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WHITE PAPER

AQUIOS Tetraアプリケーションのゲーティング戦略

リンパ球ゲーティングの課題

AQUIOS CLフローサイトメーターは、リンパ球サブセットの分析と計数をシングルプラットフォーム技術（SPT）にて行う。SPTは、

単一の装置によって単一チューブから各リンパ球サブセットの絶対数と割合を測定するプロセスである（1,2）。SPTの最近の進

歩により、AQUIOS CLフローサイトメーターは、リンパ球ゲーティングとデータ解析によって生じる課題に対処することが可能と

なった。日常サンプルについて一貫性のある迅速かつ簡単な分析が可能となることから、多くの臨床検査室は、日々の大量の

T細胞、B細胞、およびNK細胞の分析にSPTを使い始めている。

種々のリンパ球の分析、定量、および測定を行うために、フローサイトメーターは、細胞の種類の同定が可能なデータ分析方法

を使用する。このプロセスは「ゲーティング」と呼ばれる。フローサイトメトリーのデータ解析ゲートは、目的とする細胞集団の周り

に描かれた領域であり、細胞の混合物からこれらの細胞を「単離する」ために使用される。

簡単に言うと、ゲートは基本的には電子フィルタである。ゲーティングは、特異性の異なる種々の電子フィルタをフローサイトメト

リーデータに適用するプロセスである。従ってゲーティングプロセスにより、細胞の混合物から目的の種類の細胞サブセットを分

析することが可能となる。この計算プロセスにより、更なる分析のために細胞を物理的に選別する必要がなくなる。オペレータ

ーは、細胞形態、細胞表面の蛍光、細胞内マーカーの蛍光、またはこれらの特性の組み合わせに基づいて、細胞混合物に適

用するゲートの特異性を選択する。

しかし、正確なリンパ球のゲーティングを行うには、生物学的ばらつき、サンプル調製法、蛍光抗体の組合せの選択、および機

器変動など、多くの因子が課題となる（3,4）。加えて、純度と回収率は、サブセットの割合と絶対数を計算する際に重要である。

従って、リンパ球サブセットの分析で種々の細胞の絶対数を取得し、割合を計算するには、装置がリンパ球ゲートを正確に確立

できる必要がある。

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ゲートの確立にはいくつかのパラメータが使用される。最も一般的な2つのゲーティングパラメータは、いずれも光散乱パラメー

タである側方散乱（SS）と前方散乱（FS）である。SSは、細胞の顆粒性の相対尺度であり、FSは、細胞の大きさの相対尺度で

ある。これら2つの光散乱パラメータは、細胞の形態のみに依存し、蛍光染色には依存しないため、ゲートの作成に頻繁に使用

される。通常FSとSSを使用するゲートは、単一パラメータのヒストグラム（FS）、または2パラメータのドットプロット（FS vs SS）か

ら作成される。2パラメータのドットプロットの例（FS vs SS）については、図1を参照すること。

図1. FS vs SSのドットプロット

診断検査室では、ゲーティングパラメータは、手動、あるいは複雑なアルゴリズムを用いるソフトウェア法を介して使用される。

従来のフローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの分析は、自動ゲーティングアルゴリズムによって、または測定ソフトウェアを

用いたオペレーターによる手動ゲーティングによって行うことができる。しかしながら、オペレーターは画面上でいくつかのパラメ

ータを評価しなければならず、同時にゲーティングは、分析された細胞サブセットの正確性、回収率、および純度に対処しなけ

ればならないため、手動ゲーティングは主観的かつ時間がかかり、エラーを引き起こしやすい。AQUIOS CLフローサイトメータ

ーは、正確で一貫性のある検査結果を生成しながらこれらの課題に対応するオペレーターを、自動ゲーティングアルゴリズム

でサポートする。

手動ゲーティングに加えて、様々な要因がゲーティングに影響する可能性がある。これらの要因の一部は、サンプルをフロー

サイトメーターに載せる前に影響を及ぼしている可能性がある。ゲーティングは、モノクローナル抗体試薬の選択、蛍光色素の

選択、試薬の品質管理、蛍光補正、および装置の品質管理、ならびに分析に選択したパラメータとデータ処理後ゲーティング

戦略により影響を受ける可能性がある。

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Beckman Coulter社はこれらの問題を認識しており、不均一な細胞集団の解析を向上・簡略化するために、これらの装置を

標準化・較正し、試薬を最適化し、試薬の品質を管理することによって、装置が正確な結果を生成するため適切に設定されて

いることを証明する。AQUIOS CLフローサイトメーターは、定義されたモノクローナル試薬抗体パネルを標準化された分析プロ

トコルおよび自動制御ゲーティングアルゴリズムと組み合わせてヒューマンエラーを最小化することにより、ゲーティングの意思

決定をより簡単にする。従って、AQUIOS CLフローサイトメーターのデータとアルゴリズムは、免疫不全を有する、またはそれが

疑われる患者の免疫学的評価のために正確な結果を生成することに寄与する。

AQUIOS TETRA検査

AQUIOS CLフローサイトメーターは、あらかじめ定義され、十分に特徴付けられた検査を実行するように設計されている。全血

中のTリンパ球、Bリンパ球、およびNKリンパ球の同定と計数を同時に行うことを目的とするBeckman Coulter社のAQUIOS

Tetra検査は、信頼性と精度について実証済みであり、AQUIOS CLシステムを補完する。

AQUIOS Tetra検査は、別々の抗原決定基またはその組み合わせを発現する細胞の表面にモノクローナル抗体が結合する

能力に基づいている。

AQUIOS Tetra-1 パネル CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 と AQUIOS Tetra-2+ パネル CD45-

FITC/(CD56+CD16)-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5モノクローナル抗体試薬は、それぞれ4種または5種のマウスモノクローナ

ル抗体の組み合わせであり、特定の蛍光色素が結合している各抗体は、各細胞表面抗原に特異的である。AQUIOS Tetra-

1パネルとAQUIOS Tetra-2+パネルは、個別に、あるいはAQUIOS Tetra Combo検査として連続して同時に測定することが

できる。

白血球の特異的染色は、全血をモノクローナル抗体試薬とともにインキュベートすることによって行われる。その後赤血球

（RBC）を溶血によって除去し、残った白血球をフローサイトメトリーにより分析する。

正確なリンパ球数―純度と回収率

フローサイトメトリーにおける純度と回収率は、常にゲーティングにおけるトレードオフの関係として存在する。オペレーターが純度

と回収率との間の適切なバランスを選択することが必要である。免疫不全疾患の臨床管理では、各白血球サブセットの細胞

絶対数を正確にカウントし、血液中の個々のサブタイプの割合を測定することが重要である。ゲーティングしたリンパ球の純度

は、絶対数の正確性に影響する。前方散乱（FS）／側方散乱（SS）ドットプロットでゲーティングすることによって、リンパ球を同

定し、他の白血球から分離することができる。しかしながら、従来の光散乱による形態ゲートは、リンパ球以外の白血球を多数

含むサンプルでは信頼できない（5）。

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リンパ球ゲートの純度と回収率は、明るいCD45（汎白血球マーカー）蛍光と相対的に低いSSに位置するリンパ球をゲーティン

グすることによって大幅に向上させることができる。このゲーティング法は、現在広く受け入れられて使用されており、FS/SSと

組み合わせて使用すると、＞95％のリンパ球ゲート純度および回収率を保証する（6）。

CD45/SSゲーティング法が、光散乱の低下により伝統的なリンパ球散乱光ゲートを逃れるリンパ球を捕捉するのに十分でない

症例もある。生物学的ばらつき、サンプル調製方法、試薬、および蛍光色素は、リンパ球の光散乱特性低下の一因となる要素

の一部である。リンパ球ゲートの正確性を高めるために、Beckman Coulter社は、相対的細胞体積の尺度としてElectric

Volume（EV）と呼ばれるパラメータを使用する。AQUIOS CLフローサイトメーターにはこのパラメータが組み込まれており、2パ

ラメータゲートでEV vs SSを使用してリンパ球をゲーティングする。リンパ球サブセット解析ゲーティング戦略のレパートリーに追

加されたこの追加ゲーティングパラメータは、純度と正確性においてスピードとバランスをとるようにして、総リンパ球の純度と回

収率を向上させる。

AQUIOS CLフローサイトメーターではどのように行われているのか

AQUIOS CLフローサイトメーターは、T細胞、B細胞、およびNK細胞のクロスチェックにより、純度と回収率の両方のバランスを

とるように設計されている。細胞の性質の一部は、サンプル調製プロセスの間に改変され、通常と異なるFSまたはSSのプロフ

ァイルが得られる（5）。これにより、特定のサブ集団のドットプロットの位置が予想と異なる場合がある。そのため、しばしば

「escapees」（7,8）と呼ばれるこれらの細胞は、従来のゲーティングでは見逃され、偏った結果につながることがある。

典型的なフローサイトメーターでは、全リンパ球が最初に同定された後、T細胞、B細胞、NK細胞、その他細胞の4つの主要な

グループに分けられる。この方法の問題点は、もし最初のリンパ球の定義が正しくなければ、その後の分類も正しくないことであ

る。従って、CD45/SSグラフでリンパ領域を正しくゲーティングすることは、正確な結果を得るために重要である。小さな配置の

誤差が、結果に著しい影響を及ぼし得る。

AQUIOS CLフローサイトメーターは、ボトムアップでゲーティングを行う。本サイトメーターは、4つの主要グループからリンパ球

を構築することによって、CD45/SSグラフにおけるリンパ領域の不正確なゲーティングの影響を最小限にする。リンパ球と単球

の境界が正しく配置されることが重要である。ゲーティングが厳密すぎると、リンパ球の純度は良くなるが、回収率が低下するこ

とになる。ゲーティングが緩すぎると、回収率は良くなるが、リンパ球の純度は低くなる。純度と回収率の最適なバランスを得る

ため、AQUIOS CLシステムでは、リンパ球の定義を緩和して回収率を最大化すること、および厳格なリンパ球の定義を作成し

て、同時に純度を最大化することが可能となっている。システムは、追加のリンパ球特異的マーカー（CD3とCD19）を、サブセ

ットを同定するゲートの緩い定義と組み合わせて使用する。逆に、NK細胞等、単球の導入により汚染されるリスクの高い細胞

には、システムはゲート定義を厳格化する。「escapees」の影響を補正するために、AQUIOS CLシステムは7つのパラメータを

使用する。

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加えて、システムはFSとCD45の2つの識別子を使用する。分析で細胞がカウントされるには、2つの識別子のうちいずれかを

満たすだけでよい。これは、非蛍光性や小さすぎる細胞を排除するのに役立つ。

「escapees」の捕捉と新たなElectronic Volume(EV)パラメータ

生物は可変であるため、従来のFS/SSリンパ球ゲート、あるいはCD45/SSパラメータゲートですら、データセット内に存在するす

べてのリンパ球を明らかにするには十分とは限らない。これらの行方不明のリンパ球細胞は、「escapees」と呼ばれる。

「escapees」は、伝統的なリンパ球ゲートで見落とされる原因となり得る特徴を有したリンパ球細胞である。「escapees」は、リン

パ球ゲートの正確性と純度に影響する（7,8）。「escapees」現象は、ヒトリンパ球と活性化血小板および単球との凝集に起因す

る。これらの凝集体のサイズと粒度が大きいほどFSとSS値が変化し、凝集体は従来のリンパ球ゲートの外に存在することにな

る。その結果、凝集体は誤カウントされ、絶対数が変わる。

複数の因子が、凝集体の形成に寄与する。主要な因子として、モノクローナル抗体の特異性とIgGサブクラス、蛍光色素の種

類、モノクローナル抗体の結合、溶血剤、サンプル処理、患者検体間における著しい変動等が挙げられる。これらの有害因子

の多くは、AQUIOS CLフローサイトメーターで利用できるようになった革新的技術の特徴によって軽減または排除することがで

きる。これらの革新的な特徴として、あらかじめフォーマット済みのAQUIOS Tetraモノクローナル抗体試薬、手動サンプル調製

によるばらつきがない高度に自動化された採血管からの直接サンプル処理、およびEVパラメータの追加が挙げられる。EVは

細胞粒度の影響を受けないため、正確な細胞体積情報をもたらす（5）。

EVの測定は、コールター原理に依拠する（9）。EV検出器は、細胞の電気インピーダンスを測定することにより細胞体積を測定

する。それは、導電性のシース流体中で2つの電極を持つフローセルに細胞を通過させることによって機能する。流体のインピ

ーダンスは定義されており、細胞がフローセル流路内に引き込まれるにつれて、細胞の体積と等量の電解液が置換される。こ

れにより電極間のインピーダンスが変化する。この「細胞」パルスは、細胞体積と直接相関する（5）。

EVパラメータとSSパラメータを使用して設定されたゲートは、これを用いなければ従来のFS/SSゲートでは失われるリンパ球で

あっても回収することが可能である。EVは一般的に相対サイズの解析に使用されており、他の市販臨床用フローサイトメーター

では使用できないAQUIOS固有のパラメータである。

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バランスと自動化

AQUIOS CLシステムソフトウェアの自動制御ゲーティングアルゴリズムは、リンパ球の特異性、純度、および回収率をバランス

よく考慮し、高品質のデータを生成する。本ソフトウェアシステムのこのユニークな能力は、目的の細胞を探す場所を知る上で、

手動ゲート調整の必要性を最小限にすることができる。レビュー／編集権限および／または管理者権限を有するオペレーター

は、必要に応じて調整を行うことができる。ゲーティングの正確性の検証手順の詳細については、AQUIOS Tetraシステムガイ

ドの第5章の分析信頼性の確認を参照すること。

自動化と点検者／調整者の役割

AQUIOS CLフローサイトメーターは、オペレーターがサンプルを迅速かつ簡単に測定することを可能にする。しかしながら、

AQUIOS CLシステムのシンプルなワークフローの背後では、高度なアルゴリズムが実行され、目的の細胞サブセットを繰り返し

追跡・ゲートする。結果は、ゲート領域に基づいて、特定検査について自動的に生成される。AQUIOS CLソフトウェアは、何ら

かの異常を検出すると、システムおよびアプリケーション固有のフラグまたは通知を自動的に発する。以下のいくつかの機能が、

このような自動化を可能にしている。

分離指数（SQ）：Separation Quotient（SQ）と呼ばれる新たな計算指標は、検査結果に関連したフラグと通知の生成に大き

な役割を果たす。SQは、感度と特異性の相対的な尺度であり、蛍光パラメータにおける陽性 vs 陰性の細胞集団、サンプル

vs デブリス、またはリンパ球 vs 単球等、2つの異なる集団の分離を示す指標として用いられる。SQは迅速な分離推定方法

として用いられ、パラメータ特異的であるため、AQUIOS CLフローサイトメーターは、サンプルを測定している際にリアルタイム

でSQを計測する。SS等の特定パラメータのSQは、あらかじめ定義されており、リアルタイムのチェックとバランスを取ることがで

きる。

もしコントロール測定で問題が発生した場合においては、標準設定範囲外のSQが算出されるとフラグまたは通知が発せられる。

コントロールの具体的な範囲については、AQUIOS IMMUNO-TROLとAQUIOS IMMUNOTROL Lowのアッセイシートを参

照すること。サンプルの測定については、結果に影響する可能性のある異常の場合にフラグ／通知が発せられる。これにより、

オペレーターは迅速に是正措置をとることが可能となる。加えて、SQが範囲外の場合は、点検画面のドットプロットとヒストグラ

ムにおいて、細胞集団が事前設定された領域から外れることとなる。

臨床検査情報システム（LIS）：LISは、多くの臨床検査室の主要な構成要素となっている。Beckman Coulter社はその必要

性を認識し、AQUIOS CLフローサイトメーターを自動化に適するように設計した。AQUIOS CLシステムは、結果をLISに自動

的に送信する機能を提供する。AQUIOS CLシステムは、フラグおよび通知のないすべての結果を自動的に送信する、あるい

はすべての結果を保持するように設定することができる。

注意：QC の測定結果は LIS に転送されない。

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オペレーターは検査結果をLISに自動送信することができるものの、オペレーター／管理者は、結果の公開前にすべてのサン

プルをレビューすることが望まれる。これは、重要な臨床分析が正しく行われることを確実にする、オペレーターが行う重要な

点検の役割である。

LOAD & GOシステム：本システムは矛盾をチェックするアルゴリズムを適用し、矛盾が確認された場合は、オペレーターに警

告または通知を行う。AQUIOS CLフローサイトメーターはLOAD & GOシステムであるため、オペレーターは、サンプルにフラ

グが付された場合にシステムからテキストメッセージまたは電子メールを受信することを選択できる。レビュー／編集または管

理者権限を持つオペレーターのみが、これらのアルゴリズムで定義された領域を編集することができる。これらの警告フラグと

通知は、臨床検査室の環境においてAQUIOS CLフローサイトメーターを真のウォークアウェイ（現場待機不要）かつ信頼性の

高い分析装置にする上で重要な役割を果たす。

ゲーティングの調整

AQUIOS CLフローサイトメーターは、手動でゲートを調整する必要性を最小限に抑える独自のアルゴリズムを使用してり、各サ

ンプルのゲーティングを自動的に行う。フラグが付されているサンプルデータは、レビュー画面で点検することができる。しかし、

レビュー／編集および／または管理者の権限を持つオペレーターが、自身のニーズに応じて、ゲーティングを微調整する能力

を必要とすることもある。変更がファイルに保存されると、システムはこれらの変更をUser Modifiedの通知としてタグ付けする。

これらのステップの詳細な概要については、AQUIOS Tetraシステムガイドを参照すること。許容できないゲートと領域の例を、

表1と表2に示す。

表 1. AQUIOS Tetra-1 と AQUIOS Tetra-2+の詳細プロットにおける領域編集

リンパ球ゲートは次の 2 つのプロットから定義される：SS Lin vs CD45 と SS Lin vs EV。

マウスを用いて領域をドラッグし、または形を整えて、明るい CD45+FITC 蛍光と低い SS を持つリンパ球を

含めるように Lymphs（45）ゲートを編集する（許容可能な例を参照）。

この分析では、単球（やや低めの CD45 発現と中程度の SS）と好塩基球（低めの CD45 と低 SS）を極力排

除しながら、リンパ球を含める。

マウスを用いてポインタをドラッグし、低・中 SS を持つリンパ球を含めるように Lymphs（EV）ゲートを編集す

る（許容可能な例を参照）。

この分析では、単球と好塩基球を極力排除しながら、リンパ球を含める。

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表 2. リンパ総 CD3 ヒストグラム

許容可能な例に示すように、CD3+集団を包含するためにリージョンの境界を全 CD3+ヒストグラム上に設定する。

注意：時折、CD45 ゲートが緩く設定されるが、これは EV 対 SS 領域が正しく描画される限り許容可能である。

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分析アルゴリズムの概要

これに関する詳細については、AQUIOS Tetraシステムガイドの第2章分析アルゴリズム概要の項を参照すること。

AQUIOS TETRAゲーティング戦略の概要

サンプル中の単球および顆粒球は、フローサイトメーター上の適切なリンパ球ゲーティングにより除外することができる（11）。

AQUIOS CLシステムでは、特異性と正確性を確保するためにいくつかの方法が使用されている。

1. AQUIOS Tetraシステムソフトウェアは、CD45+、EV、光散乱特性、および蛍光パラメータ（FL1 FL4）に基づいて、リンパ

球ゲートを自動的に確認し、最適化するよう設計されている。

2. 追加的な鑑別パラメータとしてEVを使用することは、他の白血球および／またはデブリス／ノイズからのリンパ球分離に

役立つ。

3. AQUIOS Tetraソフトウェアは、陽性ピークと陰性ピークの分離に基づいて自動的にカーソルを配置すること、およびその

差異を計測することにより、リンパ球への非特異的抗体結合を監視する。このプロセスにより、アイソタイプコントロールの必

要性がなくなる。

AQUIOSのゲーティング戦略は、リンパ球集団を捕捉し、リンパ球サブセットを計測する。AQUIOSシステムは、FS（相対サイ

ズ）、SS（顆粒性）、蛍光パラメータ（FL1 FL4）、ならびにEVパラメータ（相対細胞体積）を使用して、各集団を分離する。

ゲーティングの詳細については、AQUIOS CLフローサイトメーターの使用説明書の第6章を参照すること。

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結論

AQUIOS CLフローサイトメーターは、自動サンプル調製、自動QC、および患者サンプル分析を統合することにより、サンプル

調製、分析、およびゲーティングといった、従来のフローサイトメーターにおける課題が大幅に改善されている。

AQUIOS CLシステムは、ゲーティングとデータ解析を簡略化する自動制御ソフトウェアを使用するシステムである。

AQUIOS CLシステムの革新的なゲーティング戦略は：

再現性のある正確なリンパ球サブセットの計数をもたらす。

EVパラメータを統合し、検体中の様々なリンパ球集団を捉える。

リンパ球の純度と回収率へのバランスのとれたアプローチを提供する。

臨床における免疫学的マーカー診断の標準化に役立つ。

免疫学的マーカー診断プロセスのあらゆる段階で全面的なゲーティングソリューションを提示する。

AQUIOS CLフローサイトメーターを使用することにより、従来のフローサイトメトリーにおいて必要であった手動および繰り返し作

業の数が最小化されるため、AQUIOSのオペレーターは、経験があまりなくとも、システム使用方法の迅速な習得、効率的な

運用、および一貫した正確な結果を得ることが可能となる。

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参考文献

1. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for performing single platform absolute CD4+ T cell

determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. MMWR, 2003:52

(No. RR 2):1 13.

2. CDC: 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T Cell Determinations in Persons Infected with Human

Immunodeficiency Virus (HIV). MMWR 1997; 46 (RR 2); 1 29.

3. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Maecker HT, McCoy JP, Nussenblatt

R. Nat Rev Immunol. 2012 Feb 17; 12(3):191 200. doi: 10.1038/nri3158.

4. Koepke JA and Landay AL. Precision and accuracy of absolute lymphocyte counts. Clin Immunol Immunopathol,

1989; 52:19 27.

5. Givan A.L. Flow Cytometry First Principles. 2nd ed. Wiley-Liss, Inc. New York, NY. 2001.

6. Nicholson JKA, Hubbard M and Jones BM. Use of CD45 fluorescence and side scatter characteristics for gating

lymphocytes when using the whole blood lysis procedure and flow cytometry. Cytometry (Communications in

Clinical Cytometry), 1996; 26: 16 21

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8. Analysis of factors contributing to the formation of mononuclear cell aggregates («escapees») in flow cytometric

immunophenotyping. Gratama JW, van der Linden R, van der Holt B, Bolhuis RL, van de Winkel JG. Cytometry.

1997 Nov 1;29(3):250 60

9. Coulter, Wallace H., (1953). Means for counting particles suspended in a fluid, Patent number: 2656508

10. H42 A2 CLSI: Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry: Approved

Guideline 2nd Edition 2007.

11. Nicholson JKA, Hubbard M Jones BM. Use of CD45 fluorescence and side scatter characteristics for gating

lymphocytes when using the whole blood lysis procedure and flow cytometry. Cytometry (Communications in

Clinical Cytometry), 1996; 26: 16 21.

2016.08

頭字語

SPT：シングルプラットフォーム技術

FS：前方散乱

SS：側方散乱

EV(Electric Volume)：細胞電気抵抗法により測定された細胞体積

SQ(Separation Quotient)：分離指数

LIS：臨床検査情報システム

QC：精度管理

商標について

Beckman Coulter ロゴ、および Load & Go は Beckman Coulter, Inc.の商標である。

AQUIOS CL はクラス 1 レーザー製品である。

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