antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · fluoreszcens technikák •...

Biológiai Intézet

Immunológiai

Tanszék

Antigén–ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló

analitikai módszerek II.

Áramlási citofluorimetria

Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia

Uzonyi Barbara

2019.11.07.

Fluoreszcens technikák

• érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni

• térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz

• nem veszélyes (vs. radioaktív technikák)

• egyszerre több jel mérhető ugyanabban a mintában

• élő sejtek vizsgálatára is alkalmas

Módszerek / műszerek:

spektrofluorimetria

fluoreszcens scanner

FLIA (fluorescent immunoassay)

DNS-szekvenálás és DNS-detektálás (PCR, qRT-PCR)

áramlási citometria

fluoreszcens mikroszkópia (FISH, CLSM)

BD FACSCanto II

Az áramlási citométer felépítése

Beckman Coulter CytoFLEX

minta

köpenyfolyadék


Hidrodinamikai fókuszálás:

- lamináris áramlás

- véd és irányít

- mérendő részecskék rendezéseFluidikai rendszer

Molecular Probes Tutorial


• megvilágítás

• gerjesztés

UVközeli

UVviolett sötétkék kék zöld

sárgás-

zöldnarancs vörös

hullám-

hossz (nm)325/355 375 405/407 445/457 488 514-532 561 592 633-640

Lézer



optikai

rendszer

Lencsék, tükrök, szűrők

• fókuszálják a fényt

• gyűjtik és felosztják a szórt és emittált fényt


Detektorok

FL

SSC

FSC

Számítógép

• citométer vezérlése

• adatgyűjtés és -tárolás

• analízis

Detektorok

• fotodiódák vagy fotoelektronsokszorozók

• optikai jelet elektromos jellé alakítják

• jelerősítés



MérésFényút a mérőcellában

minta: 105 – 106 sejt/ml

áramlási sebesség: 30-60 µl/perc

~103 -104 sejt/másodperc

>10000 sejt/minta mérésenként

www.bdbiosciences.com


Fluoreszcencia

Oldalra irányuló fényszórás (SSC)

Mért paraméterek

Előre irányuló fényszórás (FSC)

1-6 (18) csatornában


Oldalra irányuló fényszórás (SSC)

Előre irányuló fényszórás (FSC)

Mért paraméterek

Előre irányuló fényszórás (forward scatter, FSC)

• fényelhajlás

• arányos a sejt méretével

• a megvilágító fény tengelyén mérjük

(megvilágító fény blokkolása!)

Oldalra irányuló fényszórás (side scatter, SSC)

• fényszórás és fénytörés

• arányos a sejt belső komplexitásával

• a megvilágító fényre merőlegesen mérjük

Mért paraméterek

Fluoreszcencia

Abszorbeált fény Emittált fény

gerjesztés emisszió

Alapállapot

Gerjesztett állapot

Antitest

Antigén

Fluorokróm

DNS

Fluoreszcens

nukleinsav

festékek

A fluoreszcencia forrása

1. autofluoreszcencia

aromás aminosavak, NADH, NADPH...

2. jelölés

Egyéb fluoreszcens próbák:

• pH

• intracelluláris ionok

• membránpotenciál

• reaktív oxigéngyökök

• organellum

• transzportfehérjék

• enzimszubsztrátok

• ...• sejtfelszíni

• intracelluláris

fixálás, permeabilizálás

• direkt

• indirekt

emissziós spektrum

gerjesztési spektrum

hullámhossz (nm)

rela

tív

inte

nzitás

(%)

gerjesztő lézer

(488 nm) detektált hullám-

hossztartomány

A fluorofórok spektrális tulajdonságai

www.thermofisher.com

FITC (fluoreszcein-izotiocianát)

• melyik hullámhosszon optimális az adott fluorofór gerjesztése

• milyen hullámhossztartományban célszerű detektálni

Előre irányuló

fényszórás (FSC)

Oldalirányú fényszórás

(SSC)

Hisztogram: egyparaméteres gyakoriság eloszlás

x-tengely: mért szignálintenzitás

y-tengely: adott intenzitáshoz tartozó eseményszám

Eloszlás

méret alapján

Eloszlás

granuláltság alapján

Az adatok ábrázolása

granulociták

monociták

limfociták

Humán vérminta FSC–SSC képe a vörösvértestek lízise után



Felhődiagram („Dot-Plot”): kétparaméteres ábrázolás

x- és y-tengelyen is egy mért paraméter intenzitás eloszlása van

dot plot

density

plot

contour

plot


Relatív fluoreszcenciaintenzitás

Sejtszám

Az emittált fluoreszcens fény intenzitása arányos a

sejtek által megkötött fluorokróm molekulák számával.

jelölt sejtekjelöletlen sejtek

(autofluoreszcencia)


Az adatok ábrázolása – fluoreszcencia

Fluoreszcenciaintenzitás 1 (zöld)Flu

ore

szcencia

inte

nzitás

2 (

nara

ncs)

Jelölés többféle ellenanyaggal / festékkel

Az adatok ábrázolása – fluoreszcencia

Kapuzás („gating”): egy adott sejtpopuláció kijelölése

CD45

SS

C

granulociták

monociták SS

C

CD3

CD3– CD3+

CD3–

CD3+

Sejtszám

Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)

CD3–

B-sejtek

NK-sejtek

CD3+

T-sejtek

CD45+ limfociták


Az adatok ábrázolása – kapuzás

Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)

• alvadásgátolt vér, köldökzsinórvér, vérkészítmények

• testfolyadékok, pl.

csontvelő, gerincvelői folyadék, ízületi folyadék, tüdőváladék, ejakulátum...

• szövetek (a sejtek szuszpenzióba hozása után)

• tenyésztett sejtvonalak

• gyöngyök (latexpartikulumok kalibráláshoz, szolubilis molekulák méréséhez)

• mikroorganizmusok (baktériumok, gombaspórák, egysejtűek)

természetes vizekből, tenyészetekből, testfolyadékokból...

• exoszómák, mikrovezikulák

• kromoszómák

• ...

Citométerrel mérhető minták

Részecskék / sejtek szuszpenzióban (~300 nm – 100 µm)

Kent, Stephen J (June 2017) HIV Vaccine Approaches. In: eLS. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.

Idő (évek)

CD

4+

lim

fociták

szám

a/µ

l vér

Opportunista fertőzések

Wilcox CM & Saag MS, Gut2008;57:861–870.

Immunológiai vizsgálatok:

HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása

CD4+ > CD8+ CD4+ < CD8+

Diagnózis: szerológiai vizsgálatok (pl. plazmában antitestek és virus kimutatása)

+ hematológiai vizsgálatok

www.med4you.at

Egészséges Beteg



Normál tartomány:

CD4+: 31-63 %, 314-1270 sejt/µl*

CD8+: 12-37 %, 147-836 sejt/µl*

Kalibrációs gyöngyök

segítségével meghatározható

az abszolút sejtszám.

Abszolút CD4+ sejtszám szükséges

- profilaktikus kezelés esetén (opportunista fertőzések)

- antiretrovirális terápia megkezdése előtt


CD3/CD4/CD8/CD45

* Bisset RL et al., 2004 Eur J Haematol. 72(3):203-12.



• malignus B-sejt limfóma

• monoklonális plazmasejtszaporulat a csontvelőben

• paraprotein / M-Protein (kóros immunglobulin)

Diagnosztika:

• Labor – vizelet- és vérvizsgálatok

• képalkotó eljárások

• immunfenotipizálás

• csontvelővizsgálatokTakeda Oncology


Mielóma multiplex

Plazmasejtek a csontvelőben

Molekuláris biológiai módszerek: allélspecifikus PCR, NGS

- érzékenyebbek lehetnek

- drágábbak

- diagnosztikai mintának kell lenni a terápia előtt

- nem rutin laboratóriumi eljárások

Jelinek et al., Blood Cancer J. 2017 Oct; 7(10):e617.

Minimális reziduális betegség kimutatása

abnormális plazmasejtek

normál plazmasejtek

többi csontvelői sejt

CD45−/CD38dim/CD19−/CD56+/CD27−/CD81−/CD117+/cyKappa+


Mielóma multiplex – betegségkövetés

Sejtaktivitás mérése – fagocitózisteszt

www.imd-berlin.de

Funkciózavarok:

• veleszületett immundefektus

• tumor, krónikus fertőzések, AIDS, TBC

• iatrogén funkcióvesztés

pl. immunszuppresszív kezelés

Neutrofil granulociták:

• veleszülett immunrendszer sejtjei

• fehérvérsejtek 65-70%-a

• baktériumok, gombák eliminációja

• kemotaxis, fagocitózis, reaktív oxigéngyökök

termelése

Fagocitózis teszt

Heparinos vér

+ opszonizált jelölt E. coli

Inkubálás 37°C-on

A festék cask akkor fluoreszkál, ha

alacsony a közeg pH-ja – vagyis

bekerült a fagolizoszómába.


Sejtaktivitás mérése – fagocitózisteszt

• apoptózis

• sejtciklus analízis

• ploiditás vizsgálat

• ivarsejtek válogatása

• proliferáció

DNS-festékek kötődése

• mindig sztöchiometrikusan kötnek (mennyiségi meghatározás)

• membránpermeábilis és impermeábilis festékek

beépült nukleotid-analóg jelölése

fluoreszcensen


DNS-tartalom mérése

DNS-tartalom mérése

Hang & Fox, Methods Mol Biol. 2004;241:23-35.

se

jtszám

fluoreszcenciaintenzitás (PI)

se

jtszám

fluoreszcenciaintenzitáswww.thermofisher.com

proliferáció

sejtciklus

Marie D et al., http://citeseerx.ist.psu.edu Alice Longobardi Givan: Flow cytometry: first principles (Wiley, 2001)

T0

20 hKlo

rofill

fluore

szcencia

FSC

Óceanográfia – természetes fikobiliproteinekMit eszik a kagyló?

Fitoplanktonok azonosítása

FSC SSC

SSC

fikoeritr

inF

I

fikoeritrin FI

klo

rofill

FI

klo

rofill

FI

klo

rofill

FI

Antibiotikumrezisztencia mérése

Inokulálás

baktériumok növesztése

40-60 Min

Inkubálás:

antibiotikum és DiBAC4(3)

120 Min

citometria

kontroll és 6 minta

centrifugálás és

reszuszpendálás

Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5

DiBAC4(3):

fluoreszcens festék a

membránpotenciál

változásának mérésére

Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5

E. coli izolátum antibiotikumrezisztencia vizsgálata

Antibiotikumrezisztencia mérése

Kirby-Bauer korongdiffúziós teszt (24 h)kontroll

antibiotikummal kezelt

Multiplex áramlási citometriás mérés

• CBA – Cytokine Bead Array (Beckton Dickinson)

• Nagy számú analit mérése akár 1 mintából (vs ELISA, ahol sok mintából 1 analit mérése)

• Nem tudjuk, hogy melyik populáció termelte az adott citokint (ELISA-nál sem)

• Detektálható citokinek: IFNγ, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2, TNFα...

• Felhasználható mintatípusok: szérum, plazma, sejtkultúra felülúszója

gyöngyök minta

detektáló antitestek

mosás citometriás

mérés

koncentráció

standardgörbe


Multiplex citometria – citokinmérés

citometriás

mérés

PE (FL2) +

APC (FL3)

FITC (FL1)

Multiplex citometria – citokinmérés

Sejtválogatás - szortírozás

FACS: fluorescence-activated cell sorting

https://lombardi.georgetown.edu

Fluoreszcens mikroszkópia

www.edmundoptics.com

fényforrás

• lézer

• lámpa

excitációs filter

• szelektív – csak a jelölt molekulákat látni

• térbeli és időbeli meghatározás

• minta: adherens és kitapasztott sejtek is

• jelölés gyakorlatilag azonos a citometriással

detektor

kamera

fotoelektronsokszorozó

emissziós filter

dikroikus

tükör

Paramecium sp.

www.leica-microsystems.com

minta

Lézer pásztázó konfokális mikroszkóp (CLSM)

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu

• élő sejtek, folyamatok vizsgálata

(live cell imaging)

• pontos lokalizáció

kolokalizáció, FRET

hátrányok, nehézségek:

• kevés sejtről ad információt

(citometriához képest)

• lassabb (felbontástól függően)

adott idő alatt kevesebb sejt mérése

• fluorofórok halványodása, „kiégése”

• max. 4 paraméter

FRET: fluoreszcencia-rezonancia energia transzfer

Széles mező megvilágítás (WF) vs. pont szkennelés (CLSM)

fényforrás

minta

széles mező konfokális

lyukdiafragma

„pinhole”

Lézer pásztázó konfokális mikroszkópia – optikai szeletelés

www.olympus-lifescience.com

napraforgó pollen

(széles mező, epifluoreszcens kép)

20-40 µm nagy

0,5 µm-es szeletekcam.facilities.northwestern.edu

• fokális sík < minta vastagsága

• kép több fokális síkból leképezi az egész mintát

• fókuszon kívüli jelek kizárása

Kontrasztfelvételek

www.olympus-lifescience.com

• Külön felvételek, digitálisan egymásra vetítve

(merge, overlay)

• A fluoreszcens jel lokalizációja

Fázis kontraszt (PC):

speciális kondenzor + fáziskontraszt objektív

megnövelt kontraszt

vékony (0,1 – 1 µm) mintáknál

Differencia interferencia kontraszt (DIC):

polarizátor + prizmák

relief-szerű kép

relatív vastag minták is vizsgálhatók így

Fibroblasztok

differencia

interferencia

kontraszt

sejtmag (DAPI) egymásra vetítve

Macska agyszövet, Criptococcus fertőzés

fázis kontraszt

neuron (FITC)

Criptococcus

(kongóvörös) egymásra vetítve

Időbeli folyamatok követése:

Neutrofil extracelluláris csapda képződése

Bruns et al., PLoS Pathogens. 2010; 6: e1000873.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000873.s002

Video S1

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000873.s002

Összefoglalás

Áramlási citometria

• gyors

• multiparaméteres

• sok sejtről ad információt (statisztika)

• adherens sejtek, szövetek nem fiziológiásan

• lokalizáció nem mérhető

• időbeli folyamatok csak populációszinten

• adatok archiválása könnyű

Konfokális lézer pásztázó mikroszkópia

• lassabb (adott idő alatt kevesebb sejt mérhető)

• max. 4 paraméter

• kevesebb sejtről ad információt

• adherens sejtek, szövetek is fiziológiásan

• pontos térbeli lokalizáció

• időbeli folyamatok sejtszinten mérhetők

• adatok archiválása nehézkes (nagy méretű fájlok)

minta

(szuszpenzió)

fényszórás

fluoreszcencia

minta

(hordozón)

kontrasztkép

fluoreszcencia

Köszönöm a figyelmet!

www. cellcartoons.net

antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · fluoreszcens technikák •...

Documents