Aplicações biomédicas dos plasmas não térmicos à pressão

atmosférica

September 11, 2014

Figure 1: Slide 3

Os plasmas não térmicos à pressão atmosférica (PNTPA) contêm iões positivos, iões negativos, electrõese radiação ultravioleta. A sua interacão com a célula leva ao aparecimento de espécies reactivas. As maisimportantes são apresentadas na tabela 1 por ordem inversa de concentração[9]:

Concentração�cm�3

�Espécies Reactivas

1015 � 1017 Ozono (O3) e Hidroxilo (OH•)1014 � 1016 Peróxido de Hidrogénio (H2O2) e Singleto de Oxigénio

�1O2

�

1013 � 1014 Óxido Nítrico (NO)1010 � 1012 Superóxido

�O•�

2

�e outros iões positivos

Table 1: Três grupos principais de espécies reactivas

A experiência sugere que a interacção dos iões com as células inicia e cataliza processos de peroxidação

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semelhantes aos que ocorrem com radiação ionizante. Um desses processos pode por exemplo iniciar naperoxidação dos fosfolípidos da membrana celular e levar à geração de Malondialdeído (MDA) que participana formação de aduções no DNA[5]. Este tipo de alterações genéticas são facilmente resolvidas por célulaseucarióticas mas muito dificilmente por bactérias.

De facto, verifica-se na prática que os PNTPA permitem a eliminação de bactérias sem provocar qualquerdano irreparável nas células eucarióticas.

Um outro possível mecanismo de dano celular [13] envolve também a membrana celular. Esta é constituídapor uma dupla camada de fosfolípidos. Os grupos fosfato polares formam duas camadas separadas por umacamada de lípidos de acordo com a figura. A transferência de electrões entre grupos fosfato faz-se facilmente;De tal forma que podemos ver a membrana celular como um condensador de placas paralelas.

A interacção dos iões do plasma com as moléculas do meio extracelular leva à acumulação de cargaeléctrica. Ou seja, o condensador carrega-se com uma carga total Q. Existe por isso uma força entre asplacas do condensador (camadas de fosfatos) igual a:

F =Q2

2A"

em que A é a área da superfície da membrana e " é a constante dieléctrica do meio que separa as placas(camada de lípidos). Com acumulação de carga suficiente esta força pode levar à disrupção da membrana.

Este mecanismo é consistente com a ocorrência de poração observada em fungos e esporos[15, 4].Estes efeitos são selectivos (poupam as células eucarióticas presentes) quando a dose de exposição é inferior

a 6 J/cm2. Note-se que a unidade de dose é o J/cm2 e não J/cm3 como seria de esperar. A razão é que osPNTPA têm uma profundidade de penetração máxima da ordem do 1mm.

Figure 2: Slide 4

Um estudo realizado por Cheng et al. [2] sugere que, de todas as espécies presentes no plasma, os iões sãoos principais responsáveis pela inactivação de bactérias expostas a PNTPA. As exposições são feitas com ainterposição de uma grelha metálica ligada à terra (eliminando as espécies carregadas), com o alvo carregadopositivamente (eliminando as cargas positivas) ou com com o alvo carregado negativamente (eliminando as

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cargas negativas). Os raios UV são responsáveis por uma pequena percentagem da inactivação das E. coli.Os iões positivos têm um efeito semelhante ao dos iões negativos e são responsáveis pela maior percentagemda inactivação.

Figure 3: Slide 5

Os PNTPA permitem também inactivar fungos (poração de S. cerevisiae [14])

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Figure 4: Slide 6

e esporos (desnaturação, desidratação e poração de B. subtilis [15, 4]).

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Figure 5: Slide 7

Na tabela acima mostra-se o tempo de exposição (/ dose) necessário para causar efeitos semlhantes embactérias (E. coli, S. aureus), fungos (S. cerevisiae) e esporos (B. subtilis). Verifica-se que a dose necessáriapara inactivar esporos é uma ordem de grandeza superior à dose para inactivar fungos e duas ordens degrandeza superior à dose para inactivar bactérias.

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Figure 6: Slide 8

Uma aplicação possível de PNTPA é na esterilização do ar em condutas de ar hospitalares. Verificou-seque é possível inactivar vírus (influenza virus type A, parainfluenza virus type 3, respiratory syncytial virus[16]) com PNTPA.

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Figure 7: Slide 9

Os resultados obtidos sugerem que estes plasmas têm efeito superior em 1 a 3 ordens de grandeza ao dosraios UV correntemente utilizados. Em conjunto estas duas técnicas permitem melhorar significativamentea esterilização aérea hospitalar.

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Figure 8: Slide 10

Os PNTPA permitem tanbém inactivar priões (Bovine serum albumin [3]).

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Figure 9: Slide 11

O biofilme é formado por bactérias agregadas umas às outras. Em conjunto têm uma fisiologia diferente dequando se encontram em suspensão. Estão em geral rodeadas de uma substância formada de DNA, proteínase polisacarídeos. Estas colónias podem formar-se tanto sobre superfícies inertes como sobre tecidos. Obiofilme é altamente resistente a antibióticos e antisépticos.

Algumas bactérias (e.g. E. coli, S. aureus, MRSA95, USA300 e USA400 ) [8] têm maior facilidade emformar biofilme a partir de culturas planctónicas (bactérias suspensas). Recorrendo ao método de contagemde unidades formadoras de colónias observou-se uma forte correlação negativa entre a dose de PNTPA e onúmero de bactérias viáveis.

Nos gráficos A e B as culturas eram de biofilme e em C planctónicas. Nos gráficos A e C o plasma eradirecto (iões + UV) e no gráfico B era indirecto (apenas UV). Verificou-se que os iões do plasma têm grandeimportância na inactivação de bactérias em biofilme. Obteve-se inactivação total para doses da ordem de20 J/cm2 mas para doses da ordem de 10 J/cm2 conseguiu-se uma redução de cerca de 50%. Das 5 bactériastestadas, a mais resistente foi a E coli.

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Figure 10: Slide 12

No domínio da oncologia, descobriu-se que é possível induzir a apoptose em células eucarióticas expondo-as a PNTPA. Esta observação evidencia uma potencial utilização dos PNTPA na destruição de célulasneoplásicas (e.g. melanoma ATCC A2058). Verificou-se um aumento da ocorrência de fragmentação deDNA[7] (kit DeadEnd™ Fluorometric TUNEL).

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Figure 11: Slide 13

Esses resultados foram confirmados por western blot (melanoma B16F10)[12]. Houve um aumento de�H2A.X (indicando quebras de dupla hélice), de enzima de reparação p53 após a exposição a um plasma.Estes resultados também sugerem a ocorrência de apoptose devido ao aumento de GAPDH ao longo dotempo e do aparecimento de fragmentação de Caspase � 3. Verificou-se que tanto a GAPDH como aCaspase � 3 fragmentada tinham um máximo cerca de 3 horas após a exposição. Os níveis relativos deproteínas pro-apoptóticas (Bax) e anti-apoptóticas (Bcl � 2) não foram conclusivos quanto à viabilidadefinal das células.

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Figure 12: Slide 14

No presente estudo [10] procedeu-se ao xenotransplante de células neoplásicas. Em seguida realizou-seuma exposição a PNTPA e observou-se não só uma redução efectiva dos tumores expostos (apoptose dascélulas neoplásicas) ao fim de 24 horas como também que o efeito é selectivo. Ou seja, se houver célulasnormais e neoplásicas em iguais condições de exposição a PNTPA, as células neoplásicas apresentarão umamaior taxa de mortalidade que as células normais.

O modelo adoptado para tentar justificar essa selectividade é o de que as células em geral são maissusceptíveis de sofrer apoptose quando expostas a PNTPA se estão na fase de síntese do ciclo celular. Umavez que as células neoplásicas estão numa multiplicação muito mais intensa, supõe-se que há uma maiorquantidade de células neoplásicas nesta fase[11].

Se tivermos em conta que a exposição de fibroblastos a PNTPA activa as integrinas (proteínas da mem-brana celular que promovem a adesão da membrana) [17] é pertinente perguntar: será que as integrinas dascélulas neoplásicas também são activáveis por exposição a PNTPA?

Caso afirmativo poderíamos dificultar a capacidade de uma célula neoplásica formar colónias remotas(metástases) ao activar as integrinas da membrana.

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Figure 13: Slide 15

Os PNTPA têm protagonizado resultados surpreendentes na regeneração de feridas. A sua aplicaçãodirecta em feridas diminui o período de hemostase significativamente ao activar as plaquetas e diminuir otempo de coagulação. Este facto é visível por microscopia electrónica[6]. Para além disso os PNTPA têm umefeito angiogénico [1].

A activação intensa de plaquetas leva à recruta de fibroblastos promove a sua adesão (activação deintegrinas [17]) e dá-se uma catalização da formação da matriz extracelular. Daí resulta também umadiminuição significativa do período de cicatrização.

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Figure 14: Slide 16

Se juntarmos também o facto de os PNTPA serem muito eficazes na redução de bactérias constata-setambém uma redução considerável do período inflamatório.

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Figure 15: Slide 17 e 18

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Os PNTPA aplicados na regeneração de feridas podem ainda ser melhorados se forem complementadoscom o aumento de determinadas espécies reactivas[6]. Por exemplo, é amplamente conhecido o efeito anti-microbiano do NO (monóxido de azoto ou óxido nítrico) assim como o seu papel na vasodilatação (paramencionar apenas alguns). O potencial impacto clínico e económico desta modalidade de tratamento deferidas pode ser estimado se tivermos em conta o número de casos de úlceras venosas e diabéticas assim comoda recuperação de incisões cirúrgicas e de queimaduras[15].

Figure 16: Slide 19 (resumo das doses e efeitos resultantes)

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