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AS CARACTERÍSTICAS DOS MECANISMOS E SISTEMAS DE

EDIÇÃO GENÔMICA

LISTIK, Eduardo1; CARMO, Ana Carolina Viegas

2

[email protected]

Centro de Pós-Graduação Oswaldo Cruz; 1Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade

de São Paulo (ICB-USP); 2Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTE)

Resumo: A edição genômica se baseia na aplicação de tecnologias que exploram,

frequentemente, a função de nucleases programáveis, tal como as nucleases dedo de zinco, as

meganucleases, as TALE nucleases e o sistema CRISPR-Cas9; de modo a introduzirem

quebras nas duplas fitas de DNA. Os mecanismos de reparo endógeno, tais como a união

terminal não-homóloga ou o reparo direcionado por homologia, podem condicionar a

modificações no DNA (mutações, correções, deleções, inserções, knock outs) que possuem

finalidades terapêuticas em doenças genéticas, ou até mesmo em doenças imunes ou

neurodegenerativas.

Palavras-chave: Edição genômica, Nucleases programáveis, Engenharia genética.

Abstract: Genomic editing is based on technologies that frequently explore the function of

programmable nucleases, such as zinc finger nucleases (ZNF), meganucleases, TALE

nucleases and the CRISPR-Cas9 system; as a parameter to induce double strand breaks

(DSBs) into the DNA. Mechanisms of endogenous DNA repair, as non-homologous end-

joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) can prompt DNA modifications

(mutations, corrections, deletions, insertions, knock outs), which have many therapeutic

values in genetic diseases, or even immune- or neurodegenerative-associated pathologies.

Keywords: Genomic editing, Programmable nucleases, Genetic engineering.

1 OS FUNDAMENTOS DA EDIÇÃO GENÔMICA

As tecnologias baseadas na edição genômica exploram, frequentemente, a função de

nucleases programáveis, como nucleases dedo de zinco, meganucleases, as TALE nucleases e

o sistema CRISPR-Cas9 (HOTTA e YAMANAKA, 2015). Tais tecnologias possibilitam a

edição genômica ao introduzirem quebras na dupla fita de DNA (em inglês, double strand

breaks, DSBs) em loci específicos. Tais DSBs envolvem diversos mecanismos de reparo

endógenos como a união terminal não-homóloga (em inglês, non-homologous end-joining,

NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (em inglês, homology-directed repair, HDR)

(COX et al., 2015).

Após a formação da DSB, os mecanismos de reparo por HDR ou por NHEJ podem se

suceder. O reparo por HDR (Figura 1D, E) parte do ponto clivado, mas exige a existência de

um modelo para que este reparo seja sucedido (SZOSTAK et al., 1983). A HDR pode ser

empregada para restaurar a funcionalidade de genes mutados pela sua correção, retomando

sua expressão e finalidade fisiológica benéfica. Neste caso, o emprego de padrões de DNA

exógenos que especificam o resultado do reparo de DSBs-alvo possibilita este emprego de

ferramenta de reparo de forma terapêutica (CHOULIKA et al., 1995).

O reparo em DSBs por NHEJ (Figura 1A–C), por outro lado está associado com o

religamento direto da quebra. Este procedimento, embora apresente certa acurácia, está

associado com eventuais mutações, quer por deleções ou inserções, os chamados indels

(LIEBER et al., 2003). O aspecto mutagênico atrelado à NHEJ elicita possibilidades de que

esta ferramenta de reparo seja explorada para a indução da mutagênese, knock out ou deleção

de determinados genes de interesse. Em certos eventos patológicos, como ocorre na distrofia

muscular de Duchenne, a deleção de genes pode resultar na expressão de proteínas defectivas.

Neste caso, a modificação de tais genes pelos indels gerados a partir da NHEJ direcionada

pode restaurar a função de tais proteínas (OUSTEROUT et al., 2013). Os reparos induzidos

pela NHEJ também têm a capacidade introduzir códons de parada prematuros em genes de

interesse, possibilitando o knock out de tais genes (PEREZ et al., 2008; ARONIN e

DIFIGLIA, 2014). Ademais, a indução de duas DSBs em determinada sessão do DNA pode

acarretar na deleção genômica da região então delimitada, silenciando genes específicos

(XIAO et al., 2013).

Até este ponto averiguaram-se aspectos da correção, mutação, knock out e deleção de

genes. A inserção de genes é possível quer mediada por HDR ou por NHEJ. No caso da HDR,

é possível o uso de um modelo de DNA que apresente transgenes terapêuticos, os quais

podem ser inseridos em determinados loci do genoma, denominados de safe harbor,

diminuindo os riscos de mutagênese e aumentando a expressão do gene inserido (MOEHLE

et al., 2007). Pode-se também adicionar um transgene por NHEJ quando se induz a DSB de

modo a proporcionar uma clivagem compatível em que pontos de reconhecimento permitem a

inserção do transgene como um indel à região de reparo (MARESCA et al., 2013).

A) Mutação/Knock out

B) Deleção

C) Inserção (Knock in) por NHEJ

D) Inserção (Knock in) por HDR

E) Correção

Figura 1 (continuação) Mecanismos de edição genômica envolvendo NHEJ (A–C) e HDR (D

e E). (A) O reparo por NHEJ pode condicionar à inserção ou deleção (indels) de sequência em

genes, condicionando à formação de códons de parada, e promovendo o knock out de tais

genes. (B) A indução de duas DSBs pode promover a deleção de sequências genômicas por

NHEJ, de modo a reparar proteínas mutadas. (C) Transgenes podem ser inseridos por NHEJ

em DSBs a partir de doadores que contenham pontos de reconhecimento. (D) A HDR também

pode condicionar à adição de genes em loci específicos, como os safe harbor loci. A inserção

é condicionada a partir de um modelo de DNA contendo o gene de interesse. (E) Ademais, a

HDR permite corrigir sequências com mutações, necessitando de um modelo corretivo de

DNA para tal.

2 AS NUCLEASES PROGRAMÁVEIS

Os mecanismos de reparo do DNA quer por NHEJ ou por HDR consistem em formas

endógenas de reparo de DSBs. No entanto, tal ferramentário pode ser explorado quando

determinadas DSBs são intencionalmente e direcionalmente realizadas. As possibilidades

terapêuticas neste caso são vastas e abordam as inúmeras técnicas tecidas previamente. De

forma a condicionar DSBs em pontos específicos, tem-se o papel das nucleases programáveis.

2.1 Nucleases dedo de zinco

Os dedos de zinco (em inglês, zinc fingers, ZFs) constituem pequenos domínios proteicos

em que o zinco contribui para a estabilidade térmica e conformacional da estrutura. ZFs estão

presentes em inúmeras proteínas que reconhecem sequências de DNA atuantes como fatores

de transcrição (KLUG, 2010). Este reconhecimento se faz tanto pela interação entre os

aminoácidos individuais -1, 3 e 6 presentes no ZF e as bases nitrogenadas do DNA, quanto

por potenciais ligações de hidrogênio entre o aminoácido 2 do ZF e a fita complementar de

DNA, numa interação cruzada (em inglês, cross-strand) (PAVLETICH e PABO, 1991;

ISALAN et al., 1997).

Dentre a classificação dos ZFs, os da família C2H2 constituem os mais estudados.

(IUCHI, 2001). Tais ZFs apresentam dois pares de resíduos conservados de cisteínas e

histidinas que quelam o zinco. Estruturalmente, são compostos por um grampo β, associado a

uma hélice em α que se desenvolve em uma unidade ββα (KRISHNA et al., 2003).

As nucleases dedo de zinco (em inglês, zinc finger nucleases, ZFNs) consistem na

associação de séries de ZFs C2H2 com a endonuclease de restrição FokI, a qual apresenta

domínios de ligação no DNA (em inglês, DNA binding domains, DBDs) independentes dos

próprios ZFs (LI et al., 1992). A associação de ZFs com a FokI forma nucleases quiméricas

com novas propriedades e especificidades de ligação (KIM e CHANDRASEGARAN, 1994).

Para gerar a DSB, as ZFNs devem atuar como um dímero na dupla fita (Figura 2) (SMITH et

al., 2000).

Figura 2 Funcionamento das nucleases dedo de zinco. As ZFs Cys2His2 são pequenos

domínios proteicos estabilizados pelo zinco cuja interação direta na fita 3’-5’ (aminoácidos

(a.a.) -1, 3 e 6 do ZF) ou cruzada com a fita 5’-3’ (a.a. 2 do ZF) permitem o reconhecimento

de elementos da fita dupla, especialmente em regiões ricas em guanina (em amarelo, verde e

azul claro). As ZFNs consistem em ZFs associados à FokI, que reconhece a sequência 5’-

GGATG-3’, induzindo à clivagem da fita (região em vermelho). A atuação de dímeros de

ZFNs condiciona à formação de DSBs.

2.2 Meganucleases

Meganucleases, também conhecidas como endonucleases teleguiadas (em inglês, homing

endonucleases, HEs), consistem em endonucleases capazes de reconhecer grandes e

específicas sequências de DNA, normalmente com mais de 14 pares de bases, e clivar a fita

formando DSBs em tais loci (SMITH et al., 2006). O uso de HEs tem se baseado na correção

de determinados genes a partir do reparo por HDR (DONOHO et al., 1998).

As HEs podem ser divididas em cinco famílias com base em sua sequência e motivos

estruturais: His-Cys box, GIY-YIG, HNH, PD-(D/E)XK e LAGLIDADG, sendo esta última a

mais estudada e tendo sido verificada em todos os reinos biológicos. HEs da família

LAGLIDADG possuem, normalmente, a capacidade de facilitar a corte-junção (splicing) de

suas próprias regiões intrônicas; ou de agir como endonucleases altamente específicas,

capazes de clivar a junção exon-exon em que seu intron reside (SILVA et al., 2011).

Dois grupos de HEs da famílias LAGLIDADG largamente empregados são os de único

motivo proteico, I-CreI (Figura 3A), ou de duplo motivo proteico, PI-SceI, que apresentam o

domínio da endonuclease na estrutura αββαββα, o qual forma um centro catalítico bipartido.

No caso da I-CreI, há a formação de um homodímero composto pelos domínios α/β, ao passo

que na PI-SceI, uma HE monomérica, dois domínios estão presentes, em que um, formado por

domínimos α/β, apresenta a função de endonuclease e outro, formado por folhas β, está

associado a modificações transcricionais (DUAN et al., 1997; HEATH et al., 1997).

O que se averigua das HEs é a sua capacidade de identificar, com grande especificidade,

grandes sequências de DNA e promover DSBs. Em HEs sintéticas, busca-se redesenhar tais

endonucleases, de modo a redefinir as sequências de clivagem, mas de modo que a

estabilidade e estrutura terciária das proteínas sejam mantidas. O intuito de tal é promover o

reparo de distintas regiões mutadas do DNA por meio da HDR e proporcionado o aspecto

terapêutico.

Arnould e colaboradores descreveram um método para a obtenção de I-CreI mutantes

capazes de reconhecer sequências de DNA distintas. Em primeira instância, induzem-se

mutações nos distintos DBDs de cada domínio da I-CreI, e posteriormente combinam-se as

regiões mutantes para originar complexos I-CreI homodiméricos mutantes. Pode-se, por fim,

combinar heterodímeros de modo a criar HEs com especificidades completamente

modificadas (Figura 3B). (ARNOULD et al., 2007).

Figura 3 Características estruturais e de reconhecimento de meganucleases (A) e princípios

da confecção de HEs mutantes (B). (A) A I-CreI é uma HE da família LAGLIDADG, cuja

estrutura é formada por domínios α/β, permitindo a estrutura em dois DBDs específicos

(marcados de amarelo e verde). A ação da endonuclease é atingida com a estrutura

homodimérica da I-CreI, onde a clivagem ocorre na região destacada em vermelho

(CHEVALIER et al., 2002). (B) Método de síntese de meganucleases mutantes para

reconhecimento de sequências distintas do DNA. Selecionam-se I-CreI com mutações em

regiões específicas (A/A’, B/B’, C/C’ e D/D’), e posteriormente realiza-se a combinação para

formar I-CreI homodiméricas mutantes (AB/B’A’ e CD/D’C’). Por fim, heterodímeros são

confeccionados por co-expressão (AB/D’C’).

2.3 TALE Nucleases

TALENs (em inglês, transcription activator-like effector nucleases) consistem em DBDs

cutomizáveis associadas a uma FokI não-específica. As DBDs, neste caso, consistem em

repetições altamente conservadas derivadas dos efetores pseudo-ativadores de transcrição (em

inglês, transcription activator-like effectors, TALEs), proteínas secretadas pela Xanthomonas

(JOUNG e SANDER, 2013).

A forma com a qual as TALEs efetivam o reconhecimento de sequências do DNA se

baseia no pareamento de bases com dois resíduos hipervariáveis, normalmente nas posições

12 ou 13 do domínio (BOCH et al., 2009). Desta forma, sequência de resíduos de asparagina-

isoleucina (NI) reconhecem a adenina (A); a de histidina-aspartato (HD) reconhecem a

cisteína (C), e assim por diante (MOSCOU e BOGDANOVE, 2009). Uma timina (T), no

entanto, sempre precede as repetições. A repetição de asparagina-asparagina (NN) reconhece

preferencialmente a guanina (G), mas também pode reconhecer A. A repetição de resíduos

hipervariáveis asparagina-histidina (NH) possui uma afinidade levemente maior pela guanina

que NN (STREUBEL et al., 2012) (Figura 4).

Similarmente às ZFNs, TALENs podem ser empregadas para promover a edição

genômica por NHEJ ou HDR. Mutações induzidas por NHEJ foram utilizadas para efetuar o

knock out de diversos genes, de modo a originar modelos para enfermidades humanas, ou para

realizar deleções e inversões de grandes sequências de DNA em gado (CARLSON et al.,

2012). As correções de mutações genéticas por HDR também podem ser precedidas por DSBs

geradas por TALENs (HOCKEMEYER et al., 2011).

Figura 4 Esquema de uma TALE nuclease genérica. A proteína que constitui a DBD do

complexo apresenta sequências repetidas, em que dois resíduos hipervariáveis, normalmente

nas posições 12 e 13 do domínio em destaque, efetuam o reconhecimento de bases

nitrogenadas do DNA (NI – A; NG – T; HD – C e NN/NH – G). Uma timina precede a

primeira base associada à repetição da TALE. A FokI encontra-se em um domínio não-

específico para realizar a clivagem e introduzir DSBs no DNA. Para que isto ocorra, as

TALENs devem atuar como dímeros.

2.4 Sistema CRISPR-Cas9

O sistema CRISPR (em inglês, clusteres regularly interspaced short palindromic

repeats)-Cas9 (em inglês, CRISPR-associated 9) consiste num dos sistemas mais simples e

eficientes de aplicação para edição genômica (HAEUSSLER e CONCORDET, 2016). Neste

sistema, DSBs podem ser geradas pela associação da Cas9, uma endonuclease, com o

CRISPR RNA (crRNA) e o crRNA de ativação em trans (em inglês, trans-activating crRNA,

tracrRNA) (Figura 5A). Jinek e colaboradores demonstraram que a Cas9 pode ser programada

com a incorporação de um RNA sintético como transcrito único, quimérico, o sgRNA (em

inglês, single guide RNA), para clivar sequências de DNA de interesse. O sgRNA consiste

nos crRNA e tracrRNA hibridizados com uma ponte GAAA os unindo (JINEK et al., 2012)

(Figura 5B).

A Cas9 apresenta dois domínios característicos com função de nuclease: a RuvC e a

HNH. O domínio da RuvC apresenta três subdomínios (I-III), em que RuvC I encontra-se na

porção amino-terminal da Cas9, e RuvC II/III circundam o domínio HNH próximo à região

central da proteína. Quando esta não se encontra associado ao DNA alvo ou ao RNA, a

endonuclease se autoinibe, com o domínio da RuvC bloqueando o da HNH (JINEK et al.,

2014). Ademais, a Cas9 está atrelada exclusivamente com o locus da CRISPR do tipo II, o

qual é subdividido em três subtipos (IIA-C). Ao passo que o tipo de locus da CRISPR indica o

tipo de gene da cas, de arranjos de CRISPR e tracrRNA, o subtipo revela a arquitetura e

organização de cada locus da CRISPR. Os loci da CRISPR do tipo II normalmente

apresentam genes da cas9, ca1 e cas2. Os subtipos IIA e B apresentam quatro genes cas, e o

IIC apenas três (CHYLINSKI et al., 2013). Uma característica marcante do sistema Cas9 é o

motivo adjacente ao protoespaçador (em inglês, protospacer adjacent motif, PAM), o qual

flanqueia o terminal 3’ do DNA-alvo e consititui o mecanismo de busca da proteína,

reconhecendo sequências de DNA. Embora o PAM seja específico para cada ortólogo de

Cas9, sua especificidade pode ser modificada com domínios flexíveis como 5’-NGG-3’ (HSU

et al., 2014; NISHIMASU et al., 2014).

O sistema CRISPR-Cas9 pode induzir DSBs a serem reparadas por NHEJ ou HDR. A

aplicação de tal sistema mostra-se promissora, quer para criar novos modelos animais para

experimentação, quer para novas possibilidades de terapias. Long e colaboradores

demonstraram que o uso do sistema CRISPR-Cas9 poderia ser utilizado para a remoção de

um exon de distrofina incorreto, possibilitando o tratamento da distrofia muscular em

camundongos (LONG et al., 2016). Averiguam-se ainda as probabilidades de tratamento com

tal sistema para as doenças de Huntington, associada com a expansão poliQ, e de Parkinson,

que pode estar associada com o gene da α-sinucleína mutante (YANG et al., 2016). Tal

sistema apresenta diversas vantagens em relação às outras nucleases programáveis. A Error!

Reference source not found. compara vantagens e desvantagens entre os sistemas de edição

genômica discutidos nesta revisão.

Figura 5 Representação do sistema CRISPR-Cas9. (A) O sistema nativo CRISPR do tipo II

envolve a Cas9, uma endonuclease, e duas pequenas sequências de RNA: crRNA (CRISPR

RNA) e tracrRNA (trans crRNA) para mediar a clivagem em regiões específicas do DNA e

promover DSBs. (B) As duas sequências de RNA podem ser unidas em um RNA quimérico

tracrRNA:crRNA unidos por uma ponte GAAA e formando o sgRNA (single guide RNA),

que pode ser sintetizado, de forma a permitir o reconhecimento do sistema a partir de uma

região de 20 nucleotídeos de DNA.

Tabela 1 Quadro comparativo das nucleases programáveis (ZFNs, meganucleases, TALENs

e sistema CRISPR-Cas9), expondo vantagens e desvantagens de cada uma.

Nucleases programáveis Vantagens Desvantagens

ZFNs As DSBs originadas

podem ser usadas para

reparar o genoma por NHEJ

ou HDR. Podem ser

aplicadas em células

somáticas ou células-tronco

pluripotentes.

O desenho é caro e

trabalhoso e requer o uso de

regiões ricas em guanina

(GNN), que ocorrem

raramente na maioria dos

alvos desejados

(BITINAITE et al., 1998).

Meganucleases A menor classe de

nucleases sintéticas,

podendo facilitar seu

transporte. Proporciona a

formação de um gancho na

fita 3’ propício para o reparo

por HDR.

Difícil de separar os

domínios de clivagem das

DBDs. A funcionalidade de

tais nucleases está mais

associada com correção de

genes mutados.

TALENs Similar às ZFNs, as DSBs

originadas podem ser usadas

para reparar o genoma por

NHEJ ou HDR, mas o

domínio da FokI não é

específico e a DBD é mais

customizável.

Dificuldade de se construir

plasmídeos que codifiquem

TALENs, devido ao

tamanho do complexo.

CRISPR-Cas9 O sistema é de simples

confecção e escalonamento,

além de não ser tão caro.

Sistemas de reparo pela

NHEJ e HDR podem ser

explorados.

Pode induzir a mutações e

rearranjos fora do alvo

desejado. Levando a

preocupações quanto a sua

aplicabilidade terapêutica

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As ferramentas de edição genômica, como as nucleases programáveis, trouxeram grandes

facilidades e inovações no âmbito da engenharia genética. Busca-se, assim, aprimorar e

enriquecer o arsenal de modelos de doenças, para que estas sejam melhor compreendidas e

prevenidas. Por outro lado, a busca por novas formas terapêuticas também é um objetivo e a

manipulação das ferramentas de edição genômica permite que seja possível grande

flexibilidade para a busca por novos tratamentos.

Agradecimentos

O autor agradece à sua orientadora, professora Ana Carolina Viegas Carmo, e ao Centro

de Pós-Graduação Oswaldo Cruz.

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as caracterÍsticas dos mecanismos e sistemas de...

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