apoptóza - Ústav klinické a molekulární patologie lf up a...

Apoptóza

Veronika Žižková Ústav klinické a molekulární patologie a

Laboratoř molekulární patologie

Apoptóza

Úvod

Apoptóza vs nekróza

Role apoptózy v organismu

Mechanismus apoptózy

Metody detekce

Úvod - apoptóza

Aktivní proces sebedestrukce, který je závislý na energii a vyžadující čas (12-24 h), byl definovaný morfologicky v roce 1972, geneticky v 80. letech

Charakterizována:

morfologicky jako karyorhexe, karyopyknóza

degradací cytoskeletu + následnou změnou tvaru cytoplasmatické membrány (tzv. blebbing)

kondenzací chromatinu

fragmentací DNA (na 180 bp úseky)

rozpadem buňky na apoptotická tělíska

Úvod - apoptóza

Apoptotická tělíska jsou fagocytována (okolními buňkami a makrofágy) a nedochází k zánětlivé reakci

Geneticky regulovaný proces, při kterém dochází k aktivaci specifických proteas a nukleas

Signály pro indukci apoptózy mohou být:

• vnější (hormonální impuls, nutriční deficience)

• vnitřní (fyzikální nebo chemické poškození DNA či endoplasmatického retikula – UV, volné radikály, cytostatika, hypoxie,…)

Nekróza

Patologický a spontánní proces, který vyvolává zánětlivé odpovědi a je významný během mikrobiálních infekcí

Příčiny vzniku mohou být např. mechanické, termické, elektrické, rentgenové, chemické,…

Chakterizována:

jako rychlý proces (několik hodin), který je nezávislý na energii

není geneticky regulována

rychlým praskáním buněčné membrány

atypickým tvarem jádra


Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV (1994): Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73(12): 3108


Apoptóza Nekróza

Děj fyziologický i patologický Děj vždy patologický

Aktivní proces vyžadující E Děj nezavislý na E

Nástup je pomalý (hodiny) Nástup je rychlý (sekundy, minuty)

Nevyvolává zánět Způsobuje zánět okolí

Aktivace kaspas Bez aktivace kaspas

Buňka se smršťuje Zvětšování objemu buněk


Normální buňka (a); Nekrotická buňka (b); Apoptotická buňka (c)


www.wikipedie.org

Syndaktylie – porucha apoptózy

Nekróza


Ontogeneze, tvorba orgánů (a); kontrola počtu buněk (c); odstraňování některých orgánů (ztráta ocásku u žab, slinné žlázy u housenek) (b) a poškozených buněk (d)

1. Fyziologická funkce

Baehrecke EH (2002): How death shapes life during development. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3; 779-787


Nadměrná apoptóza

•Degenerativní neurologické choroby (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba)

•ischemické poruchy (infarkt myokardu)

•Toxické poškození jater

•AIDS

•Některé vývojové vady

Nedostatečná apoptóza

•Nádorová onemocnění (karcinomy s mutací p53)

•Imunitní abnormality (alergie)

•Autoimunitní choroby (revmatoidní

artritida)

•Infekce – bakterie –TBC, poxviry,

herpesviry

•Některé vývojové vady

2. Patologická funkce


Cytochrom C Receptory smrti modulátory

efektory Kaspasa 9

Kaspasa 8

Smrt buňky Smrt buňky

Proteiny, DNA Proteiny, DNA

VNITŘNÍ (mitochondriální)

VNĚJŠÍ (receptorová)

substrát

výsledek


• Kaspasy (Cysteinyl aspartate-specific protease)

• Neaktivní prekurzory jsou prokaspázy

• Aktivní forma vzniká proteolytickým štěpením prokaspas (v místě Asp)

• Prokaspasy se aktivují návzájem - kaskáda

• Mají specifické substráty

Pro

kaspasa 8

Pro

kaspasa 8

Kaspasa 8


• Proteiny rodiny Bcl-2 (klíčové regulátory apoptózy)

• Klasifikace dle počtu společných domén s Bcl-2 (BH: Bcl-2 homology)

• Podle aktivity se člení na antiapoptotické a proapoptotické

• Bcl-2 – první nalezený člen této rodiny, antiapoptotický efekt

• Bax – objeven na základě asociace s Bcl-2, proapoptotický efekt


• Proteiny rodiny Bcl-2 (klíčové regulátory apoptózy)

Metody detekce apoptózy

• Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie

• Zaměřená na detekci morfologických změn - apoptotická tělíska, kondenzace chromatinu, puchýřkování membrány


• Využití substrátů kaspas

• Detekce štěpení např. keratinu 18 (protilátka M30 proti štěpenému fragmentu), laminu B

(inverzní průkazy) a transglutaminasy

www.roche-applied-science.com


• Změny DNA a změny na cytoplasmatické membráně

• Využití DNA žebříku nebo expozice fosfatidylserinu a vazby annexinu V

www.abcam.com

Aditivní materiály

• http://www.youtube.com/watch?v=J0u_PS2JqSY

• http://en.wikipedia.org/wiki/Programmed_cell_death

• Patobiochemie buňky – J. Masopust a kol., 2003 UK Praha

• Molekulární patologie – Zdeněk Kolář a kol., Epava 2003

• Článek Vesmír - http://vesmir.cz/clanky/clanek/id/3704

Genová terapie

Genová terapie

• Genová terapie somatická – genom nemocného je pozměněn, ale změna není přenášená do další generace

• Genová terapie zárodečná – genom je změněn přímo ve vajíčku nebo spermii a změna je přenášená do dalších generací, zatím neprobíhá u vyšších obratlovců ani u člověka (celosvětové moratorium)

Genová terapie

• V současné době se většina úsilí orientuje na získané choroby, především na zhoubné nádory

Genová terapie v léčbě nádorů:

je jednodušší buňku zničit, než ji opravit (př. vyvoláním apoptózy)

vzhledem k povaze onemocnění jsou pacienti ochotni podstoupit i nové postupy

Genová terapie

• Změna v jednom genu – jednobodové mutace, např. srpkovitá anémie

• Multigenové poruchy – mutace ve více genech, často se uplatňuje i vliv prostředí, např. cukrovka, rakovina

• Mitochondriální poruchy – mutace v mitochondriální DNA je letální, např. poruchy řady orgánů

• Chromozomální abnormality – ztráta či zmnožení celých či částí chromosomů, např. Downův syndrom

Metody doručení genu do tkáně

Virální vektory Nevirální systémy

Adenoviry Injekce čisté DNA přímo

do nádoru

Retroviry Elektroporace

Lentiviry Heat-shock

Herpes simplex virus Lipofekce

Hybridní systémy

Metody doručení genu do tkáně

www.willey.co.uk/genmed/clinical

Nemoci léčené genovou terapií

Onemocnění Defekt Cílové buňky Četnost

Těžká imunodeficience

(SCID)

adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1:1 000 000

Hemofilie krevní faktor VIII

a IX

játra, svaly ♂ 1:1 000 000

Cystická fibrosa transmembránový

regulátor CF

plicní alveoly 1:2 500

Deficience na alfa

antitrypsin

rozedma plic plicní alveoly 1:3 500

Rakovina nespecifický mnoho 1:4

Neurologické nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1:250

Kardiovaskulární

onemocnění

arterosklerosa cévní endotel 1:2

Těžká imunodeficience (SCID)

• SCID (severe combined immunodeficiency)

• Jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu adenosin deaminasy (ADA) a to vede ke zpomalení dělení rychle proliferujících buněk (např. T-lymfocyty)

• U pacientů je omezena funkce imunitního systému

• „Bubble boy“ – David Vetter

(1971-1984)

www.wired.com


• Od 80.let se léčí transplantací kostní dřeně

• 1986 – injekce hovězí ADA stabilizované PEG intramaskulárně (PEG-ADA, nutno opakovat každé 2 týdny), často končí hemofilií

• 1990 – první pokus genové terapie na člověku – 4 letá Ashanti DeSilva, její

T-lymfocyty byly upraveny

ex-vivo normálním ADA

s využitím vektoru

bio3400.nicerweb.com


• 2002 – dalších 6 chlapců podstoupilo genovou terapii ex-vivo, u 4 z nich se stav výrazně zlepšil, u 2 z nich však propukla leukémie

• Pokusy jsou dnes pozastaveny a zdokonaluje se metodika, kdy transgen se zabudovává do genomu T-lymfocytu do blízkosti onkogenu

Hemofilie

• Je geneticky podmíněná choroba projevující se poruchou srážlivostí krve

• Existují 2 typy – A (absence faktoru srážlivosti VIII; ♂ 1:10 000) a B (absence faktoru srážlivosti IX; ♂ 1:70 000)

• 2011 – šesti mužům trpícím hemofilií typu B byl injikován adeno-asociovaný virus nesoucí transgen F9. Čtyři z nich mohli injekce se srážecími faktory vysadit úplně, u 2 došlo alespoň k prodloužení aplikace injekcí

Cystická fibróza

• 1989 – objeven gen CFTR, jehož poškození vyvolává CF + objevena i 1. konkrétní mutace (dnes je známo asi 1 500 různých typů)

• Chorobu vyvolává porucha iontového kanálu, který zajišťuje transport chloridových iontů přes epitely

• U lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího trangen CFTR do nosu

Rizika genové terapie

• 1999 – první případ úmrtí po genové terapii – Jesse Gelsinger (1981-1999) trpěl deficiencí ornitin transkarbamylasy (OTC)

• 50 % dětí s OTC umírá do 1 měsíce po porodu

• J.G. měl lehčí formu OTC,

kterou lze léčit medikamenty

a dietou

www.jesse-gelsinger.com

Děkuji za pozornost!

apoptóza - Ústav klinické a molekulární patologie lf up a...

Documents