“Quenching” de fluorescencia

quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión

IF (Q) < IF (-Q)

Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional)

Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete

Rearreglos moleculares

Transferencia de energía

Transferencia de carga

Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)

τ0

τ / τ0 = F/F0

Quenching colisional o dinámico

X X*hν

hν’

τ < τ0

QXQ*

X + Q

X

kQ

Quenching colisional o dinámico

F0/FStern-Volmer

Quenching de triptofano por O2

KSV = 32 M-1

Quenching colisional o dinámico

KSV = kq τ0 kq = cte. vel. quenching

k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión)

fQ = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching

kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski:

O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:

DeterminaciDeterminacióón de coeficiente de difusin de coeficiente de difusióón de NO en LDL n de NO en LDL por desactivacipor desactivacióón de la fluorescencian de la fluorescencia

O CO

(CH2)7 C CH H

(CH2)7CH3

CH3CHOCCH2O

••NO NONO

NO

Denicola et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 932-

Denicola et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 932-

= 1

Quenching colisional y estático combinado

Quenching dinámico y estático

• Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular

• Quenching dinámico o colisional: Q + F*

• Quenching estático: Q + F

• Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente)

Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q

Colicin E1 = proteina de membrana12 W

Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like –NH3+, -COOH, histidine protonated

Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)

DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescenteSBP = steroid binding protein

Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv)

Fracción accesible al quencher

Stern-Volmer modificada

a = fluoróforo accesible a Qb = fluoróforo no accesiblefa = fracción de la fluorescenciainicial que se quenchea

F0/F

cAMP Receptor Protein (CRP)

2 subunidades idénticas de 209 aa

W13 (expuesto) W85 (no accesible

+ cAMP = cambio conformacional = W13 y W85 expuestos

10-doxilnonadecano = quencher hidrofóbico

Acrilamida = quencher soluble

Quencher soluble en membranaCalcular la partición P

Lípido marcado (NBD)Q = 5-nitroxide estearico

Quenching como indicador de analitos – cuantificación del Q

Fluoróforo sensible a cloruros

Detección por levantamiento de Quenching

Secuencia de ADN con Fluoresceina quencheadapor pireno

Hibridización, se intercala el Pireno hidrofóbico y levanta el quenching de la Fluoresceina

Detección por levantamiento de Quenching

Oligómero con tiol en 3’ para unirse a la superfcie (o coloide) Au.Rodamina (TMR) en 5’ quencheada por Au.Hibridización correcta, levanta el quenching (aleja TMR de Au)

Quenching intermolecular

Q y F están unidos covalentemente

Enzima flavina reductasa con FMN unidoLa F de FMN es solución > F de FMN unido

La Y35 responsible de quenching interno de FMN por transferenciaelectrónica

Autoquenching – elevada concentración del fluoróforo

Fluoróforos con pococorrimiento Stokes

- reabsorción de las λmenores de emisión

- formación de excímeros

Rodamina 6G

5 µM

0.16 mM

5.7 mM