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Nutrição
Bioquímica
APOSTILA
DE
AULAS-PRÁTICAS
PROFESSORES: Antonio Celso S. R. Filho /
Fernanda Drummond
FAM
2
Sumário
1. Cronograma das aulas --------------------------------- pág. 2
2. Normas de segurança ---------------------------------- pág.4
3. Aula-prática 1: Potencial energético dos
alimentos ------------------------------------------------ pág.7
4. Aula-prática 2: Caracterização de carboidratos
pelo método de Benedict (açúcares redutores)--- pág.11
5. Aula-prática 3: Propriedades químicas dos
lipídios ------------------------------------------------------ pág.17
6. Aula-prática 4: Caracterização de proteínas pelo
método do Biureto -------------------------------------- pág.24
7. Aula-prática 5: Avaliação da atividade amilásica
da saliva ---------------------------------------------------- pág.29
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CRONOGRAMA AULAS-PRÁTICAS
AULA DATA Horário TÍTULO DA AULA
1 14/08/2015 20h40 - 22h10 Potencial energético dos alimentos
2 28/08/2015 20h40 - 22h10 Caracterização de carboidratos pelo método
de Benedict(açúcares redutores).
3 02/10/2015 20h40 - 22h10 Propriedades dos lipídios
4 16/10/2015 20h40 - 22h10 Caracterização de proteínas pelo método de
Biureto
5 30/10/2015 20h40 - 22h10 Avaliação da atividade amilásica da saliva.
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NORMAS DE SEGURANÇA E CUIDADOS ESPECIAIS PARA TRABALHO LABORATÓRIOS DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
I - INTRODUÇÃO
Acidentes em laboratórios ocorrem frequentemente em virtude da
pressa excessiva na obtenção de resultados. Todo aquele que trabalha em
laboratório deve ter responsabilidade no seu trabalho e evitar atitudes ou
pressa que possam acarretar acidentes e possíveis danos para si e para os
demais. Deve prestar atenção a sua volta e se prevenir contra perigos que
possam surgir do trabalho de outros, assim como do seu próprio.
O usuário de laboratório deve, portanto, adotar sempre uma atitude
atenciosa, cuidadosa e metódica no que faz. Deve, particularmente,
concentrar-se no seu trabalho e não permitir qualquer distração durante o
processo. Da mesma forma não deve distrair os demais enquanto
desenvolvem trabalhos no laboratório.
A seguir estão relacionadas algumas regras de segurança que você
deverá colocar em prática para sua segurança e de seus colegas.
II - UTILIZAÇÃO
As normas de segurança, abaixo relacionadas, devem ser
rigorosamente observadas pelos profissionais técnicos que trabalham nos
Laboratórios de Química e Bioquímica, bem como pelos usuários, a fim de
que possibilite a maior segurança possível aos funcionários e aos seus
próprios colegas.
III - REGRAS PRÁTICAS PARA O TRABALHO
1. Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é
potencialmente perigoso. Portanto, tenha o máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento, evitando conversas e
brincadeiras que dispersem a concentração; 2. Existe uma regra geral que deve ser seguida neste ambiente: toda
substância desconhecida é potencialmente perigosa até que se prove
o contrário; 3. Siga rigorosamente as instruções específicas do professor. Consulte-o
quando tiver dúvidas e avise-o de qualquer acidente que ocorra, por menor que pareça;
4. Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar
ordenadamente, com consciência da seqüência a ser realizada. Leia atentamente o procedimento experimental certificando-se de que
todos os materiais e reagentes necessários estão disponíveis. Anote os resultados obtidos, relacionado-os à teoria da prática;
5. Em caso de acidentes, mantenha a calma e chame o professor ou
técnico responsável; 6. Evite trabalhar sozinho, e fora das horas de trabalho convencionais;
7. Localize os extintores de incêndio e familiarize-se com seu uso, ou seja, aprenda a utilizá-lo antes que o incêndio aconteça;
5
8. Certifique-se do bom funcionamento dos chuveiros e lava-olhos de
emergência; 9. Antes de usar qualquer equipamento elétrico, verifique a voltagem
correta e no caso de dúvida, consulte o professor ou o técnico de laboratório;
10. É obrigatório o uso de avental apropriado, ou seja, de algodão (se
possível) e de mangas compridas, na altura dos joelhos e fechado; 11. Use sapato fechado, de salto baixo, ou tênis durante as aulas
práticas; 12. Óculos protetores de segurança são requeridos durante todo o
período de trabalho no laboratório;
13. Brincadeiras são absolutamente proibidas nos laboratórios; 14. É proibido fumar no laboratório ou em qualquer outro lugar que
possa por em risco a segurança ou saúde das pessoas; 15. Não coma ou beba dentro do laboratório; 16. Nunca use material de laboratório para beber ou comer;
17. Não prove ou engula drogas ou reagentes do laboratório; 18. Caminhe com atenção e nunca corra no laboratório;
19. Lentes de contato não devem ser usadas em laboratórios, pois podem absorver produtos químicos e causar lesões nos olhos;
20. Objetos pessoais como bolsas, blusas, etc, devem ser guardados em armários de preferência em áreas externas aos laboratórios;
21. Aventais de laboratório, luvas, óculos de proteção ou outras
vestimentas não devem ser usados fora do laboratório; 22. Não use relógios, pulseiras, anéis ou qualquer ornamento durante o
trabalho no laboratório; 23. Alunos que possuam cabelos longos devem trabalhar com os
mesmos presos durante as aulas de laboratório;
24.Observe a limpeza dos materiais antes de utilizá-los; 25. Não trabalhe com material defeituoso, principalmente o de vidro;
26. Vidrarias trincadas, lascadas ou quebradas devem ser descartadas pelo técnico ou professor Portanto, detectando problemas desta natureza chame-os;
27. Nunca jogue no lixo restos de reações; 28. As substâncias químicas, principalmente os solventes, são
normalmente, voláteis, corrosivos e combustíveis. Desta forma, o uso de chama deve ser evitado, quando utilizado, deve-se cercar de todas as precauções;
29. Trabalhando com reações perigosas, explosivas, tóxicas ou que envolvam a liberação de gases e/ou vapores tóxicos devem ser
realizadas na câmara de exaustão (capela); 30. Quando utilizar soluções e reagentes, certifique-se que o rótulo
esteja voltado para cima, evitando que se estrague;
31. Feche adequadamente os frascos das soluções e regentes, principalmente os que forem voláteis e inflamáveis;
32. Não jogue resíduos de solventes nas pias. Resíduos de reações devem ser antes inativados, depois armazenados em frascos adequados;
33. Não gaste reagentes e soluções inutilmente, utilize somente o necessário para o experimento;
34. Os reagentes e soluções devem ser claramente identificados e as soluções apresentar data de preparo, validade e o nome do analista que a preparou;
35. Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou frasco correto;
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36. Nunca retorne um reagente líquido ou sólido, não utilizado, para o
vidro de reagente estoque; 37. Evite contato com qualquer substância com a pele. Seja
particularmente cuidadoso quando manusear substâncias corrosivas como ácidos e bases concentrados;
38. Não jogue nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos, ainda
que seja ligeiramente solúvel; 39. Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta,
use banho-maria; 40. Nunca pipete com a boca, utilize pêras de borracha; 41. Ao aquecer um tubo de ensaio contendo qualquer substância, não
volte a extremidade aberta do mesmo para si ou para uma pessoa próxima;
42. Sempre que proceder a diluição de um ácido concentrado, adicione-o lentamente, sob agitação sobre a água e NUNCA o contrário;
43. Antes de manipular qualquer reagente deve-se ter conhecimento de
suas características com relação à toxicidade, inflamabilidade e explosividade;
44. Certifique-se que vidros que foram aquecidos estejam frios antes de tocá-los. Não se esqueça, tubos e materiais de vidro, frios ou
quentes, têm a mesma aparência; 45. Ao introduzir rolhas em tubos de vidro, umedeça-os
convenientemente e enrole a peça de vidro numa toalha ou em um
papel para proteger as mãos; 46. Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite
aquecimento prolongado ou que desenvolva grande quantidade de energia (calor);
47. Deve-se tomar cuidados especiais quando manipular substâncias
com potencial carcinogênico; 48. Todas as substâncias são tóxicas, dependendo de sua concentração.
Nunca confie no aspecto de uma droga, deve-se conhecer suas propriedades para manipulá-la;
49. Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança; use
béquer, vidro de relógio ou papel manteiga; 50. Todo acidente com reagentes deve ser limpo imediatamente
protegendo-se se necessário. No caso de ácidos e bases devem ser neutralizados antes da limpeza;
51. Ao final de cada aula, as vidrarias utilizadas durante o trabalho de
laboratório devem ser esvaziadas nos frascos de descarte e enxaguadas com água antes de serem enviadas para limpeza;
52. Ao se retirar do laboratório verifique se não há torneiras (água ou gás) abertas. Desligue todos os aparelhos, deixe todo o equipamento e vidrarias limpas e lave as mãos;
53. Receber visitas apenas fora do laboratório, pois elas não conhecem as normas de segurança e não estão adequadamente vestidas.
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AULA PRÁTICA 1
POTENCIAL ENERGÉTICO DOS ALIMENTOS
1) Introdução:
Inicialmente, definiremos provisoriamente calor, como uma quantidade
de energia que se transfere de um corpo a outro por efeito exclusivo de uma
diferença de temperatura entre ambos. A quantidade de calor recebida por um
sistema simples, sob pressão constante (por exemplo, a pressão atmosférica
local), é proporcional ao acréscimo de temperatura produzido, isto é:
Q = C(T2-T1)
Onde C é um fator de proporcionalidade, chamado capacidade calorífica, que
depende da natureza da substância, da massa considerada, e que varia
também, sensivelmente com o intervalo de temperatura (T2-T1).
A unidade utilizada para a energia no Sistema Internacional de Unidades
é o joule, J. Porém, a unidade caloria (1 cal = 4,184 J), continua sendo utilizada
na indústria alimentícia, e uma caloria nutricional é igual a 1000 calorias
químicas (1kcal). Atualmente, os rótulos dos alimentos devem conter as
informações em calorias químicas. A capacidade calorífica em calorias por grau
e a capacidade calorífica específica em calorias por grau e por grama
(cal/g.°C).
Calorimetria é a determinação da quantidade de calor liberada ou
absorvida como decorrência de uma transformação química ou física. Esta
determinação baseia-se na aplicação da 1ª Lei da Termodinâmica: “para
qualquer sistema, existe uma propriedade denominada energia, que é
conservada e que pode ser transferida para outro sistema por interações de
calor ou de trabalho”. Medidas calorimétricas são feitas para determinar a
capacidade calorífica de materiais, bem como os ganhos ou perdas de energia
decorrente de transformações físicas (vaporização, fusão, etc.) ou químicas
(reações de combustão e neutralização). A parte da calorimetria que trata
especificamente das variações de temperatura causadas por reações químicas
é conhecida como Termoquímica.
Medidas calorimétricas mais precisas são feitas em calorímetros,
aparelhos que permitem isolar termicamente do meio o sistema a ser estudado.
Deste modo pode-se trabalhar adiabaticamente. Um calorímetro consiste
usualmente de uma câmara de reação, a qual contém um termômetro e um
agitador.
Quando uma transformação qualquer é realizada em calorímetro, uma
fração do calor liberado ou absorvido é gasta para aquecer ou resfriar os
diversos componentes do próprio calorímetro. Consequentemente, antes de
utilizar um calorímetro é necessário conhecer a sua capacidade calorífica, Ccal.
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Nas experiências termoquímicas realizadas em laboratórios,
basicamente, o que se faz é medir a variação de temperatura dos calorímetros
e seu conteúdo, decorrente da reação química. Pode-se então calcular o calor
absorvido ou cedido no frasco, denominado calor medido qmed. Como as
variações térmicas que ocorrem em um calorímetro adiabático são causadas
só pela ocorrência de reação química, um aumento na temperatura do frasco
(qmed > 0) implica que a reação é exotérmica (ΔH < 0), e uma diminuição
(qmed < 0) implica que a reação é endotérmica (ΔH > 0). Pode-se dizer que a
relação entre o calor medido e a variação de entalpia da reação é:
∆H = - qmed
A determinação da variação de temperatura que acompanha a
ocorrência de uma transformação química ou física exige paciência e
meticulosidade. Tanto antes (estado inicial) como após (estado final) à
ocorrência de um processo, faz-se necessário acompanhar a evolução da
temperatura com o tempo.
Nesta atividade, vamos calcular a quantidade de energia (em calorias)
que um grão de amendoim, uma porção de pão e uma porção de bolacha
podem fornecer ao corpo. Para isso, vamos queimar os alimentos, e usar o
calor produzido nesse processo para aquecer uma quantidade conhecida de
água. Isso irá provocar um aumento na temperatura da água e, com esse dado,
será possível calcular a energia fornecida pelos alimentos utilizando a seguinte
fórmula:
qmed = (Mágua . Cágua . ΔT + Mvidro . Cvidro . ΔT)
como
qliberado = -qmed
obteremos o valor da quantidade de energia liberada pela queima dos
alimentos analisados.
2) Objetivos:
Medir o potencial energético de alguns alimentos.
3) Procedimento experimental
• Preparação Prévia
Os alimentos devem ser desidratados em estufa (37°C).
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A montagem do calorímetro consiste em retirar a parte de baixo de uma
embalagem longa vida a qual deve ser fixada em uma base firme. Na parte
superior da embalagem recorte um orifício pouco menor que o diâmetro de um
tudo de ensaio,encaixe um tubo de ensaio nesse orifício.
• Procedimento:
1°) Pese as amostras que devem ter em torno de 0,5g;
2°) Pese os tubos de ensaio;
3°) Adicione água destilada (10 mL).
4°) Leia a temperatura da água neste instante (temperatura ambiente).
5°) Coloque o tubo de ensaio no sistema montado como na figura 1.
6°) Fixe as amostras em hastes metálicas. Inflame o alimento com um fósforo
ou bico de gás e coloque-o rapidamente dento do cilindro para que a chama
atinja diretamente o tubo de ensaio.
7°) Quando a combustão terminar meça a temperatura da água;
8°) Repita o procedimento com outros alimentos para comparação.
9°) Todas as medidas realizadas no experimento devem ser realizadas em
duplicata.
4) Análise de dados e discussão.
• Deve se calcular o calor medido (Qmed) em cal, kcal, j e kj;
• Calcular o potencial energético (μq) em Kj/g e Kcal/g;
• Considerar densidade da água como 1 g/cm3;
• Considerar como calor específico do vidro 0,2cal/g;
• Discuta sobre a viabilidade do experimento;
• Discussão sobre possíveis fontes de erro;
• Correlacionar os valores obtidos com valores reais.
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5) Referências Bibliográficas
• ATKINS, P.W. Físico-química, 6ª edição, vol 1, Rio de Janeiro, LTC,1999,
p.37-45.
• ATKINS, P; JONES, L.Princípios de Química: questionando a vida moderna e
o meio
ambiente, 3ªedição, Porto Alegre, Bookman, 2006, p.304-311.
• GOMES, Márcio Augusto de Oliveira. Determinação da energia contida em
alguns
alimentos. Curitiba, 1999.26f. Monografia (Especialização em Ensino de
Química
Experimenal para o 2o. Grau) - Setor de Ciências Exatas, Departamento de
Química,
Universidade Federal do Paraná, p.112-124.
• CROCKFORD, H.D; KNIGHT, S.B. Fundamentos de Físico-química, LTC, Rio
de Janeiro,
1977, p.53.
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AULA PRÁTICA 2
Caracterização de carboidratos pelo método de Benedict
I. INTRODUÇÃO TEÓRICA
Os carboidratos, ou sacarídeos, são classificados como
poliidroxialdeídos ou cetonas. Possuem a fórmula empírica [CH2O]n, que
originalmente sugere “hidratos” de carbono. Os monossacarídeos, também
chamados de açúcares simples, consistem numa só unidade poliidroxialdeídica
ou cetônica. O esqueleto de carbono dos monossacarídeos comuns é não-
ramificado e cada átomo de carbono possui um grupo hidroxílico no átomo de
carbono, EXCETO o carbono carbonílico. Quando o grupo carbonílico estiver
na extremidade da cadeia, o monossacarídeo é um aldeído derivado,
denominado aldose; se estiver em qualquer outra posição, o monossacarídeo
é uma cetona derivada, denominada cetose. (figura 1).
Figura 1. Exemplos de aldose (D-glucose) e cetose (D-frutose) com seis átomos de carbono, mostradas
em fórmulas estruturais de cadeia aberta.
A partir de várias considerações químicas, deduziu-se que os
monossacarídeos (aldoses e cetoses) com cinco ou mais átomos de carbono
não são estruturas de cadeia aberta, mas estruturas cíclicas. No caso da D-
glicose, formam-se estruturas cíclicas de seis elementos, pela reação do grupo
hidroxílico alcoólico do átomo de carbono 5 com o átomo de carbono aldeídico
1, conforme ilustrado na figura 2. As formas isoméricas dos monossacarídeos
(dextrógira,D, e levógira,L), diferem entre si apenas na configuração ao redor
do átomo denominado de carbono anomérico.
O monossacarídeo mais abundante é o açúcar de seis carbonos D-
glicose, de onde muitos outros são derivados. A D-glicose é o principal
combustível para a maioria dos organismos, e faz parte da composição de
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dissacarídeos comuns, como maltose, lactose e sacarose, e de polissacarídeos
abundantes na natureza, tais como o amido e a celulose.
As unidades de monossacarídeos são unidas por ligações glicosídicas,
as quais são formadas pela reação do carbono anomérico de um
monossacarídeo com um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo
(figura 3). Dessa forma, os dissacarídeos consistem em dois monossacarídeos
unidos por uma ligação glicosídica, e os oligossacarídeos e polissacarídeos
são cadeias de monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas.
Figura 2. Reação de ciclização da molécula de glicose (glucose), produzindo as formas anoméricas α e β.
A reação envolve o grupo hidroxila ligado ao carbono 5 e o átomo de carbono carbonílico 1, formando
moléculas cíclicas com 6 átomos de carbono.
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Figura 3. Exemplo da formação de uma ligação glicosídica entre duas moléculas de glicose, produzindo
maltose. A ligação glicosídica é formada pela reação do carbono anomérico de um monossacarídeo com
um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo.
II. PRÍNCIPIO DA REAÇÃO PARA PESQUISA DE SACARÍDEOS
REDUTORES
Os sacarídeos cujo grupo hidroxila ligado ao carbono anomérico está
livre (ou seja, não está envolvido em ligações químicas), possuem a
capacidade de reduzir íons metálicos, tais com: Cu2+, Ag+ ou ferricianeto, em
meio alcalino. Os açúcares capazes de reduzir tais agentes são denominados
açúcares redutores. De modo geral, os monossacarídeos são açúcares
redutores, enquanto que os sacarídeos de cadeia maior nem sempre
apresentam essa propriedade. O dissacarídeo lactose é encontrado no leite,
não tendo outra ocorrência na natureza e sua hidrólise produz galactose e
glicose. A lactose é um dissacarídeo redutor, uma vez que possui um carbono
anomérico livre na unidade de glicose.
A sacarose, ou açúcar de cana, é um dissacarídeo de glicose e frutose,
sendo extremamente abundante no reino vegetal e é conhecida como açúcar
de mesa. Em contraste com a maioria dos dissacarídeos e oligossacarídeos, a
sacarose não possui átomos de carbono anomérico livres, uma vez que os
átomos de carbono anoméricos de ambos os monossacarídeos estão ligados
entre si e não podem sofrer oxidação. Por esta razão, a sacarose não age
como açúcar redutor.
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O amido e a sacarose são açúcares não-redutores, cujas ligações
glicosídicas são hidrolisadas pelo tratamento com ácidos fortes à quente,
produzindo monossacarídeos. Estes produtos, por sua vez, são açúcares
redutores, pois possuem uma hidroxila livre no carbono anomérico. A
comprovação da hidrólise ácida do amido e da sacarose se dá pela
positividade da reação de Benedict.
III. REAÇÃO DE BENEDICT
A ação redutora de açúcares em meio alcalino é bastante utilizada para
a determinação quantitativa e qualitativa de açúcares. Nesta aula, utilizaremos
o Reagente de Benedict, que contém íons Cu2+ ligados a agentes
complexantes, em meio alcalino.
Com o aquecimento do açúcar com grupamento redutor, em presença
dos íons Cu2+ e OH-, o Cu2+ é reduzido a Cu+ e o açúcar é oxidado, e ocorre a
formação de precipitados de Cu2O (óxido cuproso). A cor do precipitado
depende do conteúdo de açúcar redutor.
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Precipitado esverdeado -------- traços
Precipitado amarelado --------- 10 g/L
Precipitado vermelho -----------20 g/L
OH- Cu++ + açúcar redutor → →→ → Cu2O + açúcar oxidado ∆
IV. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
1°ETAPA - Caracterizando os Açúcares
1. Enumere 9 tubos e adicione 1,5mL das seguintes soluções em cada um
deles:
Tubo 1: água destilada
Tubo 2: glicose 0,1mol/L
Tubo 3: frutose 0,1mol/L
Tubo 4: sacarose 0,1mol/L
Tubo 5: amido 1,5%
Tubo 6: maltose 0,1mol/L
Tubo 7: galactose 0,1mol/L
Tubo 8: lactose 0,1mol/L
Tubo 9: alanina 0,1mol/L
Tubo 10: àcido aspártico 0,1mol/L
2. Adicione 1,5mL do reativo de Benedict em cada tubo, agite e anote a
coloração observada.
3. Aqueça os tubos rapidamente no bico de bulsen.
4. Verifique a coloração após o aquecimento.
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5. Quais os açúcares redutores entre os utilizados na atividade? Justifique.
6. Porque algumas solução mudaram de cor quando aquecidas?
7. É possível criar uma escala de poder de redução dos açúcares utilizados
comparando o tubo contendo água (tubo 1) com os demais? Esquematize esta
escala.
2ªETAPA – Explorando açúcares em alimentos
1. Enumere 5 tubos e adicione 1,5mL das seguintes soluções em cada um
deles:
Tubo1: refrigerante
Tubo 2: mel de abelha
Tubo 3: suco de fruta
Tubo 4: adoçante em gotas
Tubo 5: refrigerante diet (ou zero)
2. Adicione 1,5mL do reativo de Benedict em cada tubo, agite e anote a
coloração observada.
3. Aqueça os tubos rapidamente no bico de bulsen.
4. Verifique a coloração após o aquecimento.
5. Quais os alimentos utilizados que possuem açúcares redutores?
Justifique.
17
AULA PRÁTICA 3
Estudo das propriedades dos lipídios
II. INTRODUÇÃO TEÓRICA
1. Lipídeos
São biomoléculas orgânicas insolúveis na água que podem ser extraídas de
células e tecidos por solventes não polares, como, por exemplo, clorofórmio,
éter ou benzeno. Podem ser de origem animal ou vegetal e possuem
importantes funções biológicas. Eles são componentes estruturais de
membranas, atuam como forma de armazenamento e transporte de
combustível metabólico. São precursores para biossíntese de algumas
vitaminas, hormônios e mediadores inflamatórios, funcionam como isolante
térmico em animais como a foca.
A classificação dos lipídeos pode ser baseada na estrutura de seus
esqueletos. Os lipídeos simples não contêm ácidos graxos (ex: esteróides,
prostaglandinas) enquanto que os lipídeos complexos são constituídos de
ácidos graxos e diferem na estrutura dos esqueletos aos quais esses ácidos
estão covalentemente ligados. Por exemplo:
Triacilgliceróis ou triglicerídeos: ácidos graxos ligados ao glicerol, na
forma de éster.
Fosfolipídeos ou Fosfoglicerídeos: ácidos graxos ligados ao glicerol-
3-fosfato, com diferentes grupos ligados ao grupo fosfato. Os
diferentes tipos de fosfolipídeos são denominados de acordo com o
grupo ligado à sua cabeça polar. Ex: cardiolipina,
fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol.
Ceras: ácidos graxos ligados a álcoois de cadeia longa, na forma de
éster.
Esfingolipídeos: ácidos graxos de cadeia longa ligados a esfingosina
(aminoálcool de cadeia longa). Ex:esfingomielina, cerebrosídeos.
18
2. Ácidos graxos
Os ácidos graxos possuem uma longa cadeia hidrocarbonada (cauda
apolar) e um grupo carboxílico terminal (cabeça polar) (figura 1). Eles ocorrem
apenas em pequenas quantidades na forma livre; a quase totalidade dos
ácidos graxos encontra-se ligada a diferentes compostos, geralmente na forma
de ésteres, conforme citado acima (figura 2).
A cadeia hidrocarbonada pode ser saturada, isto é, com átomos de
carbono unidos apenas por ligações simples; ou insaturada contendo uma ou
mais ligações duplas ou triplas. Os ácidos graxos diferem um do outro
primariamente no comprimento da cadeia e no número e posição de suas
ligações insaturadas.
Figura 1. Estrutura simplificada de ácidos graxos livres, saturados e insaturados.
Figura 2. Fórmula estrutural e representação simplificada da estrutura de um triacilglicerol.
O número relativo de ligações duplas em uma dada amostra de ácidos
graxos ou lipídeos pode ser determinado empregando-se compostos
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halogenados, como iodo, cloro e bromo. Esses halogênios adicionam-se às
duplas ligações, sendo que a cada lado da dupla ligação se adiciona um átomo
de halogênio. A quantidade de halogênio absorvido é, portanto, proporcional ao
número total de duplas ligações.
Quando se empregam soluções de iodo em clorofórmio, observa-se que
quanto maior o grau de insaturação do lipídeo, mais rápido ocorre o
desaparecimento da cor da solução (figura 3).
Figura 3. Reação de adição de iodo em duplas ligações de ácidos graxos insaturados.
2.1. Propriedades gerais
A. Solubilidade
Os glicerídeos de ácidos graxos inferiores (menores), como o ácido butírico,
são ligeiramente solúveis em água, enquanto os de ácidos graxos superiores
são insolúveis. Todos são solúveis em éter, clorofórmio e benzeno. São pouco
solúveis em etanol a frio, mas a solubilidade aumenta muito em etanol quente.
Os lipídeos, por definição, são moléculas de baixa polaridade, portanto
praticamente insolúveis em solventes polares, como a água. Desse modo, a
ordem de solubilidade esperada para o óleo vegetal é: éter> álcool > água.
B. Saponificação
Os ácidos graxos complexos são também denominados “lipídeos
saponificáveis”, uma vez que produzem sabões, sais de ácidos graxos, sob
hidrólise alcalina.
Os triglicerídeos, ácidos graxos esterificados com glicerol, decompõem-se
facilmente em glicerol e sais de ácido graxo (sabões) por ebulição em bases
fortes como NaOH ou KOH. Como os lipídeos são insolúveis em água, o
processo é facilitado adicionando-se solução alcoólica da base.
Ao acidificar o meio de reação, o sal de ácido graxo, que é solúvel em
água, é convertido em ácido graxo. Este, por sua vez, não é solúvel em água, e
20
separa-se do meio de reação. Além disso, o ácido graxo fica na superfície da
solução, pois é menos denso que a água, e o glicerol permanece dissolvido na
fase aquosa, devido à sua natureza polar.
O ácido graxo separado pode novamente ser convertido em sabão, pela
adição de uma base forte e sob aquecimento. Por esta razão, ao se agitar o
tubo contendo água quente, solução de NaOH 1 mol/L e o ácido graxo
(insolúvel), ocorre formação de espuma, que é indicativa da presença do
sabão.
C. Propriedades dos sabões.
Os sabões de metais alcalinos particularmente de Na e K são solúveis
em água. Os sabões de massa molecular mais alto são menos solúveis. Os de
Ca2+e Mg2+ são muito insolúveis em água e precipitam. Os sais de Pb dos
ácidos graxos saturados possuem solubilidade limitada em água enquanto que
os dos ácidos graxos insaturados são muito mais solúveis (Isto pode servir
para separar ácidos graxos saturados de ácidos graxos insaturados).
Quando acrescentamos solução saturada de cloreto de sódio no sabão,
ocorre precipitação do sabão por sequestrar a água que envolve as moléculas,
de modo semelhante ao fenômeno de precipitação de proteínas por solução
saturada de sulfato de amônio.
21
III. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Propriedades dos ácidos graxos:
1. Separar 3 tubos de ensaio limpos e secos e numerá-los.
Tubo-1: adicione 3 gotas de ácido acético
Tubo-2: adicione 3 gotas de ácido oleico
Tubo-3: adicione pequenos fragmentos de ácido esteárico.
2. Verifique o cheiro e o aspecto físico de cada um, e anotar os resultados
na Tabela-1.
3. Adicione 4mL de H2O(d) a cada tubo, agite bem.
SABÃO
(sais de ácidos graxos)
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4. Retire 1gota de cada tubo e coloque sobre um pedaço de papel azul de
tornassol, previamente umedecido com água destilada. Observe se
ocorre mudança de coloração, e anote os resultados na Tabela1.
5. Aqueça até ebulição cada um dos tubos. Sinta o cheiro, e anote os
resultados na Tabela-1.
6. Esfregue sobre o vapor de cada tubo um pedaço de papel azul de
tornassol. Anote os resultados na Tabela-1.
7. Adicione 1 gota de solução de fenoftaleína, a cada tubo.
8. Adicione gota a gota, solução de NaOH 2mol/L, até o aparecimento de
uma coloração rosada.
9. Aqueça. Observe a formação de espuma nos tubos 2 e 3.
10. Complete com água destilada para 10mL, o volume dos 3 tubos.
11. Divida o conteúdo do Tubo 1 em duas porções (numerar 1a e 1b). Repita
o procedimento para o Tubo-2 (2a e 2b) e Tubo-3 (3a e 3b).
12. Nos tubos (1a, 2a, e 3a) adicione 3 gotas de solução de CaCl2 – 0,5%.
Observe e anote os resultados na Tabela-2.
13. Nos tubos (1b,2b,e 3b) adicione 3 gotas de solução de HCl a 2mol/L.
Observe e anote os resultados na Tabela-2.
II. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
1. Por que o ácido acético é solúvel em água?
1. Por que os ácidos oleico e esteárico são insolúveis na água?
2. Por que o ácido acético muda a cor do papel de tornassol e o ácido
oleico e esteárico não mudam a coloração do papel de tornassol?
3. O que é saponificação?
4. Por que a adição de solução de CaCl2, faz com que a espuma
desapareça?
5. Por que, ao adicionar solução de HCl desaparece a coloração rosa da
solução.
23
ANEXOS
Tabela1. Características gerais dos ácidos orgânicos
Ác.
Acétic
o
Ác.
oleíco
Ác.
esteáric
o
Cheiro Papel de
tornassol - I
Cheiro após
aquecimento
Papel de
tornassol - II
Tubo-1 3 gts ------ -------
---
Tubo-2 ------ 3 gts -------
---
Tubo-3 ------ ------ fragme
ntos
Tabela2. Reatibilidade com os íons Ca2+e H+
CaCl2 HCl Observação
Tubo-1a 3gts -------------
Tubo-1b ------------- 3gts
Tubo-2a 3gts -------------
Tubo-2b ------------- 3gts
Tubo-3a 3gts -------------
Tubo-3b ------------- 3gts
24
AULA PRÁTICA 4
Caracterização de proteínas pelo método de biureto
I. INTRODUÇÃO TEÓRICA
As proteínas são macromoléculas complexas, constituídas por
aminoácidos, e fundamentais para o metabolismo em diferentes organismos
vivos. Seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro
lugar". Os aminoácidos possuem um átomo de carbono assimétrico, ao qual
estão ligados um grupo amino livre, um grupo carboxila livre, um átomo de
hidrogênio e uma cadeia lateral. Esta última é diferente para cada aminoácido.
Figura 1. Fórmula estrutural geral dos aminoácidos.
Nas moléculas protéicas, os resíduos de aminoácidos ligam-se
covalentemente, formando longos polímeros não-ramificados. As ligações
peptídicas, que unem um aminoácido a outro, são formadas pela reação entre
o grupo amino de um aminoácido e o grupo carboxílico do aminoácido
subseqüente, eliminando moléculas de água.
Figura 2. Reação geral da formação de uma ligação peptídica.
25
Figura 3. Exemplo de peptídeo formado por cinco aminoácidos.
II. REAÇÃO PARA IDENFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de
seus grupamentos funcionais, isto é, os grupos carboxílicos, os grupos amino,
e os grupos funcionais presentes nas diversas cadeias laterais. Essas reações
permitem, por exemplo, a identificação de aminoácidos nos hidrolisados
protéicos, identificação da seqüência de aminoácidos de uma proteína,
identificação de aminoácidos essenciais para a atividade de uma enzima.
Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de aminoácidos
em pequenas amostras é a Reação da Ninidrina, devido à sua elevada
sensibilidade.
Princípio da reação da ninidrina: pelo aquecimento, o grupo α-amino
de um aminoácido reage com duas moléculas de ninidrina, produzindo um
complexo de cor azul, denominado “Púrpura de Ruhemann”.
A cor azul é obtida na reação da ninidrina para todos os aminoácidos
que apresentam um grupo α-amino livre. Enquanto que a prolina e a
hidroxiprolina, em que o grupo α-amino está substituído, produzem derivados
com uma cor amarela característica.
26
Figura 4. Reação de ninidrina
III. REAÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Na literatura, podem ser encontrados vários métodos para identificação
e/ou quantificação de proteínas. Eles são baseados em alguma característica
da molécula de proteína, tal como a presença das ligações peptídicas, o
conteúdo de aminoácidos aromáticos ou de grupos R fenólicos.
Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de proteínas é a
Reação do Biureto, devido à sua alta sensibilidade.
Princípio da Reação do Biureto: em meio moderadamente alcalino, os íons
Cu2+ do reagente de Biureto interagem com átomos de nitrogênio das ligações
peptídicas das proteínas, formando complexos de cor violeta. Para a formação
do complexo são necessárias quatro ligações peptídicas para cada íon Cu2+,
conforme ilustrado na figura abaixo.
A Reação do Biureto pode ser empregada também para determinar a
concentração de proteínas em uma amostra, pois a intensidade da cor é
diretamente proporcional à concentração de proteínas.
27
Figura 5. Esquema da reação do Biureto.
IV. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
1. Enumere 8 tubos e adicione 1,5mL das seguintes soluções em cada um
deles:
Tubo 1: água destilada
Tubo2: glicose 0,1mol/L
Tubo 3: solução de clara de ovo
Tubo 4: solução de gelatina 2%
Tubo 5: amido 1,5%
Tubo 6: leite desnatado
Tubo 7: leite integral
Tubo 8: água com sal
2. Adicione em cada tubo 3mL do reativo de biureto e agite.
3. Observe o que ocorre.
4. Adicione 4mL de H2O(d) a cada tubo, agite bem.
5. Aqueça até ebulição cada um dos tubos.
6. Observe o que ocorre.
7. Repita os procedimentos 1 e 2
8. Adicione em cada tubo 3 gotas de HCl 1mol/L
28
9. Observe o que ocorre.
V. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES.
1. Em quais soluções é possível afirmar que há ligações peptídicas?
2. Se a intensidade da cor resultante da reação com biureto é proporcional à
concentração proteica da solução, faça uma sequencia do meio mais proteico
para o menos proteico
3. Por que o aquecimento e a adição de HCl modificaram a coloração da
solução?
29
AULA PRÁTICA 5
Avaliação da atividade amilásica da saliva
I. INTRODUÇÃO TEÓRICA
Enzima é uma classe especial de proteínas que atuam como
catalisadores em todas as células de todos os seres vivos. Elas aumentam a
velocidade das reações químicas sem alterar o equilíbrio das reações por elas
catalisadas. Sob condições brandas de pH e temperatura, existentes nas
células, muitas reações bioquímicas não ocorreriam em velocidade compatível
coma vida, não fossem as enzimas. As enzimas diferem dos catalisadores em
três importantes aspectos: (1) elas são específicas para a reação que
catalisam, em geral cada enzima catalisando uma reação diferente. (2) as
condições de pH e temperatura requeridas para o seu funcionamento são
compatíveis com as fisiológicas. (3) sua ação catalítica pode ser regulada para
adequar a velocidade de formação dos produtos às necessidades celulares.
Vários fatores afetam a velocidade das reações catalisadas por enzimas dentre
eles a temperatura, o pH, a concentração do substrato e a própria
concentração de enzima (Cisternas et al., 2011). .
O amido é encontrado na forma de grãos nas sementes, caules, e raízes
de várias plantas como trigo, mandioca, arroz, milho, feijão, batata, entre
outros. No processo de digestão as enzimas α e β- amilase rompem as
ligações glicosídicas do amido originando maltose, amilopectina, e glicose.
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
1. Preparação das enzimas
Amilase salivar: coletar aproximadamente 3mL de saliva filtrada em gaze e
fazer uma diluição com solução salina (NaCl 0,9%) na proporção de 1:10.
Invertase: misturar 50g de levedura seca (fermento de padaria com 150 mL de
NaHCO3 0,1M em um erlerlemmeyer de 1L). Fechar o frasco com algodão e
colocá-lo em banho-maria entre 40-45°C. Deixar a preparação autolisar durante
24horas. Centrifugar a 15000 rpm por 15minutos. Decantar. Manter o
sobrenadante em banho de gelo entre 0-4°C durante todo o tempo de uso.
Tripsina: solução estoque 5mg/mL em HCl 1mM. Diluir com tampão de modo a
obter uma solução de uso contendo 0,025 mg/mL de tampão TRIS-HCl 0,05M
com CaCl2 5 mM pH8,0.
2. Especificidade enzimática
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2.1.Enumere 4 tubos e adicione 2,0 mL das seguintes soluções em cada um
deles:
Tubo 1: água
Tubo 2: amilase
Tubo 3: tripsina
Tubo 4: invertase
2.2. Adicione 2,0 mL de amido em cada tubo.
2.3. Incubar todos os tubos durante 15 min em banho-maria a 37°C.
2.4 Verificar a presença de amido adicionando ao meio uma gota de lugol em cada tubo.
3. Influência da concentração na atividade amilásica
3.1 Enumere 4 tubos e adicione 2,0 mL das seguintes soluções em cada um
deles:
Tubo 1: água
Tubo 2: amido 0,2%
Tubo 3: amido 1%
Tubo 4: amido 2%
3.2. Adicione 2,0 mL de solução amilásica
3.3. Incubar todos os tubos durante 15 min em banho-maria a 37°C.
3.4 Verificar a presença de amido adicionando ao meio uma gota de lugol em cada tubo.
4. Influência do pH na atividade amilásica
4.1 Enumere 4 tubos e adicione 2,0 mL das seguintes soluções em cada um
deles:
Tubo 1: água
Tubo 2: solução pH 4,0
Tubo 3: solução pH 7,0
Tubo 4: solução pH 9,0
4.2. Adicione 2,0 mL de amido em cada tubo.
4.3. Incubar todos os tubos durante 15 min em banho-maria a 37°C.
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4.4 Verificar a presença de amido adicionando ao meio uma gota de lugol em cada tubo.
III. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES.
1. Qual foi a enzima mais efetiva em digerir o amido? Justifique.
2 O que aconteceu com a atividade enzimática quando a concentração de amido foi aumentada e diminuida? O tempo poderia interferir nesses resultados? Justifique.
3. Qual o melhor pH para favorecer a atividade da amilase salivar?