LAPORAN RESMIBIOTEKNOLOGIACARA 1 VISUALISASI EKSTRAKSI DNA

OLEH :KELOMPOK 4RIVAN NOVIANTO MADILANA 26020113140089ASISTEN : AHMAD SADDAM HABIBI26020111170001MUHAMMAD SYAHRIAL A.26020112130038AKBAR FIRMANSYAH26020111130074

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTANJURUSAN ILMU KELAUTANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTANUNIVERSITAS DIPONEGOROSEMARANG2015LEMBAR PENILAIAN DAN PENGESAHAN

No.KeteranganNilai

1.Pendahuluan

2.Tinjauan Pustaka

3Materi dan Metode

4.Hasil dan Pembahasan

5.Penutup

6.Daftar Pustaka

7.Lampiran

Total

Semarang, 17 Juni 2015

Asisten

AHMAD SADDAM HABIBI 26020111170001

Praktikan

RIVAN NOVIANTO MADILANA26020113140089

Asisten

MUHAMMAD SYAHRIAL A. 26020112130038

Mengetahui,Kordinator Asisten Praktikum

AKBAR FIRMANSYAH26020111130074

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar belakangPada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. Bioteknologi adalah cabang biologi yang mempelajari pemanfaatan prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, proses biologis untuk meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan manusia.DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.Pada praktikum ini akan dilakukan visualisasi ekstraksi DNA dengan menggunakan teknik gel elektroforesis sehingga diperoleh identifikasi DNA. Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular.

1.2. Tujuan1. Melatih praktikan untuk dapat cara mengekstraksi DNA secara sederhana.2. Melatih praktikan untuk dapat melihat presipitasi DNA dari hasil ekstraksi.3. Melatih praktikan untuk dapat melakukan analisa hasil ekstraksi DNA.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DNAMenurut Priyani (2004), DNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida-nukleotida dalam DNA dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu nukleotida terdiri dari sebuah gula pantosa (deoksiribosa), satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut berikatan dengan carbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan Carbon kelima dari gula yang sama. Basa nitrogen yang menyusun nukleotida dikelompokan menjadi 2 yaitu: a. Purine, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa dua cincin. Termasuk diantaranya adalah : adenin dan guanin. b. Primidin, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa satu cincin. Termasuk diantaranya adalah : citosin dan timin.Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).Menurut Dwianto (2010), pada struktur DNA, gula ribosa dan gugus phosphate yang terikat adalah sama. Yang berbeda hanyalah pada basa nitrogen. Jadi sebetulnya perbedaan disebabkan oleh variasi susunan dari basa-basa nitrogen yang terdapat pada rantai DNA. Ada empat macam basa nitrogen. Adenin, Cytosine, Guainne, dan Thymine.

Gambar 1. Basa NitrogenKetika basa-basa nitrogen tersebut terikat dalam nukleotida, maka penamaan-pun berubah. Ingat kembali penjelasan di awal tentang nukelotida. Nukleotida terdiri dari gugus triphosphate dan satu basa nitrogen yang terikat pada satu molekul ribose.

2.2 Ekstraksi DNAEkstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana di peroleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample (Nurkamila et al., 2014)).Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Melalui proses tersebut DNA dipisahkan dari komponen seluler lain seperti protein, RNA (Riboksi nukleat acid), dan lemak (Langga et al, 2012).Sampel untuk ekstraksi DNA tumbuhan dapat berasal dari berbagai sumber, seperti jaringan segar, jaringan yang dibekukan dengan nitrogen cair jaringan yang dikeringkan dengan silika gel dan jaringan herbarium (Lambertini et al., 2008).

2.3 ElektroforesisElektroforesis merupakan metode pemisahan serta analisis makromolekul (DNA, RNA, protein) dan fragmennya, berdasarkan ukuran dan muatan.Partikel dan molekul bermuatan bermigrasi dalam medium yang bermuatan listrik.Karena kecepatan migrasi berbeda tergantung muatan dan ukuran, diana komponen sampel dipisahkan ke dalam zona-zona dan ditampilkan dalam bentuk pola khusus. Prinsip elektroforesis ditemukan oleh Arne Tiselius ketika ia memisahkan serum manusia ke menjadi 4 komponen utamanya; albumin dan globulin a, b, dan g (Jan-Christer Janson, 2011).Elektroforesis dikatakan sebagai analisis yang ideal untuk memurnikan komponen protein dari campuran sampel dengan cara penambahan medium yang dapat mengikat protein selama elektroforesis. Metode terbaik dalam pemurnian protein dengan tehnik elektroforesis adalah dengan bahan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Gel poliakrilamid merupakan larutan dari akrilamid dan bisakrilamid (Fatmawati et al., 2010). Menurut Sihotang (2010), Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan dibawah pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. Elektroforesis DNA memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Berikut adalah gambar elektroforesis DNA dengan jenis SDS-PAGE dan bagian-bagiannya :

Gambar 2. Elektroforesis SDS-PAGEKeterangan : Larutan elektrolit, digunakan untuk menghantarkan arus listrik dari ion ion yang terdapat pada larutan. Sumber energi, digunakan untuk menyuplai energi ketika elektroforesis bekerja. Lempeng gel, digunakan sebagai sistem sekuensing dan alat analisis genetik secara otomatis. Cloth wick atau kain sumbu, digunakan untuk menyalurkan kabel dengan gel berisi sampel. Sample wells in gel atau sumur sampel pada gel, digunakan untuk meletakkan sampel yang akan dianalisis genetiknya.

2.4 DNA LadderDNA ladder merupakan salah satu komponen elektoforesis, Dna ladder digunakan untuk membandingkan ukuran panjang basa pada fragmen DNA sampel. Pemendaran yang dihasilkan dihasilkan oleh pewarna ElBr dapat dilihat menggunakan sinar UV (Sambrook & Russell, 2001).DNA ladder di dalamnya terdiri dari satu set fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda. Fragmen DNA ini dipisahkan dan divisualisasikan sebagai pita DNA pada gel. Pita DNA dipisahkan bersama-sama terlihat seperti ladder (tangga) pada gel. DNA ladder yang digunakan dalam elektroforesis gel untuk menentukan ukuran dan jumlah fragmentes DNA dari genom (Priyani, 2004).DNA ladder yang ukurannya sudah diketahui dimasukkan juga kedalam geluntuk mengidentifikasi DNA.Agarose gel elektroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agarose gel dan kemudian menghubungkan arus listrik pada gel. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat daripada rantai yang lebih besar melalui gel menuju arus positif (Sudjadi, 2008).Tabel.1. GeneRuler 1 kb, 100 bp, and 50 bp DNA ladders selection guideRange, bpDNA LadderQuantity

501,000GeneRuler 50 bp DNA Ladder50 g

5 x 50 g

GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use50 g

1001,000GeneRuler 100 bp DNA Ladder50 g

5 x 50 g

GeneRuler 100 bp DNA Ladder, ready-to-use50 g

5 x 50 g

1003,000GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder50 g

5 x 50 g

GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use50 g

5 x 50 g

25010,000GeneRuler 1 kb DNA Ladder5 x 50 g

25 x 50 g

GeneRuler 1 kb DNA Ladder, ready-to-use50 g

5 x 50 g

7520,000GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder5 x 50 g

25 x 50 g

GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use5 x 50 g

50 g

10010,000GeneRuler DNA Ladder Mix5 x 50 g

25 x 50 g

GeneRuler DNA Ladder Mix, ready-to-use50 g

5 x 50 g

III. MATERI DAN METODE

3.1 Materi3.1.1 Waktu dan TempatHari/tanggal: Jumat, 12 Juni 2015Waktu : 18.30 20.30 WIBTempat: Laboratorium Mikrobiologi Laut, Gd. E Ilmu Kelautan,Universitas Diponegoro, Semarang

3.2 Alat dan BahanTabel 1. Alat dan Bahan Ekstraksi DNANoNamaGambarFungsi

1Tabung SentrifugeSebagai tempat sampel

2Beaker GelasSebagai tempat buffer lysis

3PengadukUntuk menghomogenkan buffer lysis

4SaringanUntuk menyaring sampel

5Plastik Zip-lockSebagai tempat mengomogenkan sampel dengan buffer lysis

6Stawberry, Pisang, IkanSampel yang dianalisis DNA

7PisangSampel yang dianalisis DNA

8Daging IkanSampel yang dianalisis DNA

9Garam IodiumCampuran buffer lysis

10AlkoholUntuk presipitasi DNA

11Buffer LysisLarutan yang digunakan untuk presipitasi

12AquadestCampuran buffer lysis

13EnzimCampuran buffer lysis

14ShampooCampuran buffer lysis

15Gelas UkurSebagai tempat mengukur larutan/buffer lysis

16Kertas SaringUntuk menyaring serat sampel

Tabel 2. Alat dan Bahan ElektroforesisNoNamaGambarFungsi

1AgaroseUntuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp

2Loading DyeDigunakan sebagai penanda tagging

3Buffer TAE IXDigunakan untuk menggenangkan agarose, untuk menghantarkan listrik

4Perangkat Gel ElektroforesisDigunakan untuk proses elektroforesis

5UVTransluminatorUntuk menampilkan hasil elektroforesis

6MikropipetAlat untuk memindahkan sampel ke sumuran

7Tip Wadah untuk memindahkan sampel ke agarose

3.3 Metode 3.3.1 Ekstraksi DNABuat larutan buffer lisis. Terdiri dari 1 sachet shampoo + 2 tetes Enzim RNAse (cairan softlens) + 10ml air destilasi.

Sampel strawberry, pisang, dan daging ikan masing-masing dimasukan kedalam plastik ziplock, kemudian dihaluskan

.Larutan buffer lisis dimasukkan ke dalam plastik ziplock berisi sampel sebanyak 10 ml, kemudian dihomogenkan

Setiap sampel disaring untuk memisakan ampas/residu, kemudian hasil saringan dimasukkan pada tabung sentrifuge 50ml.

Alkohol 95% dimasukkan pada tiap sentrifuge berisi sampel hasil saringan sebanyak 30 ml.

Tunggu dan amati muncul / tidaknya benang benang pita DNA yang akan diamati.

Catat Hasil

3.3.2 Gel ElektroforesisGel agarose 1% disiapkan lalu dimasukkan dalam perangkat elektroforesis, hindari terbentuk gelembung udara

Memasukkan buffer electrophoresis (TBE 1X) ke dalam electrophoresis apparatus hingga gel terendam

Hasil elektroforesis diamati menggunakan UV-TransluminatorTiap sampel dimasukkan dalam sumur gel agarose sebanyak 4 mikron

1 mikron loading dye ditambahkan pada elektroforesis

Elektroforesis dilakukan selama 50 menit, pada tegangan 100 volt

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil4.1.1. Ekstraksi DNA

1. Pembuatan Larutan Buffer Lysis1. Sampel dihaluskan

1. Buffer Lysis dimasukkan dalam ziplock berisi sampel1. Sampel disaring

1. Hasil saringan dimasukkan ke dalam sentrifuge1. Hasil saringan ditambahkan 30 ml alcohol 95%

1. Hasil presipitasi DNA Strawberry, Pisang, dan Ikan

4.1.2. Gel Elektroforesis

1. Menyiapkan perangkat gel elektroforesis berisi agarose, loading dye, dan buffer TBE 1X1. Mengambil 4 mikron hasil presipitasi DNA dengan mikropipet

1. Dimasukkan ke dalam sumuran agarose1. Proses elektroforesis dilakukan selama 50 menit dalam 100 volt

3. PembahasanEktraksi DNA dilakukan dengan menggunakan sampel buah dan ikan. Sampel buah yang digunakan berupa sampel strawberry dan pisang. Dalam melakukan ekstraksi DNA perlu dilakukan pemecahan dinding-dinding sel DNA serta pemecahan protein sehingga dapat diisolasi DNA dari masing-masing sampel. DNA yang diperoleh berupa benang-benang DNA yang berwarna putih seperti lendir.Dilihat dari sampel yang digunakan, jenis sampel sangat menunjukkan adanya perbedaan yang nyata antara sampel buah dan ikan yang dilihat berdasarkan tekstur dan kadar air. Sampel strawberry memiliki tekstur keras dan kasar dengan kandungan air yang tinggi, sampel pisang memiliki tekstur yang lembut dengan kadar air sedang, dan sampel ikan memiliki tekstur sedikit kasar dengan kandungan air yang rendah.Dengan penambahan alkohol untuk melihat presipitasinya dimana DNA yang terkumpul berupa benang-benang DNA mampu memisahkan diri dari larutan buffer lisis sehingga terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat digunakan untuk analisis. Pada sampel strawberry terlihat adanya benang-benang DNA dengan cepat, hal ini dikarenakan kandungan air yang tinggi pada sampel, berbeda dengan sampel pisang dan ikan. Pada sampel pisang dengan kadar air sedang terlihat benang-benang DNA tetapi tidak memisahkan diri dari larutan buffer lisis nya dan pada sampel ikan dengan kadar air rendah tidak terbentuk benang-benang DNA.Pengamatan dan analisis kandungan atau komponen DNA menggunakan alat eketroforesis dimana pemisahan komponen ini berdasarkan ukuran dan migrasi muatannya dalam aliran listrik. Hasilnya akan ditampilkan dalam UV tranluminator.

V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan1. Ekstraksi DNA dilakukan dengan menambahkan larutan buffer lisis pada ekstrak sampel strawberry, pisang dan ikan.2. Presipitasi dapat dilihat dari ada tidaknya benang-benang DNA (lendir) yang naik ke permukaan dari masing-masing sampel yang sudah diberi alkohol. Pada sampel ekstrak strawberry terlihat presipitasinya yang naik ke permukaan, pada sampel ekstrak pisang terlihat presipitasinya tetapi tidak naik ke permukaan, dan pada sampel ekstrak ikan tidak terlihat presipitasinya.3. Analisis DNA dilakukan dengan menggunakan alat gel elektroforensis dan divisualisasikan dengan alat UV transliminator.

5.2 Saran0. Pada saat menghaluskan sampel harus sampai benar-benar halus agar dapat terlihat presipitasi DNAnya.0. Pada saat memasukan ekstrak DNA ke dalam gel elektroforesis harus dilakukan dengan pelan-pelan dan hati-hati agar dapat terlihat visualisasinya didalam UV transluminator.

DAFTAR PUSTAKA

Dwianto, Sulis. 2010. Deoxyribonucleic Acid. Graha Ilmu. BogorFatmawati, Umi. Suranto dan Sajidan. 2010. Ekspresi Protein Pada Mikroorganisme Resisten Logam Berat Cr Dengan Metode Elektroforesis. Universitas Negeri SurakartaJamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi. Malang : Universitas Negeri MalangJan-Christer Janson. 2011. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, 3rd Edition. Joh & Wiley Inc. Canada.Langga, Indah Fajarwati. Muh. Restu dan Tutik Kuswinanti. 2012. Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam Ekstraksi DnaTanaman Bitti (Vitex Cofassus Reinw)Serta KeragamanGenetik Dengan Teknik Rapd-Pcr. J. Sains & Teknologi, Desember 2012, Vol.12 No.3 : 265 276Lambertini, C., J. Frydenberg, M.H.G.Gustafsson, H. Brix. 2008. Herbarium Specimens as a Source of DNA for AFLP Fingerprinting of Phragmites (Poaceae): Possibilities and Limitations. Pl. Syst. Evol. 272: 223 231.Nurkamila, Uul Shovi dan Made Pharmawati. 2014. Ekstraksi Dna Dari Herbarium Anggrek (Dna Extraction From Orchid Herbarium Materials). JURNAL SIMBIOSIS II (1): 135- 146 Jurusan Biologi FMIPA Universitas UdayanaPriyani, Nunuk. 2004. Sifat Fisik dan Kimia DNA. Progran Studi Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara Sihotang, Laurencius. 2010. Deteksi DNA Secara Visual Dengan Teknik Elektroforesis. IPB. BogorSudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Hal. 94 99 dan hal. 131 43Sambrook and Russell. 2001. Molecular Cloning : A Laboratory Manuals. QH 440.5 5187m.