APLIKASI TEKNIK MEMPELAJARI SEL:PROTEIN TRAFFICKING WITH GFP

• Agus Hendriyanto• Arie Triani

• Sanggraha M. T.• Lintang R.N.

• Musabaqoh M. B.• Reza Yustian

Elusi

• Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen fragmen DNA pengotornya. ‐

• Fragment• Enzim restriksi/hasil PCR• Elektroforesis• Memotong gel agarose yang mengandung

fragment• Isolasi fragmen DNA dari agarose

Ligasi• Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA

dengan fragmen DNA lainnya. • T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E.

coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri.

• Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+

• Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen.

Transformasi

• Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel inang.

• sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

Seleksi Transforman

• Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

Seleksi sel rekombinan

• Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in  vitro menggunakan teknik PCR

PERANAN GREEN FLOUORESCENT PROTEIN?

• Bagi para peneliti, sangatlah penting untuk dapat mengetahui dengan cepat, apakah proses transformasi itu telah berlangsung baik atau tidak, dan apakah gen target dapat diekspresikan tanpa masalah.

• Gen yang menghasilkan protein yang dapat berpendar hijau atau Green Fluorosceint Protein (gfp) inilah yang banyak dipakai oleh para ilmuwan sebagai gen pewarta yang aslinya berasal dari ubur ubur laut. ‐

Mekanisme GFP

• Gen asing target yang ingin dicangkokkan ke dalam suatu sel organisme biasanya digabungkan dengan gen gfp  dalam bentuk gen kimera atau gen gabungan, sehingga nanti akan dihasilkan protein baru fungsional (yang menjadi sifat baru organism tersebut) dalam bentuk protein gabungan dengan gfp.  Jadi,  jika  gen  yang  digabung  dengan  gen  pewarta berhasil  masuk  dan  fungsional  di  dalam  sel  bakteri  E.  coli misalnya,  maka  sel  E.  coli  yang  berpendar  hijau  di kegelapan adalah bakteri  transgenik  yang  fungsional  yang membawa  sifat  baru.  Proses  penapisan  klon  transgenik yang positif menjadi lebih cepat dan mudah. 

Keunggulan GFP

• Untuk berpendar gfp sama sekali tidak membutuhkan substrat

• gfp menghasilkan sinar hijau fluoresens secara instrinsik,  ketika  diberi  sinar  eksitasi  pada panjang  gelombang  biru  sekitar  395 nanometer.  Jadi  hanya  dibutuhkan  lampu  UV gelombang  panjang  atau  sinar  biru  untuk dapat mendeteksinya dalam kegelapan. 

Contoh aplikasi GFP• Pada tumbuhan tembakau yang berpendar hijau

misalnya. Gen gfp  diekspresikan  pada  virus  mosaik yang  biasa  menyerang  tumbuhan  tembakau.  Banyak hal yang masih belum diketahui tentang interaksi virus ini  dengan  tembakau.  Dalam  proses  terinfeksinya tembakau  dengan  virus  ini  sampai  tembakau  menjadi sakit  lalu  mati,  para  peneliti  tanaman  tidak mengetahui  lokasi  awal  timbulnya  virus  dan penyebarannya.  Dengan  memasukkan  virus  mosaik yang  mengekspresikan  gfp,  maka  tempat  penyebaran virus  dapat  terpantau  hanya  dengan  membawa tanaman  tembakau  ini  ke  ruang  gelap  dan menyinarinya dengan lampu UV secara periodik. (Dr. Is Helianti, MSc) 

PUSTAKA• Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd

edition. Thomson Brooks/Cole, USA. 323 pages. • Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka

Wirausaha Muda dan USESE Foundation, Bogor. 123 halaman.

• Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya

Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI – DIKNAS, Bogor.

• Gunawan, B. K. 2008. Skripsi: Introduksi dan Persentase Ikan Yang Membawa Gen Gh Growth Hormone Ikan Nila Oreochromis Niloticus Pada Ikan Lele Dumbo Clarias

Sp. Generasi F0. Program Studi Teknologi Dan Manajemen Akuakultur, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan.

Institut Pertanian Bogor