg-specifična
At
InkubacijaIspiranje
6
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
Inkubacija
ObeleženaIg-specifična AtF
F
F
F
F
FF
F
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
Inkubacija
FF
F
F
F
FF
F
12
6
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
Ispiranje
FF
F F
FF
F
F
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
F F
F
Ekscitacija
Fluorescencija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)
fiksiraniantigen
Ispitivani serum
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)
InkubacijaIspiranje
6
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)
Inkubacija
ObeleženaIg-specifična AtF
F
F
F
F
FF
F
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)
Inkubacija
FF
F
F
F
FF
F
12
6
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)
Ispiranje
FF
F F
FF
F
F
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)
F
F F
F
Ekscitacija
Fluorescencija
Radio-imunotest(RIA)
Marker je radioaktivni izotop (npr. 125I), a obeležen je ili antigen iliantitelo
Problem zbog rada sa radioaktivnošću i odlaganja otpada
Signal se detektuje pomoću brojača (broj raspada)
Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili antitela (tipično u serumu)
Bazira se na principu radioaktivnosti
Vrlo osetljiv kvantitativan test
Antigen-antitelo reakcije zavisne od komplementa
Ag-At reakcija in vitro koje postaju detektabilne (merljive) usled aktivacije prisutnog komplementa
Koriste se za:
1. Funkcionalno ispitivanje komplementa Test titracije komplementa
2. Detekciju antigena ili antitela Reakcija vezivanja komplementa (RVK) Mikrocitotoksični test (HLA tipizacija)
Test titracije komplementa(Funkcionalno ispitivanje komplementa)
Postupak za određivanje ukupne hemolizne aktivnosti C’
Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita (eritrocita obloženih anti-eritrocitnim antitelima) u toku aktivacije klasičnog puta
Izražava se u:
CH50 jedinicama u ml (spektrofotometrijski na osnovu optičke gustine oslobođenog hemoglobina)
CH100 jedinicama u ml (golim okom)
Reakcija vezivanja komplementa(Test fiksacije komplementa)
Postupak za određivanje specifičnih antitela (npr. za respiratorne
viruse) u serumu pacijenata
Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita (eritrocita obloženih anti-eritrocitnim antitelima) usled aktivacije komplementa nastalim Ag-At kompleksima
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter31/animation_quiz_4.html
Reakcijavezivanja
Komplementa(princip)
Pozitivan
Negativan
Nema lize Er
Taloženje Er
Liza Er
Serum saantitelima
Serum bezantitela
Antigenvezan
Antigenslobodan
Komplement
vezan(aktiviran)
Komplement
slobodan(neaktivira
n)
Serum
Antigen
+
+
Komplement
+
Senzibilisani Er(indikator)
Rezultat
Nemakompleme
nta
Komplement
aktiviran
=
Liza eritrocita
negativan
Odsustvo lizeeritrocita
(eritrocitnodugme)
pozitivan
Brzi test za otkrivanje trudnoće
(demonstracija)
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (princip)
detekcija beta HCG u urinu trudne žene
koriste se tri vrste antitela:
1. anti-HCG antitelo - obeleženo koloidnim zlatom (slobodno)
2. anti-HCG antitelo – neobeleženo (fiksirano za membranu)
3. anti-imunoglobulinsko antitelo – neobeleženo (fiksirano za membranu)
pozitivan
uzorak (urin)
negativan
uzorak (urin)
+
–
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (rezultati)
pozitivan
uzorak (urin)
Z Z Z
Z
difuzija
Z
Z Z
difuzija
Z
HCG
obeleženoanti-HCG
At
neobeleženoanti-HCG
At
anti-IgAt
+
uzorak(urin)
Z
Z
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (pozitivan rezultat)
Z
negativan
Z Z ZZ
difuzija Z Z
difuzija
ZZ Z
–
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (negativan rezultat)
uzorak (urin)
uzorak(urin) neobeleženo
anti-HCGAt
anti-IgAt
obeleženoanti-HCG
At
http://bio-alive.com/animations/immunology.htm