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CITOMETRIA DE FLUXO
por Álvaro Luiz Bertho HISTÓRIA DA CITOMETRIA DE FLUXO
O primeiro contador celular automático foi desenvolvido por Moldavan (1934) e consistia num tubo capilar por onde se faziam passar células coradas. O capilar era montado sob um microscópio ótico com uma objetiva sobre a qual havia um detector fotoelétrico que registrava a passagem das células de acordo com a mudança da luz que recebia. Uns anos mais tarde, Kielland (1941) patenteava um modelo semelhante ao de Moldavan.
Um importante avanço para o desenvolvimento da citometria de fluxo se conseguiu em 1953 ao inventar, Crosland e Taylor, uma câmara de fluxo baseada na injeção das amostras no centro de um fluxo de revestimento (sheath fluid) através de um capilar que passava pelo centro da mesma.Com este sistema se evitavam dois grandes problemas:
o O capilar tinha um diâmetro maior, evitando entupimentos o Permitia um maior foco das amostras com a fonte de luz. É a base das câmaras
que se usam na atualidade. Wallace Coulter havia descrito um pouco antes (1949) o princípio que leva seu nome
(Coulter counter). Desenvolveu um contador celular baseado na mudança que produz uma partícula ao passar por uma agulha em que exista uma diferença de potencial conhecida. Em 1966 também usou ondas de rádio freqüência.
Em 1953 Parker e Horst descrevem o primeiro contador diferencial hematológico usando células coradas em vermelho (hemácias) e azul (leucócitos), luz visível e detectores para luz azul e vermelha.
Katmentsky (1965) introduziu dois avanços capitais na citometria: o O uso da espectrofotometria (luz absorvida) para quantificar DNA o A medida multiparamétrica de luz dispersada
Foi o primeiro a empregar histogramas biparamétricos. Algum tempo mais tarde,
desenvolveu um sorter pneumático. Com o tempo foi-se introduzindo o emprego de substâncias fluorescentes que permitiam
um menor sinal/ruído do que os corantes e absorção. Em 1967-69 Van Dilla descreve o primeiro citômetro de fluxo com configuração
ortogonal usando a câmara descrita por Crosland-Taylor. Demonstraram a relação existente entre ploidia e intensidade de fluorescência na quantificação de DNA e produziram histogramas aonde se podia visualizar as fases do ciclo celular (G0/G1; fase S; G2M).
No final dos anos 60, o “Fluorescence Activated Cell Sorter” (FACS) foi inventado por Bonner, Sweet, Hullet, Herzenberg e outros. A Becton and Dickinson introduziu equipamentos
comercial no início dos anos 70 utilizando a patente da Universidade de Stanford e o conhecimento do Laboratório do Dr. Herzenberg.
Fulwyler descreve o processo de sorting eletrostático em 1965, baseando-se na tecnologia das impressoras jato de tinta. É o sistema mais empregado na atualidade.
Durante as décadas de 60 e 70 se produziram avanços na tecnologia e sua aplicação na citometria de fluxo, porém no final dos anos 70 e princípio dos 80 existiam poucas aplicações da citometria com interesse biológico. Os esforços se concentravam principalmente em melhorar os equipamentos que estavam sendo desenvolvidos.
A partir daí, se tem conseguido avanços nas aplicações da citometria de fluxo na investigação biomédica. Os mais importantes são:
o Reinherz (1975) emprega a tecnologia dos anticorpos monoclonais de Kholer e Milstein para identificar subpopulações celulares em função dos antígenos de superfície.
o Loken (1977) mede simultaneamente dois antígenos celulares com um laser só, emprega a compensação eletrônica de sinal entre o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e a tetrametilrodamina (RD).
o Oi (1982) introduz as ficobiliproteínas como fluorocromos (ficoeritrina). o Darzynkiewicz e Traganos (1976-79) estidam com laranja de acridina o DNA e
RNA. o Andreff inicia a classificação das leucemias. o Grynkiewicz (1985) introduz o Indo-1 para medir a concentração intracelular de
cálcio. o Entre 1979-80 vários autores descrevem técnicas citofluorimétricas para medir
condições fisiológicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de superfície) e Thorell (estado redox).
o Hedley (1983) põe a ponto uma técnica para o estudo por citometria de fluxo do DNA de núcleos de amostras parafinadas.
o Gratzner (1975) descreve a técnica da bromodeoxiuridina (BrdU) e anticorpos contra ela, que permite ampliar o estudo das fases do ciclo celular.
o Gray (1975) realiza o cariótipo por citometria de fluxo. Este procedimento foi posteriormente melhorado por Carrano.
Muitos outros autores têm contribuído com seus experimentos para desenvolver técnicas
aplicáveis na citometria de fluxo que agora estão dando seus frutos e se empregam tanto em laboratório de rotina, como na investigação básica e/ou clínica.
CONCEITOS BÁSICOS. Para compreendermos a real importância da citometria de fluxo, talvez devêssemos
responder a algumas questões básicas, como:
o que é citometria de fluxo; seus princípios; e suas aplicações, tanto no campo da pesquisa como na clínica.
A citometria de fluxo é uma tecnologia, baseada no emprego de radiação laser, fluxo hidrodinâmico, ótica, substâncias fluorescentes (fluorocromos), recursos de informática, utilizada para determinar algumas características estruturais e funcionais de partículas biológicas. Essas partículas biológicas entendem-se como vários tipos de células, protozoários, bactérias etc. Esta tecnologia é usada para determinar componentes e propriedades de células e organelas celulares que fluem em uma suspensão celular. Os citômetros de fluxo, como são chamados os equipamentos utilizados para esse fim, têm como princípio básico aspirar células ou partículas de uma suspensão previamente preparada e forçá-las a passar por uma câmara especial (flow cell) que faz com que as células fiquem envolvidas e centralizadas num fluxo contínuo de líquido (sheath fluid) e saiam desta câmara uma atrás da outra de modo que uma única célula seja interceptada pelo laser. Uma vez interceptada pelo laser, dois tipos de fenômenos físicos ocorrem e fornecem informações acerca da célula.
Primeiro, uma parte da luz é espalhada (scatter) de acordo com as características morfológicas e estruturais da célula. O Forward Scatter (FS) se relaciona com o tamanho e o Side Scatter (SS) com a granularidade da célula ou partícula. Segundo, as células previamente coradas com fluorocromos, uma vez excitadas pelo laser, emitem luz de acordo com suas características fluorescentes e são utilizadas para se examinar aspectos bioquímicos, biofísicos e moleculares das células. Uma série de lentes colocadas próximas desta zona de interceptação (célula-laser) coletam a luz dispersa e enviam-na para tubos fotomultiplicadores (PMTs) que convertem o sinal luminosos em pulsos elétricos, os quais são proporcionais à quantidade de luz dispersa ou fluorescente captada pelos PMTs.
Para a seleção e captação destes sinais luminosos, filtros óticos são usados para bloquear determinados comprimentos de onda da luz incidente e deixar passar somente a luz de comprimento de onda desejado. Os sinais elétricos gerados pelos PMTs são amplificados, convertidos para a forma digital e enviados para um computador. A amostragem dos dados, as análises e a interpretação podem, então, ser realizadas através de softwares específicos. Seis parâmetros são considerados básicos e podem ser medidos simultaneamente, são eles: tamanho celular (FS); granularidade interna das células (SS); fluorescência verde (FL1); fluorescência amarela (FL2); fluorescência laranja (FL3); Fluorescência vermelha (FL4); Fluorescência roxa (FL5).
Figura 1 - Configuração ótica de duas cores em um citômetro de fluxo baseado num sistema de iluminação com um laser
Alguns parâmetros determinados pela Citometria de Fluxo
Estruturais Funcionais Intrínsecos Morfologia da célula
Proteínas fluorescentes Estado RedOx Proliferação celular Ativação celular Apoptose
Extrínsecos Conteúdo de DNA e RNA Taxa de DNA Estrutura cromatínica Proteínas totais ou básicas Grupos químicos Antígenos Açúcares de superfície Estrutura citoesqueleto
Estudos da membrana celular Atividade enzimática Endocitose Síntese de DNA Receptores Potencial de membrana Ph, cálcio, carga de superfície
Laser argônio
PMTs
Forward Scatter
Side Scatter
Sorting
Flow Cell
Amostra
Sheath Fluid
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS CITÔMETROS DE FLUXO Atualmente, existem três fabricantes de citômetros de fluxo com representantes no
Brasil. A Beckman-Coulter, que comercializa os EPICS XL, EPICS ALTRA e FC500; a BD Biosciences, com os FACSCalibur, FACSVantage, FACSCanto e o FACSAria; e a Cytomation com o MoFlow.
Existem basicamente dois tipos de citômetros de fluxo disponíveis comercialmente. Um tipo, chamado de citômetro de bancada (banch-top flow cytometers), empregados principalmente em laboratórios clínicos, realizam somente as análises multiparamétricas das células. Freqüentemente, vêm equipados com um laser argônio de baixa potência refrigerado a ar, podendo vir em alguns casos equipados também com laser He-Ne. Geralmente analisam até quatro cores. Como exemplos temos o FACSCalibur, FACSCanto, EPICS XL, FC500.
Já o outro tipo, chamado de cell sorters (separadores de células), apresentam mais recursos que os anteriores (até 11 cores), possuem lasers mais potentes refrigerados à água e possuem ainda a capacidade de separar fisicamente as células seletivamente de uma suspensão heterogênea (sorting). Temos o EPICS ALTRA, o FACSVantage, o FACSAria e o MoFlow. Seu uso é mais direcionado para instituições de pesquisa, pois possibilitam uma infinidade de aplicações. Ambos funcionam de maneira similar durante a aquisição dos dados, entretanto os sorters são mais complexos e possuem mais componentes eletrônicos, o que os tornam mais caros e difíceis de operar. Assim, os citômetros não sorters, são os equipamentos mais freqüentemente encontrados.
A maioria dos citômetros de fluxo utiliza lasers como luz estável, monocromática e de alta potência. Existem lasers sintonizáveis ou de emissão fixa, podendo ser refrigerados a água ou a ar (menor potência). O laser de íon argônio (argon ion laser) é o mais empregado, por ter uma emissão a 488 nm, comprimento de onda muito utilizado para a excitação de vários fluorocromos tais como o FITC, PE, ECD, PerCP, PI, 7-AAD, anexina V, brometo de etídeo, laranja de acridina, pironina Y ,fluo-3, muitas rodaminas. Outros fluorocromos, como o Hoescht, a mitramicina, APC, são excitados por lasers com outros comprimentos de onda, como os de UV ou de Hélio-Neônio (He-Ne). Torna-se assim imprescindível, o conhecimento do comprimento de onda de excitação do fluorocromo a ser utilizado para se certificar que tal equipamento seja capaz de lê-lo. Os citômetros atuais podem ser equipados com dois ou mais lasers aumentando assim sua capacidade de análise multiparamétrica. Atualmente, cada vez mais se utilizam os lasers de Argônio de baixa intensidade (10-15 mW) refrigerados a ar e que podem ser usados na maioria das aplicações citométricas. No caso dos sorters, é mais indicado o uso de lasers refrigerados a água (mais potentes). Em adição aos lasers, componentes eletrônicos, computadores e filtros óticos têm um papel essencial no rendimento dos citômetros de fluxo. A função de alguns filtros é absorver alguns comprimentos de onda e deixar passar a luz com o comprimento de onda que interessa. A qualidade de tais filtros é da maior importância na citometria de fluxo. Deve-se sempre mantê-los em ótimo estado. Outro componente importante nos citômetros é a câmara de fluxo (flow cell). Existem alguns tipos de câmaras de fluxo, cada qual com sua finalidade. Os principais são:
o Sense-in-Quartz – são câmaras de fluxo que apresentam uma ponteira de quartz
no interior da qual ocorre a intercessão laser-célula. Podem apresentar três tipos: � Sort sense - a maioria dos citômetros equipados com lasers refrigerados
a ar vem com esse tipo de flow cell. São câmaras que conseguem fluxos hidrodinâmicos com velocidades inferiores e produzem menos ruído luminoso. São designadas também para sorting usando esse tipo de laser. Possuem modelos com orifícios de 76 ou 100 µm de diâmetro.
Figura 2 – Sort sense flow cell
� Fast Quartz – Essa flow cell incorpora a carcterística de baixo ruído
luminoso da Sort sense com a vantagem de uma maior velocidade de passagem. Indicada para sorting de alta velocidade e citômetros com laser refrigerados a ar ou a água.
Figura 3 – Fast Quartz Flow Cell
� HyPerSort Sense Quartz – é semelhante à Fast quartz, porém inclue uma lente para aumentar a sensibilidade sob altas pressões de fluxo.
Figura 4 - HyPerSort Sense Quartz Flow Cell
Exemplos de citômetros encontrados atualmente no mercado
EPICS ALTRA – Beckman Coulter
FACSCalibur - BD
CYAN – Dako Cytomation
MoFlow – Dako Cytomation
FACSAria - BD
FC-500 – Beckman Coulter
EPICS XL – Beckman Coulter
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FLUOROCROMOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO Os fluorocromos oferecem um método sensível para obter informação acerca da estrutura,
função e vitalidade das células. Existam dois modos de uso: (1) ligação covalente do fluorocromo à moléculas que se unem especificamente a componentes celulares, e (2) fluorocromos que variam suas características em função do microambiente que os cerca.
Substância Excitação (nm) Emissão (nm) Substância Excitação Emissão FITC 490 520 DiBA-Isop 493 517 XTRITC 580 604 RN-heptano 485 525 TR 596 620 RN-acetona 530 605 R-PE 480-565 578 Indo 1 350 505-510 APC 650 660 PE-Cy5 480-565 670 Hoestch 33342 340 450 PE-TR 480-565 613 DAPI 350 470 PE-Cy7 480-565 695 Brometo de etídeo 510 595 Pironina Y – DNA 560 570 Iodeto de propídeo (PI)
536 623 Pironina Y – RNA 497 563
DNA 480 520 N Tiazol 453 480 RNA 440-470 650
o Técnicas imunofluorescentes - marcadores fluorescentes de ligação covalente: são
fluorocromos que reagem e se usam para marcar proteínas, lipídeos ou outras moléculas biológicas. Devem ser suficientes seletivos e reativos. Se empregam cromóforos como grupos isotiocianato, clorotrirzinil, e ésteres de succinimida, por sua capacidade de união. O fluorocromo mais empregado é a FLUORESCEÍNA. Outros que se tem descrito são: rodamina, Texas red, cianinas etc, porém o mais conhecido é a FICOERITRINA por sua grande excitação, rendimento e fotoestabilidade; além disso pode ser excitado a 488 nm porém emite mais a frente do espectro da fluoresceína permitindo uma análise dupla com um só laser. Avanços recentes são o uso de sondas de DNA unidas a fluoresceína e os anticorpos anti-bromodeoxiuridina para o estudo do ciclo celular. Atualmente se tem generalizado o estudo multiparamétrico de antígenos celulares aom o emprego simultâneo de 4 e 5 anticorpos conjugados cada um com diferentes fluorocromos com diferentes emissões de luz (FITC, PE, ECD ou PerCP, PE-Cy5, PE-Cy7).
o Fluorocromos que se ligam não covalentemente à estruturas celulares: são
fluorocromos que devido a sua composição molecular especial se unem a determinados componentes celulares.
� Marcadores do conteúdo de DNA e RNA: dependendo do tipo são mais ou menos específicos para DNA, RNA ou determinadas bases. Se empregam o Hoescht 33342 Liga-se a A-T), DAPI (A-T-), DIPI (A-T), cromomicina A3 (G-C), olivomicina (G-C), mitramicina (G-C).O laranja de acridina se liga ao DNA e RNA porém tem a particularidade de emitir em diferentes comprimentos de onda dependendo do ácido nucléico ao qual está ligado. De uso mais comum é o Iodeto de propídeo (PI) que se excita com um laser de 488 nm.
� Marcadores do potencial de membrana: são as cianinas e a rodamina 123. Também marcam mitocôndrias devido a alta diferença de potencial entre suas membranas.
o Marcadores fluorescentes que são sensíveis ao microambiente: certos
fluorocromos podem ser empregados para estimar as propriedades do ambiente em que se encontram, posto que variam seu espectro de excitação ou emissão em função das características do microambiente que os cerca. São usados para a determinação de diversos estados funcionais celulares: pH (6-carboxi-fluoresceína; 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno; hidroxipireno trisulfato), cálcio (quin II, fura –2, indo-1), potencial redox (diclorofluoresceína, NADH, NADHP), atividade enzimática (substratos que por ação da enzima variam sua fluorescência ou espectro), polaridade (anilino-naftalina-sulfato ou ANS), e viscosidade /fluidez.
A disponibilidade de fluorocromos específicos e suas propriedades são essenciais para o
desenvolvimento das aplicações em citometria de fluxo. Usualmente, grandes centros de pesquisa e hospitais possuem citômetros de fluxo e treinam
pessoal para operá-los. Embora esses profissionais sejam responsáveis em realizar a aquisição de amostras ou estejam disponíveis para orientar outros usuários, é importante que os pesquisadores e clínicos tenham um conhecimento básico de, pelo menos, como um citômetro funciona para elaborarem seus experimentos de maneira objetiva, além de estarem aptos a determinar resultados consistentes e confiáveis e interpretar laudos clínicos.
PADRÕES E CONTROLES Um padrão é um material estável que tem um valor determinado de fluorescência ou
dispersão de luz. Utilizam-se para alinhar ou calibrar os citômetros de fluxo. O uso de padrões de alinhamento proporciona um bom método para detectar mudanças e
problemas na configuração ótica e de sinal de um dia para o outro.O citômetro está alinhado quando se consegue uma elevada fluorescência ou sinal com baixo CV.
Os citômetros de fluxo oferecem uma informação relativa, não absoluta. Para quantificar é necessário correlacionar os canais com resultados de amostras conhecidas.O método mais sensível consiste em ajustar a voltagem do PMT ou ganhos para conseguir um pico de intensidade determinada de um padrão estável.
Os fluorocromos têm espectros de emissão que em ocasiões se sobrepõe e os filtros não são perfeitos, por isso os citômetros possuem um sistema informático de compensação ou subtração de sinal. É difícil predizer teoricamente o grau de compensação e deve-se ajusta-lo individualmente. Geralmente se deve extrair FL1 de FL2, e também FL3 de FL2 e FL1.Alguns citômetros permitem fazer gráficos do número de células processadas, do canal de fluorescência ao longo do tempo. Pode-se usar para ver as estabilidades das medições do citômetro com o tempo e detectar a presença de algum problema (Fig. 5).
Figura 5 – Interferência de FL1 em FL2, FL3 e FL4.
Já os controles são materiais que produzem resultados esperados (conhecidos). São usados para monitorar a reprodutibilidade dos reativos e a qualidade dos métodos de preparação celular. São importantes nas análises de DNA e imunofluorescência. Geralmente, se usam controles de ploidia e controles de imunofluorescência positivos e negativos.
Como controle de ploidia se deve usar um controle interno, processado no mesmo tubo da amostra, para descartar a aneuploidia e calcular o índice de DNA e outro tubo para calcular as fases do ciclo celular. Para realizar uma boa leitura de DNA se deve ter o citômetro de fluxo em perfeitas condições e ser cuidadoso no processo de preparação da amostra. A análise e interpretação se fazem mediante um software adequado.
O objetivo das análises de imunofluorescência é se utilizar de reativos específicos para determinar subpopulações celulares. São necessários controles negativos para descartar ligações inespecíficas do fluorocromo e selecionar o valor de autofluorescência.
São causas de marcação inespecífica os fragmentos Fc das imunoglobulinas, as células mortas, debris etc.
PROCESSAMENTO E ANÀLISE DE DADOS Os citômetros de fluxo produzem uma grande quantidade de informações que pode ser
armazenadas em forma de histogramas (histogramas monoparamétricas de 256 ou 1024 canais, histogramas biparamétricos de 64 x 64) ou em List mode, que consiste em guardar toda a informação obtida para cada evento de modo que se pode modificar as regiões de análise e reconstruir os histogramas em função de novos parâmetros de seleção.
o Dados univariantes (histogramas monoparamétricos): são representados como um histograma. Um método rápido e sensível de interpretação, é a observação de histograma e a ajuda informática do citômetro para calcular a porcentagem de eventos
em regiões selecionadas. Tem que ser levado em conta a resolução do histograma para a discriminação do sinal e o CV.
� Métodos não paramétricos: se baseiam na observação do histograma e posição dos cursores. Um problema são as amostras com baixa fluorescência que se diferenciam pouco do negativo. Se empregam métodos de normalização e subtração do sinal com comparações de curvas (Kolmogorov-Smirnov).
� Métodos paramétricos: em alguns casos pela dificuldade de interpretação de dados e a elevada informação que contêm, é necessa´rio aplicar modelos matemáticos.
o Dados bivariantes (histogramas biparamétricos): se apresentam como histogramas biparamétricos com dois eixos e o número de eventos se representa como densidade de pontos, cores, ou linhas isométricas.
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO A citometria de fluxo é particularmente importante para investigações biomédicas já que ela
permite avaliações qualitativa e quantitativa de células e de seus constituintes. As aplicações fundamentais desta técnica se dão em biologia e medicina e são a identificação de antígenos celulares mediante técnicas de imunofluorescência e o estudo do conteúdo de DNA e fases do ciclo celular. A citometria de fluxo tem sido utilizada na biomedicina com diferentes objetivos: Na hematologia – contagem celular, formula leucocitária, análise da medula óssea; na farmacologia – estudos de cinética celular, resistência à drogas; na imunologia – subpopulações de células T, tipagem tissular, estimulação linfocitária, apoptose; na oncologia – diagnóstico/prognóstico, monitorar tratamento; na microbiologia – diagnóstico bacteriano e viral, sensibilidade a antibióticos; na genética – cariótipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal, tipagem para transplantes.
Com a Citometria de Fluxo é possível analisar o conteúdo de DNA e RNA, definir em que posição do ciclo celular a célula se encontra (Fig. 6), analisar cromossomos (Fig. 7), determinar células cancerígenas que apresentem alterações na sua taxa normal de DNA (Fig. 8) e células que se encontrem em processo de morte programada (apoptose) ou necrose (Fig. 9).
Figura 6 - Histograma de células normais coradas com iodeto de propídeo. Após a divisão, as células entram numa fase Gap (G1), seguida por um período de síntese de DNA (S) durante o qual todos os cromossomas são replicados. A fase S é seguida por uma segunda fase Gap (G2) e, então, sofre mitose. O pico standard representa o nuçleo de eritrócitos de galinha.
padrão
G0/G1
G2/M
Figura 7 - Distribuição da intensidade de fluorescência do Hoeshst 33258 (eixo do y) vs. Cromomicina A3 (eixo do x), de cromossomos isolados de fibroblastos humanos. Todos os cromossomos estão mostrados no painel (B). O painel (A) mostra uma distribuição somente dos cromossomos 8 até 22 e Y.
Figura 8 - Histogramas padrões encontrados em análise de DNA por citometria de fluxo. Normal = 46 cromossomos; Hipodiploidia < 46 cromossomos; Hiperdiploidia > 46 cromossomos.
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Figura 9 - Quantificação de linfócitos CD4+ ou CD8+ necróticos, apoptóticos ou viáveis, utilizando-se uma análise multiparamétrica. As células CD4+ foram marcadas com PE, as CD8+ com FITC) e a incorporação ao DNA foi feita pela a (7 AAD).
No que diz respeito ao uso da citometria de fluxo em imunologia, uma variedade grande de estudos podem ser realizados com o intuito de se conhecer melhor o que acontece nas doenças em que há comprometimento do sistema imunológico, como é o caso das doenças auto-imunes e das sindromes de imunodeficiência (AIDS). Mudanças nas taxas de linfócitos T e B, mudanças nas taxas de linfócitos T CD4+ e CD8+ podem ser analisadas facilmente, o que ajuda no diagnóstico da doença.
O estudo fenotípico destas subpopulações de células, tornou-se importante na clínica, com uma avaliação geral da resposta imune celular, na contribuição da atividade de processos de doenças auto-imunes, na classificação de órgãos para que ocorra um transplante com sucesso (Fig. 10), no monitoramento de pacientes que tenham sofrido algum tipo de transplante para a determinação de sinais precoces de rejeição, e ainda, a possível classificação de determinadas leucemias através da detecção de marcadores de superfície específicos (Tabela 2). A análise fenotípica está relacionada ainda com outras doenças como a Hemoglobinúria Paroxística Noturna com diminuição ou ausência de CD55 e CD59; a distinção entre leucemia das células do manto da leucemia linfocítica crônica através da quantificação de CD79; e a espondilite anquilosante com a determinação de HLAB27..
Na oncologia, a mensuração de células progenitoras CD34+ por citometria de fluxo se tornou de importante valor para a monitorização de transplantes dessas células.
Na imunologia experimental vários receptores de superfície das células podem ser determinados com o uso de anticorpos monoclonais específicos conjugados a um determinado fluorocromo. Com isso, células de várias origens, como p. ex., timócitos, esplenócitos, células de gânglios linfáticos, células intestinais de qualquer modelo experimental podem ter seus receptores de superfícies e/ou moléculas intracelulares, como, citocinas e DNA, bem definidos.
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Figura 10 - “Crossmatching” para transplantes de órgãos. Células do doador são incubadas inicialmente com o soro de receptor e posteriormente com um anticorpo anti-imunoglobulina G humana. O experimento é feito em duplicata e seu resultado (E, F) comparado com controles negativos (C, D) ou positivos (A, B). A positividade no teste impossibilita a realização do transplante.
TABELA 1 - Painel resumido de diferentes anticorpos monoclonais
usado no diagnóstico de vários tipos de leucemias.
HLA-DR CD19 CD5 CD2 CD10 MY7 MY9
LMA 90% 0% 0% <5% 0% 75% 60%
LLA-T 25% 0% 75% 90% 10% <5% <5%
LLA-Não-T
CALLA +
CALLA -
90%
90%
95%
95%
0%
0%
<5%
<5%
100%
0%
0%
<5%
0%
<5%
LLC-B 90% 0% 100% 90% 0% 0% 0%
LLC-T 25% 0% 100% 90% 0% 0% 0%
LMC
Mielóide
Linfóide
90%
90%
0%
90%
0%
0%
<5%
<5%
0%
80%
75%
0%
90%
0%
Tipos celulares: LMA - Leucemia Mielóide Aguda; LLA-T - Leucemia
Linfoblástica Aguda de células T; LLA-Não-T - Leucemia Linfoblástica
Aguda de células não-T; CALLA - Leucemia Linfoblástica Aguda Adquirida
na Infância; LCM - Leucemia Mielóide Crônica; LLC - Leucemia
Linfoblástica Crônica (B ou T).
A
B
C
D
E
F
Para se tentar entender melhor as diferentes patogenias causadas por parasitas, vários estudos envolvendo a interação parasita-célula hospedeira têm sido desenvolvidos. Alguns autores se utilizam da citometria de fluxo com o intuito de estudar a interação entre protozoários e bactérias com células do sistema fagocítico mononuclear. Esse método demonstrou ser bastante eficiente, mostrando inclusive a importância da Leishmania no processo de fagocitose por macrófagos. Além disso, estudos da produção de cálcio nessas interações tem sido realizados. A citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar a produção de cálcio e metabólitos do oxigênio (“burst” respiratório) em células infectadas por protozoários do gênero Leishmania e Trypanosoma. Assim como, analisar a presença de cistos de Pneumocystis carinii obtidos de homogeneizados de pulmão, a viabilidade de hemoparasitos intraeritrocíticos, identificar espécies de bactérias e determinar a infecção de hemácias por Plasmodium. Pode, ainda, ser utilizada para quantificar o papel funcional de determinada organela (p.ex. mitocôndrias) ou a resistência biológica de um determinado parasita a drogas. Ainda na parasitologia experimental, a clonagem utilizando a citometria de fluxo tem sido bastante utilizada com o intuito de se conhecer as características biológicas e bioquímicas de uma única espécie de microorganismo. Por fim, a citometria de fluxo abre um leque de opções e perspectivas para o conhecimento. Porém, torna-se indispensável um grande conhecimento da biologia dos sistemas a serem estudados, assim como, uma familiaridade com reagentes, métodos de marcação com anticorpos monoclonais fluoresceinados e controles. SORTING Além de analisar células, alguns citômetros de fluxo têm a propriedade de separar uma
população celular de acordo com parâmetros pré-estabelecidos. A separação de células (sorting) pode ser baseado nas propriedades funcionais, bioquímicas ou morfológicas das células. As mesmas não sofrem qualquer dano durante o processo e a população obtida pode ser posteriormente utilizada em qualquer outro ensaio experimental in vitro ou in vivo, já que todo o processo pode ser feito sob condições estéreis.
Basicamente o que ocorre no sorting é que um sistema específico aplica vibrações ultrassônicas ao flow cell o qual faz com que no fluxo contínuo de líquido haja a formação de gotas (droplets). As gotas que possuírem no seu interior as células de interesse passarão pó rum colar elétrico onde elas podem permanecer sem carga ou receber uma carga positiva ou negativa de acordo com os critérios pré-estabelecidos no computador. Em seguida, as gotas corregadas passam por entre duas placas elétricas onde, de acordo com a polaridade, as gotas vão ser defletidas para a esquerda ou para a direita caindo em tubos coletores (Fig. 11). As populações podem ser separadas com uma pureza de até 98% na primeira passagem. Se maiores graus de pureza são desejados a suspensão purificada pode ser submetida ao sorting novamente.
Figura 11 – Esquema do sorting
Existem outros métodos de separação celular conhecidos atualmente, inclusive mais rápidos,
porém, o sorting por citometria é o único método pelo qual pode-se separar células levando-se em conta apenas suas características físicas, como tamanho e granulosidade, sem a utilização da marcação por anticorpos monoclonais. Utilizando este princípio, é que se torna possível a clonagem de células e/ou parasitas. Um acessório destes equipamentos permite dispensar uma única partícula (célula ou parasita) em um poço de uma placa de microtitulação (Auto-Clone).
pneumático
Existem os sorters pneumáticos que empregam seringas e energia acústica para desviar o fluxo por alguns milisegundos onde as células são coletadas mecanicamente. São processos mais simples e baratos, porém sua especificidade e velocidade são muito baixas. E os sorters de defleção eletrostática, que são complexos e necessitam de um grande suporte tecnológico e de informática. São os mais específicos e os mais utilizados.
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS Devido às características especiais dos citômetros de fluxo. A amostra a ser analisada deve se encontrar em forma de suspensão. Existem amostras como o sangue periférico, medula óssea, ou outros fluidos biológicos, que precisam de um mínimo de processamento, em contraste os tumores sólidos ou as amostras parafinadas necessitam de uma desagregação mais ou menos intensa (mecânica, enzimática etc). Um fator limitante comum em citometria de fluxo é a disponibilidade de uma suspensão celular para estudar suas características e relacionar ou extrapolar seus resultados com fenômenos in vivo.
Defleção
eletrostática
REFERÊNCIAS:
MELAMED, M.R.; MULLANEY, P.F., MENDELSON, M.L. - Flow cytometry and sorting. John Wilwy & sons., 1979. RILEY, R.S., MAHIN, E.J. - Clinical applications of flow cytometry. ASCP National Meeting. Las Vegas, Nevada, 1988. SHAPIRO, H.M. - Pratical flow cytometry. Alan R. Liss, Inc., 1985. BERTHO, A.L., SANTIAGO, M.A., DA-CRUZ, A.M., COUTINHO, S.G. Detection of early apoptosis and cell death in T CD4+ and CD8+ cells from lesions of patients with localized cutaneous leishmaniasis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33: 317-325, 2000. BERTHO, A.L., SANTIAGO, M.A., COUTINHO, S.G. Flow Cytometry in the study of cell death. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 95:429-433, 2000. BERTHO, A.L., CYSNE, L., COUTINHO, S.G. Flow Cytometry in the study of the interaction between murine macrophages and the protozoan parasite Leishmania amazonensis. Journal of Parasitology, 78:.666-671, 1992. SANTIAGO, M.A., LUCA, P.M., BERTHO, A.L., AZEREDO-COUTINHO, R.B.G., COUTINHO, S.G. Detection of intracytoplasmic cytokines by flow cytometry. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 95: 401-402, 2000. CIANCIARULLO, A.M., NAOUM, P.C., BERTHO, A.L., KOBASHI, L.S., BECAK, W., SOARES, M.J. Aspects of gene regulation in the diploid and tetraploid Odontophrynus americanus (Amphibia, Anura, Leptodactylidae. Genetics and Molecular Biology, .23: 357-364, 2000. VON SYDOW, F.F.O., SANTIAGO, M.A., NEVES-SOUZA, P.C., CERQUEIRA, D.I., GOUVEIA, A.S., LAVATORI, M.F., BERTHO, A.L., KUBELKA, C.F. Comparison of dengue infection in human mononuclear leukocytes with mosquito C6/36 and mammalian Vero cells using flow cytometry to detect virus antigen.. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. , 95: 483-489, 2000. PINTO, M.A., MARCHEVSKY, R.S., PELAJO-MACHADO, M., SANTIAGO, M.A., PISSURNO, J.W., FRANÇA, M.S., BAPTISTA, M.L., GOUVEA, A.S., SANTANA, A.A., BERTHO, A.L., SHATZMAYR, H.G., GASPAR, A.M., KUBELKA, C.F. Inducible nitric oxide (iNOS) expression in liver and splenic T lymphocyte rise is associated with liver histological damage during experimental hepatitis A virus (HAV) infection in Callithrix jacchus. Experimental Toxicology Pathology, .52: 3-10, 2000.
CIANCIARULLO, A.M., BERTHO, A.L., MEIRELLES, M.N.L. Mitochondrial kinetics during amphibian erythropoiesis related to haeme synthesis. Cell Biology International, 24: 183-192, 2000. LUCA, P.M., BERTHO, A.L., MAYRINK, W., ALVES, C.R., COUTINHO, S.G., OLIVEIRA, M. P., TOLEDO, V. P., COSTA, C.A., GENARO, O., MENDONÇA, S.C.F. Evaluation of the stability and immunogenicity of autoclaved and nonautoclaved preparations of a vaccine against American tegumentary leishmaniasis. Vaccine, 17: 1179-1185, 1998. NEVES JR, I., BERTHO, A.L., VELOSO, V.G., NASIMENTO, D.V., CAMPOS-MELLO, D.L.A.., MORGADO, M.G. Improvement of the lymphoproliferative immune response and apoptosis inhibition upon in vitro treatment with zinc of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HIV+ individuals. Clinical Experimental Immunology, 111:.264-268, 1998. COTTA-DE-ALMEIDA, V., BERTHO, A.L., VILA-VERDE, D.M.S., SAVINO, W. Phenotypic and functional alterations of thymic nurse cells following acute Trypanosoma cruzi infection. Clinical Immunology and Immunopathology, 82:125-132, 1997. GUEIROS-FILHO, F. J., VIOLA, J. P. B., GOMES, F. C. A., FARINA, M., LINS, U., BERTHO, A. L., WIRTH, D. F., LOPES, U. G. Leishmania amazonensis: DNA amplification and multidrug resistance phenotype in a vinblastine resistant cell line. Experimental Parasitology, 81:480-490, 1995. PALOMO, L.F.C., MATOS, D.C.S., LEAL, E.C., BERTHO, A.L., MARCOVISTZ, R. Lymphocyte subsets and cell proliferation analysis in Rabies-infected mice. Journal Clinical Laboratory Immunology, 46:49-61, 1995. STEPHENS, P.R S., BERTHO, A.L., LUZ, N.C., SANTIAGO, M.A., KUBELKA, C.F. Characterization of CD4 and CD8 bearing cells in intestines of rotavitus susceptible (suckling) and resistant (adult/weanling) mice by flow cytometry. Ciência e Cultura, 46:182-184, 1994. MARCOVISTZ, R., BERTHO, A.L., MATOS, D.C.S. Relationship between apoptosis and thymocyte depletion in rabies-infected mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 27: 1599-1603, 1994. SIBAJEV, A., PACHECO, R.S., SOARES, M.J., CUPOLILLO, E., BERTHO, A.L., MOMEM, H. Crithidia ricardoi sp. n. New species of Trypanosomatidea isolated from Culex saltanensis Dyar, 1928 (diptera Culicidae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. Brasil, 88:541-545, 1993.
LIBERTIN,C.R.;WOLOSCHAK,G.E.;WILSON,W.R.; SMITH.F. - Analysis of Pneumocystis carinii cysts with a fluorescence-activated cell sorter. J.Clin.Microbiol., 20:877-880, 1984.
RUSSEL,H.J.; BATTYE,F.L.; MITCHELL, G.F. - Plasmodium-infected blood cells analysed and sorted by flow fluorimetry with the Deoxiribonucleic Acid binding dye 33258 Hoechst. J.Histochem.Cytochem., 27:803-813, 1979.
JOUIN, H., GOGUET de la SALMONIÈRE, Y.O., BEHR,C., HUYIN QAN DAT, M., MICHEL, J.C., SARTHOU, J.L., PEREIRA DA SILVA, L., DUBOIS, P. Flow cytometry detection of surface antigens on fresch, unfixed red blood cells infected by Plasmodium falciparum. Journal of Immunological Methods, 179:1-12, 1995. SAITO-ITO, A., AKAI, Y., HE, S., KIMURA, M., KAWABATA, M. A rapid, simple and sensitive flow cytometry system for detection of Plasmodium falciparum. Parasitology International, 50:249-257, 2001.
Álvaro Luiz Bertho, PhD é Pesquisador Titular, consultor e coordenador do Núcleo de Citometria de Fluxo do Lab. de Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Av. Brasil, 4365 - Pavilhão Leônidas Deane, Sala 408-A, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 21045-900. Coordenador do Programa Integrado em Citometria de Fluxo da FIOCRUZ. Tel: 55 21 3865.8126 [email protected] http://picf.ioc.fiocruz.br/ncfm.htm http://picf.ioc.fiocruz.br/flowconsult.htm
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CITOMETRIA DE FLUXO
por Álvaro Luiz Bertho
HISTÓRIA DA CITOMETRIA DE FLUXO
O primeiro contador celular automático foi desenvolvido por Moldavan (1934) e consistia num tubo capilar por onde se faziam passar células coradas. O capilar era montado sob um microscópio ótico com uma objetiva sobre a qual havia um detector fotoelétrico que registrava a passagem das células de acordo com a mudança da luz que recebia. Uns anos mais tarde, Kielland (1941) patenteava um modelo semelhante ao de Moldavan.
Um importante avanço para o desenvolvimento da citometria de fluxo se conseguiu em 1953 ao inventar, Crosland e Taylor, uma câmara de fluxo baseada na injeção das amostras no centro de um fluxo de revestimento (sheath fluid) através de um capilar que passava pelo centro da mesma.Com este sistema se evitavam dois grandes problemas:
o O capilar tinha um diâmetro maior, evitando entupimentos o Permitia um maior foco das amostras com a fonte de luz. É a base das câmaras que se
usam na atualidade. Wallace Coulter havia descrito um pouco antes (1949) o princípio que leva seu nome (Coulter
counter). Desenvolveu um contador celular baseado na mudança que produz uma partícula ao passar por uma agulha em que exista uma diferença de potencial conhecida. Em 1966 também usou ondas de rádio freqüência.
Em 1953 Parker e Horst descrevem o primeiro contador diferencial hematológico usando células coradas em vermelho (hemácias) e azul (leucócitos), luz visível e detectores para luz azul e vermelha.
Katmentsky (1965) introduziu dois avanços capitais na citometria: o O uso da espectrofotometria (luz absorvida) para quantificar DNA o A medida multiparamétrica de luz dispersada
Foi o primeiro a empregar histogramas biparamétricos. Algum tempo mais tarde, desenvolveu
um sorter pneumático.
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Com o tempo foi-se introduzindo o emprego de substâncias fluorescentes que permitiam um
menor sinal/ruído do que os corantes e absorção. Em 1967-69 Van Dilla descreve o primeiro citômetro de fluxo com configuração ortogonal
usando a câmara descrita por Crosland-Taylor. Demonstraram a relação existente entre ploidia e intensidade de fluorescência na quantificação de DNA e produziram histogramas aonde se podia visualizar as fases do ciclo celular (G0/G1; fase S; G2M).
No final dos anos 60, o “Fluorescence Activated Cell Sorter” (FACS) foi inventado por Bonner, Sweet, Hullet, Herzenberg e outros. A Becton and Dickinson introduziu equipamentos comercial no início dos anos 70 utilizando a patente da Universidade de Stanford e o conhecimento do Laboratório do Dr. Herzenberg.
Fulwyler descreve o processo de sorting eletrostático em 1965, baseando-se na tecnologia das impressoras jato de tinta. É o sistema mais empregado na atualidade.
Durante as décadas de 60 e 70 se produziram avanços na tecnologia e sua aplicação na citometria de fluxo, porém no final dos anos 70 e princípio dos 80 existiam poucas aplicações da citometria com interesse biológico. Os esforços se concentravam principalmente em melhorar os equipamentos que estavam sendo desenvolvidos.
A partir daí, se tem conseguido avanços nas aplicações da citometria de fluxo na investigação biomédica. Os mais importantes são:
o Reinherz (1975) emprega a tecnologia dos anticorpos monoclonais de Kholer e Milstein para identificar subpopulações celulares em função dos antígenos de superfície.
o Loken (1977) mede simultaneamente dois antígenos celulares com um laser só, emprega a compensação eletrônica de sinal entre o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e a tetrametilrodamina (RD).
o Oi (1982) introduz as ficobiliproteínas como fluorocromos (ficoeritrina). o Darzynkiewicz e Traganos (1976-79) estidam com laranja de acridina o DNA e RNA. o Andreff inicia a classificação das leucemias. o Grynkiewicz (1985) introduz o Indo-1 para medir a concentração intracelular de
cálcio. o Entre 1979-80 vários autores descrevem técnicas citofluorimétricas para medir
condições fisiológicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de superfície) e Thorell (estado redox). o Hedley (1983) põe a ponto uma técnica para o estudo por citometria de fluxo do DNA
de núcleos de amostras parafinadas. o Gratzner (1975) descreve a técnica da bromodeoxiuridina (BrdU) e anticorpos contra
ela, que permite ampliar o estudo das fases do ciclo celular. o Gray (1975) realiza o cariótipo por citometria de fluxo. Este procedimento foi
posteriormente melhorado por Carrano. Muitos outros autores têm contribuído com seus experimentos para desenvolver técnicas
aplicáveis na citometria de fluxo que agora estão dando seus frutos e se empregam tanto em laboratório de rotina, como na investigação básica e/ou clínica.
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CONCEITOS BÁSICOS. Para compreendermos a real importância da citometria de fluxo, talvez devêssemos responder
a algumas questões básicas, como:
o que é citometria de fluxo; seus princípios; e suas aplicações, tanto no campo da pesquisa como na clínica.
A citometria de fluxo é uma tecnologia, baseada no emprego de radiação laser, fluxo hidrodinâmico, ótica, substâncias fluorescentes (fluorocromos), recursos de informática, utilizada para determinar algumas características estruturais e funcionais de partículas biológicas. Essas partículas biológicas entendem-se como vários tipos de células, protozoários, bactérias etc. Esta tecnologia é usada para determinar componentes e propriedades de células e organelas celulares que fluem em uma suspensão celular. Os citômetros de fluxo, como são chamados os equipamentos utilizados para esse fim, têm como princípio básico aspirar células ou partículas de uma suspensão previamente preparada e forçá-las a passar por uma câmara especial (flow cell) que faz com que as células fiquem envolvidas e centralizadas num fluxo contínuo de líquido (sheath fluid) e saiam desta câmara uma atrás da outra de modo que uma única célula seja interceptada pelo laser. Uma vez interceptada pelo laser, dois tipos de fenômenos físicos ocorrem e fornecem informações acerca da célula.
Primeiro, uma parte da luz é espalhada (scatter) de acordo com as características morfológicas e estruturais da célula. O Forward Scatter (FS) se relaciona com o tamanho e o Side Scatter (SS) com a granularidade da célula ou partícula. Segundo, as células previamente coradas com fluorocromos, uma vez excitadas pelo laser, emitem luz de acordo com suas características fluorescentes e são utilizadas para se examinar aspectos bioquímicos, biofísicos e moleculares das células. Uma série de lentes colocadas próximas desta zona de interceptação (célula-laser) coletam a luz dispersa e enviam-na para tubos fotomultiplicadores (PMTs) que convertem o sinal luminosos em pulsos elétricos, os quais são proporcionais à quantidade de luz dispersa ou fluorescente captada pelos PMTs.
Para a seleção e captação destes sinais luminosos, filtros óticos são usados para bloquear determinados comprimentos de onda da luz incidente e deixar passar somente a luz de comprimento de onda desejado. Os sinais elétricos gerados pelos PMTs são amplificados, convertidos para a forma digital e enviados para um computador. A amostragem dos dados, as análises e a interpretação podem, então, ser realizadas através de softwares específicos. Seis parâmetros são considerados básicos e podem ser medidos simultaneamente, são eles: tamanho celular (FS); granularidade interna
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das células (SS); fluorescência verde (FL1); fluorescência amarela (FL2); fluorescência laranja (FL3); Fluorescência vermelha (FL4); Fluorescência roxa (FL5).
Figura 1 - Configuração ótica de duas cores em um citômetro de fluxo baseado num sistema de iluminação com um laser
Laser argônio
PMTs
Forward Scatter
Side Scatter
Sorting
Flow Cell
Amostra
Sheath Fluid
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Alguns parâmetros determinados pela Citometria de Fluxo
Estruturais Funcionais Intrínsecos Morfologia da célula
Proteínas fluorescentes Estado RedOx Proliferação celular Ativação celular Apoptose
Extrínsecos Conteúdo de DNA e RNA Taxa de DNA Estrutura cromatínica Proteínas totais ou básicas Grupos químicos Antígenos Açúcares de superfície Estrutura citoesqueleto
Estudos da membrana celular Atividade enzimática Endocitose Síntese de DNA Receptores Potencial de membrana Ph, cálcio, carga de superfície
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS CITÔMETROS DE FLUXO Atualmente, existem três fabricantes de citômetros de fluxo com representantes no Brasil. A
Beckman-Coulter, que comercializa os EPICS XL, EPICS ALTRA e FC500; a BD Biosciences, com os FACSCalibur, FACSVantage, FACSCanto e o FACSAria; e a Cytomation com o MoFlow.
Existem basicamente dois tipos de citômetros de fluxo disponíveis comercialmente. Um tipo, chamado de citômetro de bancada (banch-top flow cytometers), empregados principalmente em laboratórios clínicos, realizam somente as análises multiparamétricas das células. Freqüentemente, vêm equipados com um laser argônio de baixa potência refrigerado a ar, podendo vir em alguns casos equipados também com laser He-Ne. Geralmente analisam até quatro cores. Como exemplos temos o FACSCalibur, FACSCanto, EPICS XL, FC500.
Já o outro tipo, chamado de cell sorters (separadores de células), apresentam mais recursos que os anteriores (até 11 cores), possuem lasers mais potentes refrigerados à água e possuem ainda a capacidade de separar fisicamente as células seletivamente de uma suspensão heterogênea (sorting). Temos o EPICS ALTRA, o FACSVantage, o FACSAria e o MoFlow. Seu uso é mais direcionado para instituições de pesquisa, pois possibilitam uma infinidade de aplicações. Ambos funcionam de maneira similar durante a aquisição dos dados, entretanto os sorters são mais complexos e possuem mais componentes eletrônicos, o que os tornam mais caros e difíceis de operar. Assim, os citômetros não sorters, são os equipamentos mais freqüentemente encontrados.
A maioria dos citômetros de fluxo utiliza lasers como luz estável, monocromática e de alta potência. Existem lasers sintonizáveis ou de emissão fixa, podendo ser refrigerados a água ou a ar (menor potência). O laser de íon argônio (argon ion laser) é o mais empregado, por ter uma emissão
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a 488 nm, comprimento de onda muito utilizado para a excitação de vários fluorocromos tais como o FITC, PE, ECD, PerCP, PI, 7-AAD, anexina V, brometo de etídeo, laranja de acridina, pironina Y ,fluo-3, muitas rodaminas. Outros fluorocromos, como o Hoescht, a mitramicina, APC, são excitados por lasers com outros comprimentos de onda, como os de UV ou de Hélio-Neônio (He-Ne). Torna-se assim imprescindível, o conhecimento do comprimento de onda de excitação do fluorocromo a ser utilizado para se certificar que tal equipamento seja capaz de lê-lo. Os citômetros atuais podem ser equipados com dois ou mais lasers aumentando assim sua capacidade de análise multiparamétrica. Atualmente, cada vez mais se utilizam os lasers de Argônio de baixa intensidade (10-15 mW) refrigerados a ar e que podem ser usados na maioria das aplicações citométricas. No caso dos sorters, é mais indicado o uso de lasers refrigerados a água (mais potentes). Em adição aos lasers, componentes eletrônicos, computadores e filtros óticos têm um papel essencial no rendimento dos citômetros de fluxo. A função de alguns filtros é absorver alguns comprimentos de onda e deixar passar a luz com o comprimento de onda que interessa. A qualidade de tais filtros é da maior importância na citometria de fluxo. Deve-se sempre mantê-los em ótimo estado. Outro componente importante nos citômetros é a câmara de fluxo (flow cell). Existem alguns tipos de câmaras de fluxo, cada qual com sua finalidade. Os principais são:
o Sense-in-Quartz – são câmaras de fluxo que apresentam uma ponteira de quartz no interior da qual ocorre a intercessão laser-célula. Podem apresentar três tipos:
� Sort sense - a maioria dos citômetros equipados com lasers refrigerados a ar vem com esse tipo de flow cell. São câmaras que conseguem fluxos hidrodinâmicos com velocidades inferiores e produzem menos ruído luminoso. São designadas também para sorting usando esse tipo de laser. Possuem modelos com orifícios de 76 ou 100 µm de diâmetro.
Figura 2 – Sort sense flow cell
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� Fast Quartz – Essa flow cell incorpora a carcterística de baixo ruído luminoso
da Sort sense com a vantagem de uma maior velocidade de passagem. Indicada para sorting de alta velocidade e citômetros com laser refrigerados a ar ou a água.
Figura 3 – Fast Quartz Flow Cell
� HyPerSort Sense Quartz – é semelhante à Fast quartz, porém inclue uma lente para aumentar a sensibilidade sob altas pressões de fluxo.
Figura 4 - HyPerSort Sense Quartz Flow Cell
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Exemplos de citômetros encontrados atualmente no mercado
EPICS ALTRA – Beckman Coulter
FACSCalibur - BD
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CYAN – Dako Cytomation
MoFlow – Dako Cytomation
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FACSAria - BD
FC-500 – Beckman Coulter
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EPICS XL – Beckman Coulter
FLUOROCROMOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO Os fluorocromos oferecem um método sensível para obter informação acerca da estrutura,
função e vitalidade das células. Existam dois modos de uso: (1) ligação covalente do fluorocromo à moléculas que se unem especificamente a componentes celulares, e (2) fluorocromos que variam suas características em função do microambiente que os cerca.
Substância Excitação (nm) Emissão (nm) Substância Excitação Emissão FITC 490 520 DiBA-Isop 493 517 XTRITC 580 604 RN-heptano 485 525 TR 596 620 RN-acetona 530 605 R-PE 480-565 578 Indo 1 350 505-510 APC 650 660 PE-Cy5 480-565 670 Hoestch 33342 340 450 PE-TR 480-565 613 DAPI 350 470 PE-Cy7 480-565 695 Brometo de etídeo 510 595 Pironina Y – DNA 560 570 Iodeto de propídeo (PI)
536 623 Pironina Y – RNA 497 563
DNA 480 520 N Tiazol 453 480 RNA 440-470 650
o Técnicas imunofluorescentes - marcadores fluorescentes de ligação covalente: são
fluorocromos que reagem e se usam para marcar proteínas, lipídeos ou outras moléculas biológicas. Devem ser suficientes seletivos e reativos. Se empregam cromóforos como grupos isotiocianato, clorotrirzinil, e ésteres de succinimida, por sua capacidade de união. O fluorocromo mais empregado é a FLUORESCEÍNA. Outros que se tem descrito são: rodamina, Texas red, cianinas etc, porém o
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mais conhecido é a FICOERITRINA por sua grande excitação, rendimento e fotoestabilidade; além disso pode ser excitado a 488 nm porém emite mais a frente do espectro da fluoresceína permitindo uma análise dupla com um só laser. Avanços recentes são o uso de sondas de DNA unidas a fluoresceína e os anticorpos anti-bromodeoxiuridina para o estudo do ciclo celular. Atualmente se tem generalizado o estudo multiparamétrico de antígenos celulares aom o emprego simultâneo de 4 e 5 anticorpos conjugados cada um com diferentes fluorocromos com diferentes emissões de luz (FITC, PE, ECD ou PerCP, PE-Cy5, PE-Cy7).
o Fluorocromos que se ligam não covalentemente à estruturas celulares: são
fluorocromos que devido a sua composição molecular especial se unem a determinados componentes celulares.
� Marcadores do conteúdo de DNA e RNA: dependendo do tipo são mais ou menos específicos para DNA, RNA ou determinadas bases. Se empregam o Hoescht 33342 Liga-se a A-T), DAPI (A-T-), DIPI (A-T), cromomicina A3 (G-C), olivomicina (G-C), mitramicina (G-C).O laranja de acridina se liga ao DNA e RNA porém tem a particularidade de emitir em diferentes comprimentos de onda dependendo do ácido nucléico ao qual está ligado. De uso mais comum é o Iodeto de propídeo (PI) que se excita com um laser de 488 nm.
� Marcadores do potencial de membrana: são as cianinas e a rodamina 123. Também marcam mitocôndrias devido a alta diferença de potencial entre suas membranas.
o Marcadores fluorescentes que são sensíveis ao microambiente: certos
fluorocromos podem ser empregados para estimar as propriedades do ambiente em que se encontram, posto que variam seu espectro de excitação ou emissão em função das características do microambiente que os cerca. São usados para a determinação de diversos estados funcionais celulares: pH (6-carboxi-fluoresceína; 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno; hidroxipireno trisulfato), cálcio (quin II, fura –2, indo-1), potencial redox (diclorofluoresceína, NADH, NADHP), atividade enzimática (substratos que por ação da enzima variam sua fluorescência ou espectro), polaridade (anilino-naftalina-sulfato ou ANS), e viscosidade /fluidez.
A disponibilidade de fluorocromos específicos e suas propriedades são essenciais para o
desenvolvimento das aplicações em citometria de fluxo. Usualmente, grandes centros de pesquisa e hospitais possuem citômetros de fluxo e treinam
pessoal para operá-los. Embora esses profissionais sejam responsáveis em realizar a aquisição de amostras ou estejam disponíveis para orientar outros usuários, é importante que os pesquisadores e clínicos tenham um conhecimento básico de, pelo menos, como um citômetro funciona para elaborarem seus experimentos de maneira objetiva, além de estarem aptos a determinar resultados consistentes e confiáveis e interpretar laudos clínicos.
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PADRÕES E CONTROLES Um padrão é um material estável que tem um valor determinado de fluorescência ou
dispersão de luz. Utilizam-se para alinhar ou calibrar os citômetros de fluxo. O uso de padrões de alinhamento proporciona um bom método para detectar mudanças e
problemas na configuração ótica e de sinal de um dia para o outro. O citômetro está alinhado quando se consegue uma elevada fluorescência ou sinal com baixo CV.
Os citômetros de fluxo oferecem uma informação relativa, não absoluta. Para quantificar é necessário correlacionar os canais com resultados de amostras conhecidas. O método mais sensível consiste em ajustar a voltagem do PMT ou ganhos para conseguir um pico de intensidade determinada de um padrão estável.
Os fluorocromos têm espectros de emissão que em ocasiões se sobrepõe e os filtros não são perfeitos, por isso os citômetros possuem um sistema informático de compensação ou subtração de sinal. É difícil predizer teoricamente o grau de compensação e deve-se ajusta-lo individualmente. Geralmente se deve extrair FL1 de FL2, e também FL3 de FL2 e FL1.Alguns citômetros permitem fazer gráficos do número de células processadas, do canal de fluorescência ao longo do tempo. Pode-se usar para ver as estabilidades das medições do citômetro com o tempo e detectar a presença de algum problema (Fig. 5).
Figura 5 – Interferência de FL1 em FL2, FL3 e FL4.
Já os controles são materiais que produzem resultados esperados (conhecidos). São usados para monitorar a reprodutibilidade dos reativos e a qualidade dos métodos de preparação celular. São
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importantes nas análises de DNA e imunofluorescência. Geralmente, se usam controles de ploidia e controles de imunofluorescência positivos e negativos.
Como controle de ploidia se deve usar um controle interno, processado no mesmo tubo da amostra, para descartar a aneuploidia e calcular o índice de DNA e outro tubo para calcular as fases do ciclo celular. Para realizar uma boa leitura de DNA se deve ter o citômetro de fluxo em perfeitas condições e ser cuidadoso no processo de preparação da amostra. A análise e interpretação se fazem mediante um software adequado.
O objetivo das análises de imunofluorescência é se utilizar de reativos específicos para determinar subpopulações celulares. São necessários controles negativos para descartar ligações inespecíficas do fluorocromo e selecionar o valor de autofluorescência.
São causas de marcação inespecífica os fragmentos Fc das imunoglobulinas, as células mortas, debris etc.
PROCESSAMENTO E ANÀLISE DE DADOS Os citômetros de fluxo produzem uma grande quantidade de informações que pode ser
armazenadas em forma de histogramas (histogramas monoparamétricas de 256 ou 1024 canais, histogramas biparamétricos de 64 x 64) ou em List mode, que consiste em guardar toda a informação obtida para cada evento de modo que se pode modificar as regiões de análise e reconstruir os histogramas em função de novos parâmetros de seleção.
o Dados univariantes (histogramas monoparamétricos): são representados como um histograma. Um método rápido e sensível de interpretação, é a observação de histograma e a ajuda informática do citômetro para calcular a porcentagem de eventos em regiões selecionadas. Tem que ser levado em conta a resolução do histograma para a discriminação do sinal e o CV.
� Métodos não paramétricos: se baseiam na observação do histograma e posição dos cursores. Um problema são as amostras com baixa fluorescência que se diferenciam pouco do negativo. Empregam-se métodos de normalização e subtração do sinal com comparações de curvas (Kolmogorov-Smirnov).
� Métodos paramétricos: em alguns casos pela dificuldade de interpretação de dados e a elevada informação que contêm, é necessa´rio aplicar modelos matemáticos.
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o Dados bivariantes (histogramas biparamétricos): se apresentam como histogramas biparamétricos com dois eixos e o número de eventos se representa como densidade de pontos, cores, ou linhas isométricas.
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO A citometria de fluxo é particularmente importante para investigações biomédicas já que ela
permite avaliações qualitativa e quantitativa de células e de seus constituintes. As aplicações fundamentais desta técnica se dão em biologia e medicina e são a identificação de antígenos celulares mediante técnicas de imunofluorescência e o estudo do conteúdo de DNA e fases do ciclo celular. A
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citometria de fluxo tem sido utilizada na biomedicina com diferentes objetivos: Na hematologia – contagem celular, fórmula leucocitária, análise da medula óssea; na farmacologia – estudos de cinética celular, resistência à drogas; na imunologia – subpopulações de células T, tipagem tissular, estimulação linfocitária, apoptose; na oncologia – diagnóstico/prognóstico, monitorar tratamento; na microbiologia – diagnóstico bacteriano e viral, sensibilidade a antibióticos; na genética – cariótipo, diagnóstico de portador, diagnóstico pré-natal, tipagem para transplantes.
Com a Citometria de Fluxo é possível analisar o conteúdo de DNA e RNA, definir em que posição do ciclo celular a célula se encontra (Fig. 6), analisar cromossomos (Fig. 7), determinar células cancerígenas que apresentem alterações na sua taxa normal de DNA (Fig. 8) e células que se encontrem em processo de morte programada (apoptose) ou necrose (Fig. 9).
Figura 6 - Histograma de células normais coradas com iodeto de propídeo. Após a divisão, as células entram numa fase Gap (G1), seguida por um período de síntese de DNA (S) durante o qual todos os cromossomos são replicados. A fase S é seguida por uma segunda fase Gap (G2) e, então, sofre mitose. O pico padrão representa o núcleo de eritrócitos de galinha.
padrão
G0/G1
G2/M
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Figura 7 - Distribuição da intensidade de fluorescência do Hoeshst 33258 (eixo do y) vs. Cromomicina A3 (eixo do x), de cromossomos isolados de fibroblastos humanos. Todos os cromossomos estão mostrados no painel (B). O painel (A) mostra uma distribuição somente dos cromossomos 8 até 22 e Y.
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Figura 8 - Histogramas padrões encontrados em análise de DNA por citometria de fluxo. Normal = 46 cromossomos; Hipodiploidia < 46 cromossomos; Hiperdiploidia > 46 cromossomos.
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Figura 9 - Quantificação de linfócitos CD4+ ou CD8+ necróticos, apoptóticos ou viáveis, utilizando-se uma análise multiparamétrica. As células CD4+ foram marcadas com PE, as CD8+ com FITC) e a incorporação ao DNA foi feita pela a (7 AAD). No que diz respeito ao uso da citometria de fluxo em imunologia, uma variedade grande de estudos podem ser realizados com o intuito de se conhecer melhor o que acontece nas doenças em que há comprometimento do sistema imunológico, como é o caso das doenças auto-imunes e das síndromes de imunodeficiência (AIDS). Mudanças nas taxas de linfócitos T e B, mudanças nas taxas de linfócitos T CD4+ e CD8+ podem ser analisadas facilmente, o que ajuda no diagnóstico da doença.
O estudo fenotípico destas subpopulações de células tornou-se importante na clínica, com uma avaliação geral da resposta imune celular, na contribuição da atividade de processos de doenças auto-imunes, na classificação de órgãos para que ocorra um transplante com sucesso (Fig. 10), no monitoramento de pacientes que tenham sofrido algum tipo de transplante para a determinação de sinais precoces de rejeição, e ainda, a possível classificação de determinadas leucemias através da detecção de marcadores de superfície específicos (Tabela 2). A análise fenotípica está relacionada ainda com outras doenças como a Hemoglobinúria Paroxística Noturna com diminuição ou ausência de CD55 e CD59; a distinção entre leucemia das células do manto da leucemia linfocítica crônica através da quantificação de CD79; e a espondilite anquilosante com a determinação de HLAB27..
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Na oncologia, a mensuração de células progenitoras CD34+ por citometria de fluxo se tornou de importante valor para a monitorização de transplantes dessas células.
Na imunologia experimental vários receptores de superfície das células podem ser determinados com o uso de anticorpos monoclonais específicos conjugados a um determinado fluorocromo. Com isso, células de várias origens, como p. ex., timócitos, esplenócitos, células de gânglios linfáticos, células intestinais de qualquer modelo experimental podem ter seus receptores de superfícies e/ou moléculas intracelulares, como, citocinas e DNA, bem definidos.
Figura 10 - “Crossmatching” para transplantes de órgãos. Células do doador são incubadas inicialmente com o soro de receptor e posteriormente com um anticorpo anti-imunoglobulina G humana. O experimento é feito em duplicata e seu resultado (E, F) comparado com controles negativos (C, D) ou positivos (A, B). A positividade no teste impossibilita a realização do transplante.
A
B
C
D
E
F
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TABELA 1 - Painel resumido de diferentes anticorpos monoclonais
usado no diagnóstico de vários tipos de leucemias.
HLA-DR CD19 CD5 CD2 CD10 MY7 MY9
LMA 90% 0% 0% <5% 0% 75% 60%
LLA-T 25% 0% 75% 90% 10% <5% <5%
LLA-Não-T
CALLA +
CALLA -
90%
90%
95%
95%
0%
0%
<5%
<5%
100%
0%
0%
<5%
0%
<5%
LLC-B 90% 0% 100% 90% 0% 0% 0%
LLC-T 25% 0% 100% 90% 0% 0% 0%
LMC
Mielóide
Linfóide
90%
90%
0%
90%
0%
0%
<5%
<5%
0%
80%
75%
0%
90%
0%
Tipos celulares: LMA - Leucemia Mielóide Aguda; LLA-T - Leucemia
Linfoblástica Aguda de células T; LLA-Não-T - Leucemia Linfoblástica
Aguda de células não-T; CALLA - Leucemia Linfoblástica Aguda Adquirida
na Infância; LCM - Leucemia Mielóide Crônica; LLC - Leucemia
Linfoblástica Crônica (B ou T).
Para se tentar entender melhor as diferentes patogenias causadas por parasitas, vários estudos envolvendo a interação parasita-célula hospedeira têm sido desenvolvidos. Alguns autores se utilizam da citometria de fluxo com o intuito de estudar a interação entre protozoários e bactérias com células do sistema fagocítico mononuclear. Esse método demonstrou ser bastante eficiente, mostrando inclusive a importância da Leishmania no processo de fagocitose por macrófagos. Além disso, estudos da produção de cálcio nessas interações têm sido realizados. A citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar a produção de cálcio e metabólitos do oxigênio (“burst” respiratório) em células infectadas por protozoários do gênero Leishmania e Trypanosoma. Assim como, analisar a presença de cistos de Pneumocystis carinii obtidos de homogeneizados de pulmão, a viabilidade de hemoparasitos intraeritrocíticos, identificar espécies de bactérias e determinar a infecção de hemácias por Plasmodium. Pode, ainda, ser utilizada para quantificar o papel funcional de determinada organela (p.ex. mitocôndrias) ou a resistência biológica de um determinado parasita a drogas. Ainda na parasitologia experimental, a clonagem utilizando a citometria de fluxo tem sido bastante utilizada com o intuito de se conhecer as características biológicas e bioquímicas de uma única espécie de microorganismo.
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Por fim, a citometria de fluxo abre um leque de opções e perspectivas para o conhecimento. Porém, torna-se indispensável um grande conhecimento da biologia dos sistemas a serem estudados, assim como, uma familiaridade com reagentes, métodos de marcação com anticorpos monoclonais fluoresceinados e controles.
SORTING Além de analisar células, alguns citômetros de fluxo têm a propriedade de separar uma
população celular de acordo com parâmetros pré-estabelecidos. A separação de células (sorting) pode ser baseado nas propriedades funcionais, bioquímicas ou morfológicas das células. As mesmas não sofrem qualquer dano durante o processo e a população obtida pode ser posteriormente utilizada em qualquer outro ensaio experimental in vitro ou in vivo, já que todo o processo pode ser feito sob condições estéreis.
Basicamente o que ocorre no sorting é que um sistema específico aplica vibrações ultrassônicas ao flow cell o qual faz com que no fluxo contínuo de líquido haja a formação de gotas (droplets). As gotas que possuírem no seu interior as células de interesse passarão pó rum colar elétrico onde elas podem permanecer sem carga ou receber uma carga positiva ou negativa de acordo com os critérios pré-estabelecidos no computador. Em seguida, as gotas carregadas passam por entre duas placas elétricas onde, de acordo com a polaridade, as gotas vão ser defletidas para a esquerda ou para a direita caindo em tubos coletores (Fig. 11). As populações podem ser separadas com uma pureza de até 98% na primeira passagem. Se maiores graus de pureza são desejados a suspensão purificada pode ser submetida ao sorting novamente.
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Figura 11 – Esquema do sorting
Existem outros métodos de separação celular conhecidos atualmente, inclusive mais rápidos,
porém, o sorting por citometria é o único método pelo qual pode-se separar células levando-se em conta apenas suas características físicas, como tamanho e granulosidade, sem a utilização da marcação por anticorpos monoclonais. Utilizando este princípio, é que se torna possível a clonagem de células e/ou parasitas. Um acessório destes equipamentos permite dispensar uma única partícula (célula ou parasita) em um poço de uma placa de microtitulação (Auto-Clone).
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pneumático
Existem os sorters pneumáticos que empregam seringas e energia acústica para desviar o fluxo por alguns milisegundos onde as células são coletadas mecanicamente. São processos mais simples e baratos, porém sua especificidade e velocidade são muito baixas. E os sorters de defleção eletrostática, que são complexos e necessitam de um grande suporte tecnológico e de informática. São os mais específicos e os mais utilizados.
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
Devido às características especiais dos citômetros de fluxo. A amostra a ser analisada deve se encontrar em forma de suspensão. Existem amostras como o sangue periférico, medula óssea, ou outros fluidos biológicos, que precisam de um mínimo de processamento, em contraste os tumores sólidos ou as amostras parafinadas necessitam de uma desagregação mais ou menos intensa (mecânica, enzimática etc). Um fator limitante comum em citometria de fluxo é a disponibilidade de uma suspensão celular para estudar suas características e relacionar ou extrapolar seus resultados com fenômenos in vivo.
Defleção
eletrostática
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REFERÊNCIAS:
MELAMED, M.R.; MULLANEY, P.F., MENDELSON, M.L. - Flow cytometry and sorting. John Wilwy & sons., 1979. RILEY, R.S., MAHIN, E.J. - Clinical applications of flow cytometry. ASCP National Meeting. Las Vegas, Nevada, 1988. SHAPIRO, H.M. - Pratical flow cytometry. Alan R. Liss, Inc., 1985. DOS SANTOS, AP; BERTHO, AL; MARTINS, NM; MARCOVISTZ, R. The sample processing time interval as na influential factor in flow cytometry analysia of lymphocyte subsets. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 102: 117-120, 2007. DA-CRUZ, AM; BERTHO, AL; OLIVEIRA-NETO, MP; COUTINHO, SG. Flow cytometric analysis of cellular infiltrate from American tegumentary leishmaniasis lesions. Brazilian Journal of Dermatology, 153: 537-543, 2005. BERTHO, A.L., SANTIAGO, M.A., DA-CRUZ, A.M., COUTINHO, S.G. Detection of early apoptosis and cell death in T CD4+ and CD8+ cells from lesions of patients with localized cutaneous leishmaniasis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33: 317-325, 2000. BERTHO, A.L., SANTIAGO, M.A., COUTINHO, S.G. Flow Cytometry in the study of cell death. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 95:429-433, 2000. BERTHO, A.L., CYSNE, L., COUTINHO, S.G. Flow Cytometry in the study of the interaction between murine macrophages and the protozoan parasite Leishmania amazonensis. Journal of Parasitology, 78:.666-671, 1992. SANTIAGO, M.A., LUCA, P.M., BERTHO, A.L., AZEREDO-COUTINHO, R.B.G., COUTINHO, S.G. Detection of intracytoplasmic cytokines by flow cytometry. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 95: 401-402, 2000.
26
CIANCIARULLO, A.M., NAOUM, P.C., BERTHO, A.L., KOBASHI, L.S., BECAK, W., SOARES, M.J. Aspects of gene regulation in the diploid and tetraploid Odontophrynus americanus (Amphibia, Anura, Leptodactylidae. Genetics and Molecular Biology, .23: 357-364, 2000. VON SYDOW, F.F.O., SANTIAGO, M.A., NEVES-SOUZA, P.C., CERQUEIRA, D.I., GOUVEIA, A.S., LAVATORI, M.F., BERTHO, A.L., KUBELKA, C.F. Comparison of dengue infection in human mononuclear leukocytes with mosquito C6/36 and mammalian Vero cells using flow cytometry to detect virus antigen.. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. , 95: 483-489, 2000. CIANCIARULLO, A.M., BERTHO, A.L., MEIRELLES, M.N.L. Mitochondrial kinetics during amphibian erythropoiesis related to haeme synthesis. Cell Biology International, 24: 183-192, 2000. LUCA, P.M., BERTHO, A.L., MAYRINK, W., ALVES, C.R., COUTINHO, S.G., OLIVEIRA, M. P., TOLEDO, V. P., COSTA, C.A., GENARO, O., MENDONÇA, S.C.F. Evaluation of the stability and immunogenicity of autoclaved and nonautoclaved preparations of a vaccine against American tegumentary leishmaniasis. Vaccine, 17: 1179-1185, 1998. NEVES JR, I., BERTHO, A.L., VELOSO, V.G., NASIMENTO, D.V., CAMPOS-MELLO, D.L.A.., MORGADO, M.G. Improvement of the lymphoproliferative immune response and apoptosis inhibition upon in vitro treatment with zinc of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HIV+ individuals. Clinical Experimental Immunology, 111:.264-268, 1998. COTTA-DE-ALMEIDA, V., BERTHO, A.L., VILA-VERDE, D.M.S., SAVINO, W. Phenotypic and functional alterations of thymic nurse cells following acute Trypanosoma cruzi infection. Clinical Immunology and Immunopathology, 82:125-132, 1997. GUEIROS-FILHO, F. J., VIOLA, J. P. B., GOMES, F. C. A., FARINA, M., LINS, U., BERTHO, A. L., WIRTH, D. F., LOPES, U. G. Leishmania amazonensis: DNA amplification and multidrug resistance phenotype in a vinblastine resistant cell line. Experimental Parasitology, 81:480-490, 1995. PALOMO, L.F.C., MATOS, D.C.S., LEAL, E.C., BERTHO, A.L., MARCOVISTZ, R. Lymphocyte subsets and cell proliferation analysis in Rabies-infected mice. Journal Clinical Laboratory Immunology, 46:49-61, 1995.
27
STEPHENS, P.R S., BERTHO, A.L., LUZ, N.C., SANTIAGO, M.A., KUBELKA, C.F. Characterization of CD4 and CD8 bearing cells in intestines of rotavitus susceptible (suckling) and resistant (adult/weanling) mice by flow cytometry. Ciência e Cultura, 46:182-184, 1994. MARCOVISTZ, R., BERTHO, A.L., MATOS, D.C.S. Relationship between apoptosis and thymocyte depletion in rabies-infected mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 27: 1599-1603, 1994. SIBAJEV, A., PACHECO, R.S., SOARES, M.J., CUPOLILLO, E., BERTHO, A.L., MOMEM, H. Crithidia ricardoi sp. n. New species of Trypanosomatidea isolated from Culex saltanensis Dyar, 1928 (diptera Culicidae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. Brasil, 88:541-545, 1993.
LIBERTIN,C.R.;WOLOSCHAK,G.E.;WILSON,W.R.; SMITH.F. - Analysis of Pneumocystis carinii cysts with a fluorescence-activated cell sorter. J.Clin.Microbiol., 20:877-880, 1984. RUSSEL,H.J.; BATTYE,F.L.; MITCHELL, G.F. - Plasmodium-infected blood cells analysed and sorted by flow fluorimetry with the Deoxiribonucleic Acid binding dye 33258 Hoechst. J.Histochem.Cytochem., 27:803-813, 1979.
JOUIN, H., GOGUET de la SALMONIÈRE, Y.O., BEHR,C., HUYIN QAN DAT, M., MICHEL, J.C., SARTHOU, J.L., PEREIRA DA SILVA, L., DUBOIS, P. Flow cytometry detection of surface antigens on fresch, unfixed red blood cells infected by Plasmodium falciparum. Journal of Immunological Methods, 179:1-12, 1995. SAITO-ITO, A., AKAI, Y., HE, S., KIMURA, M., KAWABATA, M. A rapid, simple and sensitive flow cytometry system for detection of Plasmodium falciparum. Parasitology International, 50:249-257, 2001.
28
Álvaro Luiz Bertho, é Biomédico, PhD, Pesquisador Titular, consultor e coordenador do Núcleo de Citometria de Fluxo do Lab. de Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Av. Brasil, 4365 - Pavilhão Leônidas Deane, Sala 408-A, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 21045-900. Coordenador do Programa Integrado em Citometria de Fluxo da FIOCRUZ. Professor Adjunto da Universidade Severino Sombra, Vassouras, RJ. Tel: 55 21 3865.8126 [email protected] http://picf.ioc.fiocruz.br/ncfm.htm http://picf.ioc.fiocruz.br/flowconsult.htm