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Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia
Bióloga Mariana Monezi Borzi
Doutoranda em Microbiologia Agropecuária
Prof. Helio José Montassier
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESPFACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV
CAMPUS DE JABOTICABAL
Novo Dogma Central
da Biologia Molecular
• Cópia das sequencias de nucleotídeos de umamolécula de DNAfd parental em duasmoléculas filhas de DNAfd
• Semi-conservativa
Replicação
Fita molde
Fita nova
É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula
de DNA de fita dupla (gene)
Transcrição
Núcleo
Informação genética
Citoplasma
DNA mRNA
Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de aminoácidos que
constituem a proteína
Tradução
Expressão gênica
Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10 KDa, com cada aminoácido unido ao
seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente.
Proteína
Sequencia linear dos
resíduos de aminoácidos
(Ligações peptídicas)
Padrões estruturais:
conformação helicoidal ou
lado a lado
(Pontes de hidrogênio)
Arranjo 3D
(Pontes de hidrogênio,
Forças de Van der Wall,
Interações iônicas)
Arranjo entre
cadeias/subunidades
(Ligações dissulfeto)
• Antígenos: substâncias (moléculas) estranhas aoSI que são reconhecidas por receptoresespecíficos em linfócitos B e T e também poranticorpos.
• Antígenos recombinantes: proteínas específicasdo agente infeccioso, produzidas artificialmentea partir da clonagem gênica
- Proteínas recombinantes
- Proteínas heterólogas
Produção em larga escala de proteínas recombinantes a partir da expressão de uma
molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.
DNA recombinante: sequencia de DNA artificial que resulta da combinação
de diferentes sequencias de DNAs
Tecnologia do DNA recombinante
Estudos bioquímicosAnálises estruturais
Dificuldades de obtenção Produção de Anticorpos
Imunodiagnóstico
Clonagem gênica: isolamento,
amplificação e purificação de um ou
mais genes a partir do material genético
de um dado organismo.
Células hospedeiras: Leveduras, Células de
insetos, Células de mamíferos, Células bacterianas
Taxa de crescimento
celular;
Complexidade do meio de
cultura;
Custo do meio de cultura;
Nível de expressão;
Capacidade de expressão
extracelular.
Capacidade de produzir as
modificações pós-
traducionais:
- enrolamento correto;
- formação das pontes
dissulfeto;
- glicosilação;
- fosforilação;
- acetilação.
• Crescimento rápido
• Pouco espaço físico
• Genética bem compreendida
• Aceita material genético estranho
Escherichia coli
Vetor: molécula de DNA usada como um veículopara carregar sequências de DNA estrangeirasdentro de uma célula hospedeira.
Plasmídeos:
• Mais simples
• Circulares
• Independentes do cromossomo bacteriano
Vetores de expressão
Gene resistência a
antibiótico
Expressão de proteína recombinante em E. coli: 3 etapas
- Clonagem Gênica
- Indução da Expressão
- Análise da Expressão
Vetor de expressão
Preparo do inserto- gene
Reação de ligação
Plasmídeo recombinante
Transformação de E. coli
competente
Plaqueamento e seleção
dos clones recombinantes
Extração do
DNAp e
Sequenciamento
ETAPA
1
amp
Tampão
de lise
Sonicação Purificação
ETAPA 2
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)
• Quanto menor for o peso molecular daproteína mais facilmente ela migrarápelos poros do gel de poliacrilamida emrelação às outras
• Após a corrida as proteínas poderão servisualizadas com a aplicação do coranteCoomassie Blue
ETAPA
3
Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e β-mercapto-etanol
Confere carga negativa Separa as cadeias
260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
10 kDa
Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do
Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
Western blotting
• Técnica bioquímica utilizada paradeterminar a quantidade relativa e o pesomolecular de uma proteína dentro de umamistura de proteínas ou outras moléculas.
• Uso de anticorpos específicos
• Detecção de antígenos proteicos
ETAPA
3
Caracterização por Western Blotting da Proteína NP recombinante do VIA expressa
em E. coli após purificação em resina de níquel-agarose.
1 2 3
260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
Análise (mapeamento)dos epítopos
Epítopo linear ou contínuo
Epítopo conformacional ou
descontínuo
Imunodiagnóstico
• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos viraise bacterianos específicos
• Clonagem e expressão da NP do VIA
• Testes de ELISA
• 121 soros testados
• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com aNP recombinante
• Negativos – não ocorria reação
ELISA indireto
• Apresentam sequencias do material genéticodo agente infeccioso que codificam antígenos
Vacinas de DNA
Clonagem do gene em vetor de expressão (propagação)
Administração ao indivíduo (transfecção)
Células produzem a própria proteína (antígeno)
Resposta imunológica com memória
• Indução da imunidade protetora emcamundongos contra o câncer e algumasdoenças auto imunes.
• Em humanos:
Vacinas de DNA
Pesquisas direcionadas contra a AIDS, malária, tuberculose,
dengue, hepatite, raiva, leptospirose, teníase etc.
• Seleção do gene alvo
• Construção do vetor de expressão
• Frequência e via de administração
• Idade, saúde e espécie
Vai depender...
• Produção em larga escala – menos custo
• Mais fácil o controle de qualidade
• Estáveis a Tº ambiente
• Podem ser liofilizadas
• Sem necessidade de refrigeração – fácil comercialização, transporte, distribuição em regiões de difícil acesso
Vantagens
OBRIGADA!