Application of Directly Coupled HPLC-NMR-MS to the Identification and Confirmation of Quercetin Glycosides and Phloretin Glycosides in Apple Peel

분야 : HPLC-(NMR)-MS

발표자 : 석사 1 기 이 강진

목 차

1. 기기 개요

2. Appele peel 의 성분

3. 분석조건

4. 분석결과

5. 고찰

6. 참고문헌

가 . 고전적 natural product 검색 방법

기기 개요 - I

1) Preparation of extracts

2) Test their pharmacological activity

3) Isolate individual components of the ext’s using liquid chromatography

4) Perform structure elucidation by NMR and MS off-line

Very tedious and time-consuming procedure

나 . 고전적 방법의 개선 노력 (On-line technique)

HPLC-UV detector

- 물질의 분리와 검출에 일반적으로 사용

- polar, nonvolatile, unstable componets 에 적합

- 물질의 구조에 대한 data 제공에 부적함 HPLC-UV-MS

- 분리된 물질의 분자량 추정 가능 HPLC-UV-NMR

- nanogram range 에서도 분석 가능 HPLC-UV-NMR-MS

- fast separation and structure elucidation

기기 개요 - Ⅱ

다 . 일반적 HPLC-NMR-MS 의 구조

기기 개요 - Ⅲ

기기 개요 - Ⅳ

라 . MS 의 구조

Apple peel 의 성분 - Ⅰ

대부분이 Falvonoids

- quercetin O-glycosides

(rutin, hyperin, isoquercetin, reynoutrin,

avicularin, quercitrin)

- phloretin O-glycosides (phloridzin)

Apple peel 의 성분 - Ⅱ

Mass spectral fragmentation pathway of flavonoids

RDA (retro-Diels-Alder) cleavage

분석 조건 - Ⅰ

가 . Apple peel extrat 준비

2.5g apple peel + 12.5 mL MeOD/D2O

↓

90℃ 에서 15 분간 추출

↓

원심분리 ( 10 min at 3,000g )

↓

감압농축하여 MeOD 에 녹임

분석 조건 - Ⅱ

나 . HPLC 조건

• Column : Reverse phase C18 column

(250 X 4 mm, paricle size 5μm, Merck)

• Column temp. : 35 ℃

• Flow rate : 1.0 mL/min

• Injection volumn : 100 ul

• Mobile phase : gradient between

D2O(0.1% trifluoro acetic acid) and acetonitril

• Diode array detector : 280 nm (phloretin glycoside)

370 nm (quercetin glycoside)

분석 조건 - Ⅲ

다 . 1H-NMR Detection

• 500 MHz

• Temperature : 30 ~ 37 ℃

• 1D TOCSY (pulse program selmp, Bruker), 128 scans

라 . MS Detection

• Scan range : 100 ~ 700 m/z

분석 결과

HPLC-MS analysis of apple peel extract

고찰

• laboratory fractionation 및 purification 필요 없음

• 극미량 (a few microgram) 의 시료로도 성분의 분석과

구조 규명이 가능

• 실험 시간의 단축 및 보다 정확한 물질에 대한

정보 획득 가능

• flavonoid algycone 및 그의 conjugates 동정에

꼭 필요한 방법

참고 문헌

1. Lommen A.; Godejohann M.; Venema D.P; Hollman P.C.H.; Spraul M. Anal. Chem. 2000, 72, 1793-1797

2. Hollman P.C.H.; van Trijjp, J. M. P.; Buysman M.N.C.P.; van der Gaag, M.S.; Mengelers, M.J.B.; de Vries, J.H.M.; Katan, M.B. FEBS Lett. 1997, 418, 152-156

3. Suarez-Valles, B.; Santamaria-Victorero, J.; Mangas-Alonso, J.J.; Blanco-Gomis, D. J. Agric. Food Chem. 1995, 42, 2732-2736

4. Andrade, P.B.; Carvalho, A.R.F>; Seabra, R.M.; Ferreira, M.A J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 968-972

5. Justesen, U.; Knouthsen, P.; Leth, T. J. Chromatogr. A 1998, 799, 101-110

6. Chaves, N.; Rios, J.J; Gutierrez, C.; J. Chromatogr. A 1998, 799, 111-115

7. Wilson, D>; Morgan, E.D>; Lafont, R.; Shocker, J.P; Lindon, J.C.; Nicholson, J.K>; Wright, B. Chromatophia 1999, 49, 374-378

8. Hansen, S.H.; Gemal Jensen, A.; cornett, C.; Bjornsdottir, I.; Taylor, S.; Wright, B.; Wilson, I.D. Anal. Chem. 1999, 71, 5235-5241

9. 분광학적 분석 입문

10. 기기분석 , 대한교과서주식회사