BIOTECHNOLOGY

MOLECULAR TECHNIQUE FOR IDENTIFICATION AND GENETICS ENGINER

Bioteknologi Adalah teknologi merekayasa pertumbuhan dan metabolisme sel hidup, baik dari mikroba, tumbuhan, hewan maupun manusia untuk produksi komoditi barang maupun jasa yang bermanfaat bagi manusia.

HORMON INSULIN

HORMON PERTUMBUHAN

Review

Introduction to PCRThe Polymerase Chain Reaction

Photo courtesy of Fisher Scientific

DefinitionPolymerase Chain Reaction (PCR): A procedure to amplify a specific DNA region

Yields millions of copies of the target region, Eksponensial amplification.

Makes enough DNA for further molecular work Is the first step in preparing DNA for :

Sequencing Restriction digestion Bacterial cloning

Diagram by Andy Vierstraete 1999

PCR

Exponential increase of the number of copies during PCR

TEKNIK-TEKNIK MOLEKULER UNTUK DIAGNOSTIK dan IDENTIFIKASI

Penggunaan teknik molekuler Untuk keperluan :1.Karakterisasi dan identifikasi Mikroba: – Keragaman genetik – Hubungan filogeni/kekerabatan2. Diagnosis: deteksi dini/cepat dari patogen/Penyakit.3. Rekayasa Genetika, (ClONING, TRANSGENIK

ORGANISM)

Keunggulan teknik molekuler: • Akurasi tinggi: sensitifitas dan spesifisitas • Cepat • Dapat mendeteksi keseluruhan mikroba: Viable

but not (yet) culturable.

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) BASED METHODS KARRY MULLIS (1982)

Teknik Molekuler berkembang setelah ditemukannya PCR (Polymerase chain Reaction) oleh karry mullis (1982) dimana dengan sebuah alat yang dinamakan ‘’Thermal Cycler” Proses sintesis protein/Amplifikasi (pemanjangan) DNA dapat dilakukan secara invitro (diluar sel).

PCR ,thermal cycler multi-block system

Tahapan teknik molekuler: A. Ekstraksi DNA Produk DNA Genom B. PCR 1. Denaturasi, (94–96°C) pemutusan ikatan hidrogen pada

DNA Genom sehingga DNA menjadi Utas Tunggal .

2. Annealing,(45-60°C), penempelan PrimerTm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Annealing Temperature.

3. Ekstension (70-72°C), pemanjangan DNA Target

C. Elektroforesis (Visualisasi )- Identifkasi Produk PCR

1. Ekstraksi DNA

2. PCR

The different steps of PCR

PCR

DNA sequencing

Microarrays

Mass-spec

Roles of PCR Reagents

GoTaq® PCR Mix Taq polymerase

Enzyme that extends growing DNA strand complementary to DNA template

MgCl2

Provides ions needed for enzyme reaction

dNTP’s Nucleotides (Adenine, Cytosine, Guanine, Thymine)

building blocks for new DNA strands

Buffer Maintains optimal pH for enzyme

ddH2O

Roles of PCR Reagents

Primers Anneal to single-stranded DNA template

Provide initiation site for extension of new DNA

Forward primer Anneals to DNA anti-sense strand

Reverse primer Anneals to DNA sense strand

DNA template In this case, the product of our DNA extraction

Quick QuizWhich of the following reagents is NOT in a master

mix?

A. MgCl2

B. Template DNAC. ddH2OD. dNTPs

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bahan Jumlah (µl)

Primer:

Forward

Reverse

1

1

dNTP 2,5

10 x Buffer Ex Taq 2,5

Taq DNA Polymerase 0,2

Steril Destilation Water (SDW) 18,5

Pembuatan Premix

Pair-ID Forwad Primer Reverse PrimerProd Len.

TmDiff.FPPos.RPPos.

2 GATGGTCAGTGCCTCTCA CCCAGTTGTATAGCGGTA 518 286

586

Primer

Primer design

General notes on primer design in PCR

Perhaps the most critical parameter for successful PCR is the design of primers

Primer selectionCritical variables are: - primer length - melting temperature (Tm) - specificity - complementary primer sequences - G/C content- 3’-end sequence

Primer length

- specificity and the temperature of annealing are atleast partly dependent on primer length

- oligonucleotides between 20 and 30 (50) bases are highly sequence specific- primer length is proportional to annealing efficiency: in general, the longer theprimer, the more inefficient the annealing

- the primers should not be too short as specificity decreases

Contoh Desain Primer

gatggatcatgaataaaactattacgttacttagtgcattattactaccactaagttttgctcacgctgccgagccaacattgtctccagagatggtcagtgcctctcaagtaagaagcgcgcaagcgaaacaaacttacacttatgtccgctgctggtaccgcaccagttattcaaaagatgaacctgcgaccgattgggaatgggcagaaaatccagacggcagttacttcacgcttgatggctactggtggagttcggtttctttcaagaacatgttctacacagacacaccgcaaagtgttatcaagcaacgttgtgagcaaactctggacctagcaaatgaaaacgctgacatcaccttctttgcagccgataaccgtttctcctacaaccatactatctggagcaacgaccctgtcatgcagccagaccaaatcaacaaggtcgtagcattgggtgacagcttgtctgatacaggcaacatctttaatgcatcacaatggcgattcccgaatccaaatagctggttcttgggacacttctcaaacggttttgtgtggactgagtacattgctcaagcgaaaaacttaccgctatacaactgggctgtgggtggcgcggcaggcgaaaaccaatacatcgctctgactggtgtaggtgagcaagtttcctcttacttggcatatgcgaaattagcgaaaaactacaagcctgctaataccctgtttacccttgagtttggtctaaatgacttcatgaactacaaccgtagcgtgccagaagtgaaatcagactacgcggaagccttgattaaactgaccgatgcaggtgcgaagaacttgttgttgatgacactaccagatgcaacacgtgcaccacagtttacctactcgactcaagaagaaatcaacaagatccgcgcgaagatcgtggaaatgaatgagttcatcaaagcacaagcggcgtattacactgcacaaggctacaacgttaccttgtacgatacgcatgcactgtttgaaagcttaacagcaaatccagagcaacacggttttgtaaacgcgagccaagcttgccaagacatcaaccgctcttcatcggtagattacctataccatcactcattgcgttctgagtgtgcgtcttctggctctgataagtttgtattctgggacgtaacacacccgaccacagcaaacaccactacgtggcagaaaaaatgctagaaagtacgaatcaattgtcaaaccatcctttctaa

Sekuen Gen Hemo

Sumber ; (Yuhana et al, 2009)

Forwards

Reverse

Good Primer Design

Length (17-28bp) GC content 50-60% GC Clamp Tm’s between 55-80 Avoid simple sequences – e.g. strings of G’s Avoid primer self complementary

e.g. hairpins, homodimers, heterodimers

Setting PCR Program

Tahapan Suhu(0C)

Waktu

Pre-Denaturasi 94 2 menit

Denaturasi 94 1 menit

Annealing 50 1 menit

Elongation 72 1 menit

Final Elongation 72 2 menit

35 siklus

Considerations

Contamination can easily lead to erroneous results

Avoid contaminating with DNA or PCR product…

DNA stocks, PCR reagents Gloves, tips, pipetters, benches

Carefully measure reagent quantities

Use appropriate cycling conditions

PCR Animation--3D

“ Short Video PCR”

3. Elektroforesis

Visualisasi Produk PCR (Elektroforesis)

Gel agarosa 0,7% (0,21 gr

agarose+30 ml TBE)

Dipanaskan sampai bening dan diamkan

hingga hangat

Dituang ke ke dalam chamber yang sudah

dipasang sisir

Dimasukkan ke bak

elektroforesis

3 µl produk PCR + 4 µl

loading dye

Dimasukkan ke sumur dalam gel

1 µl marker + 4µl

Loading dye

Running (200 Volt, 70 mA)

hingga ¾ bagian dari lebar gel

Diletakkan di atas

ultraviolet illuminator

Pengambilan gambar

DNA Sequencing

The separation of the sequencing fragments

To measure the sizes of the fragments, each of the four reactions would be loaded into a separate well on a gel, and the fragments would be separated by gel electrophoresis

Elektroforesis

Quick QuizIf you forgot to add one of your primers your

resultant gel will probably have

A. No bandsB. A smearC. A band of the wrong sizeD. Many bands

Dolly adalah hewan hasil kloning pertama

Teknik Kloning Dolly

Sel telur dari domba donor I diambil, lalu dikeluarkan intinya (yang dipakai hanya sel yang tanpa inti)

Sel dari kelenjar ambing domba donor II diambil DNAnya saja (sel dibuang, hanya inti yang dipakai)

Sel dari domba I dan II digabungkan (dengan arus listrik), kemudian terjadi pembelahan sel (embrio)

Sel yang telah membelah tsb ditanam pada uterus domba betina lain, yang selanjutnya beranak Dolly

Sepanjang hidupnya Dolly tlh melahirkan 2x, disuntik mati krn radang paru-paru dan arthritis pd umur 6,5 thn.

Profil Dolly

Review.

Kloning Pada Manusia?

Kloning Untuk Menghasilkan Sel Sebagai Terapi?

Tujuan jangka panjangriset kloning antara lain adalah di-hasilkannya protein yang dibutuhkan manusia, sbg terapi dgn menciptakan berbagai sel dan organ kompatibel yang siapdi-transplantasikan ke tubuh manusia.

Contoh membuat sel untuk melawan kanker

Cloning Genes

Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens,

penyebab penyakit crown gall, pada tanaman.

Mekanisme : parasit pada jaringan tanaman, melibatkan integrasi sebagian DNA bakteri pada tanaman inang yang menyebabkan tumor dan mengubah metabolisme tanaman.

Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens digunakan

sebagai agen kontrol biologi dan sebagai alat untuk enginering gen pada tanaman.

Plasmid Ti Hanya sel yang mengandung plasmid spesifik

(plasmid Ti) yang dapat menyebabkan penyakit. A. tumefaciens strains yang tidak mempunyai plasmid tumbuh sebagai rizosphere – inhabiting bacteria tanpa menyebabkan penyakit.

Bakteri dapat menstimulasi inang untuk memperbanyak dan membelah diri sel secara cepat dan tidak normal. Hal ini karena bakteri tersebut dapat menyisipkan sebagian DNA nya ke dalam kromosom DNA inang yang menyebabkan overproduksi dari cytokinins dan auxins.

Cytokinin dan auksin merupakan plant growth regulators, dan opines yang memberikan nutrient bagi patogen.

Jaringan inang akan terus membesar dan akan membentuk tumor di batang atau akar.

Plasmid Ti

GMO(Genetically Modified Organism)

Ice Plus Protein (Ice Nucleation active Protein)

The methods used by molecular biologists to study DNA have been developed through adaptation of the chemical reactions and biological processes that occur naturally in cells

Many of the enzymes that copy DNA, make RNA from DNA, and synthesize proteins from an RNA template were first characterized in bacteria. This basic research has become fundamental to our understanding of the function of cells and have led to immense practical applications for studying a gene and its corresponding protein.

As science advances, so do the number of tools available that are applicable to the study of molecular genetics.

PCRDNA sequencing

Microarrays

Mass-spec

The new biology lab

Laboratory Tools and Techniques

Terimakasih Semoga Bermanfaat