UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

INVESTIGAÇÃO DO PERFIL DE EXPRESSÃO DE MICRORNAS EM CULTIVOS

DE CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO

EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS COM O VÍRUS DENGUE 2

(FLAVIVIRIDAE: FLAVIVIRUS)

ANTONIO GREGORIO DIAS JUNIOR

BELÉM-PARÁ

2013

ANTONIO GREGORIO DIAS JUNIOR

INVESTIGAÇÃO DO PERFIL DE EXPRESSÃO DE MICRORNAS EM CULTIVOS

DE CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO

EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS COM O VÍRUS DENGUE 2

(FLAVIVIRIDAE: FLAVIVIRUS)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos

BELÉM-PARÁ

2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca Virtual em Saúde do Instituto Evandro Chagas (BVS IEC)

Dias Junior, Antonio Gregorio. Investigação do perfil de expressão de micrornas em cultivos de células de carcinoma hepatocelular humano experimentalmente infectados com o vírus dengue 2 (Flaviviridae: Flavivirus)/ Antonio Gregorio Dias Junior. - 2013 100 f.: il.; 30 cm Orientador: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos Dissertação (Mestrado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários, 2013. 1. Vírus dengue. 2. IL6. 3. TLR8. 4. MicroRNA. I. Vasconcelos, Pedro Fernando da Costa, orient. I. Universidade Federal do Pará. III. Título.

CDU: 578.833.2

ANTONIO GREGORIO DIAS JUNIOR

INVESTIGAÇÃO DO PERFIL DE EXPRESSÃO DE MICRORNAS EM CULTIVOS

DE CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO

EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS COM O VÍRUS DENGUE 2

(FLAVIVIRIDAE: FLAVIVIRUS)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade

Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, IEC/SVS/MS

Banca examinadora:

Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, IEC/SVS/MS

Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Prof. Dr. Antônio Carlos Rosário Vallinoto Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Prof.a Dr.a Daniele Barbosa de Almeida Medeiros (Suplente) Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, IEC/SVS/MS

Belém, 14 de Junho de 2013

EPÍGRAFE

"- Tudo é possível. Mas também é preciso duvidar de tudo"

(O Mundo de Sofia - Jostein Gaarder)

"O fato de o mar estar calmo na superfície, não significa que nada esteja acontecendo nas profundezas"

(O Mundo de Sofia - Jostein Gaarder)

DEDICATÓRIA

Ao meu pai, Antonio Gregorio Dias, e em especial, in

memoriam, à minha mãe, Edite de Oliveira Dias

AGRADECIMENTOS

A Deus pelas bênçãos alcançadas dadas as dificuldades encontradas e superadas.

À minha família (Antônio Gregorio, Elaine, Eliane, Ediane, sobrinhos), e a minha

companheira, Flávia Filocreão Malheiros, pelo apoio incondicional em todas as fases

de minha vida, conselhos, ensinamentos, amor e suporte as minhas decisões sobre

minha carreira.

Ao meu orientador, Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos, pelas orientações e

confiança a mim depositadas. Pela oportunidade de trabalhar com uma importante e

influente referência nos estudos dos arbovírus dada a produção superlativa no

campo. Isso me trouxe confiante ao fim deste projeto, e ao início de um processo de

colaboração profissional.

À banca examinadora desta dissertação pelo auxílio com as correções, sugestões e

críticas, os quais servirão de alicerce e aprendizado para futuros estudos e

colaborações.

À Dr.a Yi-Ling Lin e ao Dr. Chia-Yi Yu (Academia Sinica - Taipei, Taiwan) pela

oportunidade de participação no "Taiwan International Graduate Summer Internship",

levando a minha primeira experiência de pesquisa com o Vírus dengue e microRNA

celular.

Ao Instituto Carlos Chagas (Fiocruz - Curitiba, Brasil) pela oportunidade de

participação no curso de férias. Em especial ao Dr. Juliano Bordignon e Dr.a Claúdia

Nunes pelas discussões e curso em virologia molecular do Vírus dengue e a

gentileza em ceder os cultivos Huh7.5 utilizados neste estudo.

Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia para Febres Hemorrágicas Virais

(INCT-FHV) pelo financiamento deste estudo (processo CNPq/CAPES/FAPESPA n°

573739/2008-0).

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia em Agentes Infecciosos e Parasitários

pela oportunidade de qualificação aprimorada e treinamento, assim como suporte as

atividades acadêmicas e extracurriculares.

À CAPES pelo financiamento de uma bolsa de estudos mensal a nível de mestrado.

À empresa Exiqon (Dinamarca) pelo suporte técnico e de bioinformática,

especialmente com os ensaios de microarray (Catherine, Dr.a Hazel Pinheiro, Dr.

Michael Thorsen e Dr.a Maria Telium).

À toda equipe técnica, pesquisadores e colaboradores do Instituto Evandro Chagas,

em especial, à Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas (Laboratório de

Cultura Celular: Creuza Lima, Dr.a Valéria Lima, Ercília e Eliana Pinto; Biologia

Molecular: Bruno Nunes, Dr.a Ana Cruz, Dr.a Daniele Medeiros, Darlene Simith,

Natália do Vale, Natividade e Karlyne Brum; Laboratório de Imunopatologia: Dr.a

Edna Franco; Centro de Inovações Tecnológicas: Dr. Márcio Nunes, Dr. Evonnildo

Gonçalves, Clayton; Esterilização: Mari e Raimundo), Seção de Virologia (Dr.a Ana

Wanzeler) e Seção de Bacteriologia/Micologia (Dr.a Silvia Marques).

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16

1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE O DENGUE ......................................................... 16

1.1.1 Associação da estrutura genômica e a replicação viral ....................... 17

1.1.2 Imunopatologia do DENV e células hepáticas como modelos in vitro 22

1.2 MICRORNAS ...................................................................................................... 26

1.3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 33

1.3.1 Objetivo geral ........................................................................................... 33

1.3.2 Objetivos específicos ............................................................................... 33

3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 34

3.1 CULTIVOS CELULARES DE CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO

(HEPG2 E HUH7.5) ................................................................................................... 34

3.2 AMOSTRA VIRAL ............................................................................................... 35

3.3 PASSAGENS E ESTOQUE VIRAL EM CULTIVOS DE AEDES ALBOPICTUS

CLONE C6/36 E VERO (ATCC: CCL-81) ................................................................. 35

3.4 TITULAÇÃO VIRAL EM CÉLULAS VERO (ATCC: CCL-81) ............................... 37

3.5 SUBCULTURA, INFECÇÃO E SELEÇÃO DO MODELO IN VITRO ................... 38

3.5.1 Imunofluorescência indireta .................................................................... 39

3.5.2 Curva da cinética viral ............................................................................. 40

3.5.3 Imunocitoquímica ..................................................................................... 40

3.5.4 Viabilidade celular pelo ensaio do MTT - brometo de 3-(4,5-dimetil-

tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) ....................................................................... 41

3.6 EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL E CONTROLE DE QUALIDADE ......................... 41

3.7 MICROARRAY E PERFIL DE MICRORNAS ...................................................... 42

3.8 ANÁLISE DO PERFIL DE MICRORNAS EM VIAS METABÓLICAS ................... 43

3.9 TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DA REAÇÃO EM CADEIA MEDIADA

PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL (RT-QPCR) ............................................... 44

3.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .............................................................................. 46

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 48

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 61

5.1 O ENSAIO DE PLACAS EM CÉLULAS VERO PARA O DENV E AS

CARACTERÍSTICAS DA CEPA VIRAL DENV2 44/2 ................................................ 61

5.2 A ESCOLHA DO MODELO DE REPLICAÇÃO IN VITRO PARA O DENV2 44/2:

HEPG2 OU HUH7.5 .................................................................................................. 62

5.3 O FENÓTIPO DA INFECÇÃO DO DENV2 44/2 EM HUH7.5 .............................. 65

5.4 OS PERFIS DE MICRORNAS ............................................................................ 66

5.5 AVALIAÇÃO HIPOTÉTICA SOBRE O MIR-146A-5P: REGULAÇÃO DAS VIAS

DE IFN E UMA FUNÇÃO NUCLEAR PARA PROTEÍNA VIRAL NS5 ....................... 68

5.6 AVALIAÇÃO HIPOTÉTICA SOBRE O MIR-21-5P: EXISTE RELAÇÃO DOS

NÍVEIS DE IL-6, TLR8 E O EXTRAVASAMENTO PLASMÁTICO? .......................... 71

5.7 POTENCIAL DOS MICRORNAS COMO PROVÁVEIS BIOMARCADORES DE

INFECÇÃO DO DENV2 ............................................................................................ 74

5.8 ALGUMAS PERSPECTIVAS DO PAPEL DOS MICRORNAS NA REGULAÇÃO

DA REPLICAÇÃO DO DENV .................................................................................... 75

6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 77

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 78

APÊNDICE

ANEXO

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura - 1 Organização do genoma do vírus dengue (DENV)....................................18 Figura 2 - Exemplificação de proteínas virais e celulares envolvidas nos processos de tradução e replicação do DENV............................................................................20 Figura 3 – Representação esquemática da via de biogênese dos microRNAs.........28 Figura 4 – Micrografia de imunofluorescência indireta em células Huh7.5 infectadas com o DENV2 cepa viral 44/2....................................................................................48 Figura 5 - Curva da cinética viral................................................................................49 Figura 6 - Viabilidade celular......................................................................................50 Figura 7 - Detecção de caspase 3 por imunocitoquímica..........................................51 Figura 8 - Análise do componente principal (PCA)....................................................53 Figura 9 - Heatmap e agrupamento hierárquico entre todas as amostras dos cultivos Huh7.5 e HepG2.........................................................................................................55 Figura 10 - Níveis do aumento da expressão dos microRNAs em células Huh7.5 infectadas com o DENV2 cepa viral 44/2...................................................................58 Figura 11 - Expressão de IL6 em cultivos Huh7.5......................................................59 Figura 12 - Expressão de TLR8 em cultivos Huh7.5..................................................60

Tabela 1 - MicroRNAs diferencialmente expressos, de acordo com a técnica de microarray, em cultivos Huh7.5 infectados com a cepa viral 44/2 (DENV2) em 24 e 48 horas pós-infecção......................................................................................................................54 Tabela 2 - MicroRNAs diferencialmente expressos validados por RT-qPCR de amostras de cultivos Huh7.5 experimentalmente infectados com o DENV2 cepa viral 44/2.............................................................................................................................57

LISTA DE ABREVIATURAS

Ago - Proteína Argonauta

BSA - Albumina bovina

C – Capsídeo

cDNA - DNA complementar

CMC - Carboximetilcelulose

CS – Sequência de ciclização

DMEM – Meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco

DNA – Ácido desoxirribonucleico

dpi - dias pós-infecção

dsRNA – RNA de dupla fita

DENV – Vírus dengue

DGCR8 – DiGeorge critical region 8

D-PBS – Solução salina tamponada fosfatada de Dulbecco incompleta

E – Envelope

EBV - Vírus Epstein-Barr

ECP - Efeito citopático

FCD - Febre clássica do dengue

FHD - Febre hemorrágica do dengue

HCV - Vírus da hepatite C

hpi – horas pós-infecção

IEC – Instituto Evandro Chagas

IL - Interleucina

IFI - Imunofluorescência indireta

IFN - Interferon

IRAK - Quinase associada ao receptor de interleucina 1

IRF - Fator regulatório de interferon

M – Membrana

MDA5 – Gene 5 associado a diferenciação de melanoma

miR/miRNA – MicroRNA (s)

moi – Multiplicidade de infecção

mRNA – RNA mensageiro (s)

MYD88 - Gene de resposta primária de diferenciação mieloide 88

MTT - Brometo de 3-(4,5 dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio

NF-κB - Fator de transcrição nuclear κ B

NS – Não estrutural

nt – Nucleotídeo (s)

OAS - 2'-5'-Oligoadenilato sintetase

OMS – Organização Mundial de Saúde

ORF - Cadeia aberta de leitura

PCA - Análise do componente principal

pDCs - Células dendríticas plasmocitoides

PFU - Unidades formadoras de placa

prM – Pré-membrana

PRR – Receptores reconhecedores de padrões ligados a patógenos

RdRp - RNA polimerase dependente de RNA

RE – Retículo endoplasmático

RIG I - retinoic acid-inducible gene I

RIN – Número de integridade do RNA

RISC – Complexo de silenciamento gênico induzido por RNA

RNA – Ácido ribonucleico (s)

RNAi - RNA de interferência

RNC - Região não codificante

RPM – Rotações por minuto

RT-qPCR – Transcrição reversa seguida da reação em cadeia mediada pela

polimerase em tempo real

SAARB – Seção de arbovirologia e febres hemorrágicas

SBF – Soro bovino fetal

SCD - Síndrome do choque do dengue

siRNA – Small interfering RNA (s)

SLA - Stem loop A

SOCS – Supressor da sinalização de citocinas

STAT - Proteína transdutora de sinal e ativadora de transcrição

TA – Temperatura ambiente

TGF-β - Fator de transformação do crescimento β

TLR – Receptor semelhante a Toll

Tm – Temperatura de dissociação

TNF-α – Fator de necrose tumoral α

TRAF - Fator associado ao receptor de TNF

UAR – Upstream UAG region

VERO – Cultivo celular de rim de macaco verde africano Cercopithecus aethiops

VSV – Vírus da estomatite vesicular

Vv – Volume do estoque viral a ser utilizado para infecção

YFV – Vírus da febre amarela

RESUMO

A espécie Vírus dengue (Flaviviridae: Flavivirus) contém quatro sorotipos (DENV 1- 4) transmitidos por mosquitos do gênero Aedes. O DENV é considerado o causador da arbovirose de maior relevância em termos de saúde pública, principalmente, em países tropicais e subtropicais. Os quadros clínicos podem ser assintomáticos, febre clássica, dengue hemorrágica e síndrome do choque por dengue. Os casos graves estão, geralmente, relacionados a uma produção exacerbada de citocinas inflamatórias com carga viral elevada, incluindo importante infecção de órgãos, como o fígado. Apesar de relevante, não há vacinas e/ou tratamentos terapêuticos específicos e eficazes. Nesse aspecto, os microRNAs (miRNA) são RNA não codificantes de aproximadamente 22 nucleotídeos com atividades regulatórias na expressão gênica, e vem sendo relacionados como potenciais biomarcadores/alvos terapêuticos em várias enfermidades. Com isso, este estudo visou a pesquisa de miRNA celulares em cultivos de hepatocarcinoma humano experimentalmente infectados com DENV2, de modo a contribuir com o entendimento da imunopatologia da Dengue. Para isso, cultivos HepG2 e Huh7.5 foram infectados com uma multiplicidade de infecção 1 com a cepa viral 44/2 e avaliados pela suscetibilidade à infecção viral por imunofluorescência indireta (IFI) e títulos virais nos sobrenadantes em unidades formadoras de placas (PFU) por mL. O cultivo mais suscetível foi adicionalmente infectado e analisado até 96 horas pós-infecção (hpi) para pesquisa da curva de título viral (log2 de PFU/mL), viabilidade celular e produção de caspase 3 por imunocitoquímica. Após isso, foram realizados perfis de miRNA até 48 hpi por microarray e validados pelo ensaio da transcrição reversa seguida da reação em cadeia mediada pela polimerase em tempo real (RT-qPCR). Com a confirmada expressão de miRNA, foi verificada a expressão do receptor semelhante a Toll 8 (TLR8) e a citocina IL6. Em suma, o cultivo Huh7.5 foi o mais suscetível à infecção pela cepa viral 44/2, e apresentou picos de títulos virais em 48 e 72 hpi. A viabilidade celular foi decrescente com diminuição de aproximadamente 30% após 48 hpi. De modo semelhante, os níveis de caspase 3 foram identificados. O perfil de miRNA apresentou quatro principais miRNA com níveis de expressão alterados de forma relevante (miR-3182, miR-4198, miR-21-5p e miR-146a-5p), porém, somente os miR-21-5p e miR-146a-5p foram validados por RT-qPCR devido as suas relevâncias hipotéticas sugeridas sobre a regulação e mecanismos da imunopatologia devidos a infecção/replicação do DENV. Esses miRNA mostraram níveis de expressão aumentada em relação aos controles não infectados, assim como, foram também elevadas as produções de IL6 e TLR8. Em conclusão, verificou-se que os cultivos Huh7.5 ao serem infectados com o DENV2 foram destinados a morte celular em poucos dias pós infecção. Esse fenótipo foi observado com o aumento da expressão dos miR-21-5p e miR-146a em paralelo a TLR8 e a citocina IL6. Palavras-chave: Vírus dengue; IL6; TLR8; microRNAs

ABSTRACT

Dengue virus species (Flaviviridae: Flavivirus) comprises four serotypes (DENV 1-4) that are Aedes mosquitoes transmitted. It is the most important arbovirus threat according to tropical and sub-tropical countries public health policies. The clinical spectrum may range from assymptomatic infection and classical dengue fever to severe forms (ie., dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome). The latter is usually associated to an inflammatory cytokine storm with a high rate of infected cells, which may lead to important organs infection, eg. liver. Nonetheless, there are no vaccines and/or treatment with efficacy and safety. On this regard, microRNAs (miRNAs) are roughly 22 nucleotides non-coding RNAs with gene expression regulatory properties. These have been studied as potential biomarkers and/or therapeutical targets in several diseases. Therefore, this study aimed to perform a miRNA profiling of human hepatoma cells that were experimentally infected with DENV2 in order to contribute to the dengue immunopathology understanding. For such, both HepG2 and Huh7.5 cells were infected with the virus strain 44/2 (DENV) at a multiplicity of infection 1 and assayed for virus replication by indirect immunofluorescence (IFI) and infectious virus production in plaque-forming units (PFU) per mL. The most sucesptible culture was further investigated during 96 hours post-infection (hpi) for virus growth kinects (log2 PFU/mL), cellular viability, and caspase 3 production by immunocytochemistry. Since the outcome of infection was known, cells were infected and a miRNA profiling was performed up to 48 hpi by using microarray followed by results validation by using reverse transcription and real time polymerase chain reaction (RT-qPCR). Afterwards, toll-like receptor 8 (TLR8) and interleukin 6 (IL6) were additionally assayed by immunocytochemistry. Hence, Huh7.5 cultures were learned to present the highest rates of infection with 44/2 virus strain, and revealed virus peaks at 48 and 72 hpi. Cellular viability was decreasing about 30% each day after 48 hpi. Caspase 3 production demonstrated to follow cellular viability rationale. miRNA profiling returned at least four miRNAs with relevant altered expression levels (ie., miR-3182, miR-4198, miR-21-5p e miR-146a-5p). However, only miR-21-5p and miR-146a-5p were RT-qPCR validated due their hypothetical abilities to regulate dengue immunopathology. Both miRNAs as well as IL6, and TLR8 were all found to be up-regulated within infected Huh7.5 cells. Hence, in conclusion, infected Huh7.5 cells with DENV2 were likely to undergo cell death (apoptosis) during due course of infection. This event was observed along with the raise of expression of miR-21-5p, miR-146a-5p, TLR8, and IL6. Key-words: Dengue virus; IL6; TLR8; microRNAs

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE O DENGUE

A espécie Vírus dengue (Flaviviridae: Flavivirus) é composta por quatro vírus

homônimos, vírus dengue (DENV 1-4), classicamente referidos como sorotipos, por

serem antigenicamente distintos (Calisher et al., 1989), mas geneticamente

relacionados (King et al., 2012).

São agentes infecciosos transmitidos, principalmente, por mosquitos do

gênero Aedes (p. ex., Aedes aegypti, Aedes albopictus, Aedes polynesienses), e

possui alta relevância em termos de saúde pública no mundo. Nesse sentido,

estima-se que mais de 2,5 bilhões de pessoas vivendo em áreas subtropicais e

tropicais estão suscetíveis a contrair a infecção (Halstead, 2007; Guzman et al.,

2010), tais como, países do sul e sudeste da Ásia, Caribe, América Central e do Sul

e, mais recentemente, África e leste do Mediterrânio europeu (Guzman et al., 2010;

Whitehorn & Farrar, 2010).

Nos últimos 50 anos, a prevalência da doença tem aumentado em pelo

menos 30 vezes (Ranjit & Kissoon, 2011), e somente no ano de 2001, 69 países

notificaram casos de Dengue para a Organização Mundial de Saúde (OMS), e em

2002, somente as Américas, somaram mais de um milhão de casos notificados

(Guzman et al., 2010). Esses números apresentam uma tendência a aumentar e,

atualmente, sabe-se que mais de 100 países notificam casos de infecção

(Organização Mundial de Saúde, 2009; Simmons et al., 2012).

A relação da distribuição global e o aumento no número de casos pode ser,

parcialmente, explicada pelo aumento no processo de urbanização, crescimento

populacional, migração e viagens internacionais, dificuldades de controle do vetor, e

ainda, mudanças climáticas (Whitehorn & Farrar, 2010).

Independente do sorotipo, a infecção pode ser assintomática como na maioria

dos casos, apresentar quadros febris, febre clássica do dengue (FCD), até quadros

mais graves caracterizados por coagulopatias e permeabilidade vascular, como nos

casos de febre hemorrágica do dengue (FHD). Ainda, a FHD pode progredir para o

choque hipovolêmico, levando à síndrome do choque do dengue (SCD) (Martina et

al., 2009).

17

Atualmente, a clínica da Dengue pode ser dividida em: a) casos de Dengue

com ou sem manifestações clínicas não severas; b) casos severos (Organização

Mundial de Saúde, 2009; Ranjit & Kissoon, 2011). Os casos severos de Dengue são

aqueles classificados como FHD e SCD, mas vale ressaltar que FHD não

necessariamente pode ser um quadro hemorrágico, mas sim, uma manifestação de

permeabilidade vascular aumentada que resulta na diminuição do volume plasmático

circulante e hemoconcentração.

Dessa maneira, a OMS (Ranjit & Kissoon, 2011) preconiza que manifestações

não severas relacionadas à Dengue são basicamente: dores abdominais, vômito

persistente, letargia, aumento do fígado (> 2 cm), aumento do hematócrito e

concomitante trombocitopenia. Já os casos severos, além dos sintomas acima,

também podem incluir: perda de plasma e maior aumento de hematócrito, que pode

levar ao choque, acumulação de fluídos nas cavidades serosas (pleura, peritôneo e

pericárdio), envolvimento severo de órgãos (sistema nervoso central, fígado,

coração) e elevação das transaminases (OMS, 2009).

As causas que expliquem a severidade da doença não são totalmente

esclarecidas e são alvo de discussão e pesquisa científica. Desse modo, tem-se

argumentado como principais fatores de influência: a infecção secundária por um

sorotipo diferente da infecção primária (propiciando infecção mediada por anticorpos

não neutralizantes e/ou respostas mediadas por linfócitos T com reações cruzadas e

produtores de citocinas inflamatórias), genética viral, polimorfismos gênicos (p. ex.,

JAK1), idade, estado nutricional, resposta imune (p. ex., via JAK/STAT e Interferon

tipo I, IFN I) com uma forte resposta por citocinas (Dong et al., 2007; Halstead, 2007;

Silva et al., 2010; Perry et al., 2011; Ranjit & Kissoon, 2011; Rothman, 2011).

1.1.1 Associação da estrutura genômica e a replicação viral

O genoma viral da família Flaviviridae é composto por uma molécula de ácido

ribonucleico (RNA) fita simples e polaridade positiva de aproximadamente 11 kb.

Organiza-se em duas regiões não codificantes (RNC) 5' e 3', as quais flanqueam

uma cadeia aberta de leitura (Open reading frame - ORF) (Figura 1A). Os vírus do

gênero Flavivirus ainda produzem um RNA subgenômico não codificante (~ 0,3 - 0,5

kb) derivado da 3'-RNC, e que contribui na replicação viral (King et al., 2012).

18

Figura 1 – Organização do genoma do vírus dengue (DENV). A) A cadeia aberta de leitura (ORF) é flanqueada por duas regiões 5’ e 3’ não codificantes (RNCs) as quais contêm estruturas secundárias e tamanhos diferenciados. A ORF é composta por sequências codificantes para três proteínas estruturais: capsídeo (C), pré-membrana (prM) e envelope (E), e as proteínas não estruturais (NS) quais sejam NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. As RNCs contêm estruturas semicirculares (SL - stem loops) e sequências conservadas. B) Na região 5'-RNC encontra-se o SLA formado pelo S1, S2, S3, top loop (TL) e o side-stem loop (SSL), bem como o SLB que é formado pelo 5’-UAR (Upstream UAG region), e na região codificadora de C, encontram-se uma estrutura hairpin (cHP) e a sequência de ciclização (5’-CS). C) Na 3’-RNC identifica-se a região variável (VR - representada pelas barras), as estruturas pseudoknot em forma de Y (PK1 e PK2) contendo os elementos repetidos com sequências conservadas (RCS1 e RCS2), 3’-CS (complementar a 5'-CS), 3’-DAR (a qual é complementar a 5’-DAR), e finalmente 3’-SL e 3’-UAR. Fontes: A) Gebhard et al., 2011. B) e C) Paranjape & Harris, 2010.

A)

B) C)

A)

19

As RNCs 5’ e 3' (Figura 1B e C) contêm sequências e estruturas conservadas

importantes para replicação e controle da tradução do DENV. O genoma viral pode

sofrer ciclização pelo pareamento das sequências de ciclização (CS) 5’ e 3’ - UAR

(upstream UAG region) (esquematizado na Figura 1A), e esse evento é importante

para a replicação/síntese do RNA viral (Villordo & Gamarnik, 2009; Gebhard et al.,

2010; Paranjape & Harris, 2010).

Após a entrada do DENV na célula, e consequente liberação do genoma viral

no citoplasma, é iniciada a tradução do RNA mensageiro (mRNA) viral no retículo

endoplasmático (RE). A ORF codifica uma poliproteína, a qual é clivada em

proteínas estruturais que são representadas pelas proteínas do capsídeo (C) (11

kDa), pré-membrana (prM) (8 kDa) e envelope (E) (53 kDa), bem como em proteínas

não estruturais (NS), representadas pelas NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e

NS5. Esse processo de clivagem da poliproteína viral, ocorre com o auxílio de

proteínas NS e a provável participação de proteínas das células infectadas, como

proteases no Golgi (Figura 2A) (Clyde et al., 2006; Alcaraz-Estrada et al., 2010;

Paranjape & Harris, 2010; King et al., 2012).

O processamento da poliproteína viral é atividade das proteínas NS3 (que

também apresenta atividade de helicase) e seu cofator NS2B, enquanto que a NS5

tem atividade de polimerase de RNA dependente de RNA (RdRp) e está também

envolvida no mecanismo de adição de cap nos novos RNA formados (Figura 2B). Às

proteínas NS2A, NS4A e NS4B tem sido associadas às alterações nas membranas

celulares contribuindo para a montagem das partículas virais, bem como para a

inibição da resposta por IFN (Welsch et al., 2009).

Interessante observar que por mais que a replicação do DENV seja aceita

como citoplasmática, as proteínas NS5, NS3 e E também podem ser detectadas no

núcleo celular, bem como a proteína C pode ser detectada no nucléolo, sugerindo

assim, outras funções para as proteínas E e C além de estruturais (Clyde et al.,

2006).

A proteína NS1 pode ser encontrada associada com membranas

intracelulares e na superfície celular. Essa pode ser eventualmente secretada e,

assim, circular na corrente sanguínea dos pacientes infectados. Nesse caso, tem-se

demonstrado a modulação da resposta mediada pelo sistema complemento e

aumento da infecção viral (Gutsche et al., 2011). No entanto, seu papel na

replicação viral ainda permanece por ser melhor esclarecido.

20

Figura 2 - Exemplificação de proteínas virais e celulares envolvidas nos processos de tradução e replicação do DENV. A) A clivagem da poliproteína viral ocorre por ação das proteínas não-estruturais de origem viral, NS2B e NS3, bem como proteínas celulares. Sítios de clivagem estão indicados (setas e cabeça de setas). B) Ilustração das interações das proteínas virais e celulares com a regiões 5' e 3' RNC identificadas nos mecanismos de tradução (vermelho) e síntese do RNA viral (azul). Destaca-se nesta imagem a ligação da NS5 no 5'-Stem loop A (SLA), e interações com as proteínas viral NS3 e celular, La. Já na região 3'-RNC, destaca-se a ligação da proteína ligadora de cauda poli-A (PABP). Fontes: A) King et al., 2012; B) Paranjape & Harris, 2010.

Vale notar, que a NS5 com atividade RdRp se liga a estrutura 5'-SLA, e não a

região 3' do genoma viral, como poderia ser esperado. Portanto, ressalta-se assim a

relevância do processo de circularização no mecanismo de replicação/síntese do

A)

B)

21

RNA viral, como um dos requisitos que fornecem acesso da NS5 a extremidade 3', e

assim iniciar o processo de síntese no sentido 5'-3' (Villordo & Gamarnik, 2009;

Gebhard et al., 2010).

O RNA viral possui uma estrutura cap 5’, mas a tradução também pode

ocorrer por mecanismos não canônicos independentes de cap 5' (Paranjape &

Harris, 2010). Ainda, embora que uma cauda poli-A 3’ esteja ausente (Alcaraz-

Estrada et al., 2010), Paranjape & Harris (2010) discutem que a 3'-RNC do genoma

viral possa atuar também com a função de poli-A, como sugerido pela ligação da

proteína celular ligadora de cauda poli-A (PABP) nesta RNC (Figura 2B).

A replicação do RNA ocorre pela formação de uma fita de polaridade negativa

(produzindo formas intermediárias de RNA dupla fita, - dsRNA) que, por sua vez,

funcionará como molde para formação de novas fitas de polaridade positiva, e essa

última contribuirá para novos ciclos de tradução, produção de mais fitas de

polaridade negativa, ou pode se associar às proteínas virais estruturais (Alcaraz-

Estrada et al., 2010).

As proteínas prM e E formam heterodímeros no lúmen do RE, e a proteína C

formará o nucleocapsídeo com os novos RNA formados (Rodenhuis-Zybert et al.,

2010). Assim, as proteínas estruturais são detectadas nos virions formados no RE

(“partículas virais imaturas”), mas não as NS. Esses virions são direcionados para o

complexo de Golgi, onde a protease furina clivará a proteína prM, originando a

proteína M (membrana) e o peptídeo pr (Alcaraz-Estrada et al., 2010; Welsch et al.,

2009).

Acredita-se que a proteína prM e o peptídeo pr atuam como proteínas

chaperonas capazes de estabilizar a proteína E durante o tráfego para o complexo

de Golgi, dessa forma prevenindo mudanças conformacionais indesejadas. De modo

a prosseguir a liberação de partículas virais infecciosas (“partículas virais maduras”),

ocorre a dissociação do peptídeo pr (Rodenhuis-Zybert et al., 2010).

O nucleocapsídeo viral é formado pelo RNA viral e a proteína C, os quais são

envolvidos por um envelope viral, no qual estão inseridas as proteínas M e E

(Rodenhuis-Zybert et al., 2010).

22

1.1.2 Imunopatologia do DENV e células hepáticas como modelos in vitro

Muito do que se sabe sobre a patogênese do DENV é advindo de dados

epidemiológicos e clínicos, uma vez que existe a dificuldade de se obter modelos

animais que reproduzam a Dengue como ocorre em humanos (Rothman, 2011).

Em relação aos modelos animais, tem-se considerado que primatas não

humanos podem não representar a doença como de fato ocorra em humanos, uma

vez que o ciclo selvagem e o ciclo humano são diferenciados, bem como não há

evidências de FHD em primatas naturalmente ou experimentalmente infectados

(Rothman, 2011; Vasilaskis et al., 2011). Contudo, tem sido argumentado na história

evolutiva do DENV que o ciclo selvagem (em primatas não humanos) pode ter dado

origem ao ciclo em humanos, assim como, atualmente, tem-se isolado cepas

selvagens de DENV que podem ter advindo do ciclo humano (Vasilaskis et al.,

2011).

A ineficiência de camundongos como modelo experimental, deve-se a

aparente ausência de sintomatologia semelhante a que ocorre em humanos. Isso

pode ser devido a evidência experimental que a proteína viral NS5 consegue

degradar a proteína transdutora de sinal e ativadora de transcrição (STAT) 2

humana, e assim burlar a resposta imune, mas o mesmo não ocorre em

camundongos (Ashour et al., 2010). Entende-se transdutora como fatores de

transcrição presente no citoplasma de forma inativa, mas quando ativada podem

ativar ou inativar genes.

Dessa forma, estudos experimentais em animais vêm sendo desenvolvidos

em modelos animais que suportam replicação do DENV e apresentam certo grau de

similaridade na sintomatologia. Contudo, nenhum desses modelos foi ainda validado

quanto à resposta imune, por isso, eles apresentam vantagens e desvantagens para

estudos que busquem entender a imunopatologia e/ou testes farmacológicos e

vacinais (Zompi & Harris, 2012).

A maioria dos estudos que testam hipóteses sobre a patogênese do DENV

foca, principalmente, nos casos de FHD/SCD em resposta a infecção secundária. No

entanto, Halstead (2007; 2012) ressalta também as evidências dos casos de FHD

durante a infecção primária.

Para que a infecção/replicação viral continue a ocorrer é importante que o

DENV consiga subverter a resposta imune. Nesse sentido, respostas mediadas por

23

IFN α/β/γ são detectadas em casos de FCD e FHD/SCD (Clyde et al., 2006). Ainda,

a ativação das citocinas da imunidade inata tem sido detectada pela ativação da via

Janus quinase (JAK)/STAT, e por vias dependentes e independentes de STAT-1.

Com isso, a relevância das vias com atividade antiviral tem ganhado ênfase com os

mecanismos que demonstram proteínas virais como inibidoras dessa e outras vias

(Rodenhuis-Zybert et al., 2010).

Por mecanismos a serem mais bem esclarecidos, uma forte resposta por

citocinas (principalmente na infecção secundária) pode contribuir para sintomas da

FHD e, assim, atribuir ao sistema imune uma parcela de proteção e outra de

severidade às infecções por DENV (Rothman, 2011). Altas concentrações de IFN-α

são documentadas no início do quadro febril, enquanto que durante os eventos de

permeabilidade vascular são identificadas a presença de receptor solúvel de

interleucina (IL) 2, CD4 e CD8 solúveis, IFN-γ, fator de necrose tumoral α (TNF- α),

IL-6, IL-8, dentre outras, que juntas produzem uma massiva resposta por citocinas

capaz de ocasionar sintomas severos no hospedeiro (Halstead, 2007; Rothman,

2011).

Como mencionado anteriormente, a severidade do quadro clínico na infecção

secundária da Dengue tem em parte contribuído para o aumento da infecção viral

por mecanismos envolvendo anticorpos não neutralizantes da infecção primária.

Ainda, a intensa ativação de células T pode levar a quadros de aumento da

permeabilidade vascular (capilar) e fenômenos hemorrágicos, assim como, as

células T também podem não produzir as respostas desejáveis, p. ex., como a não

destruição de monócitos infectados (Ranjit & Kissoon, 2011).

Os receptores semelhantes a Toll (Toll-like receptors, TLR), os receptores

semelhantes a imunoglobulinas, as helicases citoplasmáticas (retinoic acid-inducible

gene I, RIG-I - e gene 5 associado a diferenciação de melanoma - melanoma

differentiation-associated gene 5, MDA5) e as lecitinas tipo C (p. ex., DC-SIGN, MR

e CLEC5) são considerados como potenciais receptores reconhecedores de padrão

associados a patógenos (pattern recognition receptors, PRR) para o DENV (Chen et

al., 2008; Conceição et al., 2010; Rodenhuis-Zybert et al., 2010; Nasirudeen et al.,

2011).

Chen et al. (2008) demonstraram que o membro A do domínio de lecitina tipo

C da família 5 (C-type lectin domain family 5 member A, CLEC5A), o qual é

semelhante a um domínio de lecitina tipo C de células T Natural killer, interage com

24

o DENV. Essa interação não leva à entrada do vírus na célula, mas estimula a

produção de citocinas inflamatórias pela fosforilação da proteína ativadora de DNAX

12kDa (DNAX-activating protein, DAP12). Ainda, esses autores mostraram que

anticorpos monoclonais para CLEC5A inibem o extravasamento de plasma causado

pela infecção do DENV, bem como a hemorragia visceral e subcutânea (Chen et al.,

2008).

Outros fatores importantes na patogênese do DENV estão relacionados à

virulência da cepa infectante (Martina et al., 2009), ou seja, há genótipos dentro de

um mesmo sorotipo mais virulentos que outros, e nesse sentido tem-se observado

que os genótipos dentro dos sorotipos DENV 2 e DENV 3 estão em maior frequência

associados a casos de FHD (Rodenhuis-Zybert et al., 2011). Isso pode ser

exemplificado nos estudos de Thepparit e Smith (2004) que mostraram a infecção

dependente do sorotipo em células hepáticas, bem como, Umareddy et al. (2008)

mostraram que a resposta imune via IFN tipo I pode ser específica e dependente da

cepa viral infectante.

Outros fatores relevantes, incluindo a ativação do complemento (C3a e C5a)

pela proteína viral NS1, polimorfismos gênicos em humanos, outros fatores solúveis,

etc. podem estar diretamente relacionados com o direcionamento da doença

provocada pelo DENV (Clyde et al., 2006; Martina et al., 2009; Ranjit & Kissoon,

2011; Rodenhuis-Zybert et al., 2011).

No início do processo de infecção viral em vertebrados, mosquitos do gênero

Aedes infectados com o DENV podem infectar primariamente células de Langerhans

(células dendríticas da epiderme), as quais após serem infectadas podem migrar

para linfonodos, e a infecção pode se espalhar (viremia) para outros tipos celulares

(p. ex., monócitos e macrófagos) e tecidos do corpo humano. A viremia primária

pode, então, infectar várias células derivadas do sistema fagocítico mononuclear,

incluindo macrófagos do fígado (células de Kupfer) (Thepparit et al., 2004; Martina et

al., 2009; Rodenhuis-Zybert et al., 2010).

De acordo com Martina et al. (2009) e Trung et al. (2010), mesmo com a

existência de muitos casos de Dengue, a autópsia é realizada em poucos pacientes

devido a menor proporção de casos fatais; ocorrência de FHD/SCD em locais

remotos sem estrutura apropriada para coleta e armazenamento de amostras; bem

como, por motivos religiosos e culturais. Por conseguinte, há dificuldades na

realização de estudos sobre o tropismo viral nos tecidos e órgãos humanos.

25

A detecção do DENV em autópsias se encontra em ordem decrescente de

frequência na pele, fígado, baço, linfonodos, rins, medula espinhal, pulmões, timo e

cérebro. Vale ressaltar que nesses estudos nem sempre foi possível o isolamento da

partícula viral infecciosa (ou não foi investigado), contudo, de modo geral, partículas

virais infecciosas eram detectadas mais frequentemente em amostras de sangue

periférico e fígado (Martina et al., 2009; Trung et al., 2010).

A ausência do isolamento viral nesses órgãos constratando com a detecção

do genoma viral pode ser, em parte, explicada pela presença de degradação da

partícula viral e/ou pela presença de complexos imunes contendo anticorpos

neutralizantes (Martina et al., 2009).

A infecção ou injúria hepática pode ser sugerida não apenas pelo isolamento

viral em autópsias, mas também pelas concentrações alteradas de enzimas

hepáticas (p. ex., transaminases séricas), hepatomegalia (principalmente nos casos

de FHD) (Seneviratne et al., 2006; Trung et al., 2010), bem como em estudos

experimentais (Paes et al., 2009).

Contudo, os mecanismos patogênicos que expliquem o envolvimento hepático

na Dengue ainda permanecem por serem elucidados, incluindo a prevalência de

mecanismos de apoptose sobre a necrose in vitro e in vivo (El-Bacha et al., 2007;

Limonta et al., 2007). O sorotipo DENV 2 tem sido identificado como principal agente

de lesões hepáticas em humanos e em modelo animal (Váquez-Pichardo et al.,

2006).

Alterações histológicas no fígado infectado pelo DENV incluem esteatose

microvesicular, necrose hepatocelular, destruição e hiperplasia de células de Kupfer

e corpos de Coulciman (Seneviratne et al., 2006).

Na infecção pelo Vírus da febre amarela (Yellow fever virus – YFV – família

Flaviviridae, gênero Flavivirus), o fígado é um órgão alvo da infecção e resulta na

diminuição da função hepática, o que pode levar à diminuição da síntese de fatores

de coagulação (Martina et al., 2009).

A patologia hepática ocasionada pelo DENV é semelhante àquelas

ocasionadas nas fases iniciais da infecção pelo YFV, no entanto, a infecção pelo

YFV pode acarretar maiores danos (Seneviratne et al., 2006). A infecção do cultivo

celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 mostra que o DENV produz

baixos títulos virais em comparação ao YFV, concomitante com a marcação da

imunofluorescência de antígenos do DENV em focos perinucleares, enquanto que os

26

antígenos de YFV se encontram distribuídos pelo citoplasma (Marianneau et al.,

1998; Seneviratne et al., 2006).

Por outro lado, a replicação do DENV em cultivo HepG2 pode ser aumentada

quando as células se encontram em fase G2 do ciclo celular, o que leva à hipótese

de que a fisiologia celular possui considerável influência na eficiência da infecção

viral e aumento da produção de partículas infecciosas virais (Phoocharoen & Smith,

2004).

An et al. (1999) desenvolveram um modelo animal, utilizando camundongos,

para o estudo do DENV, no qual várias similaridades com os casos humanos foram

encontradas, incluindo sinais hemorrágicos no fígado, trombocitopenia, aumento do

hematócrito, de ureia e TNF-α, observados, principalmente, naqueles camundongos

que sofreram paralisia. Esse modelo foi desenvolvido em camundongos

imunodeficientes nos quais foram transplantadas células HepG2, as quais se

agregaram, principalmente, no fígado. Por conseguinte, alto título viral foi detectado

nos fígados dos animais nas fases iniciais da doença.

As células HepG2 tem sido dessa maneira bastante utilizadas para estudos

experimentais sobre o DENV, incluindo estudos sobre secretoma (Higa et al., 2008),

proteômica (Pattanakitsakul et al., 2007), internalização e propagação viral por

sorotipos específicos (Thepparit et al., 2004; Thepparit & Smith, 2004) e expressão

de genes envolvidos na imunidade inata (Conceição et al., 2010), dentre outros.

1.2 MICRORNAS

O mecanismo do RNA de interferência (RNAi) foi descrito como mecanismo

de silenciamento gênico iniciado por dsRNA exógeno com sequências homólogas a

um gene alvo. Posteriormente, o termo tem sido utilizado para designar de forma

mais ampla a inibição da expressão gênica por pequenos RNAs (Vilgelm et al.,

2006).

Dentre as várias populações de pequenos RNAs com funções regulatórias,

em mamíferos podem ser encontrados microRNA (miR/miRNA), piRNA (na linhagem

germinativa) e, mais recentemente, endo-siRNA (derivados de transposons). Além

dessas, outras classes podem ser encontradas em outros seres vivos, tais como,

siRNA, casiRNA, tasiRNA, natsiRNA (Ghildiyal & Zamore, 2009). Em relação aos

miRNAs em mamíferos, ainda se pode dizer que várias novas classes estão sendo

27

descobertas, mas que fogem da via de biogênese canônica (mecanismo clássico de

biogênese), e estão sendo considerados como pequenos RNAs semelhantes a

miRNAs (miRs-like small RNAs), como visto a seguir.

Filipowicz et al. (2008) e Winter et al. (2009) fornecem excelentes revisões

sobre os mecanismos de biogênese dos miRNAs (Figura 3). Em suma, os

precursores dos miRNAs são transcritos pelas RNA polimerases II e III a partir de

sequências presentes em “genes” de miRNAs ou regiões de íntrons. A RNA

polimerase II gera pri-miRNA com cauda poli-A e cap, um precursor que apresenta

estruturas em forma de grampo (hairpin) ou haste-alça (stem loop). A expressão de

determinados miRNAs depende de fatores transcrionais (p. ex., c-Myc ou p53), ou

depende da metilação de suas respectivas sequências promotoras.

Esses transcritos primários de pri-miRNAs podem ser editados por

desaminases de adenosina atuantes em RNA (ADARs), modificando a adenosina

(A) em inosina (I), e isto pode ter implicações nas características da sequência,

pareamento de bases e estrutura (Winter et al., 2009).

A proteína nuclear Drosha é uma enzima RNAse tipo III e forma um complexo

com a proteína DGCR8 (DiGeorge critical region 8) que cliva os pri-miRNAs em pre-

miRNAs. A DGCR8 interage com o pri-miRNA e determina o sítio de clivagem 5’ e 3’

a ser processado pela Drosha. A clivagem por Drosha precede o mecanismo de

splicing de RNAs codificadores e não codificadores de proteínas (Winter et al.,

2009).

Os pre-miRNAs possuem um fosfato em sua extremidade 5’ e 2-3

nucleotídeos (nt) protundentes na extremidade 3’ (Lee et al., 2003). O pre-miRNA é

transportado de forma ativa do núcleo para o citoplasma pelo complexo Ran-

GTP/Exportina-5 (Lund et al., 2004; Yi et al., 2003). A extremidade 3’ é processada

no citoplasma pela enzima RNase tipo III, Dicer (Hutvagner & Zamore, 2002; Ketting

et al., 2001).

Inicialmente, ocorre o reconhecimento da região de fita dupla do pre-miRNA,

provavelmente, por afinidade da enzima com o fosfato 5’ e os 2-3 nt protundentes na

extremidade 3’. Em seguida, ocorre a clivagem, liberando um miRNA de fita dupla

com aproximadamente 19-25 pares de bases, contendo fosfatos nas extremidades

5’ e dois nt protundentes nas extremidades 3’ (Hutvagner & Zamore, 2002). De

acordo com esse modelo, a especificidade da primeira clivagem determina a posição

28

correta da segunda clivagem do pre-miRNA, definindo assim ambas as

extremidades do miRNA (Lee et al., 2003).

Figura 3 – Representação esquemática da via de biogênese dos microRNAs. i) A via canônica de biogênese dos miRNAs é aquela contendo transcrição mediada pela RNA polimerase II que origina microRNAs primários (pri-miRNA), os quais serão clivados pelo complexo Drosha/DGCR8 em pre-miRNA. ii) Uma vez no citoplasma, os pre-miRNA são clivados pelo complexo Dicer/TRBP em duplex de miRNA de 19-25 nucleotídeos. iii) Essa fita dupla de miRNA se separa e a fita líder guia o complexo de silenciamento (RISC) para o silenciamento gênico, por meio da inibição da tradução ou clivagem do RNA mensageiro (mRNA) alvo. Alternativamente, dentre as vias não canônicas, sem que haja participação do complexo Drosha/DGCR8, os pre-miRNA podem ser gerados: iv) a partir de pequenos RNA nucleolares (snoRNA), mirtrons; v) produtos da RNA polimerase III, tais como do reenovelamento (redesdobramento – refolding) de RNA transportador (tRNA), e ainda da clivagem pela tRNAse Z de pri-miRNA contendo estruturas semelhantes a tRNA.Fonte: Skalsky & Cullen, 2010.

Núcleo

Citoplasma

29

O complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) consiste basicamente

do miRNA (que passa a ser fita simples) que guia o RISC ao pareamento com o

mRNA alvo e a presença de uma das quatro proteínas argonautas (Ago 1-4).

Contudo, somente a Ago 2 tem atividade de enodonuclease e, assim, possui a

habilidade de clivar mRNA pareados, causando a degradação do mRNA alvo

(Skalsky & Cullen, 2010).

Novos mecanismos de ação dos miRNAs estão sendo, atualmente,

estudados, contudo, os mais bem esclarecidos e comumente observados até o

presente podem ser os seguintes: repressão da tradução ou degradação do mRNA

alvo. O primeiro modo é mais comum em mamíferos, e o último em plantas. No

entanto, recentemente, sabe-se que o inverso também pode ocorrer (Huntzinger &

Izaurralde, 2011). A diferença básica em ambos os mecanismos pode estar

associada à diferença de complementariedade miRNA:mRNA-alvo (Scaria et al.,

2006; Vilgelm et al., 2006). Complementariedade perfeita ou quase perfeita é

encontrada em plantas, e uma pequena classe de miRNAs de eucariotos que

causam clivagem e degradação do alvo, de forma análoga à ação dos siRNAs, os

quais possuem complementariedade perfeita aos mRNA alvos (Huntzinger &

Izaurralde, 2011).

Em adição, evidências sugerem que miRNAs ligados aos transcritos são

sequestrados pelos corpos de processamento (Processing bodies – P bodies), onde

eles são mantidos em estado de silenciamento tanto pelas proteínas associadas que

previnem a tradução ou, possivelmente, pela remoção da estrutura cap (Scaria et al.,

2006).

Alternativamente ao mecanismo canônico de biogênese dos miRNAs, como

comentado anteriormente, existem moléculas de RNAi semelhantes a miRNAs que

podem ser geradas a partir de vias não canônicas. As fontes de miRNAs alternativos

a essa via podem ser derivados de uma variadade de RNAs celulares não

codificantes, tais como, RNA transportador (tRNA), pequenos RNAs nucleolares

(snoRNAs), RNAs vault, RNA Y, pequenos RNAs nucleares (snRNAs), entre outros

(Langenberger et al., 2012).

A nível de tentativa de classificação, pode-se então dividir os miRNAs

advindos da via canônica e os das vias não canônicas. As vias não canônicas

seriam: a) vias independentes da clivagem por Drosha, por exemplo, mirtrons

(derivados de íntrons que diretamente se enovelam em estruturas pre-miRNA),

30

snoRNAs, shRNAs, derivados de transcritos pré-tRNA, estruturas semelhantes a

tRNA produzidos pela RNA polimerase III e clivados por tRNAse-Z e endo-siRNAs;

b) vias independentes da clivagem por Dicer, por exemplo, pre-miRNAs clivados

diretamente por Ago 2, bem como, pré-tRNAs clivados por RNAse P, seguido da

clivagem por tRNAse-Z (Miyoshi et al., 2010).

Em invertebrados, a via do RNAi (especificamente, siRNA) é considerada

evolutivamente antiviral. Por exemplo, a alta sensibilidade dos cultivos de Aedes

albopictus clone C6/36 à infecção pelo DENV é possível em parte pelo fato de que

esses cultivos celulares apresentam ineficiente clivagem de longos dsRNA mediada

pela Dicer 2, denotando uma ausência de uma resposta completamente funcional

por mecanismo de RNAi (Brackney et al., 2010; Scott et al., 2010).

Já em vertebrados, esses não possuem a via do siRNA, com exceção dos

recém-descobertos, endo-siRNAs derivados de transposons (Ghildiyal & Zamore,

2009). Portanto, restando os miRNAs, os mesmos tem sido observados na

participação das várias vias metabólicas envolvidas no controle do desenvolvimento

celular, homeostase e respostas em vias altamente especificas. Pode-se

exemplificar o exposto em relação ao sistema imune, com o possível envolvimento

de miRNAs no controle da sensibilidade de células T aos sinais do receptor de célula

T, bem como no fato de que a deleção da proteína Ago 2 afeta o desenvolvimento

de células B (Xiao & Rajewsky, 2009).

A expressão de miRNAs celulares é profundamente influenciada pela infecção

viral, a qual pode ser atribuída tanto às defesas antivirais do hospedeiro, quanto

fatores virais que podem alterar o ambiente celular. MiR-155 e miR-146a são

miRNAs celulares que podem ser expressos quando há infecção pelo Vírus Epstein-

Barr (EBV), bem como por lipopolissacarídeos bacterianos, e ambos participam da

modulação da resposta imune (Skalsky & Cullen, 2010).

Assim, embora não possuam características evolutivas antivirais, os miRNAs

ainda assim podem também atuar de tal maneira, ou ainda como favorecedores da

replicação viral. Em suporte, evidências tem mostrado a expressão de miRNAs

relacionadas à estimulação do IFN tipo I (Skalsky & Cullen, 2010). É possível que

alguns vírus de RNA explorem o mecanismo dos miRNAs celulares de modo a

impedirem que os RNAs virais sejam alvos no momento da tradução, para que a

síntese do RNA viral e a montagem da partícula viral possam ocorrer (Skalsky &

Cullen, 2010), bem como, para modular a resposta imune.

31

Xiao & Rajewsky (2009) discutem que miRNAs celulares, além de seus

papéis regulatórios fisiológicos, podem participar de uma defesa antiviral [p.ex., miR-

32 detém a acumulação do vírus espumoso de primatas tipo 1 (FPV-1) em células

humanas por direta inibição do genoma do FPV-1 e, assim, causando inibição da

tradução].

Outra evidência disso está no achado que a infecção de macrófagos pelo

Vírus da estomatite vesicular (VSV) ocasiona a superexpressão do miR-155, o qual

promoveu um papel antiviral pela ativação da via do IFN I pela inibição do supressor

de sinalização de citocinas tipo I (SOCSI) (Wang, P. et al., 2010).

Os vírus ainda podem tomar vantagem dos miRNA do hospedeiro como no

caso do miRNA específico do fígado, miR-122, o qual interage com sequências da

5’-RNC do RNA do Vírus da hepatite C (HCV), e essa interação é necessária para

replicação viral e mantém alta abundância de RNA viral nas células hepáticas, o que

além de tudo, contribui para a seletividade do HCV para o tecido hepático (Xiao &

Rajewsky, 2009).

Em suporte ao papel dos miRNAs na regulação da resposta imune, tem-se

discutido e observado isso na regulação dos TLRs (O'Neill et al., 2011), na

modulação de IFN, inflamação e outras respostas imunes (Gantier et al., 2007;

Contreras & Rao, 2011), incluindo a regulação de resposta por RIG-I (Hou et al.,

2011).

Embora não seja objetivo deste estudo, vale mencionar que Parameswaran et

al. (2010), utilizando técnicas de sequenciamento de última geração, encontraram

pequenos RNAs derivados do genoma viral (vsRNA) de seis vírus de RNA, incluindo

o DENV. Contudo, estes vsRNAs ainda remanescem a serem identificados como

funcionais a nível de regulação gênica, atuando assim semelhante a miRNA/siRNA.

Nesse estudo, o DENV apresentou a menor incidência de vsRNAs, e dentre os

cultivos celulares testados, essa incidência só foi detectada em células de hepatoma

humano Huh7 24 horas pós-infecção (hpi). Ainda nessas mesmas células, foi

identificado um aumento na regulação de miRNA de origem celular, tais como miR-

107 e miR-193, e diminuição na regulação dos miRNA celulares miR-17-5p, miR-

148a e miR-23a (Parameswaran et al. 2010).

Pelo fato dos miRNAs celulares estarem envolvidos na modulação da

expressão gênica, incluindo, na resposta imune às infecções virais, além do fato de

serem considerados como potenciais biomarcadores e/ou alvos terapêuticos em

32

diversas doenças, o presente estudo visou averiguar uma possível associação

desses miRNAs na infecção/replicação do DENV. O cárater de biomarcador dos

miRNAs está também relacionado à capacidade desses se tornarem circulantes nos

fluídos córporeos (p. ex., plasma, soro, urina, etc.) (Vickers et al., 2011; Boon &

Vickers et al., 2013), o que no caso do DENV, seria de interesse pesquisar

biomarcadores relacionados com a severidade da doença.

Tendo em vista o exposto, o presente estudo visou buscar um modelo

experimental in vitro de cultivo celular de origem humana (HepG2 e/ou Huh7.5) que

apresentasse alta suscetibilidade à infecção/replicação do DENV para estudos de

miRNAs celulares, possivelmente, relacionados aos casos severos da doença. Com

isso, procurou-se contribuir para o entendimento das respostas imunes celulares,

bem como na pesquisa de potenciais biomarcadores e/ou alvos terapêuticos.

Por fim, para estudos futuros, os cultivos celulares poderão auxiliar como

modelos in vitro para se entender os mecanismos básicos da doença, uma vez que

seja confirmada a relevância dos achados deste estudo em amostras de pacientes

naturalmente infectados com o DENV.

33

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo geral

Contribuir para a compreensão das respostas imunológicas envolvidas na

infecção pelo DENV mediante a pesquisa de microRNAs celulares como potenciais

biomarcadores e/ou alvos terapêuticos.

1.3.2 Objetivos específicos

a) Avaliar um sistema in vitro em cultivos celulares humanos (HepG2 e

Huh7.5) com elevada suscetibilidade à infecção pelo DENV;

b) Identificar o fenótipo causado pela infecção do DENV no sistema in vitro

mais suscetível;

c) Caracterizar perfis de miRNAs, de modo a averiguar os miRNAs

diferencialmente expressos e potencialmente envolvidos nas respostas à

infecção/replicação viral;

d) Analisar os miRNAs quanto a possibilidade de regulação de vias

metabólicas celulares, com destaque às vias de resposta imune celular, e dessa

forma avaliar o potencial de se tornarem biomarcadores e/ou alvos terapêuticos em

pacientes naturalmente acometidos pelo DENV.

34

3 MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo não visou a utilização de animais e/ou humanos e/ou meio

ambiente como objetos direto de pesquisa. Além disso, foi autorizada a utilização

das amostras virais já previamente isoladas em cultivos celulares pertencentes ao

Instituto Evandro Chagas (IEC), Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas

Virais (SAARB/IEC) (Anexo 1).

Todos os procedimentos foram desenvolvidos observando-se as normas e os

critérios pré-estabelecidos e exigidos pelo Comitê Internacional de Biossegurança.

Os que envolveram manipulação direta dos vírus foram realizados em cabines de

biossegurança classe II (B2) e os que utilizaram substâncias tóxicas, em capelas de

exaustão.

Vale mencionar que em alguns dos tópicos a seguir, utilizar-se-á a abreviatura

D-PBS, a qual significa solução salina tamponada fosfatada de Dulbecco (Dulbecco

& Vogt, 1953) incompleta, isto é, sem adição de Ca2+ e Mg2+.

Para a preparação do D-PBS foram utilizados NaCl (8,0 g), KCl (0,2 g),

Na2HPO4 (1,15 g), KH2PO4 (0,2 g) diluídos em 1000 mL de água deionizada

(Millipore, EUA).

3.1 CULTIVOS CELULARES DE CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO (HEPG2 E HUH7.5)

O cultivo epitelial HepG2 (ATCC:HB-8065; BCRJ:0103) foi cedido pela Dra.

Andrea Thompson Da Poian (Instituto de Bioquímica Médica - Universidade Federal

do Rio de Janeiro). Esse cultivo é considerado nível de biossegurança 1 e foi

derivado de uma biópsia retirada de um adolescente caucasiano argentino de 15

anos de idade, bem como foram identificados 55 cromossomos, sendo o

cromossomo 1 rearranjado (Knowles & Aden, 1983).

O cultivo epitelial Huh7.5 foi gentilmente fornecido pela Dra. Claúdia Nunes

Duarte dos Santos (Instituto Carlos Chagas - Fundação Osvaldo Cruz - Curitiba,

Paraná). Esse cultivo foi derivado do original Huh7 para pesquisa de sistemas mais

permissivos à replicação do HCV (Blight et al., 2002).

35

Assim, ambos os cultivos foram utilizados em paralelo para determinação da

suscetibilidade dos mesmos à infecção pelo DENV, analisados de acordo com os

títulos virais produzidos nos sobrenadantes.

3.2 AMOSTRA VIRAL

Neste estudo utilizou-se a cepa viral 44/2 do sorotipo DENV2, isolada de um

caso febril de Dengue em Vitória, Espírito Santo. Essa foi gentilmente cedida pelo

Dr. Ricardo Galler (Fiocruz, RJ), na forma tipo selvagem (wild-type), isto é, após a

purificação pelo método de placas da cepa viral em cultivo celular de rim de macaco

verde africano Cercopithecus aethiops (VERO), com a seleção do clone (placa) 44/2

(Freire et al., 2007). Essa é representante do genótipo III (Jamaica) de acordo com a

classificação proposta por Rico-Hesse (1990), considerada assim, pertencente ao

genótipo americano com proximidade filogenética ao asiático (Miagostovich et al.,

2003; Freire et al., 2007).

3.3 PASSAGENS E ESTOQUE VIRAL EM CULTIVOS DE AEDES ALBOPICTUS CLONE C6/36 E VERO (ATCC: CCL-81)

O cultivo celular de Aedes albopictus clone C6/36 foi propagado em meio

Leibowitz (L-15 – Invitrogen, EUA) com adição de triptose fosfato a 2,95% (Himedia,

Índia), solução de aminoácidos não essenciais (fórmula do Dr. Moacir Rebello –

Baktron microbiologia, Brasil), 2,2 g/L de bicarbonato de sódio (Sigma, EUA), bem

como uma formulação de dois antibióticos (Sigma, EUA) sendo penicilina (100

UI/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). O meio de crescimento contém 5% de soro

bovino fetal (Sigma, EUA), SBF, e o de manutenção 2%.

A subcultura foi realizada como indicado no sítio eletrônico do ATCC

(American type culture collection, 2012), e distribuídas em novas garrafas de cultivo

celular numa divisão (split ratio) de 1:4 até 1:10.

A técnica de passagem celular (subcultura) para células VERO foi adaptada

dos procedimentos padrões (Freshney, 2010) para cultivos de vertebrados.

Para tal, foi utilizado o meio 199 (Gibco, EUA) acrescido de Hepes (Sigma,

EUA) a 10 mM e 1 g/L de bicarbonato de sódio. As concentrações finais de

antibióticos e SBF para o meio de crescimento e manutenção são semelhantes às

mencionadas anteriormente.

36

Em suma, o meio de cultura foi retirado, e a monocamada de células VERO

(ATCC: CCL-81) foi lavada três vezes com D-PBS. Adicionou-se, então, uma

solução contendo 0,25 % de tripsina (DIFCO, EUA)/0,02% EDTA (Invitrogen, EUA)

pré-aquecida a 37 °C num volume de 0,5mL/25cm2. Após cobrir toda a monocamada

de células, essas ficaram em repouso por 30 segundos, quando logo após, 80% da

tripsina foi removida, e as células foram incubadas em estufa 37 °C por 2 minutos,

de modo a permitir o desprendimento mais individual possível das células na

monocamada.

Imediatamente, seguiu-se à inativação da tripsina com meio de crescimento

utilizando-se um volume de pelo menos duas vezes ao de tripsina adicionado.

Prosseguiu-se à centrifugação a 800 rotações por minuto (RPM) por 5-7 minutos a 4

°C. O sobrenadante foi desprezado, e o precipitado de células foi ressuspendido em

3-6 mL de meio de crescimento.

Novas garrafas de cultivo celular foram mantidas numa divisão de 1:3 a 1:6

(American type culture collection, 2012) para preparo de estoque de células, ou

foram contadas em câmara de Neubauer (Louis & Siegel, 2011) quando foram

utilizadas para titulação do estoque viral.

A cepa viral 44/2, no laboratório do IEC, foi usada para infecção por duas

passagens em C6/36, seguida de mais duas passagens para estoque viral em

células VERO. Para passagens e estoque viral, o inóculo viral foi utilizado em uma

multiplicidade de infecção (moi) de 0,01 ou 0,1. Após 4-6 dias pós inoculação (dpi),

os sobrenadantes foram centrifugados a 2.000 RPM a 4 °C e aliquotados para

posterior titulação viral. O título do estoque viral atingido e utilizado neste estudo foi

de 7,2 x 107 unidades formadoras de placas por mL (PFU/mL).

Para o cálculo do volume do estoque viral (Vv) titulado necessário a ser

utilizado na infecção para se obter o desejado moi, foi utilizada a seguinte fórmula:

Vv (mL) = MOI x número de total de células a serem infectadas

Título viral (PFU/mL)

37

3.4 TITULAÇÃO VIRAL EM CÉLULAS VERO (ATCC: CCL-81)

Para titulação viral, monocamadas de células VERO foram plaqueadas com

3x105, 2x105 ou 105 células/mL de modo a formar confluência das monocamadas em

um, dois ou três dias pós-passagem, respectivamente. Para isso, foram utilizadas

placas de poliestireno (TPP, Suíça) de 24 poços com 1 mL de meio de crescimento

contendo a densidade de células desejada.

A titulação biológica da cepa do estudo foi padronizada como uma adaptação

da técnica descrita por Malewicz e Jenkin (1979), os quais utilizaram um meio semi-

sólido (overlay) sem SBF.

Após a formação da monocamada de células VERO foi retirado todo o meio

de crescimento das placas de 24 poços, seguido de uma lavagem das

monocamadas com meio 199 (contendo 1g/L de bicarbonato de sódio, 10 mM de

hepes e 0,4% SBF). Foram preparadas diluições de 10-1 a 10-5 dos inóculos virais

provenientes dos estoques virais em meio 199 contendo a mesma formulação do

meio descrito para lavagem.

Foi realizada a inoculação de 0,1 mL de cada diluição em seus respectivos

poços, e no controle negativo foi adicionado apenas o meio de cultura sem inóculo

viral. Logo após, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C com 5 % de CO2 por

uma hora, com agitação a cada 15 minutos para auxiliar na adsorção viral.

Finalmente, o inóculo viral foi removido, as monocamadas foram lavadas para

posterior adição de 1 mL do meio overlay. O meio overlay consiste em meio 199 1X

(contendo 1g/L de bicarbonato de sódio e hepes a 10 mM) e carboximetilcelulose

(CMC) de média viscosidade (Sigma, EUA) na concentração final de 1,6%. Após

isso, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C com 5 % de CO2 por sete dias.

Após o período de incubação, as placas foram fixadas em formol a 10 % e

coradas com cristal violeta a 0,1 %. O título viral foi determinado em PFU/mL.

As placas foram contadas na primeira diluição que se observaram placas

individualizadas. Por conseguinte, os números de placas foram multiplicados pelos

seus respectivos fatores de diluição, e divididos pelo volume em mL utilizado como

inóculo, como apresentado na fórmula a seguir:

Título viral (PFU/mL) = Média de placas x fator de diluição

Volume do inóculo (mL)

38

3.5 SUBCULTURA, INFECÇÃO E SELEÇÃO DO MODELO IN VITRO

Os procedimentos para subcultura e infecção paras os cultivos HepG2 e

Huh7.5 foram semelhantes. O meio de cultura consistiu de meio essencial de Eagle

modificado por Dulbecco (DMEM - Sigma, EUA), acrescidos de 1,5 g/L de

bicarbonato de sódio, 10 mM Hepes, 2 mM L-glutamina (Sigma, EUA), pH 7,2. O

meio de crescimento continha 10 % de SBF e o de manutenção, 2 %.

A subcultura dos cultivos foi realizada quando a confluência da monocamada

era de 70-80 %. O procedimento foi semelhante ao descrito para células VERO, com

pequenas modificações: o tempo de contato da monocamada com a tripsina foi de

30 a 60 segundos. Com a posterior retirada de 80 % da tripsina, as garrafas foram

levadas para estufa 37 °C e incubadas por 2-5 minutos, e após isso, seguiu-se como

descrito anteriormente.

As células plaqueadas foram incubadas em meio de crescimento por menos

de 24 horas. Após isso, células extras (que não participaram dos experimentos)

foram tripsinizadas e o número total de células foi verificado, para se seguir à

infecção como descrito a seguir.

O meio de crescimento foi removido, e as monocamadas foram lavadas duas

vezes com D-PBS, e inoculadas com moi 1. Para isso, as amostras virais foram

diluídas em meio DMEM semelhante ao de manutenção, porém sem SBF,

padronizando-se o volume final para 3 ou 0,1 mL, se plaqueadas em garrafas de 25

cm2 ou lâminas Lab-tek® (Nunc, EUA) (ou quando mencionado sistema diferente)

com quatro poços, respectivamente. Nos controles negativos (cultivos não

infectados) foram adicionados 3 ou 0,1 mL somente de meio. As garrafas ou lâminas

foram incubadas por 2 horas em estufa 37 °C a 5 % de CO2 e regularmente

agitadas.

Após a adsorção viral, os inóculos virais foram removidos e as monocamadas

foram lavadas uma a duas vezes com D-PBS. Foi, então, adicionado 7 ou 1 mL de

meio de manutenção, respectivamente. Seguiu-se, então, a incubação em estufa 37

°C a 5 % de CO2. por 24 e 48 horas.

Verificou-se por titulação em placa e imunofluorescência indireta qual o cultivo

mais suscetível à cepa viral 44/2 após 24 hpi. Baseado nesses dados, o modelo de

infecção in vitro escolhido foi submetido a experimentos de perfil de miRNAs nos

intervalos de 24 e 48 hpi. De modo a verificar qual o resultado da infecção viral no

39

cultivo modelo, realizou-se ensaios de viabilidade celular, curva do título viral e

imunocitoquímica em 24, 48, 72 e 96 hpi (descritos a seguir). Adicionalmente, e para

motivos de uma comparação da população global de miRNAs, o cultivo menos

suscetível também foi submetido ao perfil de miRNAs somente com 24 hpi.

3.5.1 Imunofluorescência indireta

A técnica de imunofluorescência indireta (IFI) foi utilizada de modo a

determinar o modelo mais suscetível à infecção, juntamente com a titulação por

placa (descrito anteriormente), em 24 hpi. Em adição, a técnica também foi realizada

até 48 hpi somente com o modelo escolhido.

Um total de 105 de células foi plaqueado em lâminas Lab-tek® com quatro

poços e infectadas com moi 1, como descrito. Após os períodos de incubações

discriminados, as células foram lavadas com D-PBS, e fixadas com parafomaldeído

a 4 % por 30-60 minutos a 4-8 °C. Em seguida, foram lavadas com D-PBS e tratadas

com cloreto de amônio 50 mM por 30 minutos à temperatura ambiente (TA).

Após procedimento de lavagens, as células foram permeabilizadas com Triton

X-100 (Sigma, EUA) 0,5% por 4 minutos. Logo após, as lâminas foram incubadas

com solução PBS acrescida de Tween 20 0,2 % (Sigma, EUA) e albumina bovina

(BSA) 1 % (Bioworld, EUA) e incubadas por 25 minutos à TA.

O anticorpo primário monoclonal específico para DENV2 foi adquirido da

Fundação Osvaldo Cruz (Biomanguinhos, Rio de Janeiro), derivado do hibridoma

3H5-1 (Henchal et al., 1982). Esse foi utilizado com uma diluição 1:800 e incubado

por 12-16 horas a 4-8 °C com as amostras. Após isso, as lâminas foram lavadas

com a mesma solução PBS descrita acima, para prosseguir com a incubação com

anticorpo secundário anticamundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína

(FITC) (Cappel, EUA) na diluição 1:800. Juntamente a esse anticorpo, e para

marcação de DNA no núcleo celular, foram adicionados 2 µL de iodeto de propídeo

a 100 µg/mL (Invitrogen, EUA) diluído em tampão contendo 50 mM hepes, 700 mM

NaCl, 12,5 mM CaCl2, pH 7,4. Prosseguiu-se a incubação a 37 °C em câmara úmida

por 60 minutos.

As lâminas foram extensivamente lavadas inicialmente com PBS contendo

Tween 20 0,2 % e BSA 1 %, seguida da lavagem somente com D-PBS pH 7,4 e,

40

após, água destilada. As lâminas secas foram montadas com glicerina e observadas

em microscópio de fluorescência (Zeiss) com epi-iluminação.

3.5.2 Curva da cinética viral

Para comparar o título viral em 24 hpi nos cultivos Huh7.5 e HepG2, 106 de

células foram infectadas e os sobrenadantes utilizados para titulação.

A curva da cinética viral foi realizada no cultivo mais suscetível. Nesse caso,

as células foram plaqueadas e infectadas como descrito. Esse experimento foi

realizado em 24, 48, 72 e 96 hpi, nos quais os sobrenadantes foram coletados,

centrifugados a 2.000 RPM a 4 °C, alíquotados e estocados em freezers a - 70 °C,

para posterior titulação viral pelo método de ensaio de placas. Em adição, as células

foram observadas nesses intervalos de tempo objetivando a pesquisa de provável

efeito citopático (ECP) em microscópio ótico invertido (Zeiss).

Foram realizados experimentos em duplicatas. Além disso, as monocamadas

foram fixadas com paraformaldeído 4 % como anteriormente, e utilizadas para

ensaios de imunocitoquímica.

3.5.3 Imunocitoquímica

A técnica de imunocitoquímica foi utilizada de modo a contribuir na

caracterização fenótipica dos cultivos infectados. Para isso, foram pesquisadas a

produção de caspase 3 (para detecção de apoptose), IL6 e TLR8.

Após a fixação, as células foram incubadas com PBS contendo Triton X 100

0,5 % por 4 minutos. Após isso, foram incubadas com PBS contendo BSA 1 % por

30 minutos à TA. Novamente foram lavadas em PBS, de modo a prosseguir com a

incubação por 12-16 horas com os anticorpos primários (Abcam, EUA) anti-IL6

(1:100), anti-caspase 3 (1:250), e anti-TLR-8 (1:150).

Após esse período, as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas com

anticorpo secundário ligado a biotina por 30 minutos a 37 °C. Prosseguiu-se com

lavagens em PBS e incubação com estreptavidina (Dako, EUA) por 30 minutos a 37

°C. Por fim, após lavagens das lâminas com PBS, o sistema foi revelado em solução

substrato (DAB) (Dako, EUA) aproximadamente por 40 segundos a 1 minuto,

sucedendo-o com lavagens em água destilada e montagens da lâminas com glicerol.

41

3.5.4 Viabilidade celular pelo ensaio do MTT - brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio)

Objetivando-se comparar com as análises qualitativas das pesquisas de ECP

e detecção de apoptose (caspase 3) por imunocitoquímica, realizou-se o ensaio

quantitativo do MTT - brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio para

verificação da viabilidade/citotoxicidade celular.

Essa técnica se baseia no processo de redução da molécula do MTT de um

composto amarelado para cristais escuros de cor púrpura de formazano (Kupcsik,

2011), por ação da atividade metabólica de desidrogenases associadas ao NADPH

e ao NADH. Esses cristais foram dissolvidos em solvente orgânico, dimetilsufóxido

(DMSO), e a leitura foi realizada por métodos espectrofotométricos (p. ex., leitores

de placa de ELISA). A absorbância é proporcional ao número de células viáveis.

Para realização do método, 104 de células por poço cresceram por menos de

24 horas em placas de ELISA de 96 poços e foram infectadas como descrito

anteriormente. Os experimentos foram realizados pelo menos em triplicata, em dois

experimentos independentes, contendo controles negativos de células não

infectadas, bem como poços "branco" contendo os reagentes utilizados, mas com

ausência de células, os quais foram utilizados no processo de normalização dos

dados. O protocolo adotado foi aquele descrito de acordo com as instruções do

fabricante do Vybrant® MTT Cell Proliferation Assay kit (Invitrogen, EUA). Os

experimentos foram realizados em 24, 48, 72 e 96 hpi.

Vale ressaltar que para este ensaio foi utilizado um meio DMEM sem

vermelho de fenol (Invitrogen, EUA), como recomendado.

3.6 EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL E CONTROLE DE QUALIDADE

Para experimentos de perfil de miRNAs, 106 células foram plaqueadas em

garrafas de 25 cm2 e infectadas como descrito anteriormente. Após a incubação por

24 e 48 hpi, o meio de manutenção foi retirado e a monocamada de células foi

lavada 2-3 vezes com D-PBS. O tampão de lise foi então diretamente aplicado à

monocamada de células, seguindo o protocolo de extração de RNA total como

recomendado pelo fabricante do mirCury™ RNA Isolation kit - Cell & Plant (Exiqon,

Dinamarca).

42

Com a obtenção do RNA total extraído, seguiu-se as análises de controle de

qualidade. Nesse sentido, a determinação dos valores de integridade do RNA (RNA

integrity number - RIN) tem sido descrita como uma dos melhores técnicas atuais

para se avaliar a qualidade do RNA para experimentos que envolvam microarray e o

método da transcrição reversa seguido da reação em cadeia mediada pela

polimerase em tempo real (RT-qPCR) (Nolan et al., 2006), dentre outros. Os valores

de RIN variam de 1 a 10, onde 1 representa amostras de RNA com alta taxa de

degradação, enquanto que 10 representa amostras íntegras (Schroeder et al., 2006).

Para estudos com miRNA, é recomendável se utilizar amostras de RNA total com

excelente qualidade, isto é, com valores de RIN maior ou igual a 7 (Mraz et al.,

2009). Assim sendo, esse foi o padrão adotado neste estudo.

O método de determinação do RIN foi aquele descrito nos métodos de

eletroforese microcapilar do equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer em conjunto com

os kits RNA 6000 Nano e RNA 6000 Pico LabChips. Esse equipamento bioanalítico

se baseia numa combinação de microchips de microfluídos, separação por tamanho

induzido por voltagem em géis com canais e um sistema de detecção de

fluorescência induzido por laser (LIF – Laser-induced fluorescence) (Schroeder et

al., 2006). As moléculas de RNA são intercaladas por corantes e detectadas por

meio de LIF. Os dados são arquivados automaticamente e disponibilizados em

formas de imagens semelhantes a géis, eletroferogramas, bem como formato tabular

(Schroeder et al., 2006).

A possível contaminação por proteínas (razão A260/A280) e/ou por

componentes dos tampões e compostos orgânicos (razão A260/A230) no RNA total

extraído foi analisada em equipamento de espectrofotometria Nanodrop 2000

(Thermo Scientific) para avaliação das razões de absorbância, as quais devem ser

superior a 1,8.

3.7 MICROARRAY E PERFIL DE MICRORNAS

Para os experimentos de microarray para perfil de miRNAs, utilizou-se RNA

total de excelente qualidade como descrito anteriormente, de três experimentos

independentes em simplicata para amostras controles e infectadas em 24 hpi (para

ambos cultivos celulares) e 48 hpi (somente para o cultivo modelo).

43

Dessa maneira, 750 ng de RNA total tanto das amostras em teste, quanto da

amostra referência (pool: mistura de todos os RNAs), foram marcados com as

fluorescências Hy3™ e Hy5™, respectivamente, utilizando-se o miRCURY LNA™

miRNA Hi-Power Labeling Kit, Hy3™/Hy5™ (Exiqon), de acordo com as instruções

do fabricante. Após isso, as amostras marcadas com Hy3™ e Hy5™ foram

misturadas e hibridizadas às sondas de captura contidas nos slides do miRCURY

LNA™ microRNA Array 7th Gen (Exiqon, Dinamarca), com base no banco de dados

do miRBase, versão 19.0. Essa hibridização foi realizada de acordo com o descrito

no manual, utilizando-se uma estação de hibridização Tecan HS4800™ (Tecan,

Austria). Após as hibridizações, os slides dos microarrays foram escaneados e

armazenados em ambiente livre de ozônio (níveis de ozônio com níveis menores de

2,0 ppb). O escaneamento desses slides foi realizado no equipamento Agilent

G2565BA Microarray Scanner System (Agilent, Inc., EUA), enquanto as análises das

imagens foram realizadas pelo programa ImaGene® 9 (miRCURY LNA™ microRNA

Array Analysis Software, Exiqon).

Por fim, os sinais quantificados foram corrigidos para remoção de background

(Normexp com valor de 10 - Richie et al., 2007), e normalizados com um algoritmo

de regressão pelo método Lowess (LOcally WEighted Scatterplot Smoothing).

3.8 ANÁLISE DO PERFIL DE MICRORNAS EM VIAS METABÓLICAS

Os miRNAs diferencialmente expressos foram analisados por ferramentas

bioinformáticas quanto aos seus prováveis mRNA alvos. Para isso, foram utilizados

os algoritmos implementados nos programas/softwares online miRTar (Hsu et al.,

2011) e DIANA micro test (miRPath microTCDS e Tarbase) (Maragkakis et al., 2009;

Papadopoulos et al., 2009), para confrontar os miRNAs contra as vias metabólicas.

Esses resultados ainda foram adicionalmente confrontados com previsão de alvos

disponíveis no programa miRWalk (Dweep et al., 2011), quando possível.

O programa DIANA micro test possui dois bancos de dados: o micro-TCDS, o

qual prevê os prováveis alvos por algoritmos de bioinformática, e o Tarbase que

oferece resultados baseados em alvos já validados/confirmados experimentalmente.

As vias metabólicas pesquisadas no miRTar foram primariamente citocinas,

JAK/STAT e TLRs. No entanto, essas e outras vias também foram analisadas, de

acordo com os resultados retornados pelo DIANA. Em ambos os casos, as vias

44

analisadas foram aquelas estabelecidas pelo KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes

and Genomes), as quais estão implementadas nesses softwares.

Em relação ao miRWalk, esse foi utilizado para corroborar com os resultados

dos outros dois programas, uma vez que esse faz uma previsão bioinformática

contando com oito programas, tais como, RNA22, miRanda, miRDB, TargetScan,

RNAhybrid, PITA, PICTAR, e o já mencionado DIANA-microT. Essa abordagem só

não foi utilizada, quando o miRNA pesquisado não foi detectado no banco de dados

desse software.

No entanto, apesar da pesquisa bioinformática, levou-se também em

importante consideração os dados da literatura que identifiquem, e até justifiquem,

uma relevância dos miRNAs encontrados na regulação da resposta imune e/ou

papel funcional na replicação de outros vírus, de cárater já confirmado.

De acordo com o exposto, foram selecionados os miRNAs para validação do

resultado de microarray pelo método de RT-qPCR.

3.9 TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DA REAÇÃO EM CADEIA MEDIADA PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL (RT-qPCR)

Amostras de RNA total dos experimentos acima foram utilizadas para

confirmação da infecção dos cultivos HepG2 e Huh7.5 pela cepa viral 44/2. Para

isso, 50 ng de RNA total foram utilizados com o sistema Taqman® One-step RT-PCR

Master Mix kit (Applied Biosystem, EUA), de acordo o descrito pelo fabricante. A

quantificação do RNA foi realizada de acordo com o fabricante do Qubit® RNA assay

kit utilizando o equipamento Qubit® 2.0 (Invitrogen, EUA). Os oligonucleotídeos

(primers) (F e R) foram utilizados na concentração de 400 nM e a sonda (S) 100 nM,

e esses foram aqueles descritos para DENV2 por Johnson et al. (2005): F:

CAGGTTATGGCACTGTCACGAT; R: CCATCTGCAGCAACACCATCTC; S:

CTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAA (repórter/quencher: Vic/Tamra).

Para a validação dos resultados obtidos por microarray, foi realizado RT-

qPCR utilizando ensaios customizados e validados pelo sistema químico de

fluorescência SYBR® Green, seguindo as instruções do fabricante e como

brevemente descrito a seguir.

Foi utilizado 10ng de RNA total, o qual foi reversamente transcrito em

triplicatas técnicas para uma reação final de 10 µL com o kit miRCury LNA™

45

Universal RT MicroRNA PCR, polyadenilation and cDNA synthesis (Exiqon). O DNA

complementar (cDNA) resultante foi diluído 100 X e utilizado para a etapa de qPCR

em reações de 10 µL com o kit miRCury LNA™ Universal RT microRNA PCR

(Exiqon). Cada miRNA foi testado em simplicata (ou seja, uma mesma amostra foi

feita em triplicata para RT, e cada uma dessas em simplicata para o qPCR) em

placas pré-customizada. Controles negativos foram utilizados, excluindo o RNA

molde das reações, e acrescentando água em seu lugar.

As amplificações foram realizadas no equipamento LightCycler® 480 Real-

Time PCR system (Roche) em placas de 384 poços. A análise das curvas

amplificadas foram realizadas com o programa Roche LC software, ambos para

análise de Cq (Ciclo de quantificação) e curva de dissociação (Melting curve).

Nas análises, todos os ensaios foram inspecionados para procura de curvas

de dissociação distintas com valores de Tm dentro das especificações de cada

ensaio. Em acordo com isso, cada ensaio deveria ser detectado com pelo menos 5

Cq menor que os controles negativos, e com Cq < 37 para ser incluído na análise.

Utilizando o programa NormFinder (Andersen et al., 2004), identificou-se uma

lista de cinco miRNAs (miR-151a-5p, miR-182-5p, miR-222-5p, miR-25-3p, miR-

125a-5p) com os menores índices de expressão diferencial nos ensaios de

microarray, para serem utilizados como normalizadores nos ensaios de RT-qPCR.

Foi realizada uma média de expressão de todos os miRNAs normalizadores

acima, e esse valor foi utilizado para as normalizações, com a utilização da seguinte

fórmula:

Cq normalizado = média do Cq (5 normalizadores) - Cq amostra

Com os valores normalizados, utilizou-se o método de analítico de ∆∆Cq, ou

seja, o valor das diferenças entre Cq das amostras infectadas e Cq das amostras

controle, de modo a resultar nas estimativas de abundância de um determinado

miRNA na amostra infectada. Para transformação em escala log2 para avaliar

quantas vezes mais ou menos um particular miRNA foi expresso, aplicou-se a

seguinte fórmula: 2∆∆Cq.

46

3.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

As análises estatísticas e representações gráficas foram realizadas no

software Prism (GraphPad Prism® versão de teste 6.0, EUA). Enquanto que as

análises dos dados de microarray e RT-qPCR foram realizadas no software

R/Bioconductor (fonte livre: www.bioconductor.org), usando, principalmente, o

pacote limma.

Os resultados de titulação, incluindo a curva virêmica, expressos em PFU/mL

foram descritos como médias aritméticas de experimentos realizados em duplicata.

A curva virêmica foi expressa em escala logarítmica (log).

Em relação aos ensaios de MTT, as médias normalizadas de cada hpi foram

comparadas utilizando-se ANOVA um critério seguido dos testes de Tukey, para

determinar a origem das prováveis diferenças. O intervalo de confiança escolhido foi

de 95% (p<0,05).

No entanto, para representar graficamente a viabilidade celular em cada hpi,

os valores foram considerados em porcentagens. Para isso, as médias dos valores

normalizados dos controles negativos foram consideradas como correspondentes a

100 % e, a partir disso, foi calculada a viabilidade das amostras infectadas,

considerando também seus valores normalizados.

Também, realizou-se uma análise de componente principal (PCA) com os

dados dos perfis de miRNAs. O objetivo do PCA é verificar ou reduzir a grande

dimensão dos dados e, assim, ressaltar variáveis que possam ser significativas (isto

é, destacar diferenças entre as amostras estudadas). Em outros palavras, o PCA

busca explicar as razões para a variabilidade dos dados. Por exemplo, se as

diferenças biológicas das células forem pronunciadas, essas serão consideradas um

componente primário de variação e a análise gráfica irá separar os grupos de

amostras de acordo com suas biologias. Dessa maneira, para produzir os gráficos

de PCA, utilizou-se os 50 miRNAs que apresentaram as maiores variações dentre

todas as amostras (de ambos os cultivos).

Nesse tipo de análise, utilizou-se os valores log de expressão diferencial

(logFC), a partir do cálculo (subtração) dos logs das amostras infectadas e controle.

Ainda, os logFC com valores +/- 1 (ou seja, distantes de zero em uma unidade, o

que significa expressão diferencial de pelo menos duas vezes), contribuíram para

distinguir os miRNAs em superexpressão ou baixa expressão.

47

Em adição, testes t student para amostras independentes foram utilizados

para verificar os miRNAs diferencialmente expressos em 24 hpi (p<0,05) e 48 hpi

(p<0,02). Ressaltando-se que nesses casos, as análises de logFC foram de alta

relevância para filtrar os dados gerados pelo teste t, que em uma análise com vários

miRNAs envolvidos, tende a apresentar resultados falsos negativos e positivos.

Os miRNAs validados por RT-qPCR foram analisados com testes t (p<0,05)

seguidos de correção de Benjamin Hochberg.

48

4 RESULTADOS

No procedimento de padronização da titulação do DENV em cultivos de

células VERO (ATCC: CCL-81), várias cepas de DENV dos quatro sorotipos foram

testadas, mas nem todas produziram placas em até sete dias após incubação.

Dentre essas últimas, por outro lado, algumas produziram placas em outro clone de

VERO (ATCC: E6) (dados não mostrados).

Em 24 hpi, testes de IFI identificaram marcação positiva em cultivos Huh7.5,

mas o mesmo não foi perceptível em HepG2. Ainda, testado somente no primeiro

cultivo, o número de células infectadas progrediu em 48 hpi (Figura 4). Nesse último

caso, grupos de células com intensa marcação também foram possíveis de serem

identificados em determinados campos (Figura 4 Ba).

Figura 4 – Micrografia de imunofluorescência indireta em células Huh7.5 infectadas com o DENV2 cepa viral 44/2. O DNA celular foi marcado com iodeto de propídeo (vermelho), e os antígenos para DENV foram marcados com anticorpo 3H5-1 e secundário conjugado com FITC (verde). M) Células Huh7.5 não infectadas com ausência de marcações para DENV2. Aa) e Ab) Células Huh7.5 infectadas em 24 horas pós-infecção (hpi). Ba), Bb) e Bc) Células Huh7.5 infectadas em 48 hpi.

M Aa Ab

Ba Bb Bc

49

Em relação aos títulos virais nos sobrenadantes dos cultivos Huh7.5 e HepG2

em 24 hpi, os quais foram plaqueados com 106 de células, foram detectados 2,3x105

PFU/mL (5,36 log10) e 102 PFU/mL (2 log10), respectivamente. Dessa maneira,

definiu-se o cultivo Huh7.5 como o mais suscetível, portanto, sendo escolhido como

o modelo in vitro deste estudo.

De modo a verificar o resultado da infecção (fenótipo) pela cepa viral 44/2 em

cultivos Huh7.5, realizou-se, inicialmente, uma curva da cinética viral em

monocamada com 105 de células nos intervalos 24, 48, 72 e 96 hpi. Dessa maneira,

pode-se detectar que os maiores títulos virais foram detectados em 48 e 72 hpi, uma

vez que após isso, o título viral em 96 hpi voltou a se equiparar ao título de 24 hpi

(Figura 5).

Figura 5 - Curva da cinética viral. A curva da cinética viral foi realizada com os sobrenadantes de cultivos Huh7.5 infectados com DENV2 cepa viral 44/2 durante os primeiros quatro dias pós-infecção. Os valores dos títulos virais em PFU/mL estão indicados em escala logarítmica de base 10 (log10).

Foi reproduzível em todos os experimentos realizados, a observação de ECP

em cultivos Huh7.5 infectados a partir de 72 hpi. De modo a quantificar esse achado,

realizaram-se experimentos de viabilidade/citotoxicidade celular (Figura 6), bem

como, qualitativamente foi avaliada a produção de caspase 3 (Figura 7) para

verificação de prováveis eventos de apoptose.

Nos ensaios para verificar viabilidade/citotoxicidade celular relacionada à

infecção viral, os valores de absorbância (células viáveis) foram comparados entre

50

células infectadas e não-infectadas, e a partir disso, pode-se perceber diferença

estatística relevante (p<0,05) em 72 e 96 hpi (Figura 6A). Isso é ilustrado na

observação que as células não infectadas mantiveram sua taxa de crescimento

fisiológica, enquanto as células infectadas não acompanharam esse processo.

Nesse caso, comparando-se apenas as células infectadas na Figura 6A, observou-

se que o número de células manteve-se semelhante em 24, 48 e 72 hpi (p>0,05).

Por outro lado, em 96 hpi, houve uma queda no quantitativo celular, como

demonstrado nas comparações a seguir: 24-96 hpi (p=0,02); 48-96 hpi (p<0,0001);

72-96 hpi (p=0,0001).

Representando a viabilidade celular em termos de porcentagem, a Figura 6B

considerou as células não infectadas como sendo 100% viáveis em relação as

infectadas. Assim, observou-se que as células permaneceram viáveis (p>0,05)

durantes as primeiras 48 hpi. À partir disso, a viabilidade tendeu a cair em torno de

30 % a cada tempo analisado (Figura 6B).

Figura 6 - Viabilidade celular. A) Comparação dos valores de absorbância (células viáveis) entre cultivos Huh7.5 infectados com DENV2 cepa viral 44/2 e seus respectivos controles negativos. Outras comparações foram realizadas (ver texto), mas não estão representadas. B) Representação da viabilidade celular dos cultivos infectados em porcentagem, tomando-se em consideração os controle negativos (não mostrados) como 100 % viáveis. Os valores de média estão representados. Os dados A) e B) pertencem ao mesmo experimento realizado em duplicata biológica independente com pelo menos em triplicata técnica. * p<0,0001 (ANOVA um critério seguido de Tukey - intervalo adotado p<0,05). ** Anova um critério seguido de Tukey (p<0,05).

A) B)

51

De modo a averiguar se a queda na viabilidade celular e a presença de ECP a

partir de 72 hpi estavam relacionadas à indução de apoptose, pesquisou-se a

produção de caspase 3 por imunocitoquímica (Figura 7). Desse modo, anticorpos

anti-caspase 3 confirmaram a indução de apoptose, em ordem crescente de

intensidade, em 48, 72 e 96 hpi nos cultivos Huh7.5 infectados (Figuras 7 B48, B72 e

B96).

Figura 7 - Detecção de caspase 3 por imunocitoquímica. As amostras "A" correspondem aos controles negativos Huh7.5 não infectados, enquanto "B" são as amostras infectadas com o DENV2 cepa viral 44/2. Os tempos pós-incubação estão indicados por 24, 48, 72 ou 96 horas. Eventos de apoptose foram detectados com anticorpos específicos anti-capase 3 humana (marcações amarronzadas mais enegrecidas). Barras: 100 µM.

Para verificar se a expressão global de miRNAs em Huh7.5 e HepG2

poderiam sugerir estágios fisiológicos divergentes que, possivelmente, explicassem

a maior resistência de HepG2 à infecção pelo DENV2 44/2, verificou-se em 24 hpi o

perfil de miRNAs em ambos os cultivos para comparação. Em adição, o perfil de

miRNAs foi realizado até 48 hpi em cultivos Huh7.5, uma vez que até esse estágio

foi observada replicação viral acompanhada de viabilidade celular e baixa taxa de

apoptose, como mencionados anteriormente.

Os perfis de miRNAs por microarray retornaram entre 300-400 miRNAs em

todas as amostras para análises de expressão. Portanto, mais de 1.600 sondas de

captura (miRNAs) foram descartadas. Com esses dados, selecionou-se os 50

A24

B72 B96 B24 B48

A72 A96 A48

52

miRNAs mais divergentes (variâncias) entre todas as amostras, e com isso foi

plotado um gráfico PCA (Figura 8).

Quando todas as amostras foram juntamente submetidas à análise, isto é,

Huh7.5 e HepG2, incluindo as amostras infectadas e controles negativos de ambas,

foi verificado que o PCA separou as amostras em dois principais grupos,

independentemente da presença de infecção viral (Figura 8A). Dessa forma, foi

observado que os grupos formados correspondiam às células HepG2 e Huh7.5 e,

portanto, as diferenças biológicas entre os cultivos foi considerada mais relevante.

Uma nova análise foi realizada como acima, no entanto, removendo todas as

amostras referentes ao cultivo HepG2 (Figura 8B). Nessa análise, observou-se que

as amostras em 24 horas, independente do status da infecção, formaram um grupo

separado do grupo de 48 horas. No entanto, em relação ao grupo de 48 horas, foi

possível notar ainda dois sub-grupos: um pertencente às células infectadas e outro

às células controle.

Baseado nessa evidência, assumiu-se encontrar uma maior população de

miRNAs diferencialmente expressos em 48 hpi. Assim, testes t foram realizados,

assumindo um intervalo de confiança de 95% (p<0,05) para 24 hpi e 98% (p<0,02)

para 48 hpi. Com essa abordagem, verificou-se seis miRNAs diferencialmente

expressos em 24 hpi, os quais foram novamente encontrados dentre os 61 miRNAs

diferencialmente expressos em 48 hpi.

Uma vez que os ensaios de microarray, nos quais uma grande quantidade de

miRNAs foram pesquisados paralelamente, podem gerar resultados falso positivos,

adotou-se como diferenças de expressão relevantes aquelas que pelo menos

duplicaram em termos de expressão. Ou seja, levou-se em consideração como

expressões diferenciais relevantes, os miRNAs com logFC + ou - 1, para

classificação como superexpresso ou com baixa expressão, respectivamente.

Seguindo esse critério estabelecido, cinco miRNAs foram encontrados como

potencialmente superexpressos em 48 hpi, e nenhum em 24 hpi (Tabela 1) em

cultivos Huh7.5. Os miRNAs encontrados foram: hsa-miRPlus-A1086, hsa-miR-3182,

hsa-miR-21-5p, hsa-miR-4198 e hsa-miR-146a-5p. Em especial, o primeiro miRNA

corresponde a uma sonda, dentre várias presentes no array, de candidatos a

possíveis novos miRNAs. Adicionalmente, vale notar que em cultivos HepG2,

também não houveram miRNAs diferencialmente expressos em 24 hpi.

53

Figura 8 - Análise do componente principal (PCA). Os 50 miRNAs mais divergentes entre todas as amostras foram utilizados. A análise foi realizada com os valores normalizados das razões de expressão, logFC. As características entre as amostras foram centralizadas para zero (valores de média ajustados a zero), e as escalas estão apresentadas com unidades de variância. A) PCA dos cultivos HepG2 e Huh7.5. B) PCA das amostras infectadas e controles negativos em 24 e 48 horas pós-infecção (hpi) em cultivos Huh7.5. Legendas: A, B e C (maiúsculo): Huh7.5 (24hpi), Huh7.5 (48hpi), e HepG2 (24hpi), respectivamente; a, b e c (minúsculos): representam uma das triplicatas; O número 1: representa amostras de controle negativo (não-infectado). Cont.: Controle negativo. Denv: Vírus dengue 2 cepa 44/2.

A)

B)

54

A Tabela 1 mostra uma seleção de miRNAs diferencialmente expressos.

Nessa é possível notar os seis miRNAs diferencialmente expressos em 24 hpi

(p<0,05), os quais também foram encontrados em 48 hpi, porém apenas dois desses

com níveis de expressão relevantes: miR-146a-5p e miR-4698. Destaca-se ainda, os

cinco miRNAs com expressões diferenciais relevantes (p<0,02 e logFC > +/- 1),

encontrados em 48 hpi. Por fim, a lista completa de miRNAs diferencialmente

expressos em 48 hpi (p<0,02) se encontra no Apêndice 1.

TABELA 1 - MicroRNAs diferencialmente expressos, de acordo com a técnica de microarray, em cultivos Huh7.5 infectados com a cepa viral 44/2 (DENV2) em 24 e 48 horas pós-infecção.

24 horas pós-infecção * 48 horas pós-infecção **

microRNA LogFC MicroRNA LogFC

miR-146a-5p 0,369 miR-146a-5p 1,174

miR-4698 0,723 miR-4698 1,310

miR-2355-3p 0,407 miR-2355-3p 0,554

miR-122-5p - 0,389 miR-122-5p - 0,440

miR-21-3p 0,285 miR-21-3p 0,488

miR-320a - 0,212 miR-320a - 0,394

miRPlus-A1086 1,110

miR-3182 1,013

miR-21-5p 1,212

Legenda: LogFC: valor referente a mudança de expressão em comparação as células infectadas e seus respectivos controles não infectados. MicroRNAs destacados em azul foram considerados relevantes em termos de expressão diferencial em 48 horas. Testes-t: *p<0,05. **p<0,02

Adicionalmente, para uma identificação visual dos miRNAs que apresentaram

as mais altas magnitudes de expressões diferenciais, foi plotado um heatmap para

comparação dos 50 miRNAs entre Huh7.5 e HepG2 (Figura 9A), bem como outro

heatmap para ilustrar os cinco miRNAs destacados acima em cultivos Huh7.5

(Figura 9B).

55

Figura 9 - Heatmap e agrupamento hierárquico entre todas as amostras dos cultivos Huh7.5 e HepG2. Em ambas as

figuras, os valores de expressão (razões de log normalizados) estão indicados em vermelho ou verde, e podem ser interpretados pela régua apresentada em cada figura. As réguas sinalizam aumento ou diminuição de expressão. A) O agrupamento foi realizado em todas as amostras deste estudo (colunas) com os 50 miRNAs (linhas) de maiores desvio padrão, utilizando-se os valores log normalizados. Verde significa aumento de expressão e vermelho diminuição. B) O mesmo foi realizado isoladamente com os cinco microRNAs de maior relevância em termos de diferencialmente expressos em 48 hpi em cultivos Huh7.5 (de cima para baixo: miR-3182, miRPlus-A1086, miR-21-5p e miR-146a-5p). O miR-4698 foi omitido, pois não foi detectado em todas as amostras. Vermelho significa aumento de expressão e verde diminuição. Legenda: A, B e C (maiúsculo): Huh7.5 (24hpi), Huh7.5 (48hpi), e HepG2 (24hpi), respectivamente; a, b e c (minúsculos): representam uma das triplicatas; O número 1: representa amostra de controle negativo (não-infectado).

B)

A)

56

Em relação a pesquisa de prováveis mRNAs alvos para os cinco miRNAs

diferencialmente expressos, o miRPlus-A1086 não foi analisado (verificar

Discussão). Nesse sentido, os miRNAs miR-4698 e miR-3182 foram analisados

pelos algoritmos de bioinformática descritos anteriormente. Para os miR-146a-5p e

miR-21-5p foi encontrados alvos experimentalmente validados e funções descritas

na literatura científica.

O miR-4698 não foi encontrado pelo miRTar, ao contrário do miR-3182, o qual

foi analisado para determinadas vias metabólicas. Por outro lado, ambos miRNAs

não foram encontrados no banco de dados do miRWalk.

De modo a explorar esses resultados, e ao passo de verificar possíveis alvos

para o miR-4698, todos os quatro miRNAs foram pesquisados juntamente no

software DIANA. Para isso, escolheu-se a configuração micro-TCDS (pesquisa de

mRNA alvos) para miR-4698 e miR-3182, enquanto que para miR-146a-5p e miR-

21-5p foi escolhido o Tarbase (banco de dados do DIANA contendo alvos

experimentalmente validados).

Numa análise individual, o miR-146a-5p foi relacionado com as seguintes vias

e seus respectivos alvos validados: a) TLR [TLR2, Quinase associada ao receptor

de IL1 (IRAK1), fator associado ao receptor TNF (TRAF6) e fator regulatório de IFN -

IRF-7) ; b) RIG-I (ISG-15, IRF-7 e TRAF6). Nessas vias, outros alvos validados

também foram encontrados (p. ex., IRAK2 e IRF-5) por uma pesquisa na literatura

(ver discussão a seguir). Em relação aos alvos não validados para esse miRNA,

dentre vários, o software miRWalk retornou a possibilidade de regulação de gene de

resposta primária de diferenciação mieloide (MYD88), 2’-5’-oligoadenilato sintetase

(OAS) 2, OAS3, JAK1 e IFNAR1.

Contudo, aqui, o maior destaque atribuído ao miR-21-5p não foi relacionado

aos seus prováveis alvos, mas sim, a uma busca na literatura que retornou seu

papel na ativação do TLR8 com a consequente produção de IL6 e TNF-α (ver

Discussão). Ainda assim, vale destacar dentre os prováveis alvos que o miRWalk

retornou: SOCS4, SOCS5, SOCS6, SOCS7, TLR-4, STAT3 e IL12A. Sendo

considerado como alvos validados de acordo com o Tarbase: TLR4, FAS, STAT3 e

PIK3R1.

Tendo em base os resultados acima, decidiu-se prosseguir o estudo com os

dados encontrados para o miR-146a-5p e miR-21-5p, os quais foram selecionados

57

para validação por RT-qPCR. Assim, nenhuma análise adicional foi realizada para

miR-3182 e miR-4698 neste estudo.

A validação dos resultados por RT-qPCR confirmaram os resultados de

microarray para os dois miRNAs acima pesquisados. A Tabela 2 mostra os valores

de expressão normalizados (Cq), ∆∆Cq, e resultados estatísticos. Com esses é

possível observar que em 24 hpi, somente o miR-146a-5p demonstrou expressão a

nível relevantes, e em 48 hpi os dois miRNAs estavam superexpressos. Essa análise

levou em consideração os dados brutos (não normalizados) em uma comparação

das amostras infectadas com os controles negativos em cada hpi para cada

microRNA individualmente.

TABELA 2 - MicroRNAs diferencialmente expressos validados por RT-qPCR de amostras de cultivos Huh7.5 experimentalmente infectados com o DENV2 cepa viral 44/2.

MicroRNA C** V** DP** ∆∆Cq Teste t Valor de p ajustado***

miR-146a-5p - 24 hpi* -2,55 -1,88 0,4 0,67 0,01 0,0427

miR-21-5p - 24 hpi 2,90 3,38 0,32 0,48 0,05 0,0427

miR-146a-5p - 48 hpi -3,22 -1,71 0,98 1,51 0,04 00462

miR-21-5p - 48 hpi 2,06 3,49 0,78 1,42 0,00 0,0004

Legendas: * hpi: horas-pós infecção. ** C: Controle negativo (não infectado); V: Amostra infectada; DP: Desvio padrão. ***Test t realizado com os valores brutos de Cq com correção dos valores de p pelo método de Benjamin Hochberg. Cut-off: 0,05

Para representar o aumento da expressão dos miRNAs miR-146a-5p e miR-

21-5p, descritos na tabela acima, os valores de ∆∆Cq foram transformados para

escala log2 e foram ilustrados na Figura 10. Assim, é possível perceber que em 48

hpi, quando o aumento de nível de expressão foi mais relevante para ambos os

miRNAs, o aumento foi de quase três vezes maior que em relação aos controles não

infectados.

58

Figura 10 - Níveis do aumento da expressão dos microRNAs em células Huh7.5 infectadas com o DENV2 cepa viral 44/2. A expressão dos microRNAs miR-146a-5p (indicado na imagem como miR-146a) e miR-21-5p (indicado como miR-21) foram normalizadas de acordo com os cinco miRNAs que menos sofreram mudanças de expressão. O valores estão representados em escala log2 para mostrar o aumento em quantas vezes mais foram expressos em relação às células não infectadas. *Destaque dado às amostras com p<0,05 para teste t com correção de Benjamin Hochberg dos valores brutos de expressão da comparação de cultivos infectados e não infectado (esse último não está representado na figura).

Dada a sugestão da ativação do TLR8 e produção de IL6, ambos foram

investigados por imunocitoquímica em 105 de células Huh7.5. As Figuras 11 e 12

mostram, respectivamente, que os cultivos infectados foram capazes de produzir IL6

e TLR8 em todos os períodos analisados pós-infecção. Em 72 hpi, houve uma maior

produção de ambas as proteínas em todos os experimentos realizados, sendo

possível notar o aumento de IL6 até 72 hpi.

Enquanto isso, a expressão de TLR8 foi de difícil reprodução nos

experimentos independentes em termos de identificação do dia de maior ou menor

expressão. Contudo, a sua expressão aumentada, como comentado, foi também

notória.

59

Figura 11 - Expressão de IL6 em cultivos Huh7.5. As amostras "A" correspondem aos controles negativos Huh7.5 não infectados, enquanto "B" são as amostras infectadas com a cepa viral 44/2. Os tempos pós-incubação estão indicados por 24, 48, 72 ou 96 horas. Produção de IL6 foi detectada com anticorpo específico em ensaios de imunohistoquímica. As marcações amarronzadas mais enegrecidas correspondem a marcação positiva de IL6. Barras: 100 µM.

A24 B24

A48 B48

A72 B72

A96 B96

60

Figura 12 - Expressão de TLR8 em cultivos Huh7.5. As amostras "A" correspondem aos controles negativos Huh7.5 não infectados, enquanto "B" são as amostras infectadas com a cepa viral 44/2. Os tempos pós-incubação estão indicados por 24, 48, 72 ou 96 horas. Marcação para TLR8 foi detectada com anticorpo específico em ensaios de imunohistoquímica. As marcações amarronzadas mais enegrecidas correspondem a marcação positiva a TLR8. Barras: 100 µM.

A24 B24

A48 B48

A72 B72

A96 B96

61

5 DISCUSSÃO

5.1 O ENSAIO DE PLACAS EM CÉLULAS VERO PARA O DENV E AS CARACTERÍSTICAS DA CEPA VIRAL DENV2 44/2

Devido dificuldades técnicas em se realizar ensaios de titulação em placa

para o DENV, e ainda que não tenha sido objetivo deste estudo, vale mencionar que

a técnica de titulação viral sem SBF de Malewicz e Jenkin (1979) foi aqui adaptada

para células VERO (CCL-81), mas não produziram resultados semelhantes a desses

autores no que concerne a produção de placas em menos de sete dias de

incubação.

Outras variáveis não foram avaliadas que pudessem influenciar na formação

de placas. Nesse sentido, os cultivos mais comumente utilizados para titulação do

DENV são: BHK-21 (Rim de hamster Mesocricetus auratus), LLC-MK2 (rim de

Macaca mulatta), C6/36 e clones de células VERO (Stim, 1970a; 1970b; Rao, 1976;

Malewicz & Jenkin, 1979; Liu & Wu, 2004).

Além dos fatores genéticos virais, expressão gênica celular e concentração do

meio overlay de incubação (variando de 1 a 1,6% para as vinte amostras testadas),

outros fatores que poderiam ser avaliados na padronização dessa técnica seriam

temperatura de incubação, concentração de cálcio, magnésio e bicarbonato de

sódio, pH, maior período de incubação, além de utilização de vermelho neutro para

revelação (Stim, 1970a;1970b).

Rao (1976) padronizou um método de titulação para DENV em células VERO

(no entanto, o mesmo utilizou SBF), mostrando as maiores taxas de sucesso para os

sorotipos DENV2 e DENV4. No presente estudo, poucas amostras de DENV4 foram

avaliadas, porém o encontrado foi semelhante ao estudo de Rao (1976) para o

sorotipo DENV2.

Dentre as cepas testadas para titulação viral, a cepa viral 44/2 de DENV2 foi

escolhida para este estudo, pois foi aquela que produziu resultados mais facilmente

reproduzíveis em termos de produção de placas, maiores títulos virais e a habilidade

de causar ECP vísivel à microscopia ótica em células VERO, a partir do 5° dia pós-

infecção (dpi). Essas características podem ter influência na sua origem a partir de

uma placa purificada (wild-type - tipo selvagem) de células VERO (ver metodologia).

Além disso, como mencionado anteriormente, essa cepa viral foi isolada de um

62

paciente febril em Vitória (Espírito Santo) e é filogeneticamente relacionada ao

genótipo asiático mais recentemente introduzido nas Américas [genótipo III

Jamaicano de Rico-Hesse (1990)] (Rico-Hesse et al., 1997; Miagostovich et al.,

2003; Freire et al., 2007).

Em relação a isso, o genótipo asiático é considerado um dos mais virulentos

dentro do sorotipo DENV2 (Cologna et al., 2005; Basu & Chaturvedi, 2008). Em

adição, o próprio sorotipo DENV2 está mais epidemiologicamente e

experimentalmente associado a casos graves de Dengue (Siqueira et al., 2005;

Vázquez-Pichardo et al., 2006; Martina et al., 2009).

A habilidade da cepa viral 44/2 de se replicar em sistemas experimentais in

vivo, levou a utilização da mesma como cepa desafio em um estudo em macacos

Rhesus (M. mulatta) para o teste do candidato vacinal quimérico para DENV, 17D-

D2 (Galler et al., 2005). A escolha dessa cepa nesse estudo mencionado, foi devida

a observação da capacidade da produção de viremia nesse modelo experimental em

até 8 dpi (Galler et al., 2005).

Evidências experimentais in vitro sugerem a incapacidade ou baixa taxa de

replicação em neurônios de camundongos albinos suíços Mus muculus da cepa viral

44/2 (Cruz, ACR - comunicação pessoal). Contudo, ainda que essa cepa não tenha

apresentado evidências de neurotropismo também in vivo (humano e macacos), vale

ressaltar que modelos murinos tendem a restringir a replicação do DENV (Ashour et

al., 2010).

5.2 A ESCOLHA DO MODELO DE REPLICAÇÃO IN VITRO PARA O DENV2 44/2: HEPG2 OU HUH7.5

De modo a averiguar um modelo experimental in vitro de células humanas

que apresentasse alta taxa de replicação/infecção do DENV objetivando

compreender as condições de um ambiente favorável para tal, os cultivos Huh7.5 e

HepG2 foram investigados neste estudo. Ambos os cultivos são derivados de

carcinoma hepatocelular humano, e podem contribuir para o entendimento da

resposta imune inata celular a nível tecidual, ou seja, células não propriamente ditas

do sistema imune.

Ainda, o fígado é tentativamente considerado um órgão alvo por parte das

infecções naturais pelo DENV (Basílio-de-Oliveira et al., 2005; Martina et al., 2009;

63

Trung et al., 2010 ), além de ser considerado um órgão com resposta imune inata

predominante no que diz respeito a população de macrofágos, células natural killer,

células endoteliais, etc., com atividade na eliminação de microrganismos e controle

da resposta imune sistêmica, como por exemplo, pela biosíntese de complemento e

PRRs (Gao et al., 2008). A respeito dos mecanismos imunopatológicos, anticorpos

dirigidos contra a proteína viral NS1 (bem como, alternativamente a própria proteína

NS1) podem causar injúria hepática pela interação com células endoteliais do fígado

(Lin, C. et al., 2008).

Cultivos primários de células de Kupfer foram infectados pelo DENV, os quais

impossibilitaram um completo ciclo de replicação, mas induziram uma forte resposta

por citocinas, tais como, IFN-α, TNF-α e IL6 (Marianneau et al., 1999). Dessa

maneira, torna-se contraditório afirmar que a taxa de replicação de sucesso do

DENV no fígado humano seja uma constante.

A partir do exposto, pode-se discutir que a infecção e alta taxa de replicação

viral depende de uma série de fatores relacionados variando desde a resposta

imune do hospedeiro até a genética viral. Portanto, o presente estudo, utilizando

uma única amostra viral, pode fixar a genética viral e testar a resposta do hospedeiro

como variável.

Ao infectar os cultivos Huh7.5 e HepG2 com o DENV2 cepa viral 44/2, o

primeiro cultivo apresentou uma intensa marcação por IFI, bem como um maior título

viral por PFU/mL. No segundo caso, a infecção nos estágios iniciais se mostrou mais

branda, sendo atribuída a resposta imune. Nesse sentido, sabe-se que o cultivo

HepG2 é capaz de produzir citocinas frente a infecção do DENV, incluindo IFN tipo I

(Ummareddy et al., 2008; Conceição et al., 2010).

Por outro lado, o cultivo Huh7.5, os quais foram derivados do original Huh7

(Blight et al., 2002), não expressa TLR3 e TLR7 e possuem uma mutação no gene

RIG-I, tornando-o não funcional, e em geral caracterizando esse sistema celular

como incapaz de induzir resposta por IFN por esses PRRs (Li et al., 2005; Sumpter

et al.,2005; Wang et al., 2009; Eksioglu et al., 2011). Todos esses PRRs são

caracterizados como receptores que podem ser sensibilizados pela presença de

RNA viral (Kumar et al., 2009; Wilkins & Gale Jr., 2010; Rehwinkel & Sousa., 2010;

Casanova et al., 2011).

Baseado nessas informações, buscou-se explicar a diferença de

suscetibilidade dos cultivos basicamente na resposta imune deficiente pela ausência

64

funcional desses PRRs. Nesse estágio, questionou-se quais seriam as vantagens de

se estudar o perfil de miRNAs em um sistema deficiente em importantes PRRs que

levariam a resposta antiviral por IFN tipo I.

Para responder esse questionamento, considerou-se que uma infecção viral

in vivo sensível a IFN tipo I poderá ter maior probabilidade de sucesso de replicação,

quando existerem mecanismos capazes de bloquear e/ou modular esse tipo de

resposta do hospedeiro. Uma vez que um vírus seja capaz de subverter a resposta

imune, isso aumentaria a probabilidade do aparecimento de doenças com

sintomatologia grave e quadros de extremo risco.

Portanto, o próprio DENV, ainda que dependente da genética viral, é capaz

de bloquear vias JAK/STAT e de IFN tipo I pela atividade de suas próprias proteínas

não estruturais (Ashour et al., 2009; Mazzon et al., 2009). Em adição, por

mecanismos a serem melhores esclarecidos, foi demonstrado que o modo de

entrada viral pela infecção secundária mediada por anticorpos, o qual é

epidemiologicamente relacionado aos casos graves de Dengue, é capaz de suprimir

as respostas por RIG-I, TLR-4, TLR-3 e TLR-7 em casos de FHD, mas não em FD

(Modhiran et al., 2010; Ubol et al.,2010).

Possibilidades de falhas na resposta imune não podem apenas ser

relacionadas aos mecanismos da infecção viral, mas também a polimorfismos

gênicos do hospedeiro (Silva et al., 2010). Assim sendo, teve-se o interesse em

estudar a resposta de células Huh7.5 naturalmente deficientes em RIG-I, TLR-3 e

TLR-7, como modelo humano in vitro de alta taxa de replicação do DENV,

considerando-se as possibilidades de tal fenótipo em casos graves da doença em

humanos.

Muito embora, tem-se a convicção de que os achados deste estudo

necessitam ter a relevância demonstrada em sistemas produtores de IFN,

principalmente, em amostras humanas de pacientes naturalmente infectados. Com

isso em vista, prosseguiu-se o presente estudo nesse cultivo celular (Huh7.5), aqui

objetivando a análise in vitro para futuro estudo in vivo.

Ainda, dentre os motivos que possam explicar as diferenças de infecção nos

cultivos HepG2 e Huh7.5, pode-se inferir sobre a diferença da expressão gênica em

ambos os cultivos.

Nesse caso, com os perfis de miRNAs em ambos os cultivos ilustrados

anteriormente na Fig.9A, é possível notar miRNAs celulares distintos quando se

65

compara um cultivo ao outro. Com isso, pode-se sugerir estágios fisiológicos

divergentes que possam afetar a infecção/replicação viral. Em específico ao cultivo

HepG2, no qual a infecção ocorreu, porém baixos números de partículas virais

infecciosas foram produzidas, pode-se sugerir a pesquisa da presença de

mecanismos celulares que dificultem a produção/montagem dessas partículas.

Em adição, pode-se especular sobre o papel do miRNA específico do fígado,

miR-122, o qual pode-se perceber pelos resultados de microarray, baixo nível de

expressão em cultivos HepG2, e mais elevado nível em cultivos Huh7.5. Em termos

práticos, na verdade, foi mostrado que cultivos HepG2 não expressam o miR-122

pela ausência de uma região codificante para esse produto, mesmo com a presença

de regiões promotoras presentes (Wu et al., 2009).

Uma função não comum para miRNAs é a regulação aumentada do RNA

alvo, contudo o mesmo ocorre quando o miR-122 se anexa a 5'RNC do HCV,

modulando a replicação viral e o consequente tropismo hepático (Jopling, 2008).

Ainda que o HCV pertença a família Flaviviridae, não foi estabelecido até o presente

se o mesmo possa ocorrer para o DENV, mas isso seria improvável como

comentado a seguir.

A nível de provável estratégia vacinal, um replicon de DENV foi criado com a

inserção de sítios alvos para o miR-122 na região 3'RNC, dessa maneira restrigindo

a replicação viral em tecidos de órgãos vitais (Lee et al., 2010). Com isso, sugere-se

a impossibilidade de que o miR-122 atue sobre o genoma do DENV de forma

semelhante ao HCV.

Foi demonstrado que o miR-122 é um regulador de apoptose em cultivos de

hepatocarcinoma humano por atuar negativamente sobre a expressão gênica do

gene anti-apoptótico, Bcl-w (Lin, C.J. et al., 2008). Em concordância, é possível

notar atividade apoptótica do miR-122 em cultivos Huh7, dentre outros (Wu et al.,

2009; Ma et al., 2010).

5.3 O FENÓTIPO DA INFECÇÃO DO DENV2 44/2 EM HUH7.5

Quando infectados com moi1 com o DENV2 cepa viral 44/2, cultivos Huh7.5

produziram antígenos virais a níveis detectavéis desde 24 hpi, seguido da

diminuição da viabilidade celular a cada dia seguinte do experimento. Quando

pesquisado se essa queda na viabilidade celular estava relacionada a eventos de

66

apoptose, ensaios de caspase 3 confirmaram essa sugestão. Por conseguinte, os

cultivos infectados produziram um ciclo lítico de infecção, estimando-se que levaria a

morte celular e a consequente eliminação do vírus em até 6 dpi.

Esse achado condiz com o demonstrado por Marianneau et al.(1998), que ao

comparar a infecção do DENV com YFV em cultivos HepG2, detectaram antígenos

virais do DENV e indução de apoptose em torno de 32 hpi, enquanto que o YFV

produziu esses efeitos de forma pronunciada, porém tardiamente. Ainda, os mesmos

autores mostraram maiores títulos virais para o YFV nos sobrenadantes.

Em corroboração com outros estudos in vitro, a apoptose é um mecanismo

que pode ser encontrado em cultivos infectados pelo DENV (Suksanpaisan et al.,

2007). A indução da mesma foi descrita como um evento dependente da ativação do

fator de transcrição nuclear NF-κB, além de ser sugerida como parte integrante da

patofisiologia da falha hepática em casos de FHD/SCD (Marianneau et al., 1997).

Em um estudo experimental e com amostras humanas de pacientes

naturalmente infectados individualmente com os quatro sorotipos de DENV

produzido por Vázquez-Pichardo et al.(2006), foi identificado níveis séricos elevados

de AST, ALT e LDH (comentado adiante).

Além disso, como revisado por Seneviratne et al. (2006), casos humanos

naturalmente infectados vem demonstrando a presença de apoptose em amostras

de biópsias, as quais podem ter sido induzidas pela atividade da replicação viral e/ou

toxicidade devido a resposta imune por citocinas. Portanto, amostras clínicas

reforçam que danos hepáticos durante a infecção pelo DENV, principalmente em

casos graves, também estão relacionadas à presença de apoptose (Couvelard et al.,

1999; Huerre et al., 2001; Limonta et al., 2007; Paes et al., 2009).

Não foram, no entanto, verificados se eventos de apoptose induzidos pela

replicação do DENV poderiam estar associados a expressão de miR-122, uma vez

que os níveis de expressão de capase 3 mais elevados foram detectados a partir de

72 hpi, quando nenhum experimento de detecção de miRNAs foi realizado.

5.4 OS PERFIS DE MICRORNAS

Os perfis de miRNAs foram realizados em 24 e 48 hpi, no entanto, somente

em 48 hpi, níveis de expressão mais relevantes foram detectados para miR-146a-5p

e miR-21-5p, dentre outros. Acredita-se que isso tenha sido influenciado por um

67

estresse celular mais elevado no momento do pico de replicação viral, sugerindo que

ambos os miRNAs possam ser investigados como sinais de alarme.

Outros miRNAs foram encontrados diferencialmente expressos pelos dados

de microarray, mas não foram validados por RT-qPCR. Contudo, vale refletir sobre

um provável papel para o miR-320c (ver Apêndice) durante o curso de infecção do

DENV em futuros estudos, uma vez que esse mesmo miRNA também foi reportado

por Qi et al.(2013), em um estudo de infecção ex vivo em células mononucleares de

sangue periférico humano.

Com exceção do miR-320c, o perfil encontrado pelos autores [Qi et al.(2013)]

foi diferente deste estudo. Nesse caso, esses utilizaram uma versão anterior de perfil

de microarray (miRCURY™ LNA Array, v.16), enquanto que aqui foi utilizada a

versão 19, e isso pode influenciar na análise global dos dados. Além disso, o tipo

celular usado, amostra viral (no caso dos autores supracitados, foi utilizada a

amostra protótipo de DENV2 Nova Guiné), análise na qualidade dos RNAs (os

mesmos não utilizaram o método RIN) e extração pelo método TRIzol® podem ter

interferido nos resultados.

É possível notar que dentre o perfil de citocinas encontrado por Qi et

al.(2013), a IL6 foi encontrada com alta relevância, bem como com a concomitante

alta expressão de miR-let-7e, o qual é predito como regulador direto de IL-6 pela

região 3'RNC. De um modo geral, os miRNAs encontrados forneceram a base da

sugestão que miRNAs celulares estão envolvidos na resposta imune, dentre outros

mecanismos, ao DENV em células de vertebrado (Qi et al., 2013).

Os miRNAs que não foram validados, tais como, miR-3182, miRPlus-A1086 e

miR-4198 não foram objeto de aprofundamento neste estudo pela falta de dados

mais concretos sobre suas prováveis atividades, ainda que um papel nas atividades

de endocitose, processamento de proteínas no RE, bem como na resposta imune

foram preditos por bioinformática. Ainda nessa questão, os cultivos Huh7.5 com alta

taxa de infecção podem também contribuir para estudos de entrada e saída do

DENV, bem como a dependência de interações com proteínas celulares para esses

mecanismos e os de replicação viral. Nesses aspectos, os miRNAs miR-3182 e miR-

4198 poderão ser analisados conjutamente.

Sobre o miRPlus-A1086, esse era um candidato a novo miRNA presente nos

arrays. Contudo, com a sequência cedida pela própria empresa Exiqon (Dinarmaca),

foi identificado que esse RNA não é classificado atualmente como miRNA pelo

68

miRBase, e sim como RNA vault. Essa nomenclatura é aprovada pelo Cômite de

Nomenclatura de Genes HUGO (http://www.genenames.org/). Antes disso, o mesmo

era nomeado como miR-886. No entanto, Lee et al.(2011) argumentam que inclusive

a classificação atual é indevida, e que esse é um RNA não codificante que não RNA

vault. Ainda, é discutido que o produto semelhante a um miRNA de

aproximadamente 22 nucleotídeos, que gerou essa classificação no passado, seja

na verdade produto de degradação de um produto maior de 100 nucleotídeos (Lee

et al., 2011).

5.5 AVALIAÇÃO HIPOTÉTICA SOBRE O miR-146a-5p: REGULAÇÃO DAS VIAS DE IFN E UMA FUNÇÃO NUCLEAR PARA PROTEÍNA VIRAL NS5

Os alvos experimentalmente validados para o miR-146a-5p como retornados

pelo software DIANA (Maragkakis et al., 2009; Papadopoulos et al., 2009), tais como

IRAK-1, TRAF-6, dentre outros envolvidos na sinalização de vias de IFN, sugerem

que esse miRNA possa favorecer a replicação viral pela inibição de vias que levem a

ativação de IFN.

De modo a exemplificar isso, a superexpressão e inibição de miR-146a-5p em

células mononucleares de sangue periférico levaram, respectivamente, a diminuição

e aumento da produção de IFN tipo I, devido a sua atuação também sobre IRF-5 e

STAT1 (Tang et al., 2009).

Foi demonstrado que o miR-146a-5p pode ser induzido por IL1-β, e que sua

transcrição está relacionada a atividade de NF-κB, bem como processamento pós-

transcricional a regulação por MEK-1/2 e JNK1/2. Além disso, foi proposto que o

miR-146a-5p não regula sobre IL-6 e IL-8, e apresenta funções dependentes do tipo

celular (Larner-Svensson et al., 2010).

Contribuindo na replicação do VSV em macrófagos, a alta expressão de miR-

146a-5p foi observada atuar de modo independente de MYD88, mas dependente de

RIG-I e NF-κB para bloqueio da via de IFN, incluindo pela atuação sobre o alvo

IRAK-2 (Hou et al., 2009).

Interessante citar que a proteína de membrana latente 1 (LMP1) do EBV é

capaz de ativar o fator transcricional NF-κB levando a transcrição de miR-146a-5p, o

qual é induzido, como vem sendo comentado, por fatores da resposta por IFN, bem

como pela própria LMP1 (Cameron et al., 2008). Esse exemplo, denota um outro

69

caso típico de miRNA celular que contribui para replicação viral, e que não obstante,

sua expressão é também estimulada por atividade de uma proteína viral.

Outras infecções virais também podem se beneficar da expressão do miR-

146a-5p em prol de suas próprias replicações. Outros casos assim, podem ser

exemplificados pelo Vírus hendra (Stewart et al., 2013), infecção crônica do HIV tipo

1 em microglias (Rom et al., 2010), Vírus do sarcoma de Kaposi (Punj et al., 2010),

dentre outras. Assim sugerindo que o mesmo possa a vir a ser testado como alvo

terapêutico de interesse a várias infecções virais.

De modo contraditório ao exposto, o miR-146a-5p é capaz de atuar com

atividade antiviral à infecção in vitro a cepas de H1N1 e H3N2, uma vez que a

inibição experimental desse miRNA aumentou os níveis de replicação das cepas em

questão (Terrier et al., 2013). Esses autores, trouxeram hipóteses para explicar o

achado, nas possibilidades: a) miR-146a-5p regula por feedback negativo a

expressão de NF-kB (seu próprio fator transcricional), e o aumento desse último

contribui para replicação dos títulos do Vírus Influenza A (Paik et al., 2011); b)

possibilidade que esse miRNA possa atuar negativamente e diretamente a nível do

genoma viral (Terrier et al., 2013).

No presente estudo, ainda que o sistema celular seja deficiente na resposta

imune, esse miRNA foi transcrito e teve expressão aumentada, gerando o

questionamento sobre seu papel na replicação do DENV: a) regulador positivo a

replicação do DENV?; b) ação antiviral, como no caso citado das cepas virais H1N1

e H3N2?

Na hipótese que a expressão de miR-146a-5p possa contribuir para

replicação do DENV, sugere-se que mecanismos relacionados à expressão de NF-

κB possam estar relacionados, bem como a possibilidade da atuação de proteínas

do próprio DENV.

No primeiro caso, e como já comentado anteriormente, a expressão de NF-kB

pode ser induzida pela infecção do DENV, o que resulta em apoptose (Marianneau

et al., 1997), bem como indução de IL-6 (Lee et al., 2007).

Em um trabalho de expressão gênica com pacientes (crianças) naturalmente

infectados e apresentando quadros severos de dengue, durante os dias anteriores e

o dia 1 do período de defervescência, foram detectados altos níveis de IFN-γ e IL-

12, deflagrando uma resposta antiviral. No mesmo período, houve baixa expressão

de vários genes associados a NF-kB, tais como, NFKB1, NFKB2, TNFR1, IL1B, IL8

70

e TNF-α. Após o dia 1 de defervecência, o quadro de expressão gênica se inverteu,

e TNFA e TNFR1 puderam ser correlacionadas à efusão pleural, enquanto NFKB1 e

TNFR1 com manifestações hemorrágicas (de Kruif et al., 2008).

Ainda, foi demonstrado que o DENV2, em determinadas circunstâncias, pode

ser um fraco indutor de citocinas quando capaz de bloquear a atividade de NF-kB e

a sinalização por TLRs, subvertendo assim a resposta imune inata (Chang et al.,

2012).

Com isso, a discussão gerada sobre um mecanismo de expressão de miR-

146a-5p durante o curso de infecção/replicação do DENV, com ativação dependente

de NF-kB é razoável, porém pode estar relacionada aos estágios clínicos a partir da

defervescência. Cautelosamente contudo, ainda não pode ser estabelecido se há

relação do pico de replicação viral e/ou sintomatologia para expressão desse

miRNA.

No segundo caso em hipótese em que a expressão de NF-kB possa estar

relacionada a proteínas do próprio DENV, Silva et al. (2011) demonstraram em

cultivos HepG2 que a expressão da proteína NS1 aumenta a expressão de NF-kB.

Esses dados servem de prerrogativa para estudos adicionais que demonstrem esse

relacionamento provável na expressão de miR-146a-5p. Em adição pelo fato de que

a proteína NS1 pode ser secretada por células infectadas (Gutsche et al., 2011),

levanta-se a hipótese se essa proteína viral ainda teria a habilidade de carrear

miRNAs no sangue humano, tornando esse miRNA como um prospectivo

biomarcador de infecção pelo DENV (ver adiante).

A nível de especulação do presente estudo, a proteína viral NS5 poderia

supostamente estar envolvida nos níveis de expressão de miRNAs celulares (se não

dos próprios miR-146a-5p e/ou miR-21-5p). Para fundamentar essa hipótese, vale

relembrar que a principal atividade dessa proteína é a atividade de RNA polimerase

dependente de RNA, a qual ocorre no citoplasma (Paranjape & Harris, 2009). A

proteína NS5 tem habilidade de bloquear a resposta por IFN tipo I pela interação

com UBR4, o qual ao interagir com a NS5 processada direcionam mecanismos de

degradação de STAT-2 (Morrison et al., 2013).

Entretanto, mais de 70% da proteína NS5, encontra-se no núcleo celular e

não como esperado no citoplasma. Isso foi demonstrado por ensaios de

imunofluorescência (com intensa marcação nuclear) (Welsch et al., 2009) e pela

presença de sequências de localização nuclear no genoma viral (Brooks et al.,

71

2002). No núcleo, as funções ainda não foram totalmente elucidadas, e até o

momento, Kumar et al.(2013) mostraram que a localização nuclear não interferiu na

replicação do RNA viral, bem como na inibição de IFN tipo I.

A localização nuclear da proteína NS5 possibilita a interação com a proteína

Daxx, e assim afeta na modulação da produção de RANTES (CCL5), uma

quimiocina associada aos casos de FHD (Khunchai et al., 2012).

O que de fato estimula a hipótese que a NS5 pudesse estar envolvida na

expressão/transcrição de miRNAs, talvez seja o fato que no citoplasma durante a

replicação do RNA viral, essa proteína tem afinidade pela região de stem-loop SLA5'

da 5'RNC do genoma do DENV (Filomatori et al., 2006; Paranjape & Harris, 2010;

Iglesias et al., 2011). Dessa forma, uma vez que a NS5 é facilmente colocalizada no

núcleo celular, juntamente com a provável afinidade por estruturas secundárias de

RNA, seria válido especular e investigar esse provável mecanismo.

5.6 AVALIAÇÃO HIPOTÉTICA SOBRE O miR-21-5p: EXISTE RELAÇÃO DOS NÍVEIS DE IL-6, TLR8 E O EXTRAVASAMENTO PLASMÁTICO?

Além do miR-146a-5p, o miR-21-5p também esteve entre os maiores níveis

de expressão, principalmente em 48 hpi. Juntamente com o miR-155, esses três

miRNAs são sabidamente envolvidos na regulação da resposta imune inata (Quinn

& Neill, 2011). Especificamente, o miR-21-5p foi mostrado ser induzido pela

expressão de STAT3, um fator de transcrição ativado por IL6 (Quinn & Neill, 2011).

Fabbri et al. (2012) demonstraram um novo mecanismo de ação para miRNAs

e consequente ativação de TLRs. Nesse caso, foi mostrado, por exemplo, que o

TLR8 em células humanas, e o provável correspondente TLR7 em camundongos,

podem funcionar como receptores para miRNAs, nesse caso, para o miR-21-5p

(Fabbri, 2012; Fabbri et al., 2013). A ativação de TLR7/8 (camundongo/humano,

respectivamente) por esse miRNA leva a ativação de NF-kB com a produção de IL6

e TNF-α, e essa ativação pareceu ser dependente das sequências desse miRNA,

devido ao motivo UAGC na extremidade 5', bem como o motivo GU na extremidade

3' (nt 18-21), sendo o nt 20 de extrema relevância (Fabbri et al., 2013).

Uma vez que a atuação do miR-146a-5p é esperada sobre a inibição de

IRAK1, IRAK2, TRAF6, dentre outras moléculas também presentes nas cascatas de

sinalização de TLRs e RIG-I, busca-se saber qual a relevância da ativação de TLR8

72

e IL6, provavelmente pela expressão de miR-21-5p, encontrada por

imunohistoquímica em cultivos Huh7.5 infectados com o DENV2 cepa viral 44/2.

Ainda, a cascata de sinalização por TLR8 é também dependente de MYD88, uma

proteína que foi encontrada com expressão diminuída em cultivos infectados por

DENV em HepG2 por Conceição et al. (2010).

Para que a expressão do miR-21-5p leve não somente a ativação de TLR8,

mas também a produção de IL6 pelo mecanismo anteriormente citado, seria então

necessária a existência de mecanismos, ainda a serem descobertos, pelos quais a

produção de IL6 fosse, pelo menos em parte, independente de MYD88, IRAK1,

IRAK2 e/ou TRAF6.

Sobre a ativação e a cascata de sinalização de TLR8 pode ser comentado

que a mesma vem sendo classicamente assemelhada a TLR7, por faltas de estudos

mais específicos e detalhados (Sarvestani et al., 2012). Isso pode ser sugerido por

observações em diferentes células que expressam ambos TLR8 e TLR7, mas que

preferencialmente atuam com auxílio de um ou outro receptor, tais como células

dendríticas plasmocitoides (pDCs) e células B com TLR7, enquanto monócitos com

TLR8 (Sarvestani et al., 2012).

Dadas essas particularidades fisiológicas de populações de células da

resposta imune a respeito de respostas por TLR7 ou TLR8, isso pode resultar em

funções biológicas distintas, onde pDCs geralmente produzem citocinas como IFN-α

e monócitos/macrófagos produzem TNF-α ou IL12. Com isso, TLR7 favorece a

produção do estágio antiviral (por sinalização de IFN), enquanto TLR8 favorece uma

resposta Th1 (Sarvestani et al., 2012).

Contudo, vale ressaltar que monócitos/macrófagos, focos de replicação do

DENV, podem produzir IFN mediado por RIG-I e/ou TLR3. E uma vez que ambas as

vias de sinalização sejam subvertidas por mecanismos de infecção/replicação viral,

uma resposta por TLR8 poderá ser mais enfatizada/observada (Modhiran et al.,

2010).

A outra possibilidade, de que um mecanismo de produção de IL6 ocorra

dependente da expressão de miR-21-5p seguida da expressão de TLR8, é apoiado

na hipótese que esse miRNA seja capaz de ser secretado da célula a qual foi

produzido, e atue sobre células vizinhas (Fabbri et al., 2012; Fabbri et al., 2013) que

não foram, por exemplo, infectadas pelo DENV.

73

Nesse sentido, é interessante notar dois importantes aspectos: a)

primeiramente, sabe-se que há uma correlação da produção de IL6 e casos severos

de DENV em pacientes naturalmente infectados (ver adiante); b) a imunopatologia

da dengue não é bem explicada e envolve aspectos controversos no que diz

respeito ao papel das células endoteliais (Halstead, 2012).

Quanto a produção de IL6, essa possui um papel antagônico inflamatório e

antinflamatório, e que é geralmente detectada em casos graves de DENV depois de

7 dias após início dos sintomas febris (Lin et al.,2000; Lei et al., 2001; Rothman,

2011). Para exemplificar o exposto, Juffrei et al.(2001) verificaram em crianças

naturalmente infectadas com DENV, que a expressão de IL6 foi maior quanto mais

grave foi a forma de apresentação da doença, ou seja, maior nos casos de FHD e

SCD. O estudo atual detectou níveis mais elevados de IL6 em 72 hpi, quando houve

concomitante aumento de produção de caspase 3, bem como redução de

aproximadamente 50% na viabilidade celular.

Com isso, pode-se sugerir um provável papel de IL6 na patologia do DENV, e

uma vez que essa expressão possa ser correlacionada com a expressão de miR-21-

5p, seria possível observar um prospectivo alvo terapêutico e/ou marcador de casos

graves.

Como comentado por Halstead (2012), não existem provas que células

endoteliais possam ser infectadas diretamente pelo DENV in vivo, o que se

ocorresse, contribuiria para explicar a severidade nos casos de FHD relacionados ao

extravasamento plasmático. Ao mesmo tempo que o RNA viral nunca foi encontrado

nessas células, proteínas (detectadas por anticorpos policlonais) foram

aparentemente encontradas na superfície das mesmas (Jessie et al., 2004;

Halstead, 2012).

Ainda, nenhuma mudança morfológica nas células endoteliais tem sido

demonstrada que pudesse ilustrar uma ruptura endotelial, ao passo que marcadores

endoteliais podem ser identificados nos casos de FHD, tais como, aumento de

VCAM, ICAM, fator de von Willebrand (Darymple & Meckle, 2012).

A forma secretada da proteína NS1 é capaz de produzir altas taxas de

anticorpos, inclusive com reações cruzadas, que podem interagir com moléculas na

superfície das células endoteliais (Darymple & Meckle, 2012). Outro fator que pode

afetar as células endoteliais é a forte resposta por citocinas que pode ser

desencadeada durante o curso de infecções graves (Avirutnan et al., 1998; Huang et

74

al., 2000). Nesse sentido, a resposta tende a ser do tipo Th1 em casos de febre

clássica, mudando para Th2 quando o grau de gravidade é aumentado (Basu &

Chatuverdi, 2008).

Outros fatores que podem ser associados com os casos de extravasamento

plasmático nas células endoteliais também incluem: prostaciclina, óxido nítrico,

endotelina-1, etc. (Basu & Chatuverdi, 2008). O presente estudo sugere a

possibilidade que células infectadas com o DENV, possam secretar miR-21-5p que

possa atuar sobre células endoteliais não diretamente infectadas e estimular a

produção de IL6 pela ativação de TLR8, contribuindo para os quadros graves da

infecção.

5.7 POTENCIAL DOS MICRORNAS COMO PROVÁVEIS BIOMARCADORES DE INFECÇÃO DO DENV2

Nessa questão de secreção de miRNAs, vale enfatizar que é bem

estabelecido que ambos miR-146a-5p e miR-21-5p podem ser encontrados nos

fluídos corpóreos, tais como soro, plasma e urina em diversas patologias (Wang G.

et al., 2010; Bala et al., 2012; Martino et al., 2012; Wang et al., 2012; Liu et al.,

2013). Isso, portanto, reforça a possibilidade que ambos devam ser investigados

como prováveis biomarcadores e/ou alvos terapêuticos e possam contribuir para

fornecer informações de um prognóstico de infecção pelo DENV2, e possivelmente

também para os demais sorotipos. Desse modo, a presença dos mesmos em fluídos

corpóreos, pode induzir a acreditar-se que os mesmos possam atuar em células

diferentes das quais foram inicialmente expressos, como vem sendo argumentado.

Sabe-se que miRNAs nos fluídos corpóreos são moléculas estáveis por

serem transportados por complexos de ribonucleoproteínas, em exossomos,

micropartículas (os dois últimos são vesículas que podem ser diferenciadas por suas

biogênese e vias de secreção), complexos com a proteína Ago 2 (ver introdução -

biogênese dos miRNAs) presente dentro ou fora de vesículas (Boon & Vickers,

2013). Em adição, miRNAs também podem ser transportados em moléculas de LDL

e HDL (Vickers et al., 2011).

Nesse ponto, vale relembrar o que foi anteriormente mencionado sobre o

trabalho de Vázquez-Pichardo et al. (2006), os quais encontram elevados níveis de

LDL em amostras de camundongos experimentalmente infectados pelo DENV.

75

Assim, miRNAs durante a infecção do DENV podem ser transportados por um dos

meios acima apresentados, bem como é válida a investigação se a própria proteína

NS1 secretada teria essa habilidade de complexação.

É válido ainda mencionar que os perfis de miRNAs podem ser distintos

dependendo da amostra analisada, ou seja, o perfil intracelular pode apresentar

diferenças do perfil extracelular, e nesse último caso, por exemplo, o perfil do soro

pode ser diferente do plasma e/ou urina (Boon & Vickers, 2013). Isso ressalta que

nem todo miRNA altamente expresso intracelularmente irá ser encontrado

extracelularmente, e isso ainda é motivo de discussão por não ser esclarecido.

Com isso, ao avaliar um miRNA como biomarcador de infecção do DENV será

importante enfatizar em qual tipo de amostra/sistema que o mesmo foi detectado.

5.8 ALGUMAS PERSPECTIVAS DO PAPEL DOS MICRORNAS NA REGULAÇÃO DA REPLICAÇÃO DO DENV

Durante o processo de replicação do RNA viral de vírus do gênero Flavivirus,

o mesmo pode ser direcionado aos corpos de processamento para degradação do

mesmo. Contudo, provavelmente pela presença de estruturas secundárias,

aproximadamente 0,3-0,5 kb da região 3'RNC não sofre ação das enzimas celulares

de degradação, restando um subgenoma que contribui na patogenicidade das

infecções (Pijlman et al., 2008), incluindo envolvimento em mecanismos de evasão

de IFN (Schuessler et al., 2012).

A respeito desse RNA subgenômico, foi demonstrado que o mesmo pode

competir com os miRNAs em processamento pela enzima Dicer, e assim, afetar a

clivagem de RNAs dupla fita em mosquitos e vertebrados, atuando como regulador

das vias de RNAi dependentes de dicer (Schnettler et al., 2012). Todavia, ainda não

estão esclarecidos os detalhes desse mecanismos, bem como isso pode afetar a

expressão de determinados miRNAs celulares. Neste estudo, os miR-21-5p e miR-

146a-5p hipoteticamente não tiveram suas expressões a nível de interesse afetadas

por esse mecanismo proposto.

A expressão de miR-146a-5p pode afetar os títulos virais do DENV? Essa é

uma questão que está atualmente sendo pesquisada como continuação desta

pesquisa apresentada. Para isso, está sendo realizado experimentos funcionais de

inibição desse miRNA in vitro, incluindo em cultivos de carcinoma de pulmão

76

humano (A549), devido a sua capacidade de produção de IFN para uma análise

comparativa com os cultivos Huh7.5 deficientes no mesmo.

Ainda, em cultivos Huh7.5 está sendo melhor avaliada a correlação da

expressão de miR-21-5p com a produção de IL6, especialmente em 48 e 72 hpi, por

testes de RT-qPCR e ELISA, respectivamente. Em adição, a expressão de TLR8

está sendo pesquisada para possível corroboração por análise de western blot.

Análises semelhantes serão realizadas também em cultivos A549, para se verificar a

influência da produção de IFN nesses resultados.

Perspectivas mais futuras ainda prevem a detecção de ambos esses miRNAs

em um coorte de pacientes naturalmente infectados pelo DENV, na tentativa de

avaliar além de correlacionar a expressão de citocinas, miRNAs, títulos virais,

sintomatologia e gravidade da doença. Caso o estudo in vivo confirme os achados in

vitro, poderá ser de interesse retornar aos estudos in vitro, para melhor explorar os

mecanismos de ação desses miRNAs.

Finalmente, espera-se melhorar o prognóstico dos pacientes acometidos por

DENV com medidas terapêuticas eficazes, incluindo para possíveis efeitos colaterais

a estratégias vacinais em desenvolvimento atualmente.

77

6 CONCLUSÕES

Os cultivos Huh7.5 apresentaram alta suscetibilidade à infecção pelo DENV2

quando comparados aos cultivos HepG2;

A infecção dos cultivos Huh7.5 com DENV2 produziram picos virais em 48 e

72 hpi, diminuição da viabilidade celular em torno de 30% a partir de 72 hpi com a

concomitante identificação de apoptose pela detecção de caspase 3;

Os perfis de miRNAs revelaram vários miRNAs diferencialmente expressos

em cultivos Huh7.5 e HepG2, sugerindo estágios fisiológicos distintos que possam

contribuir para entender a maior resistência à infecção/replicação do DENV;

A infecção pelo DENV2 alterou o perfil de microRNAs celulares,

principalmente após 48 hpi. Dentre esses, quatro miRNAs, quais sejam, miR-21-5p,

miR-146a-5p, miR-4698 e miR-3182 sugerem papéis regulatórios na resposta imune

inata, endocitose, vias de estresse no RE;

Os miR-21 e miR-146a-5p foram validados por RT-qPCR sendo confirmado o

aumento de expressão nos cultivos infectados em relação aos não infectados;

O miR-146a-5p foi sugerido como provável regulador positivo da

infecção/replicação do DENV por mecanismos envolvendo NF-kB;

A expressão de miR-21-5p foi relacionada hipoteticamente aos níveis de

expressão de IL6 e TLR8 encontrados nos cultivos infectados, principalmente entre

48 e 72 hpi;

A provável ativação de TLR8 pelo miR-21-5p gerando uma cascata de

sinalização que leve a produção de IL6 na presença do miR-146a-5p (inibidor da

expressão de IRAK1/2, TRAF6.) sugere que novos mecanismos devem ser existir

dentre os mecanismos desencadeados pela ativação de TLR8;

Foi sugerida a hipótese de sinalização/comunicação celular devida a provável

secreção do miR-21-5p de células infectadas com o DENV2 e sua atuação em

células não infectadas vizinhas, inclusive em células endoteliais, estimulando a

produção de IL6.

78

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APÊNDICE

APÊNDICE LISTA DO PERFIL DE MICRORNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS POR

MICROARRAY EM 48 HORAS PÓS-INFECÇÃO DE ACORDO COM TEST T COM SEUS VALORES DE LOGFC

MicroRNA LogFC

hsa-miRPlus-A1086 1,110

hsa-miR-3182 1,013

hsa-miRPlus-A1087 0,969

hsa-miR-21-5p 1,212

hsa-miR-2355-3p 0,554

hsa-miR-3676-5p 0,800

hsa-miR-4698 1,310

hsa-miR-4456 0,667

hsa-miR-4417 0,526

hsa-miR-491-3p 0,869

hsa-miR-1255a 0,624

hsa-miR-21-3p 0,488

hsa-miR-320d -0,391

hsa-miR-4667-5p 0,603

hsa-miR-320c -0,438

hsa-miR-1273e 0,471

hsa-miR-32-3p -0,368

hsa-miR-320a -0,394

hsa-miR-885-3p -0,366

hsa-miR-7-5p 0,446

kshv-miR-K12-5-5p 0,383

hsa-miR-122-5p -0,440

hsa-miR-4443 0,547

hsa-miR-320e -0,406

hsa-miR-1264 0,581

hsa-miR-3915 0,466

hsa-miR-4429 -0,367

hsa-miR-4531 0,570

SNORD68 -0,334

hsa-miR-483-3p -0,306

hsa-miR-4532 0,675

hsa-miR-423-3p -0,309

hsa-miR-493-5p 0,542

hsa-miR-4797-5p 0,625

hsa-miR-4286 0,707

hsa-miR-5581-3p 0,649

hsa-miR-27a-3p 0,540

hsa-miR-3175 -0,352

hsa-miR-320b -0,389

hsa-miR-4726-5p 0,487

hsa-miR-106b-3p -0,310

hsa-miR-19b-3p 0,459

hsa-miR-574-5p -0,272

hsa-miR-210 -0,574

hsa-miR-22-3p 0,525

hsa-miR-5100 0,672

hsa-miR-101-3p 0,474

hsa-miR-19a-3p 0,471

hsa-miR-324-3p -0,262

hsa-miR-744-5p -0,339

hsa-miR-423-5p -0,272

hsa-miR-3591-5p -0,278

hsa-miR-4657 -0,311

hsa-miR-92b-3p -0,262

hsa-miR-767-5p -0,275

hsa-miR-301a-3p 0,379

hsa-miR-146a-5p 1,174

hsa-miR-192-5p 0,524

hsa-miR-15a-5p 0,331

hsa-miR-5089-5p -0,249

hsa-miR-1275 -0,261

ANEXO

ANEXO AUTORIZAÇÃO DA DIRETORIA DO INSTITUTO EVANDRO CHAGAS PARA

UTILIZAÇÃO DOS ISOLADOS VIRAIS