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Institut für Organische Chemie und Biochemie

der Technischen Universität München

Anwendung NMR-spektroskopischer Methoden

zur Strukturaufklärung

von Proteinen und Peptiden

Angelika Kühlewein

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität München zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. St. Glaser

Prüfer der Dissertation:

1. Univ.-Prof. Dr. H. Kessler

2. Univ.-Prof. Dr. W. Hiller

Die Dissertation wurde am 18. September 2001 bei der Technischen Universität München eingereicht

und durch die Fakultät für Chemie am 11. Oktober 2001 angenommen.

Die vorliegende Arbeit entstand während meiner Tätigkeit als wissenschaftlicher Mitarbeiter

am Institut für Organische Chemie und Biochemie der Technischen Universität München in

Garching in der Zeit von Oktober 1998 bis Oktober 2001 unter der wissenschaftlichen

Betreuung von Professor Dr. Horst Kessler und PD Dr. Gerd Gemmecker.

Meinem akademischen Lehrer Professor Dr. Horst Kessler gilt mein besonderer Dank für

seine uneingeschränkte Unterstützung in allen Belangen, für die hervorragenden

Arbeitsbedingungen, für die freie und ungezwungene Arbeitsatmosphäre und für das mir

entgegengebrachte Vertrauen.

PD Dr. Gerd Gemmecker danke ich für die hervorragende Einführung in die NMR-

Spektroskopie, die Unterstützung meiner Arbeit und die vielen lehrreichen Gespräche und

Diskussionen während meiner Tätigkeit.

Mein weiterer Dank gilt:

- meinen Eltern, ohne deren vorbehaltlose Unterstützung weder das Studium noch die

Erstellung dieser Arbeit möglich gewesen wäre,

- Prof. Dr. Gunter Fischer (MPI Halle) für die hervorragende Zusammenarbeit an

Parvulin; dabei möchte ich vor allem Dr. Jens-Ulrich Rahfeld für die Bereitstellung

der Parvulin-Proben danken,

- Prof. Dr. Mäcke (Basel) und Dr. J. Schmidt für die hervorragende Zusammenarbeit an

DOTATOC,

- Dr. Manfred Schwaiger für das Wecken des NMR-Interesses,

- Georg Voll für die Strukturrechnungen und viele fruchtbare Diskussionen,

- Mandar Deshmukh für die Zusammenarbeit an Y-DOTATOC,

- Dr. Rainer Haeßner für seine unermüdliche Hilfe bei allen Kämpfen mit der Technik

und seiner ehrlichen Meinung,

- Dr. Jens Liermann für die Hilfe mit PASTA,

- meinen Praktikanten Markus Heller, Georg Eickerling und Fritz Mühlthau für ihre

selbständige und konstruktive Arbeit,

- Dr. Gerd Gemmecker, Markus Heller, Melina Haupt und Dr. Bernd Reif für das

Korrekturlesen der Arbeit,

- den Sekretärinen Frau Machule und Frau Bruckmaier für ihre Hilfe und Unterstützung

in allen Fragen der Organisation,

- allen weitern jetzigen und ehemaligen Mitgliedern des Arbeitskreises für das gute

Klima,

und meinem Mann Robert, der mich durch die Höhen und Tiefen des Studiums und der

Promotion begleitet hat.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Historische Entwicklung in der NMR-Spektroskopie 3

3 Strukturbestimmung von Parvulin 5

3.1 NMR-spektroskopische Grundlagen der Strukturaufklärung 5

3.2 Strategie der Strukturaufklärung 7

3.2.1 Zuordnung der chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats 8

3.2.2 Zuordnung der Seitenkettenresonanzen 12

3.2.3 Bestimmung der Sekundärstruktur-Parameter 14

3.2.4 Das NOESY-Experiment 15

3.3 Automatisierungen in der NMR 16

3.3.1 Automatisierung der Zuordnung der Rückgrat- und Seitenketten-Resonanzen 17

3.3.2 Automatisierung in der NOE-Zuordnung und Strukturrechnung 19

3.4 Biochemischer Hintergrund zu Parvulin 21

3.4.1 Die Proteinfaltung 21

3.4.2 Die PPIase-Familien 24

3.5 Materialien und Methoden 26

3.6 Zuordnung der chemischen Verschiebungen von Parvulin 10 27

3.6.1 Sequentielle Zuordnung 27

3.6.2 Zuordnung der Seitenkettenresonanzen 29

3.7 Die Sekundärstruktur von Par10 29

3.8 Tertiärstruktur von Parvulin 34

3.8.1 Strukturrechnung 34

3.8.2 Strukturdiskussion 39

3.9 Strukturvergleich der PPIasen 47

4 NMR-Studien von Metall-DOTATOC-Komplexen 54

Inhaltsverzeichnis II

4.1 Somatostatin und Somatostatin-Analoga 54

4.2 Strukturuntersuchungen am Peptidgerüst 60

4.3 Strukturuntersuchungen am DOTA-Liganden 64

4.3.1 Der Ga-DOTA-Komplex 64

4.3.2 Die Y- und In-DOTA-D-Phe-Komplexe 65

4.3.3 Lanthanid-DOTA-Komplexe 67

4.4 Paramagnetische Moleküle in der NMR-Spektroskopie 68

4.4.1 Grundlagen 68

4.4.2 Lanthanide als Pseudokontakt-Verschiebungsreagenzien 73

4.4.3 Besonderheiten der NMR-Experimente für paramagnetische Moleküle 74

4.5 Strukturuntersuchungen an Metall-DOTATOC-Komplexen 76

4.5.1 Probenbereitung 76

4.5.2 Ga-DOTATOC, Eu-DOTATOC und Y-DOTATOC 77

5 Zusammenfassung und Ausblick 87

6 Literaturverzeichnis 89

7 Anhang 99

7.1 Experimentelle Daten von Parvulin 99

7.1.1 Verzeichnis der an Par10 durchgeführten Experimente 99

7.1.2 Zuordnung der Par10-Resonanzen 101

7.2 Experimentelle Daten der Metall-DOTATOC-Komplexe 104

7.2.1 Verzeichnis der an DOTATOC-Komplexen durchgeführten Experimente 104

7.2.2 NMR-Daten des Ga-DOTATOC-Komplexes 106

7.2.3 NMR-Daten des Y-DOTATOC-Komplexes 110

7.3 Neu implementierte Pulsprogramme 111

7.3.1 Cβ-Hδ-Aromaten-Korrelation 111

7.3.2 Cβ-Hε-Aromaten-Korrelation 112

Abkürzungsverzeichnis III

Abkürzungsverzeichnis

Å Ångström

COSY correlated spectroscopy

CRINEPT cross-correlated relaxation-enhanced polarization transfer

CSI chemical shift index

DNA Desoxyribonukleinsäure

DOTA 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N’-N’’-N’’’N’’’’-tetraessigsäure

DOTATOC DOTA-D-Phe1-Tyr3-Octreotid

DTPA Diethylentriaminpentaessigsäure

δ chemische Verschiebung

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

FKBP FK bindendes Protein

γ gyromagnetisches Verhältnis

HSQC heteronuclear single quantum coherence

Hz Hertz

IC50 Inhibierungskonstante

INEPT insensitive nuclei enhanced by polarization transfer

JAB skalare Kopplungskonstante zwischen den Kernen A und B

kDa Kilo-Dalton

MHz Megahertz

MOLMOL molecule analysis and molecule display

MRI magnetic resonance imaging

ms Millisekunde

NMR nuclear magnetic resonance

Abkürzungsverzeichnis IV

NOE nuclear Overhauser enhancement

NOESY nuclear Overhauser and exchange spectroscopy

Par10 Parvulin 10

PASTA protein assignment by threshold accepting

PET Positronen-Emissions-Spektroskopie

ppb parts per billion

PPIase Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase

ppm parts per million

RMSD root mean square deviation

ROESY rotating frame Overhauser effect spectroscopy

SAR structure activity relationship

SSTR Somatostatin seven transmembrane receptor

T1 longitudinale Relaxationszeit

T2 transversale Relaxationszeit

TOCSY total correlated spectroscopy

TROSY transverse relaxation-optimized spectroscopy

TSP 3-(Trimethylsilyl)-propionsäure

τm Mischzeit oder Relaxationszeit durch chemischen Austausch

τr Relaxationszeit durch molekulare Rotation

τs Elektronenspin-Relaxationszeit

[U-13C/15N] uniform 13C und 15N isotopenmarkiert

Einleitung 1

1 Einleitung

Alle Lebewesen, mit Ausnahme der Viren, sind aus Zellen aufgebaut. Zellen gelten daher als

die Grundlage allen Lebens. Ihr gemeinsames Merkmal ist die Art der Vermehrung, die durch

Teilung erfolgt. Das Überleben der Zelle, deren Zyklus durch komplizierte

Regulationsmechanismen gesteuert wird, ist nur durch das Zusammenspiel aller

Komponenten der Zelle gewährleistet. Mutationen des Erbguts sind die häufigste Ursache für

eine Störung des geregelten Ablaufs in der Zelle. Eine Mutation der DNA kann entweder

vererbt werden, durch fehlerhaften Einbau bei Teilung oder durch Beschädigung durch äußere

Einflüsse auftreten. Erbkrankheiten sind beispielsweise die Phenylketonurie, bei der eine

Störung des Aminosäurestoffwechsels vorliegt oder die Cystische Fibrose, bei der ein

Ionenkanal im Cytoplasma gebildet wird, der nicht in die Zellmembran eingelagert werden

kann. Eine Mutation oder Beschädigung der DNA führt meist zur Apoptose der betroffenen

Zelle. In einigen Fällen kommt es aber nicht zum Sterben der Zelle, sondern es tritt

ungehindertes Wachstum der Zelle auf und führt zu Krebs.

Um in die Verkettung von Molekül- und Enzymreaktionen in einer Zelle gesteuert eingreifen

zu können, ist die Kenntnis der Funktionsweise und der Wechselwirkungen ihrer

Komponenten von großer Bedeutung. Da die Funktion von Proteinen in ihrer Struktur

begründet liegt, ist die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur ein wesentlicher Schritt

zum Verständnis der Reaktionsabläufe. Im Bereich der Strukturaufklärung mit atomarer

Auflösung haben sich zwei Methoden etabliert, die Röntgenstrukturanalyse und die NMR-

Spektroskopie.

Der Vorteil der Röntgenstrukturanalyse liegt in der Aufklärung großer Systeme und ihrer

weitgehenden Automatisierung. Wimberly et al. haben zum Beispiel im Dezember 2000 die

Struktur des Ribosoms S30 im Komplex mit Proteinen gelöst [1]. Der Nachteil dieser Methode

ist, dass das Protein im Kristall vorliegen muss. Die NMR-Spektroskopie beschränkt sich

dagegen heute noch auf kleinere Proteine und Komplexe, wobei immer größere Moleküle

durch technische und molekularbiologische Weiterentwicklungen zugänglich werden. Im

Kapitel 2 wird ein Überblick über die Entwicklung der NMR-Spektroskopie gegeben. Im

Gegensatz zur Röntgenstrukturanalyse liegen die Proteine bei der NMR-Spektroskopie in

Lösung vor, wodurch es möglich ist, sowohl die Struktur als auch dynamische Effekte des

Einleitung 2

Moleküls zu untersuchen. Viele Wechselwirkungen sind nur möglich, wenn Bereiche im

Molekül flexibel sind und sich dem Reaktionspartner anpassen können (induced fit).

Die Struktur eines Peptides oder eines Proteins ist ausschlaggebend für die Funktion und von

der Abfolge der Aminosäuren vorgegeben. In einer Zelle erfolgt die Faltung von Proteinen

jedoch nicht spontan, sondern wird durch Faltungshelfer, Chaperone und Enzyme unterstützt.

Die Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerisierung ist ein limitierender Schritt in der Faltung eines

Proteins. Die sogenannten Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) katalysieren diese

Reaktion. Das E. coli Parvulin 10 ist mit 10.1 kDa die kleinste PPIase der Parvulin-Familie,

die 1994 von G. Fischer entdeckt worden ist. Die Struktur von Parvulin 10 wurde durch

dreidimensionale NMR-Experimente an [U-15N]- und [U-15N/13C]- markierten Proteinproben

aufgeklärt (Kapitel 3). Zusätzlich wird in diesem Kapitel auf die Strategie der

Strukturaufklärung von Proteinen mittels NMR-Spektroskopie genauer eingegangen.

Die Wechselwirkungen zwischen Molekülen treten meist nur in einem kleinen Bereich des

Moleküls auf. Dadurch bietet sich für das Wirkstoffdesign die Möglichkeit niedermolekulare

Mimetika zu konstruieren, die an das Reaktionszentrum des Partnermoleküls binden und so

eine Reaktion inhibieren oder aktivieren können. Diese Wechselwirkungen zwischen den

Molekülen können NMR-spektroskopisch beobachtet werden. In der Industrie wird dieses

Verfahren zur Untersuchung von Struktur-Wirkungsbeziehungen (SAR by NMR) bereits

eingesetzt.

Das DOTATOC ist ein Beispiel dafür, wie das körpereigene Peptidhormon Somatostatin

durch Minimierung des Aminosäuregerüsts auf die wesentliche Bindungsstelle reduziert

werden konnte, ohne an Bindungsaffinität zu verlieren. DOTATOC (DOTA-D-Phe1-Tyr3-

Octreotid) bindet an die SST-Rezeptoren (Somatostatin seven transmembrane), die auf

verschiedenen Tumoren exprimiert werden. An den DOTA-Liganden (1,4,7,10-

Tetraazacyclododekan-N’-N’’-N’’’N’’’’-tetraessigsäure) werden unterschiedliche

Metallionen gebunden und in die Zelle eingeschleust. Durch die Variation der Metallionen

ändert sich auch die Bindungsaffinität. Das Ga-DOTATOC hat die größte Affinität gegenüber

dem SST-Rezeptor-2, Y-DOTATOC hat eine achtfach geringere Affinität. Das dritte

untersuchte DOTATOC-Derivat hat das paramagnetische Eu3+ im DOTA-Liganden

komplexiert. Mittels zweidimensionaler NMR-spektroskopischer Methoden wurde daher

untersucht, welchen Einfluss der DOTA-Metall-Komplex auf die dreidimensionale

Peptidstruktur nimmt (Kapitel 4). Im Kapitel 4 wird auch ein kurzer Einblick in die NMR-

Spektroskopie mit paramagnetischen Molekülen gegeben.

Historische Entwicklung in der NMR-Spektroskopie 3

2 Historische Entwicklung in der NMR-Spektroskopie

Seit der Entdeckung der kernmagnetischen Resonanz 1946 [2, 3] hat sich die NMR-

Spektroskopie als wichtiges Instrument in der Strukturaufklärung von Peptiden, Proteinen und

DNA-Fragmenten etabliert und rasant weiterentwickelt. Auf Grund der Entwicklung der

letzten 50 Jahre spaltet sich die NMR-Spektroskopie in drei Bereiche auf, in die NMR-

Spektroskopie in Lösung, in die Festkörper-Spektroskopie und in bildgebende Verfahren

(MRI) [4].

Die NMR-Spektroskopie nutzt die Tatsache, dass die Kernspins von Atomen durch ein

äußeres magnetisches Feld ausgerichtet werden können und nach den Gesetzen der

Quantenmechanik in diskreten Eigenenergiezuständen existieren. Bei der Einstrahlung eines

elektromagnetischen Feldes werden charakteristische Frequenzen absorbiert, die als

Resonanzsignale beobachtet werden können. Durch unterschiedliche lokale Umgebungen der

magnetisch zugänglichen Kerne ergeben sich unterschiedliche Resonanzfrequenzen, die als

chemische Verschiebungen wahrgenommen werden. Dadurch ist es möglich, Signale

einzelner Atome zu beobachten.

Der empfindlichste Kern ist das Wasserstoffisotop 1H, da es ein hohes gyromagnetisches

Verhältnis, eine natürliche Häufigkeit von 99.98 % und einen Kernspin mit dem Spinmoment

½ besitzt. Andere biologisch wichtige Kerne weisen ein wesentlich geringeres

gyromagnetisches Verhältnis auf und besitzen eine geringere Häufigkeit des beobachtbaren

Isotops. Die neben 1H für Biomakromoleküle wichtigsten Kerne, 13C und 15N, haben eine

natürliche Häufigkeit von 1.1 % bzw. 0.37 %.

Ein entscheidender Fortschritt in der Entwicklung der NMR-Spektroskopie war die

Einführung der Fourier-Transformation [5, 6] und die Entwicklung zweidimensionaler

Experimente [7, 8]. Zur Steigerung der Empfindlichkeit wurde die inverse Spektroskopie [9, 10]

eingeführt, bei der die Heterokerne durch das direkt gebundene Proton angeregt und detektiert

werden. Die klassische Strategie zur Strukturaufklärung von Proteinen mit der NMR-

Spektroskopie wurde 1986 von Wüthrich publiziert [11]. Nach dieser Methode wurden unter

ausschließlicher Verwendung homonuklearer zweidimensionaler NMR-Experimente zuerst

die Protonenspinsysteme der einzelnen Aminosäuren in COSY- und TOCSY-Spektren

charakterisiert. Anschließend erfolgte die sequentielle Verknüpfung über interresiduale

Historische Entwicklung in der NMR-Spektroskopie 4

Kontakte aus NOESY-Spektren. Dieser Ansatz ermöglicht die Aufklärung von Molekülen bis

maximal 10 kDa. Ab dieser Molekülgröße waren die Signalüberlagerungen und die

Linienbreiten der limitierende Faktor in der 2D-NMR-Spektroskopie. Erst durch die

Weiterentwicklung der NMR-Experimente, die Einführung einer dritten [12, 13] und vierten

Dimension [14] und die Anwendung 13C- und 15N-isotopenmarkierter Biomakromoleküle [15, 16]

wurde es möglich, Moleküle bis ca. 25 kDa zu untersuchen.

Mit der weiteren Zunahme der Molekülgröße nimmt die Linienverbreiterung und die

transversale Relaxation weiter zu. Der Übergang zu größeren Molekülen (> 25 kDa) ist durch

eine partielle oder vollständige Probendeuterierung oder eine selektive Isotopenmarkierung

möglich [17-19]. Die Einführung kreuzkorrelierter Relaxations-Experimente, der

TROSY-/CRINEPT-Techniken [20-22] führt zu einer Verbesserung der Kohärenzübertragung

und der Auflösung in den Spektren. Nicht auf NOEs basierende Methoden gewinnen immer

mehr an Bedeutung [23]. Die Grenze der momentan untersuchbaren Molekülgröße liegt zur

Zeit zwischen 65 kDa und 100 kDa [21, 24-26].

Strukturbestimmung von Parvulin 5

3 Strukturbestimmung von Parvulin

3.1 NMR-spektroskopische Grundlagen der Strukturaufklärung

Die modernen mehrdimensionalen Experimente beruhen größtenteils auf den Entwicklungen

in der zweidimensionalen Spektroskopie. Die Grundlage eines jeden Experiments ist die

Kohärenzerzeugung durch einen Puls und die Detektion der chemischen Verschiebung. Die

Kohärenz kann auf unterschiedlichen Wegen übertragen werden, durch skalare Kopplung,

dipolare Kopplung und Austausch.

Die skalare Kopplung wird zum Kohärenztransfer mittels eines COSY-Schrittes [7] zwischen

Kernen gleicher Art verwendet. Während der Zeit t1 entwickelt sich durch Spin-Spin-

Kopplung zum benachbarten Kern Antiphasemagnetisierung. Ein zweiter 90° Puls bewirkt

den Kohärenztransfer vom Kern I1 auf den Kern I2. Der Kohärenztransfer kann durch die

Refokussierung der Spin-Spin-Kopplung zum Kern I1 vervollständigt werden. Die Kohärenz

kann durch skalare Kopplung auch durch einen TOCSY-Schritt [27] übertragen werden. Dabei

wird hier zum Kohärenztransfer ein Spinlock eingesetzt. Während dieser Mischzeit werden

die effektiven chemischen Verschiebungen aufgehoben und die Spinsysteme stark gekoppelt.

Dadurch wird die Kohärenz über das gesamte Spinsystem verteilt.

Die Spin-Spin-Relaxation, die auf dipolarer Kopplung beruht, wird im NOESY-

Experiment [28] ausgenützt. Mit dem ersten 90°-Puls nach der Kohärenzerzeugung werden die

Gleichgewichts-Populationen der Kerne gestört und streben durch Kreuzrelaxation während

der Mischzeit wieder dem Gleichgewicht zu. Durch den darauffolgenden 90°-Puls wird die

Magnetisierung wieder in eine Kohärenz übertragen. Der Magnetisierungstransfer erfolgt

durch den Raum und ist indirekt proportional zur sechsten Potenz des Abstandes zweier

Kerne. Dadurch beinhaltet der Transfer Informationen über die räumliche Anordnung der

Atome.


Abbildung 3.1: Typische Werte der Kopplungskonstanten für 13C und 15N (in Hertz) von

Proteinen nach Bystrov [29] und Marshall [30].

Wie bereits angedeutet, hängt die optimale Übertragung der Kohärenz von der Entwicklung

des Antiphaseterms in der Evolutionszeit und damit von der Kopplung zwischen den beiden

Kernen ab. Aus diesem Grund kann die Periode der Kopplungsevolution (delay) nicht

beliebig verändert werden. Die durchschnittliche 3J-Kopplung zwischen zwei Protonen

beträgt 7 Hz und die Größe der Evolutionszeit typischerweise J2

1 = 71 ms. Je größer nun ein

Protein wird, desto schneller baut sich die Kohärenz durch Relaxationsprozesse ab und desto

weniger Kohärenz wird übertragen.

Durch die Isotopenmarkierung mit 13C und 15N werden Spin-½-Kerne eingeführt, die

ebenfalls zum Kohärenztransfer herangezogen werden können. Die heteronukleare 1J-

Kopplung ist dabei wesentlich größer, wodurch die Kohärenz schneller übertragen werden

kann. Die typischen Werte der heteronuklearen 1J-Kopplungen [29, 30] sind 120-140 Hz für 1H-

13Cali und ca. 90 Hz für 1H-15N. Der delay verringert sich dabei auf J2

1(C-H) = 4.2 - 3.5 ms

(bzw. J2

1 (N-H) = 5.5 ms). Die Werte der homonuklearen Kopplung in der aliphatischen

Seitenkette mit 30 Hz (13C-13C) erlauben auch hier einen guten Magnetisierungstransfer.


Zusätzlich lassen sich diese Heteroatome zur Entzerrung der Signale in weitere Dimensionen

heranziehen. Der INEPT-Transfer hat sich dabei als Standardübertragung der Kohärenz

zwischen Heteroatomen etabliert.

3.2 Strategie der Strukturaufklärung

Die Größe eines Moleküls bestimmt das Vorgehen zur Strukturaufklärung und die Wahl der

Experimente. Daraus ergeben sich auch die benötigten Isotopenmarkierungen. Die

Grundvoraussetzung jeglicher Strukturbestimmung ist die Zuordnung der chemischen

Verschiebungen. Die allgemeine Vorgehensweise der Proteinstrukturaufklärung ist in

Abbildung 3.2 dargestellt.

Abbildung 3.2: Allgemeine Strategie zur Aufklärung der Struktur von Proteinen

Bei kleinen Molekülen (<10 kDa) reicht die Kombination aus 1H-COSY- und TOCSY-

Experimenten, um eine Zuordnung der Resonanzen in den Spinsystemen zu erreichen. Die

sequentielle Information erhält man aus einem NOESY- [31] oder ROESY-Spektrum [32]. Bei

größeren Molekülen werden zusätzlich 15N- und 13C- Dimensionen genützt. So werden zum

Beispiel 3D-15N-HSQC-TOCSY oder –NOESY-Experimente [15, 16, 33] verwendet, die im

Prinzip die gleiche Information enthalten wie ihr zweidimensionales Pendant, nur dass sie

nicht alleine auf die Protonenverschiebungen, sondern auch (über die direkte HN-Kopplung)


auf 15N-Verschiebungen aufbauen. Mehrdimensionale Spektren können als Kombination der

zweidimensionalen Experimente betrachtet werden. So setzt sich der Name eines

mehrdimensionalen Experiments entweder aus den Bausteinen der 2D-Experimente

zusammen, wie z.B. das oben erwähnte 3D-15N-HSQC-TOCSY oder wird durch die am

Kohärenztransfer beteiligten Kerne gebildet, wie z. B. das CBCA(CO)NH-Experiment. Die

Kerne, die nicht detektiert werden, aber zum Kohärenztransfer verwendet werden, werden in

Klammern gesetzt.

3.2.1 Zuordnung der chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats

In Abbildung 3.3 ist eine Kombination aus Tripelresonanz-Experimenten für die Zuordnung

aller Rückgrat-Resonanzen eines doppelt markierten Proteins dargestellt.

Wie bei kleinen Molekülen ist der erste Schritt die Identifizierung der Rückgrat-Resonanzen

und der Spinsysteme. Dabei wird als Basis der meisten Experimente die NH-Gruppe

verwendet. Als Grundlage der Zuordnung dient entweder ein zweidimensionales 15N-HSQC

oder ein dreidimensionales HNCO [34, 35]. Darauf aufbauend werden durch komplementäre

Spektren die restlichen Rückgrat-Resonanzen ermittelt.


Abbildung 3.3: Kombination der Tripelresonanz-Experimente für die Zuordnung der

Rückgrat-Verschiebungen in einem doppelt markierten Protein. Die grau hinterlegten Kerne

werden detektiert, die weiß hinterlegten Kerne dienen dem Kohärenztransfer.

Die aussagekräftigsten Informationen lassen sich aus einer Kombination des HNCACB-

Experiments [36, 37] und des CBCA(CO)NH-Experiments [38] gewinnen. Das HNCACB enthält

gleichzeitig Cα(i), C

α(i-1), C

β(i) und Cβ

(i-1)-Verschiebungen. Die Cα- und Cβ-Signale lassen sich

durch entgegengesetzte Phasen leicht unterscheiden. Das eigene Spinsystem (i) und das

vorhergehende (i-1) können anhand der Intensität getrennt werden. In der Praxis haben die (i-

1)-Signale aber häufig zu schwache Intensitäten, weshalb die Ergänzung durch ein

CBCA(CO)NH-Spektrum nötig ist.


Die Cα- und Cβ-Verschiebungen besitzen die größte Bedeutung für die Zuordnung, da sie über

eine vergleichsweise große Dispersion verfügen (Cα ≈ 25 ppm, Cβ ≈ 60 ppm). Zusätzlich

werden die Cα- und Cβ-Verschiebungen für die Aminosäureerkennung genutzt, da viele

Aminosäuren charakteristische Kombinationen dieser beiden Werte besitzen.

Prolin ist aufgrund seines fehlenden Amidprotons nicht mit den oben genannten auf der HN-

Gruppe basierten Experimenten zu erfassen. Die Prolinverschiebungen werden daher meistens

indirekt über die (i-1) Verknüpfung (z.B. mit einem CBCA(CO)NH) oder durch spezielle

Experimente ermittelt [39, 40].

Je größer ein Molekül wird, desto mehr nimmt die transversale Relaxation zu. Durch die

Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und die chemische Verschiebungsanisotropie verstärkt sich

die Linienverbreiterung, und die Überlagerungen nehmen zu. Das TROSY-Experiment

verbessert die Auflösung, indem es durch seinen Phasencyclus in einem nicht Protonen-

entkoppelten Spektrum die Resonanzlinie auswählt, für die sich die Effekte der Dipol-Dipol

Kopplung und die chemische Verschiebungsanisotropie aufheben und damit das Signal

selektiert, das die langsamste T2-Relaxation hat [41] (Abbildung 3.4). Das TROSY kann bei

allen auf 15NH basierenden Experimenten verwendet werden [20]. Ähnliche Ansätze sind auch

für Experimente, die auf CH beruhen, bekannt [42, 43].

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung des TROSY-Effekts am Beispiel eines HN-N-

Signals in einem HSQC. A: entkoppeltes Spektrum, B: nicht entkoppeltes Spektrum, C:

Selektion eines Signals durch den TROSY-Phasencyclus.

Durch ein TROSY-Experiment werden die Signale schärfer und viele Überlagerungen lösen

sich auf. Dieser Effekt ist in den Spektrenausschnitten in Abbildung 3.5 deutlich zu erkennen.

Das 15N-HSQC und das 15N-TROSY wurden an dem Heterotetramer der N-Termini des East-

West-Proteins aus Ustilago maydis aufgenommen [44-46]. Der 58.8 kDa große Proteinkomplex

besteht aus zwei Heterodimeren, die aus je einer East- und einer West-Domäne aufgebaut

sind. Im 15N-HSQC-Spektrum sind nur sehr wenige breite Signale, die zusätzlich überlagert


sind, enthalten. Im Gegensatz dazu weist das 15N-TROSY-Spektrum wesentlich mehr und

schmalere Signale auf.

Abbildung 3.5: Vergleich eines Spektrenausschnitts aus einem 15N-TROSY (links) mit dem

gleichen Ausschnitt aus einem 15N-HSQC-Spektrum (rechts) vom Proteinkomplex der East-

West-N-Termini, gemessen bei 750 MHz und 295 K mit gleicher Auflösung und gleichem

Signal/Rausch-Verhältnis.

Durch die Deuterierung der Proteine werden ebenfalls Diffusions- und Relaxationswege

eliminiert [47]. Die Spindiffusion kann bei perdeuterierten Proteinen nicht mehr auftreten, da

die Protonen als Übertragungskerne fehlen. Bei teilweise deuterierten Proteinen ist der Effekt

der Dipol-Dipol-Wechselwirkung schon deutlich abgeschwächt. Bei der Perdeuterierung von

Proteinen werden alle nicht austauschenden Protonen durch Deuterium ersetzt. Deuterium hat

eine kleinere gyromagnetische Konstante als das Proton (γD=0.15*γH). Der Effekt durch die

Deuterierung ist besonders auffällig, da die Abhängigkeit der dipolaren Kopplung zum

gyromagnetischen Verhältnis zum Quadrat eingeht. Bei der Probendeuterierung muss jedoch

ein Mittelweg zwischen günstigster Relaxationszeit und Ausdünnung der Protonen und damit

Verlust der Information im Protein gefunden werden [48, 49].

Je nach Deuterierungsgrad können nicht mehr alle Experimente, wie sie oben vorgestellt

worden sind, verwendet werden, da die Informationen der deuterierten Protonen in der


Kohärenzübertragung fehlen. Aus diesem Grund wird beispielsweise das CBCA(CO)NH

meist durch das HN(CO)CACB-Experiment [50] ersetzt.

3.2.2 Zuordnung der Seitenkettenresonanzen

Die Bestimmung der chemischen Verschiebungen der Seitenketten beruht meistens auf

TOCSY- oder COSY-Schritten. In Abbildung 3.6 sind drei typische 3D-Seitenketten-

Experimente gezeigt.

Abbildung 3.6: Beispiele für dreidimensionale NMR-Experimente zur Zuordnung der

Seitenketten-Resonanzen.

Experimente, die auf der eigenen oder auf der nächsten Amidgruppe basieren, sind im

allgemeinen einfacher auszuwerten als Spektren, die nur 13C-1H-Verschiebungen beinhalten,

da die Amidverschiebungen oft klarer zu erkennen sind als die 13C-Resonanzen. So werden in

einem 15N-TOCSY-HSQC [15, 16, 33, 51] alle Protonen eines Spinsystems detektiert, die auf der

eigenen NH-Gruppe aufbauen. Durch Variation der Spinlockzeit kann man mehr oder

weniger weit die Seitenkettensignale erfassen.

Das (H)CC(CO)NH-TOCSY-Experiment verbindet die 13C-Signale eines Spinsystems mit der

nachfolgenden Amidgruppe. Dieses Experiment kann auch in den Variationen HC(CCON)H-

TOCSY und H(CCCO)NH-TOCSY verwendet werden [52-54]. Aus diesem Satz an Spektren

kann man alle Seitenketten-Resonanzen erhalten. Da bei den Experimenten eine hohe Anzahl

von Magnetisierungstransfers, vor allem auch über den schnell relaxierenden Cα-Kern

stattfindet, ist bei größeren Proteinen eine partielle Deuterierung empfehlenswert. Das

C(CO)NH-TOCSY-Experiment [55] wird bei perdeuterierten Proteinen eingesetzt, da hier

völlig auf die nicht austauschenden Protonen verzichtet wird.


Im HCCH-TOCSY-Experiment [56, 57] sind alle 13C- und 1H-Signale der aliphatischen

Seitenkette korreliert. Durch die hohe Signalanzahl kommt es jedoch bei größeren Proteinen

schnell zu Überlagerungen. Das HCCH-COSY-Experiment [58] beruht auf einem 13C,13C-

COSY-Schritt und verbindet 1H-13C-Signale mit den benachbarten 13C-Resonanzen in der

aliphatischen Seitenkette. Die beiden zuletzt genannten Experimente liefern die gleiche

Information, aber durch die geringere Anzahl der Signale für eine Kohlenstoffverschiebung

im HCCH-COSY-Experiment sind die Überlagerungen wesentlich geringer ausgeprägt. Die

Verknüpfung mit den bereits bekannten Rückgrat-Resonanzen erfolgt über die Cα und Cβ-

Verschiebungen.

Die Resonanzen der aromatischen Seitenketten haben für die Strukturbestimmung ebenfalls

eine große Bedeutung. Die aromatischen Hδ- und Hε-Resonanzen können mit dem Cβ-Hδ/ε-

Korrelationsexperiment ermittelt werden [59]. Die Magnetisierung wird dabei nur über skalare

Kopplungen übertragen. Je nach Anzahl der COSY-Schritte kann das Hδ- oder das Hε-Signal

detektiert werden. In Abbildung 3.7 ist das Pulsschema des Cβ-Hδ/ε-Korrelationsexperiments

gezeigt. Der Magnetisierungstransfer läuft wie folgt:

im Cβ-Hδ-Experiment Hβ → Cβ (t1) → Cγ → Cδ → Hδ (t2)

im Cβ-Hε-Experiment Hβ → Cβ (t1) → Cγ → Cδ → Cε → Hε (t2)

H

Cβ

∆ ∆

Carom

G

T-t /21 ξ T+t /21

∆1 ∆2 ∆2 ∆3

∆4

GARP∆1

DIPSY

∆3

∆4

Abbildung 3.7: Korrelationsexperiment zur Bestimmung der Hδ oder Hε-Resonanzen für

Aromaten [59]. Die Pulse in Klammern sind für den COSY-Transfer-Schritt vom Cδ auf das

Cε nötig, ohne die Klammer erhält man die Hδ-Resonanzen, mit den Pulsen in der Klammer

die Hε-Resonanzen. Die abgerundeten Balken symbolisieren selektive Pulse.


Die für einen effizienten Kohärenztransfer bei diesem Experiment benötigten Werte der

Kopplungskonstanten, sind in Abbildung 3.1 enthalten.

3.2.3 Bestimmung der Sekundärstruktur-Parameter

Die Ermittlung der Sekundärstruktur eines Proteins beruht auf bis zu vier Parametern, auf

dem chemischen Verschiebungsindex (CSI), auf den 3JHNHA-Kopplungen, auf dem

Amidprotonen-Austausch und auf charakteristischen NOE-Kontakten.

Nach der Zuordnung des Proteinrückgrats kann man den chemischen Verschiebungsindex

(CSI) der Cα-, Cβ-, Hα- und CO-Atome bestimmen. Die verschiedenen Atome erfahren in

einer Helix und in einer Faltblattstruktur eine charakteristische Hochfeld- oder

Tieffeldverschiebung [60]. Als Referenzwerte werden die chemischen Verschiebungen für

random coil-Werte der entsprechenden Aminosäuren verwendet [61, 62]. So werden in helikalen

Bereichen die Hα- und Cβ-Signale zu tieferen Werten verschoben, die Cα- und CO-Signale zu

höheren Werten. Für Aminosäuren, die in einem Faltblatt liegen, verhalten sich die Cα-, Cβ-,

Hα- und CO-Verschiebungen entgegengesetzt. Die Verschiebungseffekte der

Sekundärstruktur auf die Cβ-Signale sind für helikale Bereiche weniger ausgeprägt als im

Faltblatt. Tritt über einen längeren Bereich eine konsistente Sekundärstrukturvorhersage auf,

kann das als Indiz für das tatsächliche Vorliegen dieses Sekundärstrukturelements gewertet

werden. Die Grenzen der Methode liegen bei der exakten Bestimmung der Länge und der

Lage der Sekundärstruktur, sowie einer ausreichend genauen Vorhersage in Bereichen

höherer Flexibilität. Daher muss die Sekundärstrukturvorhersage aus dieser Methode durch

weitere Parameter unterstützt werden.

Aus dem HNHA-Experiment werden die 3JHNHα-Kopplungskonstanten nach folgender Formel

berechnet:

)2(tan2 ξπ HHdiagonal

kreuz JS

S −=

JHH ist die 3JHNHα-Kopplung, die aus Skreuz (Intensitäten der Kreuzsignale) und Sdiagonal

(Intensität der Diagonalsignale) bestimmt wird. Die Kopplungskonstanten enthalten

Informationen über die Sekundärstruktur, da die HNHα-Kopplungswerte typisch für einzelne


Sekundärstrukturen sind. Für α-Helices liegen die Kopplungskonstanten bei 3 bis 4 Hz, im

Faltblatt bei etwa 9 Hz [63].

Die genaueste Bestimmung der Sekundärstruktur erhält man aus den NOE-Signalen. Je nach

Sekundärstruktur-Elementen treten charakteristische NOEs auf. α-helikale Bereiche zeichnen

sich vor allem durch kurze HN(i)-HN

(i+1)-Abstände aus. Zusätzlich treten noch charakteristische

Hα(i)-H

N(i+3)- und Hα

(i)-HN

(i+4)-NOE-Kontakte auf. Die β-Faltblattstrukturen lassen sich durch

kurze sequentielle HN(i)-Hα

(i-1)-Abstände identifizieren. Da die β-Stränge entweder parallel

oder antiparallel angeordnet sind, findet man charakteristische NOEs zwischen den Strängen,

wodurch gleichzeitig die Lage der Stränge zueinander festgelegt wird.

Eine ergänzende Methode ist die Bestimmung der Austauschraten der Amidprotonen mittels

des MEXICO-Experiments [64] oder durch die Verschiebung der Resonanzen in Abhängigkeit

von der Temperatur. Amidprotonen, die in Wasserstoffbrücken involviert sind und sterisch

abgeschirmte Protonen haben eine verminderte Austauschrate, wodurch die

Sekundärstrukturbereiche zusätzlich bestätigt werden.

Die Anwendung dieser Verfahren ist in Kapitel 3.7 gezeigt.

3.2.4 Das NOESY-Experiment

Zur Bestimmung der Tertiärstruktur und der dazu benötigten interatomaren Abständen

bedient man sich des Kern-Overhauser-Effekts (Nuclear Overhauser Effect NOE). Mit dem

NOESY ist es möglich Protonenabstände bis ca. 5 Å zu messen. Der Magnetisierungstransfer

erfolgt durch Kreuzrelaxation, die auf dipolarer Wechselwirkung der Kerne beruht und

entspricht der Intensitätsänderung der Resonanz durch Anregung benachbarter Kerne [65]. Bei

großen Proteinen treten jedoch Probleme auf, da die Intensität der Spektren durch transversale

Relaxation abnimmt und die Signalüberlagerungen zunehmen. Die Hauptursache der

Linienverbreiterung ist dabei die Dipol-Dipol-Wechselwirkung. Bei der Deuterierung der

Proteine wird die dipolare Relaxation reduziert und die Empfindlichkeit des NOESY-

Experiments wieder gesteigert [66-69]. Andererseits reduziert die Deuterierung die Anzahl der

für die Detektion vorhandenen Protonen und die Empfindlichkeit nimmt wieder ab. Bei

perdeuterierten Proteinen stehen nur die austauschbaren Protonen, vor allem die

Amidprotonen zur Verfügung. Diese Signale sind auf Grund der Unterdrückung vieler


anderer Relaxationswege durch die Deuterierung sehr intensiv. Es kann aber keine

Information zu den Seitenketten gewonnen werden [49].

Bei partiell deuterierten Proteinen muss zwischen drei unterschiedlichen Arten der

Kreuzsignale unterschieden werden: NOE-Signale zwischen zwei austauschenden Protonen

(HN-HN), NOE-Signale zwischen einem austauschenden Proton mit einem Proton, das nicht

austauscht (HN-H) und NOE-Signale von nicht austauschenden Protonen (H-H).

Die Intensitäten der HN-HN-NOE-Signale von deuterierten Protonen sind im Vergleich zu

NOEs von nicht deuterierten Proteinen höher. Die durchschnittliche Intensität der HN-H-

NOEs bei partiell deuterierten und nicht deuterierten Proteinen bleibt dagegen ungefähr

gleich [48, 67, 70]. Die Erhöhung der Intensität, die durch die verlängerte Relaxationszeit und die

Einschränkung der Relaxationswege erreicht wird, wird durch die fehlenden Protonen

kompensiert. Gravierender ist allerdings der Intensitätsverlust durch die fehlenden Protonen

bei den H-H-NOE Signalen, wodurch eine partielle Deuterierung nicht mehr lohnenswert

ist [15, 71].

Aus diesen Überlegungen heraus ist ein NNH-NOESY-Experiment [72] für perdeuterierte

Proben gut geeignet, ein 15N-NOESY-HSQC- und ein CNH-NOESY-Experiment [73, 74] noch

für partiell deuterierte Proteine, wohingegen NOESY-Spektren, die auf 13C basieren, wie das 13C-NOESY-HSQC und das CCH-NOESY [75] an nicht deuterierten Proben aufgenommen

werden sollten.

3.3 Automatisierungen in der NMR

Wegen der Fülle an Informationen, die man aus den einzelnen Spektren erhält, bietet es sich

an, die Auswertung der Daten zu automatisieren. Eine Möglichkeit der Automatisierung liegt

in der Zuordnung der Rückgrat- und Seitenkettenresonanzen, eine andere in der

automatischen Zuordnung der NOESY-Spektren. Ein alternativer Lösungsansatz basiert auf

der Rückrechnung einer „auf Homologie gerechneten“ Struktur in ein NOESY-Spektrum und

auf dem Vergleich mit dem experimentell ermittelten Spektrum. Mit diesem Verfahren wird

gehofft, dass die Zuordnung der Resonanzen überflüssig würde.


3.3.1 Automatisierung der Zuordnung der Rückgrat- und Seitenketten-

Resonanzen

Die Zuordnung der Rückgrat-Resonanzen eines Proteins ist ein sehr zeitintensiver Schritt, der

aber gut automatisierbar ist. Dazu wurde das Programm PASTA (protein assignment by

threshold accepting) von Dr. M. Leutner und Dr. J. Liermann am Lehrstuhl für Organische

Chemie und Biochemie II entwickelt [76, 77]. Als Grundlage der Zuordnungsstrategie wird eine

Pseudo-Reste-Liste verwendet, die sämtliche Verschiebungen der Cα-, Cβ-, CO-, Hα- und Hβ-

Resonanzen enthält. Die Basis der Liste für die Zuordnung bildet die Amidgruppe. Die HN/N-

Resonanzen werden entweder aus einem 15N-HSQC- oder aus einem HNCO-Experiment

gewonnen. Die weiteren chemischen Verschiebungen können aus verschiedenen

dreidimensionalen Experimenten eingelesen werden und werden automatisch den

Amidverschiebungen zugeordnet. Anschließend können die Daten manuell korrigiert und

überprüft werden. Die Korrektur der Liste ist wegen eventueller Überlagerungen und

Artefakte ratsam. In Abbildung 3.8 sind die möglichen Spektren zusammengefasst, die

PASTA in die Pseudo-Reste-Liste einlesen kann. Damit enthält eine Pseudo-Reste-Liste alle

bekannten Daten des eigenen Aminosäure-Rückgrats und die Hβ/Cβ-Resonanzen, so wie die

sequentielle (i-1)-Information.


Abbildung 3.8: Experimente, die bei PASTA in die Pseudo-Reste-Liste eingelesen werden

können [78].

Zusätzlich bietet das Programm die Option, eine einfache Aminosäureerkennung

durchzuführen. Diese basiert auf den chemischen Verschiebungen der Cα- und Cβ-Kerne eines

Aminosäurerestes. Ausgehend von den random coil-Verschiebungen treten für die

Aminosäuren Alanin, Glycin, Serin, Threonin und Valin typische Verschiebungen auf, die oft

eine eindeutige Identifikation ermöglichen. Außerdem können die Aminosäuren Isoleucin,

Phenylalanin und Thyrosin auf Grund ihrer Ähnlichkeit als Gruppe erkannt werden.

Die Hauptaufgabe von PASTA ist jedoch die sequentielle Zuordnung der Reste in der Liste.

Dies geschieht mittels einer kombinatorischen Minimierungsmethode, dem threshold

accepting. PASTA arbeitet mit einer Pseudo-Energie, durch die bewertet wird, ob die

Resonanzen der Verschiebungen der (i-1)-Reste gut mit den i-Resonanzen der möglichen

vorhergehenden Aminosäure zusammen passen. Wenn die Übereinstimmung der Resonanzen

in der Pseudo-Reste-Liste gegeben ist, dann ist die Pseudo-Energie gering. Passt jedoch einer

der Resonanzen nicht, wird die Energie auf einen hohen Wert gesetzt und die Sequenzierung

an dieser Stelle unterbrochen. Mit diesem Programm ist es möglich die langwierige

sequentielle Zuordnung zu beschleunigen.


Weitere Details zur Programmierung, Implementierung und Datenverwaltung sowie die

Weiterentwicklung von PASTA sind an anderer Stelle beschrieben [78].

Das Programm PASTA wurde zur Sequenzierung der Rückgrat-Resonanzen von Parvulin

verwendet (Kapitel 3.6.1).

Die Automatisierung der Seitenketten ist bisher wegen des Auftretens starker Überlagerungen

oder unvollständigen Magnetisierungstransfers im Spinsystem erschwert. Verschiebungslisten

müssen manuell erzeugt und sorgfältig korrigiert werden, wodurch der zeitliche Aufwand

wieder sehr hoch wird. Aufgrund dieser Problematik besitzt die vollautomatische

Seitenkettenzuordnung noch keine Bedeutung. Bisher gibt es erst zwei Lösungsansätze für

dieses Problem [79, 80].

3.3.2 Automatisierung in der NOE-Zuordnung und Strukturrechnung

Auch in den NOESY-Spektren ist die Anzahl der Signale sehr hoch, wodurch Überlagerungen

sehr häufig auftreten. Dadurch werden Automatisierungsansätze zur NOE-Zuordnung

erschwert. Im Programm SYBYL (Tripos AG, St. Louis, MO) ist ein NOE-

Zuordnungsprogramm enthalten. Das Programm benötigt eine Startstruktur, die zum Beispiel

auf Homologiedaten basieren kann und eine Liste, in der möglichst komplett alle Resonanzen

der Aminosäuren enthalten sind (master spreadsheet). Durch ein automatisches peak picking

wird in SYBYL aus dem Spektrum eine Verschiebungsliste mit allen NOE-Signalen erzeugt.

Durch Vergleich der NOE-Verschiebungsliste mit der Resonanzliste können nun die NOE-

Signale zugeordnet werden, die intraresidual sind oder in sequentieller Nachbarschaft liegen

(NNNOE) und unter Berücksichtigung der Struktur auch zusätzlich räumlich benachbarte

Signale (IDNOE) in einem frei gewählten Abstand.

Ein anderer erfolgsreicher Automatisierungsansatz für die NOE-Zuordnung ist das Programm

ARIA von Nilges et al. [81]. ARIA verwendet ein iteratives Verfahren, das an die

Strukturrechnung gekoppelt ist. Das Programm benötigt ebenfalls eine Startstruktur, die im

Verlauf des Verfahrens immer weiter verfeinert wird. Dabei wechseln sich Schritte zur NOE-

Suche und zur Strukturrechnung ab. ARIA setzt zur Rechnung die Methode des simulated

annealing ein. Die Voraussetzung für eine möglichst genaue Bestimmung der NOE-Signale

ist eine vollständige Zuordnung der Verschiebungen aller Resonanzen. Zwischen den


einzelnen Iterationsschritten empfiehlt sich ein manuelles Überprüfen der NOE-Zuordnungen,

da Fehlzuordnungen zu einer schlechten Konvergenz der Struktur führen.

Ein anderer Ansatz zur NOE-Zuordnung ist die Simulation eines NOESY-HSQC-Spektrums

ausgehend von einer Startstruktur sowie einer Zuordnungsliste und der Vergleich des

simulierten und des experimentellen NOESY-HSQC-Spektrum. Dieses Verfahren ist die

Grundlage von AUREMOL (Universität Regensburg, Prof. Kalbitzer, Regensburg,

Deutschland), das in Kombination mit AURELIA (Bruker, Karlsruhe, Deutschland)

angewendet werden soll. Ein Vorteil von AUREMOL ist, dass auch gefaltete Spektren leicht

bearbeitet werden können. Für 2D-NOESY-Spektren ist dieses Verfahren unter dem Namen

RELAX bekannt [82].

Zur Strukturberechnung werden zwei Methoden eingesetzt: die Distanzgeometrie und

kraftfeldbasierte Rechenverfahren.

Die Distanzgeometrie ist eine Methode zur Ermittlung struktureller Informationen aus

Atomabständen [83-85]. Die Abstände werden in einem definierten Bereich variiert, um eine

optimale Konformation für das gesamte Molekül zu erhalten. Ein bekanntes

Distanzgeometrie-Programm ist DIANA von Güntert et al. [86], das in SYBYL enthalten ist.

Bei der Kraftfeldrechnung wird, im Gegensatz zur Distanzgeometrie, sowohl die Struktur als

auch die Dynamik eines Moleküls bestimmt. Dies geschieht im Allgemeinen mit

kombinatorischen Minimierungsalgorithmen wie z.B. simulated annealing. Eine Kombination

aus der Distanzgeometrierechnung und der Kraftfeldrechnung stellt das Programm XPLOR

von Brünger et al. [87] dar.


3.4 Biochemischer Hintergrund zu Parvulin

3.4.1 Die Proteinfaltung

Die Tertiärstruktur eines Proteins ist bereits durch die Abfolge seiner Aminosäuren festgelegt,

so dass sich ein Protein normalerweise spontan faltet und in seiner nativen Konformation ein

globales Minimum der freien Energie erreicht (Anfinsen-Theorem) [88]. Das Ziel einer Zelle

ist die möglichst schnelle Faltung der Proteine noch während der Bildung der Primärstruktur

an den Ribosomen, um Aggregation zu verhindern. Dazu werden in der Zelle eine Reihe von

faltungsunterstützenden Chaperonen und Enzymen eingesetzt.

Die Funktion von Chaperonen ist noch nicht genau bekannt, aber ihre Anwesenheit bei der

Faltung ist notwendig, um eine Aggregation zu vermeiden und um eine schnellere Faltung zu

gewährleisten. Die Chaperonaktivität basiert auf der selektiven Affinität der Chaperone für

nicht-native Proteine, z.B. für Proteine mit hydrophoben Resten an der Oberfläche. Chaperone

können auch im Komplex mit Enzymen vorkommen.

Ein Enzyme kann so definiert werden, dass es im Gegensatz zum Chaperon keine Energie

benötigt und als Biokatalysator der einfachen Michaelis-Menten-Beziehung folgt. Enzyme

besitzen eine bekannte Funktion, die sich in ihrem Namen widerspiegelt, z.B. Disulfid-

Isomerasen, PPIasen, Kinasen usw. Zusätzlich verfügen Enzyme über ein gut definiertes

aktives Zentrum. Enzyme und Chaperone weisen eine große Anzahl an Gemeinsamkeiten auf.

Es handelt sich in beiden Fällen um hochkonservierte Familien, die im Überfluß in allen

Zellen in allen Lebewesen vorhanden sind.

Levinthal hat 1968 postuliert, dass bei der Faltung eines denaturierten Proteins wegen der

großen Anzahl von Freiheitsgraden im Proteinrückgrat, das Protein nie in den energieärmsten

Zustand gelangen dürfte (Levinthal-Paradoxon) [89, 90]. Es gilt als Paradoxon, da es

experimentell bewiesen ist, dass ein denaturiertes Protein wieder nativ gefaltet wird. Die

Peptidbindungen sind die einzig starren Elemente im Rückgrat, da nur zwei Konformationen,

cis oder trans (ω = 0° oder ω = 180°), möglich sind. Die Planarität der Peptidbindung kommt

durch den partiellen Doppelbindungscharakter der Carbonylkohlenstoff–Stickstoff-Bindung


zustande. Die anderen Rückgratbindungen sind in ihren Freiheitsgraden nicht eingeschränkt.

In Abbildung 3.9 ist ein Peptidausschnitt mit der Definition der Rückgratwinkel dargestellt.

Abbildung 3.9: Peptid mit Rückgratwinkeln φ zwischen CO und Cα, ψ zwischen Cα und N

und ω zwischen N und CO. Die Seitenkette wird durch die Winkel χ definiert und ist hier nicht

berücksichtigt.

Die Rotation der Peptidbindung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Faltung

zum nativen Protein und damit ein potentielles Ziel für die Katalyse in der Proteinfaltung. Die

Proteine werden am Ribosom in der trans-Konformation gebildet und liegen im nativen

Protein, bis auf ca. 7% der Xaa-Pro-Peptidbindungen, auch meist in dieser Konformation

vor [91]. Die in der Zelle vorkommenden Enzyme, die diesen Schritt katalysieren, werden

PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) genannt. Die PPIasen sind die einzigen

Enzyme, die einen Übergangszustand stabilisieren, der von seinem Grundzustand nur durch

den Unterschied im Torsionswinkel abweicht. Der grundlegende Schritt in der Katalyse der

cis/trans-Isomerisierung ist die Störung der p-Orbital-Wechselwirkung des

Carbonylkohlenstoff der vorhergehenden Aminosäure mit dem freien Elektronenpaar des

Amidstickstoffs von Prolin, wodurch die Aktivierungsenergie der Drehung herabgesetzt und

die Isomerisierung beschleunigt wird. Dazu wurden einige hypothetische

Reaktionsmechanismen mit kovalenter oder nicht kovalenter Bindung des Enzyms an das

Substrat vorgeschlagen:


1) Das Enzym reagiert als Nukleophil und addiert an den Carbonylkohlenstoff. Dadurch

ändert sich die Hybridisierung des Kohlenstoffatoms von sp2 nach sp3, wodurch die

Orbital-Überlagerungen nicht mehr auftreten können [92, 93].

2) Das Enzym reagiert als Elektrophil mit dem freien Elektronenpaar des

Amidstickstoffs, wodurch dessen p-Orbitale zur Wechselwirkung nicht mehr zur

Verfügung stehen [94].

3) Das Enzym verdreht bei der Wechselwirkung mit dem Substrat den Winkel der Prolyl-

Peptidbindung auf ω = 90 °. Der Transfer des Substrats aus dem wässrigen Medium in

hydrophobe Enzymbereiche setzt die benötigte Aktivierungsenthalpie für diesen

Schritt frei (conformational twist mechanism) [95-97]. Aufgrund der p-Orbital-

Symmetrie ist so keine Wechselwirkung zwischen der Carbonylgruppe und dem freien

Elektronenpaar des Amidstickstoffs möglich.

4) Das Enzym überträgt eine positive oder negative Ladung auf die Prolyl-Peptidbindung

des Substrats [94].

Für das Parvulin Pin1 ist ein Modell des Katalysemechanismus aufgestellt worden, der auf

dem oben vorgeschlagenen Mechanismus 1 beruht [98]. In Kapitel 3.9 wird darauf noch

genauer eingegangen.

Abbildung 3.10: Darstellung der cis-trans-Konformationen für Prolin.


3.4.2 Die PPIase-Familien

Bisher sind drei Familien der PPIasen, die Cyclophiline, die FK-bindenden Proteine (FKBP)

und die Parvuline bekannt.

1984 ist die erste PPIase von G. Fischer entdeckt worden. Erst 1989 hat sich herausgestellt,

dass diese PPIase und das auch 1984 von Handschumacher et al. [99] entdeckte Cyclophilin,

ein Protein, das durch die Inhibierung von Cyclosporin bekannt geworden ist, identisch

sind [93, 100]. Cyclophiline treten in allen Bereichen der Zelle auf. Cyclophilin A (CypA)

kommt im Cytosol der Zelle vor, CypC im Endoplasmatischen Retikulum und CypD in

Mitochondrien. Cyp40 findet man, wie CypA, im Cytoplasma, wo es an das Chaperon Hsp90

gebunden wird. Erst durch diese Komplexbildung ist z.B. eine korrekte Faltung des Steroid-

Rezeptors möglich [101].

Die zweite Familie, die FK-bindenden Proteine (FKBP), haben ihren Namen daher, dass sie

durch die Makrolide FK506 und Rapamycin inhibiert werden können. Cyclosporin und

FK506 werden nach Organtransplantationen als Immunsuppressiva eingesetzt, um die

Abstoßung des fremden Organs zu unterdrücken [102, 103]. Aus diesem Grund werden

Cyclophilin und FKBP auch Immunophiline genannt. Die FKBP-Familie ist ebenfalls in allen

Zellbereichen zu finden und übernimmt eine große Anzahl von Aufgaben [104, 105].

Die dritte Familie, die Parvuline, ist 1994 auch im Institut von G. Fischer gefunden

worden [106, 107]. Der erste Vertreter seiner Familie, das Parvulin 10 (Par10), wurde aus E. coli

isoliert. Durch DNA-Sequenzvergleiche hat man viele andere Vertreter dieser Familie in Eu-

und Prokaryoten gefunden. Das E. coli Par10 ist mit einer molaren Masse von 10.1 kDa das

kleinste bisher gefundene Parvulin. Es ist aus 92 Aminosäuren aufgebaut (SWISS-PROT:

PPIC_ECOLI, P39159, E.C. 5.2.1.8). Par10 kommt im Cytoplasma der E. coli Zelle vor und

ist wahrscheinlich in die zelluläre oxidative Stressantwort eingebunden [108].

Im Menschen sind bisher zwei Vertreter dieser Familie gefunden worden, das hPin1 und das

hPar14 [109, 110]. Das hPin1 regelt den G2/M Übergang im Mitose-Zyklus. Die Affinität von

hPin1 beschränkt sich auf phosphorylierte Serine und Threonine vor einem Prolin. Ein Fehlen

von hPin1 führt zum Stopp der Mitose und zur Apoptose der Zelle. Die Funktion von hPar14

ist bisher noch nicht geklärt, jedoch wird vermutet, dass es an die DNA binden kann.


Für die Familie der Parvuline ist bisher noch kein selektiver Inhibitor gefunden worden. Das

Juglon (5-Hydroxy-1,4-naphthoquinon) inhibiert das Parvulin irreversibel, indem es an die

Cysteine bindet. Diese Bindung ist aber nicht selektiv [111]. Die Bindung des Juglons an die

Cysteine von Par10 führt wahrscheinlich zu einer teilweisen Entfaltung des aktiven Zentrums,

worauf der Aktivitätsverlust zurückgehen kann.

In Abbildung 3.11 werden einige Sequenzen von Parvulin-Homologen verglichen. Die

Unterfamilie der Pin1-Homologen, hPin1, Pin1 aus Mäusen, Dodo aus Drosophila und Ess1

aus der Hefe haben einen längeren Einschub zur Bindung der phosphorylierten Aminosäure

vor dem Prolin.

�� PPIC_ECOLI 1 AKTAAALHILVKEEK--------------LALDLLEQIKNGADFGKLAKKH--------- SALMONELLA 1 MAKMAAALHILVKEEK--------------LALDLLEQIKNGGDFEKLAKKH--------- CENARCHAEU 1 MADKIKCSHILVKKQG--------------EALAVQERLKAGEKFGKLAKEL--------- Par14 33 GGGNAVKVRHILCEKHG--------------KIMEAMEKLKSGMRFNEVAAQY--------- PIN1_HUMAN 51 QEPAKVRCSHLLVKHSQSRRPSSWRQEKITRSKEEALELINGYIQKIKSGEED--FESLASQ Mus-Pin1 51 QEPAKVRCSHLLVKHSQSRRPSSWRQEKITRSKEEALELINGYIQKIKSGEED--FESLASQ DOD_DROME0 52 GAPDEVHCLHLLVKHKGSRRPSSWREANITRTKEEAQLLLEVYRNKIVQQEAT--FDELARS ESS1_YEAST 54 RHPVRVRCLHILIKHKDSRRPASHRSENITISKQDATDELKTLITRLDDDSKTNSFEALAKE consensus lHiLvk -------------- ld le ik g f kla ---------

�� WW PPIC_ECOLI 38 –SI CP- SGKRGGDLGEFRQGQMVPAFDKVVFSCPV-L -EP—-T-GPLHTQFGYHIIKVLYRN SALMONELLA 39 –SI CP- SGKKGGHLGEFRQGQMVPAFDKVVFSCPV-L -EP—-T-GPLHTQFGYHIIKVLYRK CENARCHAEU 39 -SIDGGSAKRDGSLGYFGRGKMVKPFEDAAFRLQV-G- E- V—S-EPVKSEFGYHVIKRLG Par14 70 -SED—KARQGGDLGWMTRGSMVGPFQEAAFALPVSGMDKPVFTDPPVKTKFGYHII MVEGRK PIN1_HUMAN 111 F SDCS- SAKARGDLGPFSRGQMQKPFEDASFALRT-G-E-M—S-GPVFTDSGIHIILRTE Mus-Pin1 113 FSDCS-SAKARGDLGPFSRGQMQKPFEDASFALRT-G- E- M—S-GPVFTDSGIHIILRTE DOD_DROME0 113 YSDCS-SAKRGGDLGKFGRGQMQAAFEDAAFKLNV-N- Q- L—S-GIVDSDSGLHIILRKA ESS1_YEAST 117 RSDCS-SYKRGGDLGWFGRGEMQPSFEDAAFQLKV-G- E- V—S-DIVESGSGVHVIKRVG consensus -S c -sgkrgGdLG f GqMv aFd Fs v- -e-p—t -gpl t fGyHiIk l

Abbildung 3.11: Vergleich der Sequenzen einiger Homologe der Parvulin-Familie;

PPIC_ECOLI steht für das Par10. In den Sequenzen der Unterfamilie der Pin1-Homologen

(PIN1_HUMAN bis ESS1_YEAST) ist der Aminosäureeinschub für die spezifische

Aminosäureerkennung zu erkennen. Über den Sequenzen steht die für Par10 gefundene

Sekundärstruktur. Der consensus gibt die Übereinstimmung der Aminosäuren in den

Sequenzen an. Die schwarz hinterlegten Felder in den Sequenzen sind gleiche Aminosäuren,

die grau hinterlegten Felder ähnliche Aminosäuren. Der Sequenzhomologie-Vergleich wurde

mit dem Programm FASTA [112-114] erstellt und anschließend manuell nachbearbeitet.


Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Zuordnung der 1H-, 13C- und 15N-Resonanzen des

Parvulin 10 unter Verwendung mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie sowie die

Aufklärung der Tertiärstruktur.

3.5 Materialien und Methoden

Das Parvulin 10 aus E. coli wurde in der Max Planck Forschungsstelle für „Enzymologie der

Proteinfaltung“ in der Gruppe von G. Fischer exprimiert und gereinigt, wie von J.-U. Rahfeld

et al. beschrieben [106, 107]. Die Probenbedingungen wurden auf 10 mM Phosphatpuffer, pH 6

und 295 K eingestellt. Zusätzlich waren im Puffer noch 0.1 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM

NaN3, 1 mM DTE und 10 % D20 enthalten. Unter diesen Bedingungen waren die Proben zwei

bis vier Wochen stabil. Für die NMR-spektroskopischen Untersuchungen wurden 0.8 mM

[U-15N]-markierte und 0.8 mM [U-13C, 15N]-markierte Par10 Proben verwendet.

Die NMR-Experimente an Parvulin 10 wurden an DMX600- und DMX750-Spektrometern

der Firma Bruker bei Protonenfrequenzen von 600.40 MHz bzw. 600.13 MHZ und 750.13

MHz durchgeführt. Die verwendeten Spektrometer sind mit mindestens vier unabhängigen

Frequenzkanälen, abgeschirmten 3-Achsen-Feldgradienten und Tripel- bzw. Quadrupel-

Probenköpfen ausgestattet. Die Protonenverschiebungen sind auf externes TSP (295 K, pH

7.0) bezogen, die 13C- und 15N-Verschiebungen wurden über die Frequenzverhältnisse Ξ

kalibriert [115].

Die NMR-spektroskopischen Experimente an der [U-15N]-markierten Probe wurden von

Dr. M. Huenges am DMX600 durchgeführt. Die Experimente mit der [U-13C/15N]-markierten

Parvulin 10 Probe wurden am DMX 750 und am DMX600 aufgenommen.

Die Experimente und die wichtigsten Parameter sind im Anhang in Kapitel 7.1.1

zusammengefasst.


3.6 Zuordnung der chemischen Verschiebungen von Parvulin 10

3.6.1 Sequentielle Zuordnung

Die sequentielle Zuordnung der 1H-, 13C- und 15N-chemischen Verschiebungen des Parvulin-

Rückgrats erfolgte unter Zuhilfenahme des automatischen Zuordnungsprogamms

PASTA [76, 77]. Das Verfahren beruht auf der Erstellung einer Pseudo-Reste-Liste mit den

Resonanzen HN, N, Cα, Cαi-1, Cβ, Cβi-1, CO, COi-1, Hα und Hαi-1 für jede Aminosäure und

einem Algorithmus zur Bewertung der Sequenzierung der Reste. Zusätzlich enthält das

Programm noch eine Aminosäureerkennung, die auf den Cα/Cβ-Verschiebungen der Atome

beruht.

Zur Erstellung der Pseudo-Reste-Liste wurde eine 15N-HSQC-Signal-Liste als Grundlage

verwendet. Da das Protein aus 92 Aminosäuren besteht, sind die Überlagerungen im 15N-

HSQC nur sehr gering. Abbildung 3.12 zeigt das 15N-HSQC-Spektrum mit der Zuordnung der

Amidgruppen. Aus den Amidprotonenverschiebungen von ca. 6.4 ppm bis 10 ppm und der

guten Dispersion kann man erkennen, dass die Sekundärstruktur aus einem Faltblatt-Anteil

bestehen muss. Da im Par10 fünf Proline enthalten sind, wurden nur 87 Signale für das

Proteinrückgrat erwartet. Die HN-Signale der Arginin-Seitenketten waren nicht sichtbar,

dafür waren sechs NH2-Gruppen der Seitenketten von Glutamin und Asparagin zu erkennen.

Nachdem zusätzlich eine Signal-Liste eines HNCO-Spektrums in die Pseudo-Reste-Liste von

PASTA eingelesen wurde, konnten Artefakte aus der 15N-HSQC-Liste eliminiert und die

Überlagerungen aufgelöst werden.

Aus einer Kombination von HNCACB, CBCA(CO)NH, HA(CACO)NH und HNHA wurden

die Verschiebungen der Rückgrat-Signale zugeordnet und in ihre sequentielle Reihenfolge

gebracht. Dabei entstanden mit Hilfe von PASTA sechs charakteristische Bruchstücke, die

jeweils durch die Proline unterbrochen wurden. Die Zuordnungsstrategie und das Programm

PASTA sind in Kapitel 3.3 ausführlicher beschrieben.


Abbildung 3.12: 15N-HSQC Spektrum von Par10; die sequentielle Zuordnung der

Amidsignale des Protein-Rückgrats ist angegeben. Die Signale der Seitenketten sind durch

einen Strich verbunden. Da die Zuordnung der Seitenketten nicht komplett war, ist sie in der

Abbildung weg gelassen worden.


3.6.2 Zuordnung der Seitenkettenresonanzen

Um die Resonanzen der Seitenketten zuordnen zu können, wurde wie in Kap. 2 beschrieben,

vorgegangen. Aus den Experimenten 15N-TOCSY-HSQC, HCCH-TOCSY, HCCH-COSY

und (H)CCCONH konnten über 90% aller Seitenkettensignale zugeordnet werden. Die

chemischen Verschiebungen der Seitenketten wurden vor allem mit dem HCCH-TOCSY- und

HCCH-COSY-Experiment zugeordnet. Dabei wurde die 13C-TOCSY-Mischzeit mit 18.9 ms

so gewählt, dass möglichst alle 13C-Resonanzen zu erkennen waren. Durch Überlagerungen

war die Auflösung der Hγ- und Hδ-Protonen der Lysin-, Leucin- und Isoleucin-Seitenketten

nur teilweise möglich. Manche Überlagerungen in den Seitenketten konnten durch die

Zuhilfenahme des 13C-NOESY-HSQC-Experiments aufgelöst werden. Aus dem 15N-TOCSY-

HSQC konnten nur die Hα- und Hβ-Protonen, teilweise noch die Hγ-Protonen zugeordnet

werden. Die Hδ- und Hε-Protonen der aromatischen Systeme wurden über Cβ-Hδ/ε-

Korrelationsexperimente bestimmt [59]. Die NH2-Gruppen der Asparagin-Seitenketten konnten

bereits aus dem CBCA(CO)NH-Experiment eindeutig zugeordnet werden, da die Cβ- und Cα-

Verschiebungen sowohl vom Rückgrat wie auch von der Seitenkette aus beobachtet wurden.

Die chemischen Verschiebungen von Par10 sind im Anhang in Tabelle 7.1 zusammengefasst.

3.7 Die Sekundärstruktur von Par10

Die Sekundärstrukturbestimmung erfolgte aus einer Kombination von vier voneinander

unabhängigen Parametern: aus der Abweichung der chemischen Verschiebung für

ungeordnete Peptide gegen die Verschiebung von Aminosäuren in geordneten

Strukturelementen (CSI), aus den 3JHNHα-Kopplungskonstanten, aus dem Amidprotonen-

Austausch mit dem Lösungsmittel und aus den für Sekundärstruktur relevanten NOEs.

Der CSI (chemical shift index) wird als Grundlage für die Sekundärstrukturbestimmung

verwendet, da die chemischen Verschiebungen der Cα-, Cβ-, CO- und Hα-Atome von der

Sekundärstruktur abhängen [61, 62]. α-Helices führen zu einer negativen Abweichung von den

random coil Werten für Hα- und Cβ-Verschiebungen und zu positiven Abweichungen für die

Cα- und CO-Verschiebungen. Die Werte für β-Faltblätter verhalten sich genau

entgegengesetzt. Nur eine über einen längeren Bereich gleichbleibende Abweichung von den


random coil-Werten kann als Vorhersage für die Sekundärstruktur herangezogen werden. In

Abbildung 3.13 sind die Abweichungen der chemischen Verschiebungen von Par10 von den

random coil-Werten für Cα, Hα, Cβ und CO graphisch dargestellt. Die gefundenen

Faltblattbereiche sind hellgrau, die helikalen Bereiche dunkelgrau eingefärbt. Man kann

deutlich erkennen, dass die Sekundärstruktur von Par10 mit einem Faltblatt-Strang beginnt.

Danach folgen drei helikale Bereiche, ein kurzer Faltblatt-Strang und eine vierte Helix. Das

Protein hat an seinem C-Terminus zwei weitere Faltblatt-Stränge. Durch den CSI erhält man

erste Tendenzen, aber die Genauigkeit dieser Methode reicht nicht aus, um die exakten

Bereiche der Sekundärstruktur festlegen zu können. Zum Vergleich sind über den

Diagrammen die tatsächlichen Bereiche der Sekundärstruktur aufgetragen.

Die Bestimmung der 3JHNHα-Kopplungskonstanten ist eine dazu ergänzende Methode. Durch

den Nachweis der typischen Winkel in helikalen oder Faltblatt-Bereichen kann man ebenfalls

die Anwesenheit der Sekundärstrukturen bestätigen. Große Kopplungskonstanten deuten auf

eine Faltblatt-Struktur hin, kleine Kopplungskonstanten auf helikale Bereiche.


Abbildung 3.13: Graphische Darstellung der Abweichung der chemischen Verschiebungen

in Par10 von den random coil-Werten für die betreffenden Aminosäuren. Ganz oben ist die

aus allen Daten ermittelte Sekundärstruktur aufgetragen.


Mit Hilfe des MEXICO-Experiments [64] kann der Lösungsmittel-Austausch der

Amidprotonen beobachtet werden. Es hat sich gezeigt, dass Amidprotonen, die in einer

stabilen Wasserstoffbrücke involviert sind, keine Austauschsignale haben. Für Par10 sind in

den Bereichen der Faltblätter und in den Helices Wasserstoffbrücken zu erwarten. Die

Auswertung des MEXICO-Experiments ist in Kapitel 3.8.2 beschrieben.

Das aussagekräftigste Kriterium ist jedoch die Anwesenheit typischer NOE-Muster. Für einen

helikalen Bereich sind intensive HNi-H

Ni+1-Signale typisch, ebenso wie Hα

i-HN

i+3-und Hαi-

HNi+4-Kontakte. Ein Faltblatt zeichnet sich vor allem durch kurze HN

i-Hα

i-1-Abstände aus.

In Abbildung 3.14 sind der CSI, die Kopplungskonstanten und die typischen NOEs mit der

daraus ermittelten Sekundärstruktur zusammengefasst. Der Faltblatt-Strang 1 reicht von

Aminosäure Thr 3 bis Val 11, die drei folgenden Helices von Glu 14 bis Gly 27, von Phe 30

bis Lys 36 und von Gly 43 bis Gly 47. Der kleine Faltblattstrang 2 geht von Gly 50 bis

Arg 53. Die danach folgend Helix 4 erstreckt sich von Ala 60 bis Ser 67, die Faltblatt von

Thr 74 bis Thr 79 und der C-terminale Faltblattstrang 4 von Gly 82 bis Leu 89. Zwischen den

beiden letzten Faltblatt-Strängen ist in den Strukturrechnungen eine βI-Schleife gefunden

worden, die auch durch die vorhandenen NOE-Signale wahrscheinlich ist.

Alle Faltblatt-Bereiche und die Helices 1, 2 und 4 sind durch die oben beschriebenen vier

Kriterien gut definiert. Helix 3 ist durch die Daten weniger gut charakterisiert. Der exakte

Bereich dieser Helix wurde daher nur durch die NOE-Kontakte festgelegt.


Abbildung 3.14: Übersicht über die für die Sekundärstruktur relevanten NOEs und 3JHNHα-

Kopplungen von Par10. Die Höhe der Kästchen symbolisiert die ermittelten Intensitäten der

NOEs, so wie die Größe der Kopplungskonstanten. Im Diagramm sind auch die aus dem

Konsensus-CSI folgenden Sekundärstrukturelemente aufgetragen (h für Helix, b für Faltblatt).

Über der Aminosäuresequenz ist jeweils die aus allen Parametern ermittelte Sekundärstruktur

angegeben.


3.8 Tertiärstruktur von Parvulin

3.8.1 Strukturrechnung

Zur Bestimmung der räumlichen Struktur wurden die Abstände aus den NOE-Daten der vier

NOESY-Spektren (15N-NOESY-HSQC, 13C-NOESY-HSQC, CNH-NOESY und CCH-

NOESY) verwendet. Des weiteren wurden in der Strukturrechnung die 3JHNHα-

Kopplungskonstanten und die Austauschraten berücksichtigt.

Die Strukturrechnung von Par10 in Lösung basiert auf 1207 konformationellen

Strukturparametern, die sich wie folgt zusammensetzen: 1067 Abstände aus den NOE-

Integralen, 42 gemessene 3JHNHα-Kopplungskonstanten, 30 Wasserstoffbrücken und 68 φ/ψ-

Winkel aus den CSI-Daten für die helikalen Bereiche. Als Startstruktur wurde die ungefaltete,

gestreckte Aminosäuresequenz verwendet.

Die simulated annealing Rechnungen wurden mit dem Programsm ARIA (ambiguous

restraints in iterative assignment, Version 0.53), anschließende Verfeinerungen mit dem

Programm XPLOR durchgeführt. Aus den so erhaltenen Strukturen wurden unter Betrachtung

der Energien und der Struktureigenschaften 18 konvergente Strukturen ausgesucht, die eine

Standardabweichung (RMSD) der gemittelten Rückgratkoordinaten der Schweratome von

0.50 Å aufwiesen. Aus den 18 Strukturen (SA) wurde eine gemittelte Struktur <SA> erzeugt,

die anschließend noch regularisiert wurde <SA>r. In Tabelle 3.1 sind die experimentell

ermittelten Strukturparameter der 18 Strukturen und der regularisierten gemittelten Struktur

sowie ihre mittleren Verletzungen zusammengefasst. Aus den RMSD-Werten ist ersichtlich,

dass die Strukturen gut definiert sind.


Tabelle 3.1: Strukturstatistik von Parvulin

Wurzel der Standardabweichung ( RMSD) von

SA

18 Strukturen

<SA>r

regularisierte

Struktur

Distanzen [Å]

Alle NOEs (1097) 0.023 0.018

Intraresiduale NOEs (494) 0.017 0.011

Sequentielle NOEs (272) 0.034 0.026

NOEs mittlerer Reichweitea) (133) 0.023 0.023

Weitbereich NOEsa) (168) 0.019 0.015

Wasserstoffbrücken (30) 0.006 0.012

Diederwinkel [º] (68) 0.098 0.096

3JHNHa-Kopplungskonstanten [Hz] (42) 0.906 0.817

Abweichungen von der idealen kovalenten Geometrie

Bindungslängen [Å] 0.002 0.002

Bindungswinkel [º] 0.561 0.532 a) mittlere Reichweite: zwischen 2 und 4 Aminosäuren entfernt; Weitbereich: ab 5 Aminosäuren Entfernung

Die Konvergenz der Strukturen geht aus der Streuung der Atomkoordinaten gegenüber der

gemittelten Struktur und gegenüber der regularisierten, gemittelten Struktur hervor. Diese

Daten sind in der Tabelle 3.2 zusammengefasst.

Tabelle 3.2: Zusammenfassung der RMSD-Werte für die Schweratome

SA gegen <SA> SA gegen <SA>r

Rückgrat Alle Rückgrat Alle

Alle Reste 0.85 ± 0.14 1.39 ± 0.16 1.17 ± 0.20 1.87 ± 0.15

Sekundärstruktur 0.58 ± 0.11 1.15 ± 0.14 0.87 ± 0.09 1.64 ± 0.14

β-Faltblatt, α1, α2, α4 0.50 ± 0.06 1.05 ± 0.13 0.79 ± 0.07 1.56 ± 0.15


Die Qualität der Struktur wird mit dem Programm PROCHECK ermittelt. Zu den überprüften

Parametern gehört auch die φ,ψ-Winkelverteilung im Ramachandran-Diagramm. In

Abbildung 3.15 ist das Ramachandran-Diagramm für Par10 gezeigt. Das Diagramm zeigt,

dass 83 % der bewerteten Reste im bevorzugten Bereich liegen. In flexiblen Bereichen kommt

es jedoch zu gemittelten und damit auch zu widersprüchlichen NOE-Abstandsdaten. Um das

zu berücksichtigen müsste eigentlich eine Rechnung durchgeführt werden, die NOEs zeitlich

während der Dynamiksimulation mittelt (time averaged NOE dynamics simulation) [116-118].

Dies würde jedoch die derzeitigen Rechenresourcen überfordern. Daher bleiben zwei

mögliche Vorgehensweisen. Die eine Möglichkeit besteht darin, gezielt nur solche NOEs zu

verwenden, die für die vermutete Hauptkonformation sprechen. Die andere, hier gewählte

Möglichkeit benutzt alle gemessenen NOEs in der Rechnung, wodurch ein unverfälschteres

Bild der Wirklichkeit widergegeben wird, das jedoch zu einem höheren Anteil von

Aminosäureresten im verbotenen Bereich des Ramachandran-Diagramms führt. Der hier

gefundene Anteil von 2.6 % setzt sich aus Aminosäuren in flexiblen Bereichen sowie der

Termini zusammen.


Abbildung 3.15: Ramachandran –Diagramm für die regularisierte, gemittelte Struktur von

Parvulin, erstellt mit dem Programm PROCHECK [119]. Die Abstufung entspricht dem

bevorzugten Bereich (rot), dem erweitert erlaubten Bereich (gelb), dem großzügig erlaubten

Bereich (hellgelb) und dem verbotenen Bereich (weiß) der Lage der einzelnen Aminosäuren

(■). Helikale Strukturen haben eine Winkelkombination, die in den Bereich A fällt, ideale

Faltblattstrukturen liegen im Bereich B und linksgängige Helices im Bereich L. Vier

Aminosäuren (Y90, Q56, I39, A28) fallen in den geringfügig erlaubten Bereich. Für Glycine

(p) gelten die angegebenen Vorzugsbereiche nicht.


Tabelle 3.3: φ, ψ-Winkelverteilung im Ramachandran-Diagramm, ermittelt mit dem

Programm PROCHECK [119]

SA (18 Strukturen) <SA>r

Bevorzugter Bereich 82.8 82.9

Erweitert erlaubter Bereich 9.6 13.2

Großzügig erlaubter Bereich 4.9 2.6

Verbotener Bereich 2.6 1.3

Die MD-Rechnungen wurden in Zusammenarbeit mit Dipl.-Chem. G. Voll durchgeführt. Eine

genauere Beschreibung der Rechenprotokolle und der Qualitätsanalyse der Struktur ist in [120]

zu finden.


3.8.2 Strukturdiskussion

Die für Par10 gefundene Struktur wurde in der PDB-Datenbank unter 1JNS and 1JNT

hinterlegt.

Die für E. coli Par10 gefundene Faltung entspricht der typischen Parvulin-Faltung, wie sie

bereits für die Homologen hPin1 und hPar14 ermittelt wurde. In der Abbildung 3.16 ist die

Topologie von Par10 gezeigt. In Abbildung 3.17 ist das antiparallele Faltblatt mit den

Wasserstoffbrücken und den NOE-Kontakten zwischen den Strängen dargestellt. In der

Abbildung 3.18 ist die tertiäre Faltung von Par10 mit Sekundärstrukturmerkmalen gezeigt.

Abbildung 3.16: Topologie von Par10 ; die schwarz ausgefüllten Pfeile symbolisieren die

HN-HN-NOEs, die nicht ausgefüllten Pfeile die Hα-Hα-NOEs. Die Ausbuchtung im Faltblatt

drei stellt den Knick dar, der durch das Pro 76 verursacht wird.


NN

NN

N H

H

H

H

HO

O

O

OO

H

H

H

HH

O

NH

68

10

5054

8685

H

O

NH

H

N

O

H

NN

NN H

O

N

NN

NN

N

H

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

O

O

O

O

O

O

O

O

H

H

H

H H

H

H

H

H

O

N

H

N H

H

O

NH

8890

1N

NN

H

H

H

O

O

OH

H

H

O

N H

NN

NN

NN

NH

2

H

H

H

H

H

O

O

O

O

O

OH

H

H

H

H

H

H

N

HOH

O

H

H

O

N H

H

82

80

78

β1β2 β3β4

N

N

H

HO

OH

7774

H OH75

76

5152

53

23

45

79

1211 83

8789

81

79

84

N

Abbildung 3.17: Schematische Darstellung des viersträngigen antiparallelen β-Faltblatts.

Die Pfeile repräsentieren die experimentell beobachteten NOEs zwischen den verschiedenen

Strängen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden die Seitenketten, mit Ausnahme des

Pro 76, nicht dargestellt. Die jeweilige Aminosäure ist an der Cα-Position angegeben.


Abbildung 3.18: Schematische Darstellung der Par10-Struktur als Stereobild mit

Sekundärstrukturmerkmalen (erstellt mit dem Programm MOLMOL) [121, 122].

Das antiparallele β-Faltblatt hat die Abfolge 2143 und ist stark gebogen. Die Helices 1 und 2

liegen auf der konvexen, die Helix 4 auf der konkaven Seite des β-Faltblatts. Das Faltblatt

umschließt die Helix 4 leicht. Zwischen der Helix 4 und dem Faltblatt bildet sich eine Spalte,

in der das aktive Zentrum liegt. In der Bindungstasche befinden sich viele hochkonservierte,

lipophile Reste. In der Abbildung 3.19 ist die lipophile Bindungstasche deutlich zu erkennen.

Helix 4 ist durch zwei flexible Schlaufenregionen am Faltblatt aufgehängt. Damit ein

lipophiles Oligopeptid binden und interagieren kann, muss vermutlich Helix 4 etwas vom

Faltblatt weg bewegt werden. Helix 3 liegt leicht nach hinten versetzt neben dem Faltblatt auf

der Höhe der lipophilen Spalte.


PHE81PHE61

HIS84

HIS8

LEU49

Helix 4 Helix 4

Abbildung 3.19: Lipophile Oberfläche von Par10; die hydrophilen Reste sind blau

eingefärbt, die neutralen Reste grün und die hydrophoben Reste braun. Die hydrophobe

Spalte im Zentrum des Proteins ist deutlich zu erkennen und wird auf der einen Seite von

Helix 4 begrenzt. Die hochkonservierten Reste His 8, Leu 49, Phe 61, Phe 81 und His 84

liegen ebenfalls in dieser Region. Die rechte Darstellung ist zur linken um 90° um die

horizontale Achse gedreht.

Die Flexibilität der Struktur kann man aus den MEXICO-Daten ablesen, aus denen der

Austausch der HN-Protonen mit dem Lösungsmittel hervorgeht. Die Amidprotonen ohne

meßbaren Austausch sind entweder sterisch abgeschirmt oder in stabile intramolekulare

Wasserstoffbrücken involviert. In Abbildung 3.20 sind die Daten aus dem MEXICO-

Experiment zusammen mit der Tertiärstruktur dargestellt und in Abbildung 3.21 das

MEXICO-Spektrum mit der Zuordnung wie für das HSQC-Spektrum.

Im β-Faltblatt von Par10 wird, mit Ausnahme der Protonen von Leu 10 (schwach), His 78 und

Val 88, kein HN-Protonen Austausch beobachtet. Das steht im Einklang mit den

Wasserstoffbrücken für die Faltblattstruktur, da die beobachteten Signale entweder am Rand

der Faltblattstränge liegen und damit noch leicht flexibel sind oder nach außen zeigen. Die

Reste Gln 80 und Phe 81 liegen in den Positionen i+1 und i+2 der βI-Schleife und zeigen

einen starken Austausch.

Durch das Fehlen der MEXICO-Signale in den Helices 1, 2 und 4 kann geschlossen werden,

dass die jeweiligen Amidprotonen auch in Wasserstoffbrücken eingebunden sind. Die


Amidprotonen Gly 43, Gly 46 und Gly 47 in der Helix 3 zeigen mittelstarken bis schwachen

Austausch. Im Vergleich mit allen Strukturparametern kommt man zu dem Ergebnis, dass die

Helix 3 flexibler und nicht so gut definiert ist, wie die anderen drei Helices

Abbildung 3.20: Par10-Tertiärstruktur mit MEXICO-Daten. Das rechte Bild ist zum linken

Bild um 180° um die horizontale Achse gedreht. Die rot eingefärbten Strukturteile sind

Amidprotonen mit starken Signalen im MEXICO-Spektrum, orange Einfärbungen

symbolisieren mittelstarken Austausch der Amidprotonen und gelbe Bereiche schwachen

Austausch.


Val 88

His 78

Phe30

Cys 40

Glu 54

Lys 2Asp 29

Glu56Glu 72

Met 57 oder Ala 60

Ser 42

Gly 55

Cys 68

Gln80Thr 3

Gly 75 Ser 67

Gly 82

Ser 38

Gly 47

Leu 71 oder Thr 79

Phe 81Val 65 oder Lys 35

Seitenkettensignale

Gly 46

Gly 43

Leu 10

Abbildung 3.21: MEXICO-Spektrum von Par10 mit einer Mischzeit von 200 ms; die

sequentielle Zuordnung der Amidsignale des Protein-Rückgrats ist angegeben.


Die Flexibilität ist in der Struktur in Abbildung 3.22 noch einmal mit der Tertiärstruktur

dargestellt. Die RMSD-Werte weisen auch auf eine erhöhte Flexibilität im Bereich um Helix

3 hin. Die Gegenüberstellung der RMSD-Werte mit der Anzahl der NOEs pro Aminosäure

zeigt, dass trotz gleichbleibender Zahl der NOEs pro Aminosäure die Unbestimmtheit der

Struktur im Bereich der Helix 3 zunimmt (Abbildung 3.23).

Abbildung 3.22: Projektion der Standardabweichung auf die Struktur von Par10. Die

Struktur ist in MOLMOL aus einem Ensemble von Par10 mit dem Makro sausage.mac erzeugt

worden. Der N-Terminus und der C-Terminus sowie der Bereich nach dem Faltblatt 2 weisen

die größte Standardabweichung auf. Die Faltblattstränge und die Helices 1 und 2 zeigen

kleine Standardabweichungen.


Abbildung 3.23: Vergleich der lokalen RMSD-Werte mit der Anzahl der NOEs pro

Aminosäure. Im unteren Diagramm zeigen die hellgrauen Balken die Anzahl aller NOEs, die

schwarzen Balken die Weitbereichs-NOEs.


3.9 Strukturvergleich der PPIasen

E.coli Par10 ist der Grundtyp der Parvulin-PPIase-Familie, da es den minimalen Aminosäure-

Satz für die katalytische PPIase-Aktivität enthält. Es besitzt, im Gegensatz zu vielen

homologen Parvulinen, keine zusätzliche N-terminale Domäne. Von Interesse ist das Par10

Homologe hPin1, weil es eine hohe Substratspezifität für phosphoryliertes Serin oder

Threonin vor dem Prolin aufweist. Die Pin1-Unterfamilie enthält zusätzlich meist eine N-

terminale WW-Domäne, die für Protein/Protein-Wechselwirkungen verantwortlich ist. Das

hPin1-Protein ist beim Menschen in die Mitose involviert und greift dort am G2/M-

Kontrollpunkt ein. Wenn hPin1 fehlt, kommt es zum Stopp der Mitose und zur Apoptose der

Zelle. In der PPIase-Domäne der hPin1-Struktur ist eine zusätzliche Schleife zu erkennen, die

für die spezifische Bindung der phosphorylierten Seitenketten verantwortlich ist (Abbildung

3.24).

Neben dem hPin1 wurde im Menschen ein weiteres Parvulin-Homologes gefunden, das

hPar14 (humanes Parvulin, 14 kDa). Dieses Protein besitzt einen 34 Aminosäuren langen,

unstrukturierten N-Terminus, der nicht zur PPIase-Aktivität beiträgt und sehr viele Glycine

enthält. Es wird vermutet, dass der N-Terminus mit der DNA wechselwirkt [123]. Zusätzlich

hat es einen weiteren Aminosäure-Einschub im C-terminalen Bereich, dessen Funktion aber

noch nicht bekannt ist. hPar14 weist eine erhöhte Affinität zu Substraten mit positiv

geladenen Resten vor dem Prolin auf. In Abbildung 3.24 sind die drei homologen, bisher

bekannten Parvulin-Strukturen von hPin1, Par10 und hPar14 mit ihren

Sekundärstrukturelementen dargestellt. In Abbildung 3.25 wurden die Sequenzen von Par10,

hPar14 und hPin1 nochmals gegenübergestellt und die Aminosäure-Einschübe grau

hervorgehoben. Dabei sind die N-terminalen Domänen von hPin1 und hPar14 weggelassen

worden. In den Strukturen für Par10 und hPin1 existiert Helix 3 als definierte

Sekundärstruktur, in der Struktur von hPar14 ist an dieser Stelle nur eine Schlaufenregion zu

erkennen.


Abbildung 3.24: Strukturvergleich der drei homologen Parvuline, Par10, hPin1 und hPar14.

Von hPin1 und hPar14 sind nur die PPIase-Domänen gezeigt. Der Pfeil deutet auf die

unterschiedlichen Einschübe bei hPin1 und hPar14. An der Stelle, an der in hPin1 und Par10

Helix 3 definiert ist, wird in hPar14 nur eine Schlaufenregion erkannt.

Alle drei Homologe besitzen im Faltblattstrang 3 ein Prolin, dass einen Knick im Faltblatt

verursacht. Für diesen Knick ist im Par10 das Prolin 76 verantwortlich. Der Knick führt dazu,

dass die Wasserstoffbrücken im Faltblatt nicht mehr richtig ausgebildet werden können. Die

Cβ-Verschiebung mit 34.47 ppm in Par10 deutet auf eine cis-Konformation hin, die Cγ

Verschiebung mit 26.31 ppm ist dagegen typisch für ein trans-Prolin [124]. Im CCH-NOESY

sind eindeutige NOE-Signale enthalten, die eine cis-Prolin-Konfiguration bestätigen. Diese

Signale sind in den anderen NOESY-Spektren nicht eindeutig, da sie von den Verschiebungen

der anderen Proline überlagert werden. Die NOEs von den Gly75 Hα-Protonen zum Pro76 Cδ

fehlen, im Gegensatz dazu sind die Signale zum Pro76 Cα sichtbar. Ebenso sind die

Rücksignale (Pro76 Hα zu Gly75 Cα) vorhanden und die Signale von Pro76 Hδ1 und Hδ2 zu

Gly75 Cα fehlen. Daraus kann geschlossen werden, dass das Prolin im Par10 in der cis-

Konfiguration vorliegt.

Im Gegensatz zum E. coli Par10 fehlen in den hPar14- und hPin1-Strukturen experimentelle

Hinweise auf eine cis-Xaa-Prolin-Bindung. Das hPin1 hat vor dem Prolin (Pro 149) ebenso

wie das Par10 ein Glycin. In der Sequenz des hPar14 kommen hier zwei Proline

hintereinander (Pro 114-Pro 115) (Abbildung 3.25). Für hPar14 wurde zwar eine cis-Prolin-

Bindung in diesem Bereich vermutet, konnte aber nicht bestätigt werden. Die beiden

homologen Strukturen sind daher jeweils mit einer trans-Prolin Konfiguration veröffentlicht.


PPIC_ECOLI 1 AKTAAALHILVKEEK--------------LALDLLEQIKNGADFGKLAKKH---------

Par14 33 G—NAVKVRHILCEKHG--------------KIMEAMEKLKSGMRFNEVAAQY---------

PIN1_HUMAN 51 QEPAKVRCSHLLVKHSQSRRPSSWRQEKITRSKEEALELINGYIQKIKSGEED—FESLASQ

PPIC_ECOLI 38 –SICPSGKRGGDLGEFRQGQMVPAFDKVVFSCPV-L-E-P—-T-GPLHTQFGYHIIKVLYRN

Par14 70 -SEDK-ARQGGDLGWMTRGSMVGPFQEAAFALPVSGMDKPVFTDPPVKTKFGYHIIMVEGRK

PIN1_HUMAN 111 FSDCSSAKARGDLGPFSRGQMQKPFEDASFALRT-G- E- M—-S-GPVFTDSGIHIILRTE

Abbildung 3.25: Vergleich der Sequenzen der PPIase-Domänen von Par10 (PPIC_ECOLI),

hPar14 und hPin1. Das cis-Prolin in Par10 und deren Sequenz-Homologe sind schwarz

hervorgehoben. In der Sequenz von hPin1 und Par10 geht diesem Prolin jeweils ein Glycin

voran, in hPar14 ein weiteres Prolin. Die grau hinterlegten Felder heben die Aminosäure-

Insertationen in hPar14 und hPin1 hervor. Der Sequenzhomologie-Vergleich wurde mit dem

Programm FASTA [112-114] erstellt und anschließend manuell nachbearbeitet.

Durch das cis-Prolin ist eine bessere Wasserstoffbrücken-Bildung im β-Faltblatt zwischen den

Strängen 3 und 4 möglich, wie in Abbildung 3.26 dargestellt. Dies legt die Vermutung nahe,

dass das entsprechende Prolin auch im hPin1 und im hPar14 cis-konfiguriert ist.


Abbildung 3.26: Vergleich der Faltblatt-Strukturen von Par10, hPin1 und hPar14. Durch die

cis-Prolin-Bindung kann eine zusätzliche Wasserstoffbrücke zwischen den Strängen gebildet

werden. Die homologen Strukturen, die ein trans Prolin besitzen, können diese zusätzliche

Brücke nicht ausbilden.

Der Vergleich der aktiven Zentren von hPar14 und hPin1 mit Par10 zeigt eine extrem hohe

Konservierung und eine gleiche Orientierung der Reste (Tabelle 3.4 und Abbildung 3.27).

Das legt die Vermutung nahe, dass diese Reste für die enzymatische Funktion wichtig sind

und eine zentrale Rolle im Mechanismus der Isomerisierung spielen. Bisher ist noch nicht

geklärt, wie die katalytische Reaktion abläuft. Ranganathan et al. [98] haben für das hPin1 den

folgenden Reaktionsmechanismus vorgeschlagen.


Die Aminosäuren Leu 122, Met 130 und Phe 134 bilden eine hydrophobe Bindungstasche für

das Prolin. Das Cys 113 wird durch His 59 deprotoniert und kann als Nukleophil den

Carbonylkohlenstoff angreifen. Dadurch wird der Kohlenstoff sp3-hybridisiert und bildet ein

tetraedrisches Intermediat, bei dem der Winkel ω auf 90° gedreht werden kann. Die aus der

Additionsreaktion resultierende negative Ladung am Carbonylsauerstoff wird über

Wasserstoffbrücken durch das protonierte His 157 und Ser 154 stabilisiert. Dieses Intermediat

kann durch Auflösung des Komplexes entweder nach ω = 0° oder ω = 180° zurück reagieren.

In der Tabelle 3.4 sind die homologen Aminosäuren gegenübergestellt. Obwohl die

Strukturen in der Bindungstasche sehr gut übereinstimmen, kann der für hPin1

vorgeschlagene Mechanismus nicht für die anderen zwei homologen Proteine übernommen

werden, da die als katalytisch wichtig hervorgehobenen Aminosäuren in hPar14 und Par10

differieren. Das hPin1-Ser 154 ist in beiden anderen Strukturen ein Phenylalanin (Phe 81 in

Par10 und Phe 120 in hPar14), das keine Ladung stabilisieren kann. In Abbildung 3.27 sind

die in Tabelle 3.4 aufgeführten Aminosäuren noch einmal in einem Strukturausschnitt gezeigt.

Tabelle 3.4: Vergleich der Aminosäuren in der Bindungstasche. Die fett hervorgehobenen

Reste sind in den drei Homologen unterschiedlich.

Par10 hPin1 hPar14

Reste der Bindungstasche Leu 49 Leu 122 Leu 82

Met 57 Met 130 Met 90

Phe 61 Phe 134 Phe 94

Katalytische Reste His 8 His 59 His 42

His 84 His 157 His 123

Cys 40 Cys 113 Asp 74

Phe 81 Ser 154 Phe 120


Abbildung 3.27: Das Stereobild zeigt den Vergleich der Strukturen im aktiven Zentrum. Die

Seitenketten von Par10 sind blau eingefärbt, von hPin1 rot und von hPar14 grün. Die

Struktur von Par10 ist zur besseren Orientierung beschriftet. Die Lage der drei Strukturen

stimmt in diesem Bereich gut überein.

Die Sequenzvergleiche der Parvuline zu den anderen zwei PPIase-Familien, FKBP und

Cyclophilin weisen keine Sequenzhomologie, aber eine strukturelle Homologie, auf. In der

Abbildung 3.28 sind die drei PPIase-Familien strukturell und topologisch gegenübergestellt.

Die Struktur von Cyclophilin besteht aus einem „β-Fass“, zwei separaten kleinen β-

Faltblättern und zwei großen und einer kleinen Helix. FKBP besitzt ebenso wie Parvulin ein

gebogenes Faltblatt. Zusätzlich besteht die Struktur aus einer großen Helix und einer kleinen

Helix. Trotzdem findet man in allen drei PPIase-Familien das gleiche Faltungsmotiv, ein

viersträngiges antiparalleles β-Faltblatt und eine schräg über diesem Faltblatt liegende Helix.

Im Falle von Parvulin und FKBP bildet dieses Motiv gleichzeitig das aktive Zentrum. Im

Cyclophilin hat dieser Strukturteil seine PPIase-Aktivität verloren, aber das aktive Zentrum

von Cyclophilin ist wiederum ein viersträngiges antiparalleles Faltblatt und eine kleine Helix.


Abbildung 3.28: Vergleich der PPIase-Familien. A: Cyclophilin A (PDB: 1LOP), B:

FKBP12 (PDB: 1FKT, 1FKR), C: Par10; Das grau hinterlegte Viereck hebt das gleiche

Faltungsmotiv hervor. Dieses Faltungsmotiv entspricht im FKBP12 und Par10 gleichzeitig

dem aktiven Zentrum. Für Cyclophilin ist das aktive Zentrum zusätzlich mit einem Kreis

gekennzeichnet. Die 3D-Strukturen sind so angeordnet, dass die gemeinsame Helix vorne

liegt (Pfeil).

NMR-Studien von Metall-DOTATOC-Komplexen 54

4 NMR-Studien von Metall-DOTATOC-Komplexen

4.1 Somatostatin und Somatostatin-Analoga

Somatostatin ist ein körpereigenes Peptidhormon, das eine wichtige Rolle bei physiologischen

Vorgängen spielt. Es ist ein Inhibitor für die Freisetzung einer Reihe von Hormonen (z.B. für

Glucagon, Wachstumshormon (STH), Insulin und Gastrin) [125-128] und reguliert noch viele

andere biologische Aktivitäten, wie zum Beispiel den Na+/H+-Austausch, die Regulation des

K+-Kanals und die Auslösung von Apoptose [129-135]. Somatostatin wird in Immunzellen [136],

in neuronalen und endokrinen Zellen synthetisiert [137]. 1973 wurde Somatostatin 14 (SST 14)

von P. Brazeau aus dem Hypothalamus-Gewebe von Schafen isoliert [138]. 1980 wurde ein

zweites Somatostatin (SST 28) im intestinalen System von Schweinen von L. Pradayrol [139]

entdeckt. Je nach Ort der Ausschüttung kann das Somatostatin als Hormon, als Neurohormon

(Hormon, das in der Hypophyse und Hypothalamus gebildet wird), als Neurotransmitter oder

als Parathormon (in der Nebenschilddrüse gebildetes Hormon) fungieren. Die Wirkung von

Somatostatin erfolgt durch fünf spezifische G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren

(somatostatin seven transmembrane receptor SSTR1-5), die im Gehirn, im gastrointestinalen

Trakt, in der Schilddrüse und auf den Immunzellen sitzen [135, 137, 140-142]. Das Vorkommen der

einzelnen Rezeptoren ist in Tabelle 4.1 aufgeführt. Darüber hinaus werden die Somatostatin-

Rezeptoren auf einer Vielzahl von Tumoren exprimiert [143].


Tabelle 4.1: Vorkommen der Somatostatin-Rezeptoren im Körper

SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5

Gehirn

GI-Trakt

(Magen, Darm)

Langerhans-

Inseln

Niere

Gehirn

Hypophyse

Niere

Nebennieren

Lymphsystem

Gehirn

Kleinhirn

Hypophyse

Magen

Lymphsystem

Gehirn

Langerhans-

Inseln

Lymphsystem

Herz

Gehirn

Hypothalamus

Hypophyse

Magen

Lymphsystem

Auf Grund seiner Vielfältigkeit spielt Somatostatin eine wichtige Rolle bei der Behandlung

vieler Krankheiten, wie zum Beispiel von Akromegalie (ausgeprägte selektive Vergrößerung

der Extremitäten nach dem Wachstumsalter). Wegen seiner kurzen Halbwertszeit von ca.

zwei Minuten und seiner Ort-Wirkungs-Beziehung ist das Somatostatin ein idealer Regulator

im Körper, aber für die Behandlung von Krankheiten zu unspezifisch. Daher wurden seit der

Entdeckung von Somatostatin sehr viele Agonisten [144-160] und einige Antagonisten [161-163]

synthetisiert, die eine längere Halbwertszeit, unterschiedliche Aktivitäten und höhere

Bindungsselektivitäten aufweisen. In Abbildung 4.1 sind einige der bekannten Somatostatin-

Agonisten aufgeführt.


Abbildung 4.1: Strukturen von Somatostatin14 und 28 und Beispiele in der Entwicklung der

Somatostatin-Analoga. [138, 139, 144-146, 153, 164, 165]


Die Wechselwirkungen zwischen einem Hormon und seinem Rezeptor sind meist auf einen

kleinen Bereich des Hormons beschränkt, in dem oft Schleifen-Motive enthalten sind [124]. Für

das Somatostatin SST 14 wurden die Aminosäuren Phe7-Trp8-Lys9-Thr10 als Bindungsmotiv

gefunden, die eine βII’-Schleife ausbilden.

Die ersten Somatostatin Analoga waren Bicyclen, die zu einem Hexapeptid weiterentwickelt

und über eine Cystinbrücke oder ein Phe-Pro cyclisiert wurden [144-146]. Um die βII’-Schleife

zu stabilisieren, wurde eine D-Aminosäure in der (i+1)-Position eingebaut. Durch den Ersatz

von Trp durch D-Trp wurde so die Wirkung des Somatostatin-Analogons um das achtfache

gesteigert. Die Annahme, dass nur die Seitenketten an der Bindung zum Rezeptor beteiligt

sind, konnte durch das Somatostatin-Analogon von R. Hirschmann [147, 166, 167] bestätigt

werden. Auch die β-Aminosäure-Analoga von K. Gademann et al. [148, 168] und das

Peptidmimetikum von L. Yang et al. [149] zeigen biologische Aktivität (Abbildung 4.2).

Abbildung 4.2: Somatostatin-Analoga ohne Peptidrückgrat oder mit modifiziertem Rückgrat. [147-149, 166-168]


Das am besten untersuchte Somatostatin-Derivat ist das Octreotid, das neben Lanreotid und

Vapreotid seit einigen Jahren als Medikament eingesetzt wird. Octreotid bindet mit hoher

Affinität an SSTR2, weniger an SSTR3 und SSTR5 und zeigt keine Affinität gegenüber

SSTR1 und SSTR4 [169]. Neben der Anwendung von Octreotid in der Hormontherapie, z.B.

zur Behandlung von Drüsenerkrankungen, werden radioaktiv markierte Octreotid-Derivate

auch zur Diagnose und zur Behandlung von Tumoren eingesetzt. Die Somatostatin-Rezeptor-

Szintigraphie hat sich als Standardmethode zur Diagnose von neuroendokrinen Tumoren

etabliert. Der Prototyp der radioaktiv markierten Peptide ist das DTPA-D-Phe1-Octreotid

(OctreoScan). Das Problem bei OctreoScan ist jedoch die Tatsache, dass der DTPA-Ligand

(Diethylentriaminpentaessigsäure) vor allem für 111In eingesetzt werden kann, da die

Komplexierung mit anderen Metallionen nicht stabil genug ist. Das 111In-Ion eignet sich aber

nicht als radioaktives Therapeutikum zur direkten Behandlung, da die emittierte Strahlung zu

schwach ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene Liganden, die Metalle besser

komplexieren, entwickelt und auf ihre Eigenschaften hin untersucht [170, 171]. Dabei hat sich

gezeigt, dass der DOTA-Ligand vielseitig für verschiedenste Metallionen einsetzbar ist. Für

Szintigraphie-Verfahren wird er mit 111In (E.C.) und 67Ga (γ) markiert, für PET-

Untersuchungen (Positronen-Emissions-Tomographie) mit 68Ga (β+), 86Y (β+, E.C.), 64Cu (β+,

β-, E.C.) und einigen Lanthanid-Isotopen und in der Radiotherapie kann er mit 90Y (β-), 67Cu

(β-) und Lanthaniden eingesetzt werden [172]. Die Veränderung des Metallions ruft jedoch

erstaunlicherweise eine Veränderung der Bindungsaffinität und Rezeptor-Selektivität hervor.

Das Ga-DOTATOC zeigt im Vergleich zum unkomplexierten DOTATOC eine achtfach

höhere Affinität zum SST-Rezeptor 2. In Tabelle 4.2 sind einige DOTATOC-Derivate und

ihre Affinitäten gegenübergestellt. Da die Bindung an den Rezeptor aber nur durch den

Peptidanteil stattfinden sollte, wurden im Rahmen dieser Arbeit durch 2D-NMR-

Spektroskopie die Auswirkung der Metallbindung auf den Komplex und auf eventuelle

strukturelle Einflüsse untersucht. In Abbildung 4.3 sind die schematischen Strukturen von

DOTATOC und OctreoScan gegenübergestellt.


Abbildung 4.3: Strukturvergleich von DOTATOC (links) und OctreoScan (rechts). Die

DOTATOC-Struktur ist durchnummeriert, wie es im Text verwendet wurde.

Tabelle 4.2: Affinität (IC50) einer Reihe von Somatostatin-Analoga für menschliche SST-

Rezeptoren 1-5 [nM]. Die Werte von DOTATOC und die Werte der Ga-, Y- und Eu-

komplexierten DOTATOC-Derivate für den SSTR 2 sind fett hervorgehoben.

Peptide SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5

SST-28 5.2 2.7 7.7 5.6 4.0

Octreotid >10000 2.0 187 >1000 22

OctreoScan >10000 22 182 >1000 237

DOTATOC >10000 14 880 >1000 396

DOTA-Octreotid >10000 14 27 >1000 103

Y-DOTATOC >10000 11 389 >10000 114

Ga-DOTATOC >10000 2.5 613 >1000 73

Eu-DOTATOCa) >10000 12 140 >10000 420

Ga-DOTA-Tyr-oktreotat >10000 0.2 >1000 300 377

a) Die Werte von Eu-DOTATOC wurden auf den oben angegebenen Referenzwert von SST 28

umgerechnet.


Die Aufnahme von Metall-DOTATOC-Komplexen in die Zelle erfolgt durch Internalisierung

des Hormon-Rezeptor-Komplexes. Vorteile von DOTATOC sind die schnelle Blutklärung,

die schnelle Ausscheidung über die Niere und die hohe Aufnahme in den Tumor. Da der SST-

Rezeptor 2 auch in der Niere vorkommt, wird DOTATOC auch dort gebunden, wobei diese

Bindung aufgrund des in der Niere vorliegenden Mechanismus aber nicht so lang besteht wie

im Tumor [171-174].

Die Anwendung von Somatostatin und seiner Analoga in der Tumordiagnostik und –therapie

bringt allerdings nicht nur Vorteile mit sich. So treten bei einer Langzeitgabe von Octreotid

nicht nur Cholelithiasis (Gallensteinleiden) [175], Nierenversagen oder gastrointestinale

Beschwerden [137] auf, sondern auch eine „Resistenz“ der Tumorzellen gegen den Wirkstoff

durch Desensibilisierung oder Rückregulation der Expression von Rezeptoren an der

Zelloberfläche [143, 176]. Von Desensibilisierung spricht man, wenn der Rezeptor nach der

Internalisierung nicht mehr in die Zellmembran eingelagert wird. Bei der Rückregulation wird

dagegen kein neuer Rezeptor in der Zelle gebildet.

4.2 Strukturuntersuchungen am Peptidgerüst

Die ersten Strukturuntersuchungen an Somatostatin-Analoga wurden an den cyclischen

Peptiden cyclo(Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro) und cyclo(Phe-D-Trp-Lys-Thr-Gly-Pro)

durchgeführt [177, 178]. Veber et al. schlugen eine ebene Konformation des sogenannten Veber-

Peptids cyclo(Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro) als biologisch aktive Form vor [179, 180], während

M. Goodman eine gewölbte Struktur für das rezeptorgebundene Peptid postulierte [157]. Er

stützte seine Behauptung auf Untersuchungsergebnisse, die er durch selektive Methylierung

der α- oder β-Kohlenstoffatome des Veber-Peptids [150] erhalten hatte. Durch die Einführung

einer Methylgruppe treten sterische Hinderungen auf, die z.B. die Bildung von

Wasserstoffbrücken oder die Bindung an einen Rezeptor verhindern. Die Methylierung der α-

Position an Thr 10 führte zu einer flachen Konformation, die nicht mehr an den Rezeptor

bindet. Die β-Methylierung an den Positionen Trp 8 oder Phe 11 beeinflusst dagegen die

gewölbte Struktur nicht. Die Flexibilität der Seitenketten wird aber so stark eingeschränkt,

dass für Trp 8 nur noch die trans-oder gauche--Rotamere möglich sind, wodurch die

Bindungsaffinität sogar erhöht wurde.


Erst durch die Strukturuntersuchungen an Octreotid hat sich herausgestellt, dass sowohl eine

gewölbte wie auch eine gestreckte Struktur vorliegen [164, 181]. In Lösung befinden sich die

beiden Strukturen in einem konformationellen Gleichgewicht. Beide Konformationen werden

durch je zwei Wasserstoffbrücken stabilisiert. Die βII’-Schleife ist in beiden Strukturen

enthalten und wird durch eine Wasserstoffbrücke zwischen Phe 3 (oder Tyr 3)-C=O und

Thr 6-NH stabilisiert. Die zweite Wasserstoffbrücke wird in der β-Faltblatt Struktur zwischen

Tyr 3-N-H und Thr 6-C=O, in der gewölbten zwischen Trp 4-C=O und Cys 7-NH gebildet,

wodurch ein 310-helikales Motiv gebildet wird. In der Kristallstruktur wurde eine weitere

helikale Struktur gefunden, die sich nur durch die Drehung der Cys-CO 7-Thr(ol)-NH 8-

Peptidbindung von der ersten unterscheidet. Diese unterschiedliche Bindungswinkel-

Einstellung wurde auch in den NMR-Untersuchungen beobachtet.

Abbildung 4.4: Stereobild der Faltblatt-Struktur von Octreotid, wie sie in der

Röntgenstrukturanalyse gefunden worden ist. (CSD: YICMUS, PDB: 1SOC, 2SOC)


Abbildung 4.5: Stereobilder der Strukturen von Octreotid mit einem 310-helikalen Motiv, wie

sie in der Röntgenstrukturanalyse gefunden worden sind. Die beiden Helices unterscheiden

sich in der Ausrichtung der Peptidbindung zwischen Cys 7 und Thr(ol) 8. (CSD: YICMUS,

PDB: 1SOC, 2SOC)

Weitere Untersuchungen zur Klärung der aktiven Konformation wurden durch die N-

Methylierung von D-Phe1- (oder D-Tyr1-) (Cys2-Phe3-D-Trp4-Lys5-Thr6-Cys7)-Thr8

vorgenommen [182]. Durch die Methylierung der NH-Gruppen von Phe 3, Thr 6, Cys 7 oder

Thr 8 ist die gesamte Affinität verloren gegangen. Der Verlust der Bindungsaffinität durch die


Methylierung von Phe 3 und Thr 6 ist durch die Destabilisierung der βII’-Schleife und die

Störung der Wasserstoffbrücken zwischen diesen Aminosäuren zu erklären. Cys 7 bildet eine

Wasserstoffbrücke mit Trp 4 aus, die durch eine Methylierung gestört wird, wodurch die 310-

helikale Struktur nicht mehr gebildet werden kann. Wenn jedoch Trp 4 methyliert wird, führt

dies zu einem Rückgang der Bindungsaffinität an SSTR2 und gleichzeitig einer Steigerung

der Affinität für SSTR5.


4.3 Strukturuntersuchungen am DOTA-Liganden

4.3.1 Der Ga-DOTA-D-Phe-Komplex

Vom Ga-DOTA-D-Phe-Amid-Komplex ist eine Röntgenstruktur-Untersuchung durchgeführt

worden [172]. Ga3+ ist in diesem Komplex sechsfach koordiniert. Der DOTA-Ligand umgibt

dabei das Ga3+ in einer cis-pseudooktaedrischen Geometrie. Die äquatoriale Ebene wird durch

zwei Stickstoff-Atome und die dazu gehörenden Carboxylat-Gruppen gebildet, wobei die

axialen Positionen durch die übrigen zwei Ring-Stickstoffatome besetzt werden. Die

Geometrie des Komplexes weicht von einem optimalen Oktaeder ab, da die axialen

Stickstoffe mit dem Ga3+ einen Winkel von 156.3° bilden. Die Carboxylat-Gruppe, deren

zugehöriger Ringstickstoff an der axialen Position steht, bleibt unkoordiniert. Es ist bekannt,

dass eine freie Carboxylat-Gruppe zu einer effizienten Ausscheidung von Chemikalien durch

die Niere beiträgt [172, 183]. Dieses Verhalten wird auch für Ga-DOTATOC beobachtet.

Abbildung 4.6: Ga-DOTA-D-Phe-Amid-Komplex. Ga3+ ist oktaedrisch von vier

Stickstoffatomen und zwei Sauerstoffatomen umgeben; die dritte Carboxylat-Gruppe ist

frei [172].


4.3.2 Die Y- und In-DOTA-D-Phe-Komplexe

Y3+ liegt im DOTA-Komplex achtfach koordiniert in einer quadratisch-antiprismatischen

Geometrie vor [172]. Die vier Stickstoff-Atome und die drei Carboxylat-Gruppen sowie die

Carbonylgruppe der Peptidbindung zu D-Phe sind am Komplex beteiligt. Dabei bilden die

Ring-Stickstoff-Atome ein Quadrat, die Sauerstoffatome ein weiteres. In3+ kann sowohl

siebenfach als auch achtfach koordiniert vorliegen. Für den In-DOTA-Komplex wurde jedoch

die gleiche Koordination wie für Y3+ gefunden. Der Unterschied zwischen den beiden

Metallionen liegt in der Komplex-Konformation (Abbildung 4.7) [184].

Abbildung 4.7: Der In3+- (links) und der Y3+-DOTA-D-Phe-Amid-Komplex (rechts) liegen in

unterschiedlicher Ringkonformation vor: der Y3+-Komplex besitzt eine ∆(δδδδ)-

Konformation, der In3+-Komplex dagegen eine ∆(λλλλ)-Konformation.

Während der Y3+-Komplex eine sogenannte ∆(δδδδ)-Konformation (m2-Typ) einnimmt,

weist der In3+-Komplex eine ∆(λλλλ)-Konformation (M1-Typ) auf. In Abbildung 4.8 sind die

vier möglichen Konformationen für den Liganden dargestellt. Die Bezeichnung Λ oder ∆

richtet sich dabei nach der Orientierung der Carboxylat-Arme, die Orientierung der

Methylengruppen im Makrocyclus wird durch (λλλλ) oder (δδδδ) beschrieben. Durch die

Rotation der Carboxylat-Arme gelangt man von der Λ- zur ∆-Konformation. Die Änderung

von (λλλλ) nach (δδδδ) ist nur durch eine Inversion des Rings möglich. Daraus ergeben sich

zwei Enantiomeren-Paare von Diastereomeren.


Abbildung 4.8: Konformationen für den quadratisch-antiprismatischen Komplex von Metall-

DOTA-Komplexen. Die Konformationsänderung vom Zustand Λ zum Zustand ∆ erfolgt durch

eine Bindungsrotation, von λλλλ nach δδδδ ist eine Inversion des Rings nötig [185].


4.3.3 Lanthanid-DOTA-Komplexe

Das Lanthanid-Ion in den Ln(DOTA)-Komplexen kann acht- oder neunfach koordiniert

vorliegen. Wenn es achtfach koordiniert ist, nimmt der Komplex eine quadratisch-

antiprismatische Geometrie um das Lanthanid-Ion ein (Abbildung 4.8). Für alle Lanthanide ist

eine Inversion des Rings (M1/2 <-> m1/2) beobachtet worden. Aber dieses Zwei-

Diastereomeren-Modell reicht nicht aus, um alle experimentell gefundenen Daten zu erklären.

Das ist nur möglich, wenn der achtfach koordinierte Komplex (m: m1 oder m2; M: M1 oder

M2) auch mit einem neunfach koordinierten Komplex in einem Gleichgewicht steht. Dabei ist

die neunfach-Koordination mit einem zusätzlichen Wassermolekül über der Sauerstoff-Ebene

zu erfüllen (m’ und M’) (Abbildung 4.9) [185, 186].

Abbildung 4.9: Die achtfach koordinierten Komplexe m1 und m2 können zur m-Konformation

zusammengefasst werden, M1 und M2 zur M-Konformation. Durch Addition eines

Wassermoleküls entstehen die neunfach koordinierten Komplexe m’ und M’ [185].


Die m-Konformation wird von La(III) bis Dy(III) beobachtet und ist die dominante Struktur

bis Nd(III), die M-Struktur tritt von La(III) bis Lu(III) auf und ist am stabilsten für Ho(III).

Die m’-Konformation wird von Er(III) bis Lu(III) eingenommen. Die M’-Konformation wird

bei den Lanthaniden nicht beobachtet [185].

4.4 Paramagnetische Moleküle in der NMR-Spektroskopie

4.4.1 Grundlagen

Die bisherigen Betrachtungen sind von diamagnetischen Atomen ausgegangen, deren

Elektronen-Spinmomente sich zu Null kompensieren. Der im Magnetfeld gemessene Effekt

geht nur von den Atomkernen aus. Enthält ein Atom jedoch mindestens ein ungepaartes

Elektron, so kompensieren sich die Spinmomente der Elektronen nicht mehr und das Atom ist

paramagnetisch.

Die Effekte von Paramagnetismus und Diamagnetismus im Magnetfeld sind entgegengesetzt.

Während das diamagnetische Atom die Feldlinien auseinander drückt (Meißner-Ochsenfeld-

Effekt), werden die Feldlinien in einem Paramagneten verdichtet [187] (Abbildung 4.10).

Abbildung 4.10: Schematische Darstellung der Feldlinien im Vakuum (links), durch einen

Diamagnet (Mitte) und durch einen Paramagnet (rechts) [187].

Paramagnetische Moleküle besitzen mindestens ein ungepaartes Elektron, das sich wie ein

Kern im Magnetfeld ausrichtet. Dadurch induziert es ein zusätzliches Feld, das zur

Verdichtung der Feldlinien führt.

Sitzt das Elektron in einem s-Orbital, so beeinflusst es den Kern direkt (Fermi-Kontakt-

Verschiebung oder Kontakt-Verschiebung), sitzt es in p-, d- oder f-Orbitalen tritt der Einfluss

indirekt durch die Spin-Polarisation auf (Pseudokontakt-Verschiebung). Die chemische


Verschiebung des Kerns wird durch die veränderte Elektronen-Spindichte am Kern

beeinflusst. Die Kontakt-Verschiebung und die Pseudokontakt-Verschiebung addieren sich

zur Hyperfeinkopplung, wobei die Beiträge von Kontakt- und Pseudokontakt-Kopplung

unterschiedlich sein können. Das Phänomen des Paramagnetismus hat aber nicht nur

Auswirkungen auf das Metall mit dem ungepaarten Elektron (Metall-zentrierter Beitrag)

sondern auch auf den Liganden (Liganden-zentrierter Beitrag). Das Elektron ist dabei über die

Molekülorbitale des Liganden durch direkte Bindung delokalisiert (σ-Delokalisation, π-

Delokalisation). Der Effekt der Pseudokontakt-Kopplung ist auch in räumlich nahen, aber

ungebundenen Molekülteilen zu beobachten. Dieser Anteil an der Pseudokontakt-

Verschiebung entspricht einer dipolaren Kopplung, ähnlich dem NOE [188, 189].

Ein gut untersuchtes Molekül ist der Porphyrinring mit dem komplexierten Fe3+-Ion. Das Fe3+

im Porphyrinring bildet einen high-spin-Komplex, wenn es fünffach oder sechsfach

koordiniert ist und der axiale Ligand bzw. die zwei axialen Liganden schwach binden. Die

fünf Elektronen sind über die fünf d-Orbitale verteilt, was dazu führt, dass durch die

Symmetrie der Orbitale sowohl die σ-Delokalisierung wie auch die π-Delokalisierung der

Elektronen möglich ist. Im low-spin-Komplex ist nur ein freies Elektron vorhanden, das durch

die Symmetrie des Orbitals einzig mit den π-Bindungen wechselwirken kann. Aus diesem

Grund erhält man für die high- und low-spin-Komplexe unterschiedliche Verschiebungen der

gleichen Protonen und damit unterschiedliche Spektren [190-192]. Die Elektronenverteilung für

die high- und low-spin-Komplexe sind in Abbildung 4.11 dargestellt.

E

Abbildung 4.11: Aufspaltung der d-Orbitale für Fe3+ high-spin (links) und low-spin-

Komplexe (rechts) und die Besetzung mit Elektronen [189].Durch die Orbitalsymmetrie kann

das Dz2-y2-Orbital mit den σ-Bindungen in Wechselwirkung treten, die dxz- und dyz-Orbitale

mit den π-Bindungen.


Um eine Voraussage für die chemische Verschiebung der Protonen treffen zu können, muss

die Symmetrie des Komplexes und die Elektronenverteilung für die Aufteilung in die

Kontakt-Verschiebung und die Pseudokontakt-Verschiebung herangezogen werden. Die

Voraussage der chemischen Verschiebung für Heteroatome ist nicht mehr möglich.

Für Lanthanide tritt neben dem Liganden-Feld-Effekt verstärkt die Spin-Bahn-Kopplung auf.

Der Liganden-Feld-Effekt führt dazu, dass die sphärische Symmetrie am Metallion verloren

geht und magnetische Suszeptibilität Anisotropie verursacht. Dadurch wächst der Anteil der

Pseudokontakt-Kopplung.

In paramagnetischen Molekülen ist das ungepaarte Elektron eine zusätzliche

Relaxationsquelle für den Kern. Die Relaxation des Kerns läuft somit schneller ab. Der Effekt

ist im Spektrum meist durch deutlich breitere Linien zu sehen. Das Elektron kann durch

Elektronen-Spin-Relaxation, durch molekulare Rotation und durch chemischen Austausch

relaxieren (Abbildung 4.12).


Abbildung 4.12: Darstellung der Relaxationswege durch das Elektron; A: Elektronen-Spin-

Relaxation, B: Molekulare Rotation und C: chemischer Austausch [189].


Die Elektron-Spin-Relaxation liegt in der Größenordnung von 10-13 bis 10-7 s. Durch die

Elektronen-Spin-Relaxation (τs) ändert sich die Ausrichtung vom Elektron zum Kern.

Für den Fall, dass die Elektronen-Relaxation im Vergleich zur Molekülbewegung langsam ist,

erfährt der Kern durch die Rotation des Moleküls (τr) und durch die Ausrichtung des

Elektrons relativ zum Kern eine Relaxation durch dipolare Kopplung. Ist die Elektronen-Spin-

Relaxation sehr schnell, würde sich dieser Effekt zu Null mitteln. Das tritt jedoch nicht auf, da

durch das anliegende magnetische Feld die Zeeman-Energie-Niveaus durch die Boltzmann-

Verteilung nicht gleich populiert sind. Somit ist der Anteil der Relaxation durch

Molekülrotation auch bei schneller Elektronen-Spin-Relaxation immer gegeben. Dieser

Grenzfall wird Curie-Spin-Relaxation genannt.

Der chemische Austausch (τm) trägt sowohl mit einem dipolaren wie auch einem skalaren

Anteil zur Relaxation bei.

In Abbildung 4.13 sind die Relaxationszeiten für die Relaxation durch den Einfuß der

Elektronen den Relaxtionszeiten für die Kerne gegenübergestellt.

Abbildung 4.13: Bereiche der Relaxationszeiten für die Elektronenspinrelaxation (τs), die

molekulare Rotation (τr) und den chemischen Austausch (τm) im Vergleich zu den

Kernrelaxationszeiten T1 und T2.


4.4.2 Lanthanide als Pseudokontakt-Verschiebungsreagenzien

Die freien Elektronen der Lanthanide sind in den f-Orbitalen lokalisiert, deren Energie-

Niveaus durch die Spin-Bahn-Kopplung nahe beieinander liegen. Dadurch können sehr

schnelle Elektronen-Relaxationszeiten entstehen, weshalb nur geringe Linienverbreiterung in

den Spektren auftreten. Die Hyperfein-Verschiebung der Liganden besteht hauptsächlich aus

der Pseudokontakt-Verschiebung, da die starke Kontraktion der f-Orbitale kaum eine

Kontakt-Verschiebung über die kovalenten Bindungen zulässt. Aus diesem Grund enthalten

die daraus resultierenden dipolaren Kontakte Informationen über die Abstände zum Metall.

Die Kombination aus der vernachlässigbaren Linienverbreiterung und dem dominanten

Pseudokontakt-Verschiebungsanteil macht die Lanthanide und ihre Komplexe als

Verschiebungsreagenzien attraktiv. Ein großer Vorteil der Lanthanide als

Verschiebungsreagenzien geht auch auf ihre Tendenz zurück, mit Molekülen, die Sauerstoff

oder Stickstoff als Donoratome besitzen, zu interagieren. Lanthanide werden entweder direkt

als Salze oder in komplexierter Form zugesetzt und können somit den Platz eines Metalls in

einem Ziel-Molekül einnehmen oder an Atome komplexieren, die auf der Oberfläche liegen [189, 193] (Abbildung 4.14).

N

NN

N

COO-

COO--OOC

-OOC

N

N

N-OOC COO-

-OOC

DOTA NOTA

N N N-OOC

-OOC

COO-

COO-

COO-

DTPA

H

O

O

F3C(F2C)2

(H3C)3C

FOD

-

Abbildung 4.14: Lanthanid-chelatierende Liganden, die als Pseudokontakt-Verschiebungs-

reagenzien eingesetzt werden.


Pseudokontakt-Verschiebungsreagenzien werden nicht nur in der Lösungs-NMR verwendet,

sondern auch in bildgebenden Verfahren (MRI) als Kontrastmittel eingesetzt. In der MRI ist

die Relaxation von Wassermolekülen von großem Interesse. Die Relaxation (T1 und T2) von

Wasser weicht in einzelnen Gewebetypen aufgrund von Unterschieden im Protonengehalt und

unterschiedlicher Viskosität voneinander ab [194-197]. Dadurch ist es möglich, auch krankes

Gewebe von gesundem zu unterscheiden [198]. Allerdings kommt es vor, dass das Signal des

kranken Gewebes durch das Signal des gesunden Gewebes überlagert und damit nicht

entdeckt wird. Durch den Zusatz von paramagnetischen Ionen wird die Relaxationszeit und

damit der Kontrast erheblich beeinflusst, wodurch es möglich ist, weitere physiologische

Informationen zu gewinnen.

NMR-aktive Metallkationen von klinischem Interesse, wie z. B. Li+, Na+ und K+ kommen im

intra- und extrazellulären Raum vor. In der NMR-Spektroskopie ist für jede Ionen-Spezies nur

ein Signal sichtbar. Werden Verschiebungsreagenzien zugesetzt, die paramagnetische

Metallionen enthalten, werden nur die Signale für die Ionen im extrazellulären Raum

verschoben. Dadurch ist es möglich, beide Ionensignale gleichzeitig aufzunehmen, aber

individuell zu analysieren [199]. In den letzten Jahren wurden „Magnet-Pharmazeutika“

entwickelt, die Rezeptor- oder Antikörper-spezifisch binden und gleichzeitig als

Kontrastmittel und Medikament dienen. Ein Beispiel in der Entwicklung dieser Medikamente

ist das Eu-DOTATOC, das an die SST-Rezeptor positiven Tumore bindet. Durch seinen

paramagnetischen Einfluss verändert es die Relaxationszeit im Tumor im Gegensatz zum

umliegenden Gewebe und wirkt gleichzeitig als Radiotherapeutikum.

4.4.3 Besonderheiten der NMR-Experimente für paramagnetische

Moleküle

Paramagnetische Moleküle unterscheiden sich von diamagnetischen Molekülen zum einen

durch schnellere Relaxation und zum anderen durch den Beitrag der Hyperfein-Verschiebung.

Die Relaxation beeinflusst die Linienbreite, wodurch das Signal/Rausch-Verhältnis schlechter

wird. Durch den Beitrag der Hyperfein-Wechselwirkung wird der spektrale Bereich größer.

Das „normale“ NMR-Experiment berücksichtigt die vom Elektron ausgehenden

Relaxationsphänomene nicht, da das Experiment wesentlich kürzer ist als die Relaxation des

Kerns in einem diamagnetischen Molekül. Paramagnetische Moleküle relaxieren aber in der


2D-Experiment-Zeit teilweise oder sogar vollständig, so dass die Signalintensität verloren

geht.

Daher werden in der NMR mit Paramagneten vor allem einfache Pulssequenzen verwendet,

die auf Minimierung von t1 (Evolution) und t2 (Detektion) in der Größenordnung von T2

ausgerichtet sind. Probleme durch Relaxation treten vor allem bei Experimenten mit einer

Mischzeit auf, die nicht verkürzt werden kann, ohne zuviel Informationen zu verlieren.

Im NOESY-Experiment muss beachtet werden, dass die Mischzeit kürzer sein sollte als die

Relaxation, um die gesamte Relaxation der Signale vor der Detektion zu vermeiden. Ein

Vorteil der schnellen Relaxation ist, dass der Anteil an Spindiffusion sehr gering ist. Durch

kurze Mischzeiten werden die breiten Signale und deren Konnektivitäten bevorzugt detektiert.

Wenn die Mischzeit verlängert wird, treten Kreuzsignale zwischen den Signalen mit längerer

Relaxationszeit auf und die Signale der schneller relaxierenden Atome gehen verloren. Daher

müssen mehrere NOESY-Experimente mit unterschiedlichen Mischzeiten aufgenommen

werden, um die gesamte Information über das Molekül zu erhalten.

Zwei weitere Experimente, die von der Mischzeit abhängig sind, sind das ROESY- und das

TOCSY-Experiment, während denen ein Spinlock aktiv ist. Der Gebrauch des ROESY-

Experiments ist für paramagnetische Moleküle eher untypisch, da das Experiment keinen

wirklichen Vorteil gegenüber dem NOESY-Experiment bietet. Das TOCSY-Experiment

entwickelt während des Spinlocks skalare Kopplungen. Das maximale Signal wird nach einer

Zeit, die zwischen J2

1und T2 liegt, erreicht. Da paramagnetische Moleküle einen sehr großen

spektralen Bereich haben, kann das Spinlock-Feld den gesamten Bereich normalerweise nicht

abdecken. Dazu würde man ein sehr starkes B1-Feld benötigen und damit die Probe und den

Probenkopf überhitzen. Luchinat et al. haben zur Untersuchung von paramagnetischen

Molekülen einen Probenkopf entwickelt, der wesentlich stärkere B1-Felder aushält [200].

Normalerweise werden Spinlock-Felder eingesetzt, die nur einen kleinen Teil der spektralen

Breite abdecken. Das Spinlock-Feld wird dann in den jeweilig zu untersuchenden Bereich

umgesetzt und so sequentiell die gesamte spektrale Breite betrachtet.

Für das COSY-Experiment gilt ebenfalls, dass das maximale Signal zwischen J2

1 und T2

detektiert wird. In den paramagnetischen Molekülen ist die Linienbreite in den meisten Fällen

größer als die Kopplungskonstante. Die Multipletts können daher nicht aufgelöst werden.


Bei heteronuklearen Experimenten ist der Intensitätsverlust durch die paramagnetische

Relaxation vernachlässigbar, da die Kopplungskonstanten wesentlich größer sind und der

Kohärenztransfer viel schneller erfolgt. Für den Übergang zu mehrdimensionalen

Experimenten gilt das gleiche, wie für die 2D-Experimente beschrieben.

4.5 Strukturuntersuchungen an Metall-DOTATOC-Komplexen

4.5.1 Probenbereitung

Alle NMR-Experimente an den Metall-DOTATOC-Komplexen wurden an DMX600

Spektrometern der Firma Bruker durchgeführt. Alle verwendeten Spektrometer sind mit

mindestens vier unabhängigen Frequenzkanälen, abgeschirmten 3-Achsen-Feldgradienten und

Tripel- oder Quadrupel-Probenköpfen ausgestattet. Die durchgeführten Experimente sind im

Anhang in Kapitel 7.2.1 aufgeführt.

Die Probenbereitung ist in der Tabelle 4.3 zusammengefasst.

Tabelle 4.3: Übersicht der Probenbereitung von den Metall-DOTATOC-Komplexen

Ga-DOTATOC Y-DOTATOC Eu-DOTATOC

Molare Masse [g/mol] 1488.36 1507.54 1570.60

Konzentration [mM] 9.0 9.7 9.3

Lösungsmittel H2O mit 10% D2O H2O mit 10% D2O H2O mit 10% D2O

pH-Wert 6.0 6.0 5.0

Temperatur [K] 290 290 275


4.5.2 Ga-DOTATOC, Eu-DOTATOC und Y-DOTATOC

Die 1H- und 13C-Resonanzen von Ga-DOTATOC und Y-DOTATOC wurden durch die 2D-

NMR-Experimente TOCSY, DQF-COSY, E. COSY, 13C-HSQC und HMBC zugeordnet. Die

Bestimmung der sequentiellen Verknüpfung erfolgte durch ein NOESY- und ein ROESY-

Experiment. Die Spektren von Eu-DOTATOC konnten aufgrund starker Überlagerungen und

breiter Linien nicht ausgewertet werden. Die Kalibrierung der Proben wurde mit einem

externen Standard (TSP) durchgeführt. Die Auswertung der Y-DOTATOC-Experimente

wurde in Zusammenarbeit mit Mandar Deshmukh ausgeführt. Die Zuordnung der beiden

cyclischen Peptide Ga-DOTATOC und Y-DOTATOC steht im Anhang in Tabelle 7.2 und

Tabelle 7.5.

Wie in Abbildung 4.15 deutlich zu sehen ist, zeigt das Ga-DOTATOC nur einen 1H-NMR-

Signalsatz, wohingegen Y-DOTATOC zwei Datensätze zeigt, die im weiteren Text als Haupt-

(M) und Nebensignalsatz (m) bezeichnet werden. Sie liegen im Verhältnis 68 (M) zu 32 (m)

vor. Im 1D-Spektrum von Eu-DOTATOC sind vier Signalsätze im Verhältnis 55 : 30 : 14 : 1

zu erkennen.


Abbildung 4.15: Vergleich der 1D-Spektren von Ga-DOTATOC, Y-DOTATOC und einem

Spektrenausschnitt für den Tyr-Octreotid-Teil von Eu-DOTATOC. Die Signalverschiebungen

von Ga-DOTATOC und Y-DOTATOC sind sehr ähnlich. Im Y-DOTATOC sind die beiden

breiten Signale zwischen 9 und 10 ppm hervorgehoben. Für Eu-DOTATOC kann wegen der

Breite der Signale und der Überlagerungen keine klare Aussage getroffen werden.


In den Ga- und Y-DOTATOC-Spektren liegen zwischen 6 und 11 ppm die NH-Signale und

die Signale der Aromaten. Dabei ist das Trp-NHx des Tryptophanrings bei 10.25 ppm deutlich

zu sehen. Im Y-DOTATOC-Spektrum erscheinen bei 9.54 ppm (M) und bei 9.20 ppm (m)

zwei breite Amidsignale, die im Ga-DOTATOC-Spektrum nicht vorkommen. Diese Signale

sind auf die unterschiedliche Komplexierung der Metallionen zurückzuführen. Im Y-

DOTATOC-Komplex ist der Carbonylsauerstoff der Peptidbindung zwischen dem Liganden

und dem D-Phe 2 in den Komplex mit eingebunden. Dadurch wird Elektronendichte von der

Carbonylgruppe abgezogen, wodurch auch das freie Elektronenpaar vom Stickstoff betroffen

ist. Somit wird das Proton der Amidgruppe saurer und tauscht schneller mit dem

Lösungsmittel aus, wodurch die Linienbreite zunimmt. An der oktaedrischen Konformation

des Ga-DOTA-Liganden ist die Carbonylgruppe dagegen nicht involviert.

Die aliphatischen Signale des Peptidteils liegen in den Ga-DOTATOC- und Y-DOTATOC-

Spektren zwischen 0 und 5 ppm. Die zwei Multipletts bei 0.34 ppm und 0.54 ppm sind

Signale der Lys 6-Hγ-Gruppe, die für die Y-DOTATOC-Signalsätze in beiden

Konformationen die gleichen Verschiebungen zeigen. Die Hochfeldverschiebung dieser

Resonanzen ist auf den Einfluss der aromatischen Trp 5-Seitenkette zurückzuführen. Die

Signalunterschiede im Bereich zwischen 2 und 4.5 ppm sind auf die unterschiedlichen

Konformationen des Liganden zurückzuführen.

Das Eu3+-Ion in Eu-DOTATOC ist paramagnetisch, wodurch die Signale sehr breit werden.

Zusätzlich werden einige Signale des DOTATOC durch den Einfluss des Metallions

hochfeld- bzw. tieffeld-verschoben (Abbildung 4.16). Bei diesen Signalen handelt es sich um

die Signale des Liganden, da er durch die räumliche Nähe zum paramagnetischen Zentrum

dem größten Einfluss ausgesetzt ist (Vergleiche Kapitel 4.4). Durch die große Anzahl von

Konformationen und wegen der Breite der Signale konnte keine vollständige Zuordnung

getroffen werden. Daher konnte auch nicht bestimmt werden, welche der Protonensignale des

Liganden hochfeld- oder tieffeld-verschoben wurden.


Abbildung 4.16: 1D-Spektrum von Eu-DOTATOC. Der spektrale Bereich reicht durch den

Einfluß des paramagnetischen Metallions von –20 ppm bis +38 ppm. Die hochfeld- bzw.

tieffeld-verschobenen Signale sind dem DOTA-Liganden zuzuordnen. Zur deutlicheren

Darstellung wurden die hochfeld- und tieffeld-verschobenen Signale vergrößert abgebildet.

Die Signale zwischen 0 ppm und 11 ppm sind dem Tyr-Octreotid-Teil zuzuordnen.

Die Überlagerungen der Signale konnten auch in 2D-Experimenten nicht aufgelöst werden.

Im TOCSY-Spektrum ist ein Austausch der Konformationen während des Experiments zu

beobachten, so dass in jeder TOCSY-Spur alle Signale aller Konformationen sichtbar sind

(Abbildung 4.17). Allerdings konnte das charakteristische Spinsystem von Lysin zwischen

0 ppm und 1 ppm aufgrund der Verschiebung der Hγ-Protonen erkannt werden und das

Tryptophan-Aromatensystem durch die Verschiebung zwischen 10.2 ppm und 11 ppm.


Abbildung 4.17: Peptidteil des TOCSY-Spektrum des Eu-DOTATOC-Komplex mit 80 ms

TOCSY-Mischzeit. Die vier Konformationen pro Spinsystem sind auch bei deutlich geringerer

Mischzeit (20 ms) vorhanden. Das Spinsystem von Lys und von der Trp-Seitenkette sind gut zu

erkennen und ein Teil davon ist im Spektrum exemplarisch markiert.

Die Messungen an Eu-DOTATOC wurden bei 275 K in H2O durchgeführt. Beim Übergang

zu höheren Temperaturen beginnen sich die Konformationen zu mitteln, die Linien werden

aber so breit, dass viele Signale nicht detektierbar sind. Der Wechsel zu niedrigeren

Temperaturen sollte den Austausch der Konformationen einfrieren lassen, aber eine weitere

Reduzierung der Temperatur war nicht möglich, da als Lösungsmittel H2O eingesetzt wurde.

Die hochfeld- bzw. tieffeld-verschobenen Signale konnten mit den 2D-Experimenten nicht

erfasst werden, da deren Relaxation im Millisekundenbereich stattfindet. Die Signale

zwischen –20 und 0 ppm relaxieren in der Zeit bis 100 ms bereits wieder vollständig.


Informationen über die Struktur des Cyclopeptids geben unter anderem die

Temperaturgradienten und die daraus gewonnenen Temperatur-Koeffizienten ∆δ/∆T der NH-

Protonen. Durch Erhöhung der Temperatur nimmt der Austausch von HN-Protonen, die nicht

sterisch abgeschirmt oder durch intramolekulare Wasserstoffbrücken gebunden sind, mit dem

Lösungsmittel zu. Durch den Austausch des Amidprotons mit dem Wasser mittelt sich das

beobachtete Signal. Dadurch entsteht der Eindruck, dass sich die chemische Verschiebung der

Amidprotonen ändert, indem es sich auf das Lösungsmittelsignal zu bewegt. Wenn der Wert

für den Temperaturkoeffizienten klein ist, nimmt die chemische Verschiebung nur langsam,

d. h. das HN-Proton tauscht nicht oder nur langsam aus. Ist der Temperaturkoeffizient groß,

lässt das dagegen auf schnellen Austausch schließen. In Tabelle 4.4 sind die

Temperaturkoeffizienten von Ga-DOTATOC und den beiden Signalsätzen von Y-DOTATOC

gegenübergestellt.

Tabelle 4.4: Temperaturkoeffizienten ∆δ/∆T [-ppb/K] der Ga-DOTATOC und Y-

DOTATOC-Komplexe, M steht für den Hauptsignalsatz und m für den Nebensignalsatz. Die

Nummerierung der Aminosäuren erfolgt wie im Komplex (1 steht für den DOTA-Liganden).

Phe2HN Cys3HN Tyr4HN Trp5HN Lys6HN Thr7HN Cys8HN Thr(ol)9HN

Ga-DOTATOC 8.1 6.6 4.0 7.4 7.3 3.9 2.9 4.5

Y-DOTATOC (M) 8.3 8.0 2.7 6.2 6.9 2.6 0.0 3.8

Y-DOTATOC (m) 6.0 5.5 2.0 5.7 6.9 3.0 0.0 5.0

Die Temperaturkoeffizienten weisen darauf hin, dass die Amidprotonen von Tyr 4, Thr 7 und

Cys 8 mit großer Wahrscheinlichkeit in Wasserstoffbrücken liegen können, für das

Amidproton von Thr(ol) 9 ist es möglich, da die Werte mit 3.8 bis 5.0 Grenzwerte sind und

keine definitive Aussage zulassen. Die Amidprotonen der restlichen Aminosäuren sind

dagegen in keiner Wasserstoffbrücke involviert.

Die Bestimmung der Interprotonenabstände für die Ga- und Y-Komplexe erfolgte aus einem

ROESY- und einem NOESY-Spektrum. Für die Kalibrierung wurde der Abstand der HN-HZ2-

Ringprotonen aus dem Tryptophan herangezogen. Durch die Planarität des aromatischen

Systems ist der Abstand (2.84 Å) konstant. Zusätzlich hat die Auswahl dieser Kalibrierung

noch den Vorteil, dass die Protonen nicht koppeln können und somit das Integral nicht durch

einen Kopplungsanteil verfälscht wird.


Die 3JHNHα-Kopplungskonstanten wurden aus dem 1D-Spektrum ermittelt, die 3JHαHβ-

Kopplungskonstanten aus dem E.COSY-Spektrum.

Für die Ga-DOTATOC-Struktur liegt bisher eine vorläufige restrained-Molekulardynamik-

Rechnung vor, in der das Ga3+-Atom nicht berücksichtigt wurde, da dem verwendeten

Programm Discover (Accelrys, San Diego, CA) das dazu nötige Kraftfeld ESFF fehlt und

damit keine Parametrisierung für dieses Atom enthalten ist. Weiterführende Rechnungen mit

dem Programm Discover 3 (Accelrys, San Diego, CA), das Informationen über das Ga3+-

Atom durch das Kraftfeld ESFF enthält, werden derzeit noch von Dipl.-Chem. G. Voll

durchgeführt. Die für den Datensatz von Ga-DOTATOC ermittelten NOEs lassen sich nicht

durch eine einzige Konformation erklären. Eine einfache Annäherung ist durch die Teilung

der NOEs und der Zuordnung zu zwei Konformationen (Helix und Faltblatt) zu erhalten

(Abbildung 4.18).

Abbildung 4.18: Vorläufige Strukturen für Ga-DOTATOC ohne explizites Ga3+ im Liganden.

Die linke Struktur entspricht einer Faltblatt-Struktur, die rechte der energieärmsten der

310-helikalen Strukturen mit den charakteristischen Wasserstoffbrücken. Zur besseren

Übersicht sind die Wasserstoffatome bis auf die Amidprotonen nicht abgebildet.


So ist z.B. der NOE von Lys 6-Hα zu Cys 8-HN nur in der helikalen Konformation möglich.

Auch die NOEs zwischen Thr 7 und Cys 8 werden verletzt, wenn nur eine Konformation

angenommen wird. In Tabelle 4.5 sind die aus den Octreotid-Strukturen abgelesenen

Abstände zwischen Thr 7-Hα und -Hβ zu Cys 8-HN den experimentell ermittelten Abständen

von Ga-DOTATOC und Y-DOTATOC gegenübergestellt. Die Aufteilung der Ga-

DOTATOC-NOEs in Helix : Faltblatt im Verhältnis 75 : 25 wäre eine Erklärung für die

gefundenen Abstände. Mit hoher Wahrscheinlichkeit ist die helikale Struktur aber auch nicht

einheitlich und es erfolgt eine Rotation der Cys 8-Thr(ol) 9 Peptidbindung, wie es bei

Octreotid gefunden worden ist.

Tabelle 4.5: Vergleich der experimentell ermittelten Abstände von Ga-DOTATOC und Y-

DOTATOC mit den aus der Röntgenstruktur von Octreotid erhaltenen Abständen und den

ermittelten Verhältnissen von Helix zu Faltblatt.

NOE

Octreotid

Faltblatt

Octreotid

Helix

Ga-DOTATOC

gesamt

Y-DOTATOC

gesamt

Lys 6-Hα zu

Cys 8-HN

6.20

3.54

3.60

3.64 (M)

a) (m)

Thr 7-Hα zu

Cys 8-HN

2.25

3.50

2.86

2.60 (M)

2.70 (m)

Thr 7-Hβ zu

Cys 8-HN

2.70

4.40

2.55

3.00 (M)

3.5 (m)

Ermittelte Verhältnisse:

Helix zu Faltblatt

75: 25

73:27 (M)

80:20 (m) a) Das Signal für Lys 6-Hα zu Cys 8-HN für den Nebendatensatz m ist im Spektrum enthalten, aber aufgrund der

geringen Intensität nicht ohne größere Fehler zu integrieren.


Die Berechnung des Verhältnisses von Helix zu Faltblatt erfolgte nach:

2211 IxIxI ges +=

aus x1+x2 = 1 und 6−⋅= ii rkI folgt

21

21 II

IIx ges

−−

= bzw. 6

26

1

62

6

1 −−

−−

−−

=rr

rrx ges

nur aus dem Abstand von Thr7-Hα zu Cys8-HN, da die Thr7-Seitenkette eventuell rotiert und

so das Ergebnis verfälscht wird. x1 ist dabei der Prozentsatz der einen Struktur 1 und x2 = 1-x1

ergibt den Anteil der zweiten Struktur. r ist der Abstand (ges: experimentell, r2 und r1 für die

Konformationen) und I die Intensität der NOE-Signale.

Die zwei für das Y-DOTATOC gefundenen Signal-Datensätze zeigen im Peptidteil das

gleiche NOE-Muster. Da zu diesem Zeitpunkt erst Distanzgeometrie-Rechnungen fertig

sind, kann nur durch den Vergleich der NOEs angenommen werden, dass auch jeder

der beiden Datensätze die helikale und die Faltblatt-Konformationen enthält. Der

einzige Unterschied der Datensätze liegt wahrscheinlich in der Konformation des

DOTA-Liganden, der sich in die zwei Diastereomeren spaltet, wie in Kapitel 4.3.2

beschrieben, wodurch der Peptidteil so beeinflusst wird, dass auch hier eine Aufspaltung

in zwei Datensätze erfolgen könnte.

Da für den Peptidteil der Y-DOTATOC keine Unterschiede gefunden worden sind, ist eine

ähnliche Erklärung für das Auftreten der vier Konformationen im Eu-DOTATOC möglich. In

den Eu-DOTATOC-Spektren sind vier Datensätze im Verhältnis 55 : 30 : 14 : 1 zu

beobachten. Geht man davon aus, dass sich das Eu3+ im DOTA-Komplex wie das Y3+ verhält

und keine weiteren Auswirkungen auf den Peptidteil hat, dann könnten die Datensätze durch

das Auftreten von zwei Diastereomeren des achtfach koordinierten Komplexes und von zwei

neunfach koordinierten Komplexen erklärt werden. Wenn dem die Untersuchungen am Ln-

DOTA--Liganden zugrunde gelegt werden, dann wäre der Hauptdatensatz die

achtfachkoordinierte m-Konformation, der zweitgrößte Datensatz die achtfachkoordinierte M-

Konformation und der dritte die m’-Konformation. Der kleinste Datensatz ließe sich durch die

M’-Konformation erklären. (vergleiche hierzu Kapitel 4.3.3).


Bis zur endgültigen Lösung der Y-DOTATOC-Strukturen ist diese Schlussfolgerung sowohl

für das Auftreten der zwei Konformationen des Y-DOTATOC wie auch für die vier

Konformationen des Eu-DOTATOC eine mögliche Erklärung. Worauf die unterschiedlichen

Rezeptor-Affinitäten beruhen, kann auch erst geklärt werden, wenn die strukturellen

Unterschiede zwischen den Metall-DOTATOC-Strukturen herausgearbeitet sind. Die

bisherigen NMR-Untersuchungen zeigen jedoch, dass der Peptidteil in den unterschiedlichen

Komplexen gleich ist und zwei Konformationen einnimmt. Daher kann nur die

unterschiedliche Koordination des Metalls im DOTA-Liganden den Einfluss auf die

Bindungsaffinität erklären. Vor allem im Y-DOTATOC kann durch die Beteiligung der

Amidbindung zwischen DOTA-Liganden und Peptidteil, der DOTA-Ligand dem Peptid sehr

nah kommen, wodurch die Rezeptorbindung beeinflusst werden könnte. Bei neuesten

Arbeiten [184] zum Y-DOTATOC wurde ein β-Alanin als Platzhalter zwischen den DOTA-

Liganden und das Phe 2 eingebaut. Dadurch wird die Carbonylgruppe der Amidbindung vom

β-Alanin im Komplex koordiniert und die Amidbindung zum Phe 2 ist frei. Affinitätstests mit

diesem DOTATOC-Derivat zeigen, dass die Affinität zunimmt und der des Ga-DOTATOC

ähnelt.

Zusammenfassung und Ausblick 87

5 Zusammenfassung und Ausblick

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Anwendung der NMR-Techniken zur

Strukturaufklärung von Peptiden und Proteinen. In Kapitel 2 der Dissertation erfolgt ein

kurzer Überblick über die Entwicklung der NMR-Spektroskopie.

Eine Einführung in die Vorgehensweise zur Strukturaufklärung wird zu Beginn des Kapitels 3

gegeben. Dabei wird auf die Anwendung der NMR-Experimente für unterschiedliche

Proteingrößen eingegangen. Durch Deuterierung der Proteine und Anwendung neuer

Techniken, wie zum Beispiel Experimente, die auf der TROSY-Pulssequenz basieren, ist es

möglich, Makromoleküle bis etwa 100 kDa zu untersuchen. Die Charakterisierung der

Struktur von Parvulin 10 ist in Kapitel 3 diskutiert. Bei Par10 handelt es sich um eine PPIase,

die die Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Umlagerung katalysiert. Das Protein kommt im Cytoplasma

von E. coli vor und ist mit 10.1 kDa die bisher kleinste entdeckte PPIase. In der Struktur ist

nur der minimale katalytisch notwendige Satz an Aminosäuren vorhanden. Par10 weist daher

auch keine nennenswerte Substratspezifität für die Aminosäure vor dem Prolin auf, im

Gegensatz zu seinen Homologen hPin1 und hPar14.

Die aus NMR-Untersuchungen ermittelte Topologie weist eine αβα-Sandwich-Struktur auf

mit einem zentralen stark gebogenen antiparallelen β-Faltblatt der Strangordnung 2143 und

vier Helices. Drei der Helices liegen auf der konvexen Seite des Faltblatts, die vierte auf der

konkaven Seite. Zwischen dem Faltblatt und der vierten Helix liegt vermutlich das aktive

Zentrum des Proteins. Die Struktur beinhaltet das typische Faltungsmuster und

Aktivitätszentrum der Parvulin-Familie. Darüber hinaus weist auch die FKBP-Familie dieses

Faltungsmuster auf. Aus diesem Grund wird das Faltungsmotiv, ein gebogenes antiparalleles

β-Faltblatt, das eine Helix umschließt, auch als „FKBP-Superfaltung“ bezeichnet. Die

Cyclophilin-Familie besitzt in ihrer Struktur ebenfalls dieses Faltungsmotiv, aber das aktive

Zentrum liegt an einer anderen Stelle.

Für die FKBP- und Cyclophilin-Familien sind selektive Inhibitoren bekannt, die in der

Medizin als Immunsuppressiva eingesetzt werden. Es wäre denkbar, dass ein selektiver

Inhibitor für die Parvulin-Familie ebenfalls als Immunsuppressivum verwendet werden

könnte. Bisher ist jedoch noch kein Inhibitor für diese Familie bekannt. Daher sind

Zusammenfassung und Ausblick 88

Dynamikmessungen und Bindungsstudien (SAR by NMR) an Par10 für zukünftige

Untersuchungen sehr interessant.

In Kapitel 4 werden die Strukturen der Somatostatin-Analoga Ga-DOTATOC, Y-DOTATOC

und Eu-DOTATOC mit 2D-NMR-spektroskopischen Methoden untersucht. Die Metall-

DOTATOC-Derivate werden in der Nuklearmedizin als Kontrastmittel und zur Radiotherapie

zur Bekämpfung von Tumoren eingesetzt. Dabei binden die Peptidteile der Metall-

DOTATOC-Derivate an die Somatostatin-Rezeptoren (vor allem SSTR 2) auf der

Tumorzelloberfläche und gelangen durch Internalisierung des Rezeptors in die Zelle. Bei

Affinitätsuntersuchungen hat sich jedoch gezeigt, dass die Affinität der einzelnen Metall-

DOTATOC-Derivate variiert. Ga-DOTATOC hat im Vergleich zum Y-DOTATOC eine ca.

fünffach höhere Affinität zum SST-Rezeptor 2, Eu-DOTATOC weist die geringste Affinität

auf. Gleich in den 1D-Spektren werden die ersten Unterschiede deutlich: Ga-DOTATOC

zeigt nur einen Signalsatz, wohingegen Y-DOTATOC einen Haupt- und einen

Nebensignalsatz im Verhältnis 68 : 32 besitzt. Das 1D-Spektrum von Eu-DOTATOC besteht

aus vier Konformationen im Verhältnis 55 : 30 : 14 : 1. Die Daten für Ga-DOTATOC und die

zwei Signalsätze für Y-DOTATOC sind nicht mit einer einzigen Struktur zu erklären. Sie

werden nur dann erfüllt, wenn zumindest ein Gleichgewicht zwischen einer β-Faltblattstruktur

und einer 310-helikalen Struktur zugrunde gelegt wird. Die Unterschiede zwischen dem

Haupt- und dem Nebendatensatz für Y-DOTATOC entstehen wahrscheinlich durch den

Einfluss der DOTA-Komplexgeometrie. Der DOTA-Ligand kann im Fall des Y-DOTATOC

zwei isomere Formen annehmen, die sich durch eine Inversion des Rings unterscheiden. Die

Auswirkungen auf den Peptidteil sind dabei so stark, dass die Signale sich nicht mehr mitteln.

Die Struktur für das Eu-DOTATOC konnte nicht gelöst werden, da die vier Konformationen

schnell im Vergleich zur NMR-Zeitskala austauschen und stark überlagern. Da das Eu3+-Ion

paramagnetisch ist, kommt noch erschwerend hinzu, dass die Linien für den DOTA-Liganden

sehr breit wurden. Die Signale für den DOTA-Liganden konnten durch 2D-NMR-

Experimente nicht mehr erfasst werden. Die Vermutung liegt jedoch nahe, dass zwei der vier

Konformationen, ebenso wie für die zwei Konformationen des Y-DOTATOCs von der

Inversion des Liganden her rühren. Die zwei weiteren Datensätze könnten von der

zusätzlichen Koordination eines Wassermoleküls an die zwei Diastereomere stammen.

Literaturverzeichnis 89

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Anhang 99

7 Anhang

7.1 Experimentelle Daten von Parvulin

7.1.1 Verzeichnis der an Par10 durchgeführten Experimente

Experiment Parameter und Bemerkungen Spektrometer 15N-HSQC NS: 4, TD (15N/F2) 128 DMX 750 13C-HSQC Aliphatenbereich, NS: 4, TD (13C/F2) 192 DMX 750 13C-HQSC Aromatenbereich: NS: 8, TD (13C/F2) 128, DMX 750

SW (13C) 28.19 ppm

Experimente zur sequentiellen Zuordnung

HNCACB ∆(CαCβ) = 3.5 ms, ∆(CαN) = 14 ms, NS: 16, DMX 750

TD (13C/F2) 140, (15N/F1) 88

CBCA(CO)NH ∆(CαCβ) = 3.5 ms, ∆(CαCO) = 4.5 ms, ∆(NCO) = 13 ms DMX 750

NS: 16, TD (13C/F2) 140, (15N/F1) 92

HNCO ∆(NCO) = 11.5 ms, NS: 8, TD (13C/F2) 80, (15N/F1) 80 DMX 750

SW (13C) 11.0 ppm

HA(CACO)NH ∆(HαCα) = 2.4 ms, ∆(CαCO) = 3 ms, ∆(NCO) = 13 ms DMX 601

NS: 8, TD (1H/F2) 104, (15N/F1) 80, SW (1H/F3/F2) 12.97/5.2 ppm

Experimente zur Seitenkettenzuordnung

15N-TOCSY-HSQC τmix = 65 ms (DIPSI-2 mit 28.25 µs), NS: 32 DMX 600

TD (1H/F2) 144, (15N/F1) 76,

SW (1H/F3/F2) 11.96 ppm, SW (15N/F1) 34.0 ppm

HCCH-TOCSY τmix = 18.9 ms (DIPSI-3 mit 29 µs), NS: 16 DMX 750

TD (1H/F2) 96, (13C/F1) 128, SW (1H/F2) 7.5 ppm

HCCH-COSY NS: 16, TD (13C/F2) 94, (13C/F1) 174, DMX 750

SW (1H/F3) 10.7 ppm

(H)CC(CO)NH τmix = 18.9 ms (DIPSI-3(y) mit 29 µs), NS: 48 DMX 750

TD (13C/F2) 92, (15N/F1) 80

2D Cβ-Hδar – Korrelation NS: 768, TD (15N) 96 DMX 750

2D Cβ-Hεar - Korrelation NS: 1280, TD (15N) 96 DMX 750

Experimente zur Strukturbestimmung

HNHA ∆(HαHN) = 13 ms, NS: 16, TD (1H/F2) 128, (15N/F1) 80 DMX 600

Anhang 100

SW (1H/F3/F2) 11.96 ppm, SW (15N/F1) 34.0 ppm 15N-NOESY-HSQC τmix = 80 ms, NS: 16, TD (1H/F2) 160, (15N/F1) 80 DMX 600

SW (1H/F3/F2) 11.96 ppm, SW (15N/F1) 34.0 ppm 13C-NOESY-HSQC τmix = 80 ms, NS: 32, TD (1H/F2) 108, (13C/F1) 128 DMX 750

CCH-NOESY τmix = 80 ms, NS: 8, TD (13C/F2) 256, (13C/F1) 128 DMX 601

SW (1H/F3) 12.97 ppm, (13C/F2/F1) 138.05 ppm

CNH-NOESY τmix = 80 ms, NS: 8, TD (13C/F2) 46, (15N/F1) 120 DMX 601

SW (1H/F3) 12.97 ppm, (13C/F2) 138.05 ppm, (15N/F1) 30.0 ppm

Experimente zur Dynamikmessung

MEXICO τmix = 50 ms und 200 ms, NS: 64, TD (15N) 512 DMX 750

Das Spektrometer mit der 1H-Frequenz von 600.40 MHz wurde in der Tabelle als DMX600 und das

Spektrometer mit der Protonenfrequenz von 600.13 MHz als DMX601 bezeichnet.

Die Anzahl der komplexen Punkte (TD) in der 1H-Dimension (F3) betrug, mit Ausnahme des HCCH-TOCSY

(512) immer 1024, die Spektrale Breite (SW) wenn nicht anders angegeben 13.9 ppm für 1H, 69.8 ppm für 13C

und 30.2 ppm für die 15N-Dimension.

Die Sendefrequenzen am DMX 600 entsprachen 119.05 ppm (15N), 4.71 ppm (1H), am DMX 601 118.6 ppm

(15N), 4.66 ppm (1H), 42.41 ppm (13Cα/β) für das HA(CACO)NH und für die CNH-NOESY- und CCH-NOESY-

Experimente 119.2 ppm (15N), 4.60 ppm (1H) und 76.27 ppm (13Car/al).

Am DMX 750 waren die Sendefrequenzen 117.4 ppm (15N), 4.78 ppm (1H), 175.6 ppm (13CO), 55.13 ppm

(13Cα), 42.41 ppm (13Cα/β) und 35.0 ppm (13Cβ).

Die Evolutionszeit der Kopplung zweier Kerne A und B wird in den Parametern durch ∆(AB) angegeben.

Anhang 101

7.1.2 Zuordnung der Par10-Resonanzen

Tabelle 7.1: 1H-, 13C- und 15N-chemische Verschiebungen [ppm] und 3JHNHA-Kopplungskonstanten [Hz] von

Par10.

Aminosäure 15N 1HN 13CO 13Cα 1Hα 13Cβ 1Hβ 13Cγ/1Hγ, 13Cδ,/1Hδ, 13Cε,/1Hε, 1HNx/15Nx 3JHNHα

Ala1 174.08 51.70 4.10 19.85 1.54 Lys2 121.83 8.86 175.62 56.72 4.61 34.25 1.85 γ: 25.21/1.47, δ: 29.21/1.63,

ε: 42.33/2.98 7.4

Thr3 115.71 8.78 172.79 60.76 5.21 72.47 3.95 γ: 22.11/1.05 8.8 Ala4 122.99 8.65 173.24 50.52 4.61 23.64 0.35 7.6 Ala5 118.04 7.12 177.11 50.26 5.02 21.21 0.52 8.7 Ala6 119.90 7.33 173.15 50.52 5.07 23.31 1.30 7.4 Leu7 117.17 8.72 178.01 51.96 5.45 46.03 1.34/1.08 γ: 27.46/1.46, δ1:26.13/--, δ2:23.09/0.84 8.9 His8 116.66 9.63 174.01 54.94 6.34 37.36 3.61/3.30 arom: 116.12/6.93 6.1 Ile9 121.42 9.06 172.39 61.73 3.44 42.04 1.29 γ1: 28.84/1.45/0.34,

γ(CH3): 17.77/0.54, δ: 13.64/0.01 8.2

Leu10 129.20 7.81 174.41 53.04 4.94 45.50 1.35/0.54 γ: 27.07/0.94, δ1: 23.23/0.62, δ2: 19.57/-0.27

4.3

Val11 117.70 9.07 175.32 58.83 4.93 36.06 2.50 γ1: 22.96/.74, γ2: 19.05/0.78 8 Lys12 118.72 9.06 177.25 58.53 4.48 33.82 1.97 γ: 25.61/1.63, δ: 29.28/1.63,

ε:42.14/2.79 5.2

Glu13 115.36 7.57 175.41 55.09 4.61 31.92 2.27/1.94 γ: 36.21/2.22/2.28 7.9 Glu14 128.11 8.27 177.65 59.54 2.41 29.58 1.57/1.00 γ: 36.58/1.55/1.84 3.1 Lys15 116.45 8.55 178.63 59.54 3.78 32.06 1.77/1.65 γ: 25.16/1.39, δ: 28.98/1.62,

ε: 42.42/2.92 2.6

Leu16 118.23 6.49 177.56 57.03 4.18 41.24 1.80/1.54 γ: 27.92/1.79, δ1: 26.66/1.57, δ2: 22.52/0.81

5.3

Ala17 120.72 7.27 178.69 55.64 3.63 17.51 1.15 3.5 Leu18 116.77 8.15 179.75 58.11 3.82 41.70 1.81/1.42 γ: 27.12/1.56, δ1: 25.74/--,

δ2: 23.21/1.07 3.9

Asp19 121.88 7.89 179.22 57.27 4.29 40.98 2.76/2.71 3.9 Leu20 118.83 8.57 178.98 57.66 3.73 41.04 1.72/0.77 γ: 27.12/0.33, δ1: 17.31/1.04,

δ2: 22.40/0.25 4.2

Leu21 119.63 8.08 178.53 58.62 3.81 41.65 1.87/1.53 γ: 27.23/--, δ1: 25.84/--, δ2: 24.13/0.72 3.1 Glu22 119.54 7.62 178.98 59.40 3.95 28.98 2.19 γ: 35.87/2.26 4.2 Gln23 118.35 8.02 180.26 59.70 3.99 28.20 2.05/1.98 γ: 34.48/2.25 7.4 Ile24 122.60 8.57 180.26 65.19 3.82 38.61 1.87 γ1: 30.91/1.66, γ(CH3) 18.14/1.08,

δ: 14.49/0.45 5.2

Lys25 123.94 8.69 177.86 59.99 4.05 32.09 1.95 γ: 25.86/1.44/1.64, δ: 29.46/1.68, ε: 41.97/2.95

4.4

Asn26 115.24 7.55 175.28 53.31 4.84 38.97 3.07/2.74 Nx: 7.55/7.01/114.03 3.4 Gly27 106.53 7.76 174.94 45.56 4.47/3.72 Ala28 124.49 8.23 176.46 52.57 4.23 19.75 1.15 4.6 Asp29 121.34 8.44 175.78 54.76 4.51 43.06 2.70 4.6 Phe30 129.81 8.78 177.58 61.98 3.53 40.88 3.27/2.99 arom: --/6.98 Gly31 105.89 8.54 176.83 47.45 4.05 6 Lys32 122.60 8.57 180.43 59.95 3.96 32.70 1.90 γ: 26.20/--, δ: 29.53/--, ε: 42.42/-- 5 Leu33 119.88 7.84 179.41 58.06 4.14 41.49 1.80/1.15 γ: 27.02/1.17, δ1: 26.28/--, δ2: 23.25/-- 5.1

Anhang 102

Tabelle 7.1 Fortsetzung: 1H-, 13C- und 15N-chemische Verschiebungen [ppm] und 3JHNHA-Kopplungskonstanten

[Hz] von Par10.


Ala34 123.66 8.68 179.06 55.63 3.86 17.60 1.48 2.5 Lys35 118.34 8.13 178.61 59.20 3.86 32.99 1.87 γ: 26.08/--, δ: 29.88/--, ε: 42.42/-- 2.9 Lys36 116.58 7.28 177.75 58.38 4.00 34.30 1.61/1.39 γ: 24.82/0.91/0.46, δ: 29.07/1.63,

ε: 42.19/-- 5.7

His37 112.04 8.09 176.21 57.08 4.66 34.10 2.83/2.60 arom: 119.77/7.02 8.9 Ser38 110.69 8.38 177.73 57.78 4.70 65.90 4.15/3.86 4.2 Ile39 120.79 9.20 176.61 62.20 4.47 37.34 2.19 γ: 117.91/1.06, γ(CH3): 25.55/1.06,

δ: 14.01/0.81 8.5

Cys40 127.65 7.63 56.95 4.64 29.56 2.77/2.49 7.1 Pro41 175.42 65.32 4.45 32.24 2.45 γ: 27.54/2.10/2.06, δ: 52.77/4.49/3.80 Ser42 119.05 9.60 178.78 61.49 4.06 62.93 3.72/3.99 Gly43 117.72 9.22 175.51 48.69 4.00/3.53 5.4 Lys44 117.86 7.42 177.75 58.40 4.19 32.19 1.94/1.66 γ: 25.16/--, δ: 28.84/1.65, ε: 42.30/-- 3.8 Arg45 117.65 7.62 177.15 54.35 4.79 29.80 2.27/1.90 γ: 27.18/1.66, δ: 43.66/3.28/3.14 9.5 Gly46 108.41 8.01 174.25 46.84 4.24/4.00 Gly47 105.26 8.30 173.47 44.87 4.46/3.73 Asp48 116.39 6.53 175.95 55.65 4.56 41.81 2.88/2.55 4.3 Leu49 128.78 8.51 177.63 54.96 4.33 43.38 2.00/1.43 γ: 26.52/1.71, δ1: 25.85/0.23,

δ2: 22.40/0.51 7.5

Gly50 110.89 8.93 171.95 45.00 4.00/3.76 Glu51 118.35 8.02 176.97 54.56 5.02 32.04 1.83 γ: 37.51/2.13/1.96 7.4 Phe52 122.80 8.81 176.59 55.46 5.07 40.70 3.11/3.09 arom: 129.13/7.01, 131.05/6.89 7.7 Arg53 117.37 8.33 177.71 54.25 5.17 33.00 1.94/1.71 γ: 28.02/1.65, δ: 43.36/3.15 (oder 3.29) 7.1 Gln54 123.51 8.16 176.82 57.88 3.95 28.11 0.69 γ: 33.49/1.89/1.71 3 Gly55 117.32 9.95 174.17 45.00 4.19/3.67 Gln56 120.56 8.01 177.34 58.06 4.23 31.04 2.32/2.12 γ: 34.38/2.30/2.40,

Nx: 7.60/7.07/112.95 6.2

Met57 118.05 8.96 175.55 53.19 4.47 33.82 1.94/1.76 γ: 34.17/2.25/(2.62), ε: (34.11)/(2.15) 5.5 Val58 114.65 8.20 60.92 4.43 30.34 2.50 γ1: 21.84/1.24, γ2: 19.29/1.14 Pro59 178.45 67.33 4.33 32.60 2.40/2.00 γ: 27.79/2.19/2.08, δ: 50.69/3.95/3.79 Ala60 117.94 8.96 179.43 55.32 4.09 19.24 1.43 Phe61 116.93 7.43 176.42 59.94 3.87 41.09 3.30/2.37 arom: 130.85/6.35, 131.32/6.85 7.7 Asp62 120.27 8.52 177.37 58.32 4.27 43.70 2.59/2.78 Lys63 115.23 8.47 180.17 59.17 3.99 32.31 1.86 γ: 25.16/1.08, δ: 29.19/--, ε: 42.42/2.94 2.9 Val64 118.52 6.88 179.51 66.21 3.59 32.24 1.82 γ1: 23.67/1.05, γ2: 21.83/0.72 6.3 Val65 118.56 8.13 176.03 65.75 3.34 31.11 1.75 γ1: 23.89/0.68, γ2: 21.94/0.20 3.5 Phe66 110.82 7.60 174.68 60.55 4.23 38.20 3.31/2.84 arom: 132.34/7.48, --/7.06 9.2

Anhang 103

Tabelle 7.1 Fortsetzung: 1H-, 13C- und 15N-chemische Verschiebungen [ppm] und 3JHNHA-Kopplungskonstanten

[Hz] von Par10.


Ser67 112.17 7.68 174.35 59.31 4.74 66.62 3.89/3.82 9.5 Cys68 123.55 8.32 57.00 4.88 26.55 3.29/2.83 5.2 Pro69 177.62 62.99 4.45 31.38 2.31/1.69 γ: 28.38/1.94/2.09, δ: 51.04/3.49/3.84 Val70 123.80 8.56 175.72 64.45 3.54 31.86 1.96 γ1: 22.02/0.87, γ2: 20.92/0.92 4.3 Leu71 119.13 9.15 175.39 57.84 3.42 39.78 2.18/1.63 γ: 27.35/1.72, δ1: 25.85/--,

δ2: 24.13/0.96 5.1

Glu72 120.10 7.48 53.37 4.89 31.80 1.91/1.73 γ: 35.44/2.14 7.8 Pro73 175.36 63.35 4.81 31.59 1.94 γ: 28.61/1.91/2.31, δ: 50.93/3.95/3.85 Thr74 121.16 9.46 171.98 62.18 4.79 71.87 3.91 γ: 19.71/1.09 8.7 Gly75 111.92 8.25 42.93 4.94/3.58 6.6 Pro76 175.54 61.17 4.91 34.47 2.28/2.08 γ: 26.31/2.12/1.41, δ: 50.47/3.73/3.51 Leu77 127.98 9.51 175.32 53.52 4.89 44.55 1.82/1.56 γ: 27.58/--, δ1: 26.66/--, δ2: 23.55/0.91 8.8 His78 129.14 9.57 174.42 53.79 5.18 30.26 3.26/2.96 arom: 119.11/6.27, 136.75/7.55 7.2 Thr79 119.27 9.13 175.32 60.84 4.56 73.13 4.66 γ: 20.94/1.20 5.1 Gln80 116.33 8.98 176.21 57.30 4.00 28.68 1.75/1.85 γ: 32.29/1.93 Phe81 118.37 8.44 175.33 58.25 4.52 39.32 3.27/2.75 arom: --/7.37 7.7 Gly82 107.05 7.37 170.11 44.60 4.33/3.66 7.3 Tyr83 120.27 9.09 174.91 57.31 5.30 40.72 2.55/2.28 arom: 132.35/6.73, 118.22/6.77 8.6 His84 120.05 9.92 177.46 54.20 6.05 31.66 3.29/3.19 arom: 131.08/7.31; 136.46/8.18 8.8 Ile85 122.07 9.13 175.93 60.49 4.85 39.98 1.63 γ1: 27.81/1.43, γ(CH3): 18.95/0.87,

δ: 14.23/0.80 8.9

Ile86 126.63 9.24 174.11 60.60 5.03 43.12 1.42 γ1: 28.84/1.52, γ(CH3): 18.37/0.65, δ: 15.38/0.31

8.7

Lys87 126.09 8.76 173.61 56.16 4.18 36.54 0.93 γ: 25.62/0.65, δ: 30.34/1.08/1.25, ε: 41.96/2.43/2.52

7.2

Val88 130.13 9.74 175.77 63.70 3.86 32.43 1.71 γ1: 24.01/0.76, γ2: 22.28/-- 7.2 Leu89 128.53 8.79 177.37 56.39 4.18 42.54 1.26/1.50 γ: 27.35/1.39, δ1: 25.28/--, δ2: 22.17/-- 7.8 Tyr90 111.06 7.02 172.59 56.49 4.47 38.82 3.29/2.88 arom:133.83/6.63, 117.67/6.51 4.4 Arg91 117.52 8.36 174.19 56.01 5.02 34.18 1.71/1.61 γ: 28.04/1.47/1.41, δ: 44.49/3.10/3.15 8.4 Asn92 127.17 8.80 54.66 4.71 41.21 2.79 Nx: 7.48/6.73/112.37 8

Anhang 104

7.2 Experimentelle Daten der Metall-DOTATOC-Komplexe

7.2.1 Verzeichnis der an DOTATOC-Komplexen durchgeführten

Experimente

Verzeichnis der an Ga-DOTATOC durchgeführten Experimente:

Experiment Parameter und Bemerkungen Spektrometer

TOCSY NS: 16, TD (F1/F2) 1024/2048, DMX 600

τmix = 80 ms (DIPSI-2 mit 23.30 µs),

E.COSY NS: 24, TD (F1/F2) 1024/8192 DMX 600

DQF-COSY NS: 32, TD (F1/F2) 1024/2048 DMX 600 13C-HSQC NS: 16, TD (F1/F2) 1024/1024 DMX 600

SW (F1/13C) 144.04 ppm

HMBC NS: 256, TD (F1/F2) 512/2048 DMX 600

SW (F1/13C) 184.06 ppm, τmix = 65 ms

ROESY NS: 32, TD (F1/F2) 1024/4096, τmix = 100 ms DMX 600

NOESY NS: 16, TD (F1/F2) 1024/4096, τmix = 60 ms DMX 600


Verzeichnis der an Y-DOTATOC durchgeführten Experimente:


TOCSY NS: 16, TD (F1/F2) 1024/2048, DMX 600

τmix = 80 ms (DIPSI-2 mit 20.10 µs),

E.COSY NS: 24, TD (F1/F2) 1024/8192 DMX 600


SW (F1/13C) 144.04 ppm

HMBC NS: 256, TD (F1/F2) 512/2048 DMX 600

SW (F1/13C) 184.06 ppm, τmix = 65 ms

ROESY NS: 32, TD (F1/F2) 1024/4096, τmix = 80 ms DMX 600


Die Spektrale Breite (SW) betrug 13.9 ppm für 1H. Die komplexen Punkte (TD) sind für jedes Experiment

angegeben. Die Sendefrequenzen entsprachen 4.69 ppm (1H) und 80 ppm (13C).

Anhang 105

Verzeichnis der an Eu-DOTATOC-Komplex durchgeführten Experimente:


TOCSY NS: 16, TD (F1/F2) 1024/2048, DMX 600

τmix = 10 ms (DIPSI-2 mit 21.20 µs)



Mitte des Spinlockfeldes bei 4.69 ppm oder –5.0 ppm

E.COSY NS: 24, TD (F1/F2) 3072/8192 DMX 600


SW (F1/13C) 200 ppm (SF: 100 ppm) 13C-HSQC NS: 40, TD (F1/F2) 1024/1024 DMX 600

SW (F1/13C) 140 ppm, SF: 70 ppm, SW (F2/1H) 15 ppm


T1-Relaxation NS: 8, TD (F1/F2) 33/8196 DMX 600

(10 µs, 100 µs, 250 µs, 400 µs, 600 µs, 800 µs, 1 ms,

5 ms, 10 ms, 100 ms, 150 ms, 200 ms, 250 ms, 300 ms,

350 ms, 400 ms, 450 ms, 500 ms, 550 ms, 600 ms, 650 ms,

700 ms, 750 ms, 800 ms, 850 ms, 900 ms, 950 ms,

1 s, 1.1 s, 1.2 s, 1.4 s, 1.6 s)

Die Spektrale Breite (SW) betrug, wenn nichts anderes angegeben ist 70.01 ppm für 1H. Die komplexen Punkte

(TD) sind für jedes Experiment angegeben.

Die Sendefrequenzen (SF) entsprach 4.69 ppm für 1H. Für 13C ist die Sendefrequenz beim Experiment

angegeben.

Anhang 106

7.2.2 NMR-Daten des Ga-DOTATOC-Komplexes

Tabelle 7.2: Zuordnung der chemischen Verschiebungen [ppm] des Ga-DOTATOC-Komplexes.

Peptid 1HN 13CO 13Cα 1Hα 13Cβ 1Hβ weitere Verschiebungen (13C/1H)

Phe2 8.72 175.53 57.41 4.77 40.12 2.96/3.21 δ: 129.69/7.31 ε: 131.36/7.41

ζ: 131.92/7.35

Cys3 8.39 172.79 55.47 4.73 44.05 2.83/3.00

Tyr4 8.23 57.73 4.66 40.2 2.87/3.01 δ: 133.42/7.13 ε: 118.16/6.89

Trp5 8.68 178.15 58.69 4.29 28.78 2.95/3.08 HN: --/10.25 2: 127.20/7.17

4: 120.88/7.58

5: 122.06/7.23 6: 124.68/7.29

7: 114.66/7.53

Lys6 8.42 177.73 59.26 3.9 32.08 1.29/1.62 γ: 24.09/0.55/0.36 δ: 28.78/1.33

ε: 41.73/2.73

Thr7 8.06 175.21 62.74 4.33 69.34 4.39 γ: 21.74/1.25

Cys8 8.04 175.1 4.83 42.1 3.25/2.96

Thr9-OH 7.76 62.03 3.88 68.86 4.04 γ: 21.64/1.17 Cβ’: 63.93/3.65/3.76

Ligand1 13C 1H 13C 1H

CH2-COO-

komplexiert 61.87 3.78/3.86 62.02 3.70/3.95

frei 65.78 3.52

CH2-Amid- 64.03 3.57/3.68

CH2-CH2 56.44 2.66/3.43 59.68 3.31/3.41

59.79 3.51/3.33 57.18 3.31/3.99

57.18 3.32/4.00 59.71 3.24/3.49

57.25 3.78/3.29 59.71 3.42/3.29

Tabelle 7.3: Kopplungskonstanten von Ga-DOTATOC; die 3JHNHα wurden aus dem 1D-Spektrum bestimmt, die 3JHαHβ aus dem E.COSY-Spektrum.

Peptid 3JHNHα [Hz] 3JHαHβ [Hz]

Phe2 7.88 8.91

Cys3 7.63 4.71

Tyr4 7.88 6.45 (h) 8.29 (t)

Trp5 4.40 10.9 (h) 5.60 (t)

Lys6 6.87 3.48 (h) 10.95 (t)

Thr7 7.63 4.50

Cys8 7.88 überlagert

Thr9-OH 9.41 überlagert

Anhang 107

Tabelle 7.4: Verwendete NOE-Daten für die vorläufige Strukturrechnung von Ga-DOTATOC; Com steht für

den DOTA-Liganden, die Nummerierung der Atome erfolgte wie in der PDB-Datei vorgegeben.

Atom 1 Atom 2 Multiplizität Abstand [Å]

1 Com H22 1 Com H32 1 2.47 1 Com H22 1 Com H31 1 2.08 1 Com H31 1 Com H42 1 2.68 1 Com H32 1 Com H42 1 2.48 1 Com HN42 1 Com H71 1 2.84 1 Com H62 1 Com H71 1 2.15 1 Com HN12 1 Com Hχ1 1 2.50 1 Com H81 1 Com HN12 1 3.22 1 Com H81 1 Com H101 1 2.42 1 Com H81 1 Com H102 1 2.27 1 Com H82 1 Com H102 1 2.46 1 Com H81 2 Phe Hδ1 1 3.79 1 Com H81 2 Phe Hε1 1 3.60 1 Com H82 2 Phe Hδ1 1 4.41 1 Com H82 2 Phe Hε1 1 3.93 1 Com H101 2 Phe Hδ1 1 4.09 1 Com H102 2 Phe Hδ1 1 3.97 1 Com H102 2 Phe Hε1 1 3.53 1 Com H102 2 Phe Hζ 1 4.01

2 Phe HN 1 Com H101 1 2.63 2 Phe HN 1 Com H102 1 2.52 2 Phe HN 1 Com H81 1 3.93 2 Phe HN 2 Phe Hα 1 2.82 2 Phe HN 2 Phe Hβh 1 2.79 2 Phe HN 2 Phe Hβt 1 3.19 2 Phe HN 2 Phe Hδ1 1 3.88 2 Phe HN 3 Cys HN 1 4.59 2 Phe HN 4 Tyr HN 1 3.30 2 Phe Hα 2 Phe Hδ1 1 2.42 2 Phe Hα 2 Phe Hε1 1 3.24 2 Phe Hα 2 Phe Hζ 1 4.56 2 Phe Hβh 2 Phe Hδ1 1 2.29 2 Phe Hβh 2 Phe Hε1 1 3.24 2 Phe Hβh 2 Phe Hζ 1 3.83 2 Phe Hβt 2 Phe Hδ1 1 2.38 2 Phe Hβt 2 Phe Hζ 1 3.93 2 Phe Hβt 2 Phe Hε1 1 3.39

3 Cys HN 1 Com H101 1 4.91 3 Cys HN 1 Com H102 1 4.48 3 Cys HN 2 Phe Hα 1 2.37 3 Cys HN 2 Phe Hβh 1 5.10 3 Cys HN 2 Phe Hβt 1 3.31 3 Cys HN 3 Cys Hα 1 2.37 3 Cys HN 3 Cys Hβh 1 2.94 3 Cys HN 3 Cys Hβt 1 3.00 3 Cys Hα 4 Tyr Hδ1 1 3.75 3 Cys Hα 7 Thr qγ2 3 4.82

4 Tyr HN 3 Cys Hα 1 2.14 4 Tyr HN 3 Cys Hβh 1 2.79 4 Tyr HN 3 Cys Hβt 1 2.74 4 Tyr HN 4 Tyr Hα 1 2.75 4 Tyr HN 4 Tyr Hβh 1 2.56 4 Tyr HN 4 Tyr Hβt 1 2.87 4 Tyr HN 4 Tyr hδ1 1 3.61 4 Tyr HN 7 Thr HN 1 3.20 4 Tyr HN 7 Thr Hα 1 4.30 4 Tyr HN 7 Thr Hβ 1 3.65

Anhang 108

Tabelle 7.3 Fortsetzung: Verwendete NOE-Daten für die vorläufige Strukturrechnung von Ga-DOTATOC; Com steht für den DOTA-Liganden, die Nummerierung der Atome erfolgte wie in der PDB-Datei vorgegeben.


4 Tyr HN 7 Thr qγ2 3 4.50 4 Tyr Hα 4 Tyr Hδ1 1 2.50 4 Tyr Hα 4 Tyr Hε1 1 4.11 4 Tyr Hβh 4 Tyr Hδ1 1 2.22 4 Tyr Hβh 4 Tyr Hε1 1 3.74 4 Tyr Hβt 4 Tyr Hδ1 1 2.23 4 Tyr Hβt 4 Tyr Hε1 1 4.56 4 Tyr Hδ1 2 phe Hζ 1 2.79 4 Tyr Hε1 5 Trp Hζ3 1 2.90 4 Tyr Hε1 5 Trp Hε3 1 3.26

5 Trp HN 4 Tyr Hα 1 2.12 5 Trp HN 4 Tyr Hβh 1 4.02 5 Trp HN 4 Tyr Hβt 1 4.38 5 Trp HN 5 Trp Hα 1 2.81 5 Trp HN 5 Trp Hβh 1 2.31 5 Trp HN 5 Trp Hβt 1 2.45 5 Trp HN 5 Trp Hδ1 1 3.60 5 Trp HN 5 Trp Hε3 1 3.66 5 Trp Hα 4 Tyr Hδ1 1 2.88 5 Trp Hα 4 Tyr Hε1 1 4.14 5 Trp Hα 5 Trp Hδ1 1 3.06 5 Trp Hα 5 Trp Hε3 1 2.50 5 Trp Hβh 4 Thr Hε1 1 3.63 5 Trp Hβh 5 Trp Hδ1 1 2.69 5 Trp Hβh 5 Trp Hε3 1 2.66 5 Trp Hβt 4 Thr Hε1 1 4.33 5 Trp Hβt 5 Trp Hδ1 1 2.58 5 Trp Hβt 5 Trp Hε3 1 2.66 5 Trp Hδ1 5 Trp Hε1 1 2.42 5 Trp Hδ1 6 Lys qδ 2 5.96 5 Trp Hε1 6 Lys qε 1 3.56 5 Trp Hε1 5 Trp Hζ2 1 2.84

6 Lys HN 5 Trp Hα 1 2.13 6 Lys HN 5 Trp Hβt 1 4.37 6 Lys HN 6 Lys Hα 1 2.86 6 Lys HN 6 Lys Hβh 1 2.44 6 Lys HN 6 Lys Hβt 1 3.56 6 Lys HN 6 Lys Hγh 1 2.61 6 Lys HN 6 Lys Hγt 1 3.11 6 Lys HN 7 Thr HN 1 3.09 6 Lys Hα 5 Trp Hδ1 1 3.53 6 Lys Hα 5 Trp Hε1 1 4.89 6 Lys Hα 5 Trp Hε3 1 3.43 6 Lys Hα 5 Trp Hζ3 1 4.48 6 Lys Hα 5 Trp Hη2 1 4.52 6 Lys Hα 6 Lys Hβh 1 3.03 6 Lys Hα 6 Lys Hβt 1 2.37 6 Lys Hα 6 Lys Hγh 1 3.09 6 Lys Hα 6 Lys Hγt 1 2.55 6 Lys Hα 7 Thr qγ2 3 3.84 6 Lys Hβh 5 Trp Hε3 1 4.82 6 Lys Hβh 5 Trp Hζ2 1 3.53 6 Lys Hβt 5 Trp Hε3 1 4.79 6 Lys Hβt 5 Trp Hζ2 1 3.53 6 Lys Hβt 6 Lys Hγh 1 2.61 6 Lys Hβt 6 Lys Hγt 1 2.62 6 Lys Hγh 2 phe Hδ1 1 4.70 6 Lys Hγh 5 Trp Hδ1 1 3.92

Anhang 109

Tabelle 7.3 Fortsetzung: Verwendete NOE-Daten für die vorläufige Strukturrechnung von Ga-DOTATOC;

Com steht für den DOTA-Liganden, die Nummerierung der Atome erfolgte wie in der PDB-Datei vorgegeben.


6 Lys Hγh 5 Trp Hε3 1 5.05 6 Lys Hγh 5 Trp Hζ2 1 3.93 6 Lys Hγh 6 Lys qδ 2 2.50 6 Lys Hγh 7 Thr qγ2 3 3.70 6 Lys Hγt 5 Trp Hδ1 1 3.75 6 Lys Hγt 5 Trp Hε1 1 3.76 6 Lys Hγt 5 Trp Hζ2 1 3.93 6 Lys Hγt 6 Lys qδ 2 2.52 6 Lys qδ 5 Trp Hε1 2 4.31 6 Lys qδ 5 Trp Hζ2 2 3.75 6 Lys qδ 5 Trp Hη1 2 5.11 6 Lys qε 5 Trp Hζ2 2 3.40 6 Lys qε 5 Trp Hη1 2 4.84

7 Thr HN 2 phe Hε1 1 4.37 7 Thr HN 5 Trp Hα 1 3.77 7 Thr HN 6 Lys Hα 1 2.87 7 Thr HN 6 Lys Hβh 1 3.20 7 Thr HN 6 Lys Hβt 1 3.76 7 Thr HN 7 Thr Hα 1 2.57 7 Thr HN 7 Thr Hβ 1 2.68 7 Thr HN 7 Thr qγ2 3 3.04 7 Thr Hα 7 Thr qγ2 3 3.02 7 Thr Hβ 7 Thr qγ2 3 2.91 7 Thr qγ2 4 Tyr Hδ1 3 4.36 7 Thr qγ2 4 Tyr Hε1 3 4.63

8 Cys HN 3 Cys Ha 1 4.08 8 Cys HN 3 Cys Hbh 1 3.70 8 Cys HN 6 Lys Ha 1 3.58 8 Cys HN 7 Thr Ha 1 2.86 8 Cys HN 7 Thr Hb 1 2.55 8 Cys HN 8 Cys Ha 1 2.86 8 Cys HN 8 Cys Hbh 1 2.47 8 Cys HN 8 Cys Hbt 1 4.35 8 Cys HN 9 Thr HN 1 3.31 8 Cys HN 9 Thr Ha 1 3.62

9 Thr HN 7 Thr Hα 1 4.19 9 Thr HN 7 Thr Hβ 1 4.84 9 Thr HN 7 Thr qγ2 3 5.22 9 Thr HN 8 Cys Hα 1 2.34 9 Thr HN 8 Cys Hβh 1 3.61 9 Thr HN 8 Cys Hβt 1 3.14 9 Thr HN 9 Thr Hα 1 2.95 9 Thr HN 9 Thr Hβ 1 3.24 9 Thr HN 9 Thr Hχt 1 3.08 9 Thr HN 9 Thr Hχh 1 2.88 9 Thr HN 9 Thr qγ2 3 3.50 9 Thr Hα 9 Thr qγ2 3 2.99 9 Thr Hβ 9 Thr qγ2 3 2.92 9 Thr Hχt 9 Thr qγ2 3 3.62 9 Thr Hχh 9 Thr qγ2 3 3.47 9 Thr qγ2 4 Tyr Hε1 3 5.04

Anhang 110

7.2.3 NMR-Daten des Y-DOTATOC-Komplexes

Tabelle 7.5: Zuordnung der chemischen Verschiebung für den Hauptsignalsatz und für den Nebensignalsatz von

Y-DOTATOC. Der Ligand-Teil und einige Kohlenstoffverschiebungen sind bisher noch nicht zugeordnet.

Hauptsignalsatz

Peptid 1HN 13CO 13Cα 1Hα 13Cβ 1Hβ weitere Verschiebungen (13C/1H)

Phe2 9.54 172.29 --- 4.94 40.48 3.26/2.90 δ: --/7.46 ε: --/7.37

ζ: --/7.32

Cys3 8.73 170.56 --- 4.72 44.19 3.16/2.95

Tyr4 8.28 172.54 55.82 4.68 40.22 3.08/2.87 δ: --/7.18 ε: --/6.93

Trp5 8.69 175.63 58.66 4.23 28.70 3.04/2.88 HN: --/10.25 2: --/7.15 4: --/7.53

5: --/7.29 6: --/7.23 7: --/7.56

Lys6 8.41 176.50 57.11 3.87 31.99 1.61/1.28 γ: 24.18/0.55/0.34

δ: 28.66/1.34/1.31

ε: 41.62/2.72

Thr7 8.08 173.30 62.84 4.34 69.19 4.44 γ: 21.64/1.27 OH: 5.78

Cβ’: 63.83/3.67/3.74

Cys8 7.87 172.58 41.81 4.72 41.62 3.17/2.87

Thr9-OH 7.67 59.17 3.79 68.72 γ: 21.64/1.18 Cβ’: --/3.67/3.74

OH: 5.61

Nebensignalsatz

Phe2 9.30 4.94 3.19/3.08 δ: --/7.46 ε: --/7.37

ζ: --/7.32

Cys3 8.34 4.53 2.87/2.72

Tyr4 8.07 4.59 3.18/2.83 δ: --/7.18 ε: --/6.93

Trp5 8.60 58.63 4.17 2.98/2.80 HN: --/10.25 2: --/7.15 4: --/7.53

5: --/7.29 6: --/7.23 7:--/7.56

Lys6 8.41 57.43 3.80 1.58 γ: 24.18/0.55/0.34

δ: 28.66/1.34/1.31

ε: 41.62/2.72

Thr7 8.06 62.84 4.33 69.03 4.48 γ: 21.64/1.27 OH: 5.78

Cβ’: 63.83/3.67/3.74

Cys8 7.81 4.71 41.07 3.24/2.97

Thr9-OH 7.67 3.89 68.72 4.04 γ: 21.64/1.18 Cβ’: --/3.67/3.74

OH: 5.61

Anhang 111

7.3 Neu implementierte Pulsprogramme

7.3.1 Cβ-Hδ-Aromaten-Korrelation

Name des Pulsprogramms: aharomaten.ar #include <Avance.incl> #include <Grad.incl> ;for 13Cb and 1Hd/e ;T. Yamazaki, J.Kay, L. Kay, JACS 1993, 115, 11054 ;p1= ;90 degree hard pulse on 1H (f1) at pl1 "p2=p1*2" ;p3= ;90 degree hard pulse on C (f2) at pl2 "p4=p3*2" ;p10 ;180 degree Bloch-Siegert pulse at sp10 ;p7 ;90 degree hard pulse on X (f3) at pl14p ;p5 ;90 degree hard pulse on X (f2) at pl2 "p6=p5*2" ;p14 ;180 degree soft pulse on X (f2) at sp2 ;p16=1ms ;gradient pulse length ;pcpd1 ;pl11 1H decoupling "d2 = 4.4m-1.78m" "d3 = 4.4m-p10-3u" "d4 = 1.78m" ;1/4J(CH) "d5 = 2.7m-p14" "d6 = 2.1m" "d7 = 0.71m-(p6/2)" "d10= 1.78m-p10-20u" "d11= 3m" "d13= 115u-1.28*p3" ;for 750 MHz, delta (Ca-Cb) = ca. 23 ppm "d16= 300u" ;gradient recovery delay "d20= 1.5m" "d26= 2.1m-p2-d7" ;"d0 = d2+p6+d10+20u" ;"d8 = p6+d3+3u" "l3 = (td1/2)" 1 ze d11 2 d1 do:f3 BLKGRAD 3 9m 4 3u pl2:f2 3u pl1:f1 3u pl3:f3 (p3 ph0):f2 50u UNBLKGRAD GRADIENT(cnst21) d16 (p1 ph0) d4 ;1/4J(CH) (p2 ph0):f1 (p4 ph1):f2 d4 ;1/4J(CH) (p1 ph2):f1 GRADIENT(cnst22) d16 (p3 ph3):f2

(p10:sp10 ph0):f3 ;Bloch-Siegert comp. d10 pl11:f1 20u cpds1:f1 d2 (p3 ph4):f2 d13 (p3 ph4):f2 (p10:sp10 ph0):f3 d3 3u pl3:f3 (p3 ph0):f2 10u do:f1 GRADIENT(cnst23) d16 (p5 ph5):f3 (p14:sp2 ph0):f2 ;Bloch-Siegert comp. d5 (p10:sp10 ph6):f3 (p14:sp2 ph0):f2 d5 pl3:f3 (p5 ph0):f3 d6 (p6 ph0):f3 d7 pl1:f1 (p2 ph0):f1 d26 (p5 ph7):f3 GRADIENT(cnst24) d16 (p1 ph0):f1 d20 (p2 ph0):f1 (p6 ph0):f3 d20 pl23:f3 (p1 ph0):f1 go=2 ph31 cpd3:f3 d1 do:f3 BLKGRAD wr #0 if #0 ip3 zd lo to 3 times 2 3m id2 3m dd3 3m ip31*2 lo to 4 times l3 exit

Anhang 112

ph0= 0 ph1= 0 2 ph2= 1 3 ph3= 0 ph4= 0 0 1 1 2 2 3 3 ph5= 0 ph6= 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 ph7= 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ph31= 0 2 2 0 0 2 2 0 2 0 0 2 2 0 0 2 0 2 2 0 0 2 2 0 2 0 0 2 2 0 0 2 2 0 0 2 2 0 0 2 0 2 2 0 0 2 2 0 2 0 0 2 2 0 0 2 0 2 2 0 0 2 2 0 ;in0: 1/(2 * SW(X)) = DW(X) ;nd0: 2 ;NS: 1 * n ;DS: >= 16, but 2 * ns * m ;td1: number of experiments ;MC2: echo-antiecho ;cpd2: decoupling according to sequence defined by cpdprg2 ;pcpd2: f2 channel - 90 degree pulse for decoupling sequence ;use gradient program (GRDPROG) : 4sinema

7.3.2 Cβ-Hε-Aromaten-Korrelation

Name des Puslprogramms: aharomaten.He #include <Avance.incl> #include <Grad.incl> ;for 13Cb and 1Hd/e ;T. Yamazaki, J.Kay, L. Kay, JACS 1993, 115, 11054 ;p1= ;90 degree hard pulse on 1H (f1) at pl1 "p2=p1*2" ;p3= ;90 degree hard pulse on C (f2) at pl2 "p4=p3*2" ;p10 ;180 degree Bloch-Siegert pulse at sp10 ;p7 ;90 degree hard pulse on X (f3) at pl14p ;p5 ;90 degree hard pulse on X (f2) at pl2 "p6=p5*2" ;p14 :180 degree soft pulse on X (f2) at sp2 ;p16=1ms ;gradient pulse length ;pcpd1 ;pl11 1H decoupling "d2 = 4.4m-1.78m" "d3 = 4.4m-p10-3u" "d4 = 1.78m" ;1/4J(CH) "d5 = 2.7m-p14" "d6 = 2.1m" "d7 = 0.71m-(p6/2)" "d10= 1.78m-p10-20u" "d11= 3m" "d13= 115u-1.28*p3" ;for 750 MHz, delta (Ca-Cb) = ca. 23 ppm "d16= 300u" ;gradient recovery delay "d20= 1.5m" "d26= 2.1m-p2-d7" ;"d0 = d2+p6+d10+20u" ;"d8 = p6+d3+3u" "l3 = (td1/2)"

1 ze d11 2 d1 do:f3 BLKGRAD 3 9m 4 3u pl2:f2 3u pl1:f1 3u pl3:f3 (p3 ph0):f2 50u UNBLKGRAD GRADIENT(cnst21) d16 (p1 ph0) d4 ;1/4J(CH) (p2 ph0):f1 (p4 ph1):f2 d4 ;1/4J(CH) (p1 ph2):f1 GRADIENT(cnst22) d16 (p3 ph3):f2 (p10:sp10 ph0):f3 ;Bloch-Siegert comp. d10 pl11:f1 20u cpds1:f1 d2 (p3 ph4):f2 d13 (p3 ph4):f2 (p10:sp10 ph0):f3 d3 3u pl3:f3 (p3 ph0):f2 10u do:f1 GRADIENT(cnst23) d16 (p5 ph5):f3 (p14:sp2 ph0):f2 ;Bloch-Siegert comp. d5 (p10:sp10 ph6):f3 (p14:sp2 ph0):f2

Anhang 113

d5 pl3:f3 (p5 ph0):f3 3.8m (p6 ph0):f3 3.8m (p5 ph0):f3 d6 (p6 ph0):f3 d7 pl1:f1 (p2 ph0):f1 d26 (p5 ph7):f3 GRADIENT(cnst24) d16

(p1 ph0):f1 d20 (p2 ph0):f1 (p6 ph0):f3 d20 pl23:f3 (p1 ph0):f1 go=2 ph31 cpd3:f3 d1 do:f3 BLKGRAD wr #0 if #0 ip3 zd lo to 3 times 2 3m id2 3m dd3 3m ip31*2 lo to 4 times l3 exit

ph0= 0 ph2= 1 ph1= 0 ph3= 0 ph4= 0 1 2 3 ph5= 0 0 0 0 2 2 2 2 ph6= 0 ph7= 0 ph31=0 2 0 2 2 0 2 0 ;in0: 1/(2 * SW(X)) = DW(X) ;nd0: 2 ;NS: 1 * n ;DS: >= 16, but 2 * ns * m ;td1: number of experiments ;MC2: echo-antiecho ;cpd2: decoupling according to sequence defined by cpdprg2 ;pcpd2: f2 channel - 90 degree pulse for decoupling sequence ;use gradient program (GRDPROG) : 4sinema

anwendung nmr-spektroskopischer methoden zur ... · pdf filecrinept cross-correlated...

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