BAB IIPEMBUATAN ASAM SITRAT MENGGUNAKAN Aspergillus nigerI. TUJUAN1. Membuat Asam Sitrat menggunakan Aspergilllus niger2. Untuk mengetahui bagaimana Asam Sitrat terhadap penyediaan media yang berbedaII. DASAR TEORIAsam sitrat adalah asam organik yang secara alami terdapat pada buah-buahan seperti jeruk, nenas, pear, pisang, dan lain-lain. Asam sitrat pertama kali diekstraksi dan dikristalisasi dari buah jeruk, sehingga asam sitrat hasil ektraksi dari buah-buahan ini dikenal sebagai asam sitrat alami. Wehner (1893) pertama kali melaporkan produksi asam sitrat sebagai hasil sampingan pada fermentasi produksi asam oksalat dengan menggunakan Penicillium glaucum. Tahun 1917, Currie juga melaporkan bahwa Aspergillus niger dapat menghasilkan asam sitrat pada medium pH rendah dengan kadar gula tinggi. Sejak saat itu asam sitrat diproduksi secara komersial dengan menggunakan kapang A. niger.Kapang A. niger merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh dan banyak digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan beberapa enzim seperti pektinase dan amilase (Broekhuijsen et al. 1993; Okada 1985). A. niger mampu mensintesis asam sitrat dalam medium fermentasi ekstraseluler dengan konsentrasi yang cukup tinggi, jika dibiakkan dalam media yang kadar garamnya rendah dan mengandung gula sebagai sumber karbon (Hang et al. 1977; Ji et al. 1992). Asam sitrat (C6H8O7) banyak digunakan dalam industri terutama industri makanan, minuman, dan obat-obatan. Kurang lebih 60% dari total produksi asam sitrat digunakan dalam industri makanan, dan 30% digunakan dalam industri farmasi, sedangkan sisanya digunakan dalam industri pemacu rasa, pengawet, pencegah rusaknya rasa dan aroma, sebagai antioksidan, pengatur pH dan sebagai pemberi kesan rasa dingin. Dalam industri makanan dan kembang gula, asam sitrat digunakan sebagai pemacu rasa, penginversi sukrosa, penghasil warna gelap dan penghelat ion logam. Dalam industri farmasi asam sitrat digunakan sebgai pelarut dan pembangkit aroma, sedangkan pada industri kosmetik digunakan sebagai antioksidan (Bizri & Wahem 1994). Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus kreb (siklus asam trikarboksilat). Lintasan reaksi katabolik yang mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah lintasan glikolisis dan lintasan Entner-Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam piruvat yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar (80%) dari glukosa diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami dekarboksilasi dan berikatan dengan koenzim-A membentuk asetil-CoA dan selanjutnya masuk kedalam siklus krebs untuk bergabung dengan oksaloasetat membentuk asam sitrat. Piruvat juga bisa langsung masuk ke siklus krebs dengan bantuan enzim piruvat karboksilase yang mengubah piruvat menjadi oksaloasetat. Pada A. niger, fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat (tanpa melalui piruvat) oleh enzim fosfoenol piruvat karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan ATP sebagai sumber energi, Mg2+, atau Mn2+, dan K+, atau NH4+. Judoamidjojo & Darwis (1992) menyatakan bahwa apabila sumber karbon bukan glukosa, misalnya asam asetat, atau senyawa alifatik berantai panjang (C9 C23), maka isositrat liase akan terinduksi sehingga isositrat diubah menjadi glioksilat, selanjutnya glioksilat diubah menjadi malat oleh sintetase. Bila glukosa ditambahkan siklus tersebut akan terhambat. Asam sitrat merupakan metabolik primer, seperti halnya pertumbuhan mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dalam fermentasi dibatasi oleh ketersediaan beberapa unsur kelumit (P, Mn, Zn). Peranan ion logam dalam proses ini belum diketahui secara menyeluruh. Nilai pH optimum sekitar 1,7 2,0. Jika pH lebih tinggi (alkalis) menyebabkan pembentukan asam asam oksalat dan glukonat dalam jumlah banyak. Karenanya pengendalian kondisi proses secara cermat merupakan prasyarat untuk mempertahankan keteraturan metabolik dan mendukung pembentukan asam sitrat yang lebih banyak. Kondisi yang sesuai tersebut memungkinkan stimulasi glikolisis untuk penyediaan aliran karbon yang tidak terbatas ke dalam metabolisme antara. Akumulasi sitrat selanjutnya tergantung pada pemasokan oksaloasetat.(Mangunwidjaja & Suryani 1994).Proses fermentasi asam sitrat dapat dilakukan dengan sistem terendam, fermentasi kultur permukaan. Fermentasi kultur terendam dibagi dua yaitu pada fermentor berpengaduk dan pada air lift fermentor. Sedangkan pada fermentasi kultur permukaan dapat menggunakan media cair maupun media padat. Fermentasi sistem terendam lebih sulit dilakukan dibandingkan prosedur permukaan, tetapi dapat dilakukan secara curah, proses curah terumpani, atau sinambung. Fermentasi curah digunakan untuk substrat glukosa, dan curah terumpani lebih layak diterapkan untuk untuk tetes tebu. Biakan sinambung mempunyai produktivitas yang lebih tinggi (Mangunwidjaja & Suryani, 1994). Reaksi Pembuatan Asam Sitrat dan Permuniannya meliputi :a. Reaksi Pembentukan(C6H10O5)n(s) + nH2O(l) C12H22O11(s) KarbohidratsukrosaC12H22O11(s) + H2O(l) C6H12O6(s) + C6H12O5(s) Glukosafruktosa C6H12O6(s) + O2(g) C6H8O7(s) + 2 H2O(l)Asam sitrat

b. Reaksi Permunian2C6H8O7(s)+3Ca(OH)2(l) Ca3(C6H5O7)2(s) + 6 H2O(l)Ca. SitratCa3(C6H5O7)2(s) +3H2SO4(l) 3CaSO4(s) +2C6H8O7(s)Ca. SulfatAs. Sitrat

C6H8O7(s) + 3 NaOH (l) Na3(C6H5O7)(s)+3 H2O(l)Na. Sitrat Hal-Hal yang Berpengaruh :a. Waktu 7 hari adalah optimum, bila kurang dari 7 hari, bahan baku belum terfermentasi semua. Bila lebih mungkin asam sitrat berubah menjadi asam oksalat.b. Mikroba : Pada percobaan ini digunakan jamur Aspergillus niger. Keuntungan dari penggunaan jamur ini adalah penanganannya mudah, dapat digunakan bahan baku yang murah, yield tinggi dan konsisten, serta ekonomis.c. Jangan menaruh petri dalam keadaan keadaan terbalik, karena percobaan dalam surface culture.d. Konsentrasi gula awal : Konsentrasi gula awal menentukan yield asam sitrat dan asam organik lain. Untuk Aspergillus niger adalah 15-18%, jika lebih dari 18% tidak ekonomis dan jika kurang dari 15% terbentuk asam oksalat.e. pH Pengaturan pH sangat penting dalam fermentasi. Ini disebabkan pada pH tertentu, sterilisasi mudah dilakukan. Sterilisasi mula-mula dilakukan pada pH 2,2 atau lebih rendah. Sebagai pengatur digunakan asam klorida. Sedang pH yang baik 3,4 - 4,5. Pada pH tinggi dihasilkan asam oksalat. Untuk kondisi tertentu (misal percobaan) kadang akan menghasilkan enzim yang hanya berfungsi mengubah karbohidrat menjadi asam sitrat. Untuk kondisi lain akan dihasilkan enzim yang lain pula.f. Pemberian Oksigen : Pemberian oksigen yang terlalu banyak menimbulkan efek merugikan bagi hasil asam sitrat. Sebaliknya, bila pemberian oksigen terlalu sedikit akan kurang menguntungkan. g. Suhu : Suhu yang baik adalah 26 28o. Jika lebih dari 30o C, keasaman naik dan akibatnya ada asam oksalat.

h. Komposisi Media FermentasiTabel 2.1 Komponen Media FermentasiKomponenKuantitas (gr/l)

Sukrosa125-150

Ammonium Nitrat2,0-2,5

Pottasium Dihidrogen Phospat0,75-1,0

Magnesium Sulfat0,20-0,25

HClUntuk pengaturan pH

Pada umumnya hasil samping pertanian dan perkebunan seperti jerami padi, onggok, bagas, dan kulit kakao masih mengandung lignoselulosa. Limbah ini masih mengandung pati, protein, lemak, dan senyawa kimia lainnya. Dengan teknologi fermentasi, hasil samping ini dapat dimanfaatkan lebih lanjut menjadi produk lain yang berguna seperti pangan, pakan ternak, pelarut organik, asam-asam organik seperti asam sitrat dan lain-lain (Judoamidjojo et al. 1989).III. PROSEDUR KERJA1. Alata. b. Petridishc. Beaker Glassd. Enlemeyere. Gelas Ukurf. Pipet Volumeg. Inkubatorh. Oven i. Kain Blancuj. Kertas Saringk. Pompa Vakum l. Termometerm. Kompor Listrikn. Labu Takaro. Spatulap. Pengaduk Kacaq. Corong Pemisah r. Gelas Arlojis. Neraca Analitik2. 3. Bahana. Sumber Karbohidrat ( pisang )b. Bekatulc. Sekam Padid. Ureae. KH2 PO4f. Aspergillus nigerg. Ca (OH)2 h. H2SO4 i. NaOHj. Aquades

4. Gambar Alat Beaker Glass

PetridishEnlemeyer

InkubatorPipet VolumeGelas Ukur

Pompa VakumTermometerKertas Saring

Oven

Labu TakarNeraca Analitik

Kompor Listrik

SpatulaPengaduk Kaca

Corong Pemisah

Gelas ArlojiBall Filler

Kain Blancu

5. Skema Kerjaa. Pembuatan Biakan Kapang Siapkan media Buat biakan Aspergillus nigerInkubasiLarutkan spora dengan air steril28o C atau 30o C2 4 hari

Gambar 2.1 Skema pembuatan biakan kapang

b. Penyimpanan Media 1) Fermentasi pada Media Semi Padat Tutup kembali dengan alumunium foil Aduk hingga merataInkubasikanselama 3 hari, pada suhu 280C 300CTambah aquades Saring sedikit demi sedikit, max 50 mLMenggunakan pompa vakumFiltrat di uji asam sitratnya Tanami media suspensi spora + 5mL, aduk hingga merata Sumber karbohidrat ( pisang )Kupas dan haluskanTimbang+ aquadesAtur pHSampai lembab Tutup beaker gelas dengan alumunium foilSterilisasi1200C 1210CBiarkan pada suhu kamar + urea, sekam padi, bekatul, MgSO4.7H2O

Aduk hingga homogen

Gambar 2.2 Skema Fermentasi pada Media Semi Padat

2) Fermentasi pada Media CairSumber karbohidrat (pisang)Di timbang+ aquades 100 mL Tutup dengan alumunium foilSterilisasi Selama 15 menit, pada suhu 1210CDinginkanTanami suspensi spora + 5 cc, secara aseptikInkubasi28 300CSaringMenggunakan blancuFiltrat di uji asam sitratnya

Gambar 2.3 Skema Fermentasi pada Media Cair

Analisa Hasil Panaskan filtrat Larutan Ca(OH)2+ 10 mL Timbul EndapanSuhu 700CCepat cepat disaring Endapan dicuciDengan air panas 700CDi oven Selama 3 jam, pada suhu 600CDitimbang Larutkan dengan H2SO4 encer Atur pH

Gambar 2.4 Skema Analisa Hasil

IV. HASIL PENGAMATANTabel 2.1 Data Pengamatan Asam SitratLangkah KerjaHasil Pengamatan

Menyiapkan daging buah pisang yang telah dihaluskan, diperas hingga sedikit keringBeaker Glass 1 = 40 gram pisang + 7,5 gram gula pasir + 5 gram katul + 6 gram urea + 0,5 gram sekam padi + 0,0125 gram MgSO4 + sedikit aquades, hingga sedikit becek Beaker Glass 2 = 40 gram pisang + 7,5 gram gula pasir + 5 gram katul + 6 gram urea + 0,5 gram sekam padi + 0,0125 gram MgSO4 + 100 mL aquades Mengatur pH Menutupi beaker gelas dengan alumunium foil Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 120 0C

Penanaman spora Melakukan Aspergillus niger dalam petridis dengan air hangat sebanyak 5 mLSpora dituangkan kedalam masing masing medium dan diaduk merata

Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28 30oC

Menambahkan 50 mL aquades kedalam beaker gelas 1 (medium semi padat)

Pengeringan dengan kain blancu

Inkubasi selama 4 hari

Penyaringan dengan kain blancu kemudian buncher

Pelarutan dengan (Ca(OH)2) dalam keadaan filtrat panas 70oC Dilanjutkan penyaringan dengan buncher

Pencucian dengan air panas Pencucian dilakukan dengan menyaring medium menggunakan kertas saring kemudian dilanjutkan dengan penyaringan corong buncher

Oven pada suhu 60oC selama 3 jam

Membuat H2SO4 encer 0,01 M, 250 mL dari H2SO4 pekat 0,018 M sebanyak 0,13 mL kadar 96% Mengukur pH H2SO4 encer

Melarutkan endapan dengan H2SO4 encer sebanyak 10 mL

Beaker glass 1 : media semi padat larutan berwarna coklat becek

Beaker glass 2 : media cair Larutan berwarna coklat encer

pH diatur sekitar 4-6

Beaker glass 1 : medium menjadi memadatBeaker glass 2 : medium menjadi memadat Warna menjadi coklat tua Spora melarut, tampak bintik bintik hitam tersebar merata di petridish yang berisi air

Beaker glass 1 : Coklat tua Beaker glass 2 : Coklat tua Medium memadat, kandungan air semakin meresap kedalam medium.Medium menjadi encer dan lembab

Dihasilkan filtrat : Beaker glass 1 : 50 mLBeaker glass 2 : 30 mL Warna coklat pekat

Beaker glass 1 : Berwarna coklat pekat dan mengental Beaker glass 2 : berwarna coklat pekat

Dihasilkan endapan :Beaker glass 1 dan 2 : endapan coklat muda dan tua Terbentuk endapan Beaker glass 1 : endapan coklat muda Beaker glass 2 : endapan coklat tua

Air panas yang digunakan air steril dengan kondisi 700C Dihasilkan endapan Beaker glass 1 : endapan berwarna coklat muda Beaker glass 2 : endapan berwarna coklat tua Hasil endapan pada beaker glass 2 (medium cair) lebih banyak dari pada hasil beaker glass 1 (medium semi padat)

Endapan menjadi kering dan bebas air Hasil endapan kering yang didapat :Media semi padat = 0,08 gram Media cair = 0,26 gram

pH = 1

Beaker glass 1 : endapan melarut, pH = 2 Beaker glass 2 : endapan melarut, pH = 3

Berdasarkan pengukuran yaitu pada medium semi padat, pH = 2 pada medium cair pH = 3 dan pH awal yaitu pH asam sulfat = 1, tampak terjadi perubahan pH.Maka dapat disimpulkan bahwa telah dihasilkan asam sitrat dari fermentasi Aspergillus niger dengan kuantitas lebih besar produksi asam sitrat dengan medium cair.

V. PEMBAHASANSumber karbohidrat yaitu buah pisang yang akan digunakan sebagai medium fermentasi Aspergillus niger dihaluskan terlebih dahulu dan dikeringkan hingga berkurang kandungan airnya. Pisang yang dihaluskan atau diperkecil ukurannya ini bertujuan untuk memperbesar luas permukaan kontak aspergillus niger terhadap substrat (buah pisang).Penambahan nutrisi-nutrisi pisang, gula pasir, bekatul, urea, sekam padi, MgSO4 dan aquades dalam pembuatan medium asam sitrat berfungsi untuk memenuhi kebutuhan asupan nutrisi dalam komponen fermentasi. Seperti dijelaskan dalam Tabel 2.1, kuantitas sukrosa dapat diperoleh dari gula pasir dan dari buah pisang itu sendiri. Kuantitas ammonium nitrat dapat diperoleh dari penambahan bekatul, urea dan sekam padi. Sedangkan Magnesium Sulfat juga ditambahkan HCl digunakan untuk pengaturan pH. HCl ditambahkan apabila hasil pengecekan derajat keasamannya berada di atas angka 6.Tabel 2.1 Komponen Media FermentasiKomponenKuantitas (gr/l)

Sukrosa125-150

Ammonium Nitrat2,0-2,5

Pottasium Dihidrogen Phospat0,75-1,0

Magnesium Sulfat0,20-0,25

HClUntuk pengaturan pH

Selanjutnya adalah pengecekan derajat keasaman (pH) pada medium pertumbuhan asam sitrat. Untuk produksi asam sitrat diperlukan pH sekitar 4-6. pH yang rendah akan mengurangi resiko kontaminasi pada saat fermentasi oleh mikroorganisme lain. pH yang rendah juga akan menghambat produksi dan asam organik yang tidak diinginkan seperti asam oksalat.Langkah selanjutnya adalah sterilisasi. Sterilisasi dilakukan untuk membebaskan alat atau bahan medium asam sitrat dari segala macam kehidupan atau kontaminasi oleh mikroba. Jenis sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi menggunakan autoklaf. Sebelum sterilisasi beaker glass ditutup dengan alumunium foil yang bertujuan untuk menghindarkan pengaruh dan kontaminasi dari udara luar.Aspergilus niger yang akan digunakan dari kultur yang diperoleh dari hasil pembiakan Aspergillus niger murni pada media agar miring. Aspergillus niger kemudian dilarutkan dalam air hangat sebanyak 5 ml untuk mensterilkan biakan Aspergillus niger yang akan digunakan dalam fermentasi.Setelah biakan spora ditanamkan pada kedua medium, tahapan berikutnya adalah inkubasi. Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme Aspergillus niger yang telah diinokulasikan pada media (padat atau cair), kemudian disimpan pada suhu 28-30 oC dalam inkubator untuk dapat melihat pertumbuhannya dan perkembangbiakannya. (Anonim, 2009)Aspergillus niger dalam pertumbuhannya berhubungan langsung dengan zat makanan yang terdapat dalam substrat, molekul yang terdapat di sekeliling hifa dapat langsung diserap ke dalam sel. Aspergillus niger dapat tumbuh pada kisaran suhu 29oC-37oC (optimum) dan 6oC-8oC (minimum) serta memerlukan oksigen (O2) yang cukup. Nutrisi-nutrisi dalam medium fermentasi tadi yang akan mempengaruhi produksi enzim selulase yang dapat mengubah komponen disakarida (C12H22O11) menjadi monosakarida (C6H12O6).Setelah dua hari inkubasi, medium dalam kedua beaker glass menjadi berwarna coklat tua dan tampak medium yang memadat serta berkurangnya kandungan air. Maka dilakukan penambahan 50 ml aquades ke dalam beaker glass 1 ( medium semi padat) hingga medium menjadi encer dan lembab. Kemudian disaring atau pompa vakum untuk mengambil filtratnya yaitu asam sitrat.Untuk analisa hasil, filtrat yang diperoleh dipanaskan hingga 70oC. Sementara itu dibuat larutan Ca(OH)2 dengan melarutkan 10 gr Ca(OH)2 dengan aquadest sebanyak 100 ml. Larutan Ca(OH)2 kemudian ditambahkan ke dalam filtrat yang masih dalam kondisi panas. Endapan yang timbul cepat-cepat disaring. Endapan tersebut adalah kalsium sitrat, dengan persamaan reaksi yang terjadi :2C6H8O7 + 3Ca(OH)2 Ca3(C6H5O7)2 + 6H2OKalsium sitrat yang dihasilkan dicuci dengan air panas yaitu air steril 70oC. Hasil endapan dari beaker glass 1 ( medium semi padat ) berwarna coklat muda. Sedangkan endapan dari beaker glass 2 (medium cair) berwarna coklat tua.Kemudian kalsium sitrat tersebut dilarutkan dengan H2SO4 encer 10 ml yang dibuat dengan mengencerkan H2SO4 pekat 0,018 M sebanyak 0,13 ml dengan kadar 96% menjadi H2SO4 encer 0,01 M sebanyak 250 ml. Filtratnya merupakan asam sitrat dan endapannya merupakan kalsium sulfat. Dengan persamaan reaksi :Ca3(C6H5O7)2 (s) +3H2SO4(l) 3CaSO4 (s) + 2C6H8O7 (s)Kalsium sitratAsam sulfatKalsium Sulfat Asam sitratpH awal H2SO4 yaitu 1. Sedangkan setelah pelarutan kalsium sitrat dan H2SO4 terjadi perubahan pH. Yaitu pH = 2 pada medium semi padat dan pH = 3 pada medium cair. Dapat diketahui bahwa telah terbentuk asam sitrat yang merupakan kelompok asam lemah sehingga mampu menurunkan nilai derajat keasaman asam kuat, pH= 1 menjadi pH= 2 dan pH = 3.Kecilnya kuantitas dalam asam sitrat yang terbentuk menyebabkan sulitnya perhitungan rendemen asam sitrat. Namun secara kualitas dapat dikatakan asam sitrat telah terbentuk dengan adanya perubahan derajat keasaman ( pH ) pada tahap pemurnian kalsium sitrat dengan pelarut asam sulfat.Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus kreb ( siklus asam trikarboksilat ). Lintasan reaksi katabolik yang mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah lintasan glikolisis dan lintasan Entner-Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam piruvat yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar ( 80% ) dari glukosa diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami dekarboksilasi dan berikatan dengan koenzim-A membentuk asetil-CoA dan selanjutnya masuk kedalam siklus krebs untuk bergabung dengan oksaloasetat membentuk asam sitrat.Sehingga dapat dianalisis kurang berhasilnya perolehan yield atau rendemen dalam praktikum salah satunya adalah karena faktor konsentrasi gula awal. Konsentrasi gula awal akan menentukan yield asam sitrat dan asam organik lain. Untuk Aspergillus Niger adalah 15 18%. Jika lebih dari 18% tidak ekonomis dan jika kurang dari 15% terbentuk asam oksalat.(Judoamidjojoet, 1989). Konsentrasi gula awal yang terkandung dalam jenis maupun kuantitas pisang yang digunakan belum mencukupi sebagai komposisi media fermentasi atau dapat dikatakan kurangnya bahan utama yaitu buah pisang dalam pembuatan asam sitrat akan menyebabkan minimnya rendemen asam sitrat yang dihasilkan.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN1. KESIMPULAN a. Asam sitrat dapat diproduksi dari sumber karbohidrat seperti buah pisang, dengan fermentasi Aspergillus niger. b. Dalam buah pisang mengandung asam sitrat namun hanya sedikit, pada medium cair larutan membentuk pH 3 yang dimana pH awal 1 sebelum ditambahkan dengan H2SO4. Sedangkan pada media semi padat membentuk pH 2 dimana pH awalnya 1. Kemungkinan asam sitrat yang terbentuk sangat sedikit, sehingga tidak dilanjutkan ketahap titrasi, dan mendapatkan rendemen asam sitrat. 2. SARAN a. Pastikan semua proses berjalan steril, agar tidak ada bakteri lain. b. Tutuplah rapat beaker glass dengan alumunium foil agar tidak ada udara masuk saat sterilisasic. Pada saat mengoven pastikan suhu konstan 28-300C d. Gunakan sumber karbohidrat yang banyak agar memperoleh rendemen yang banyak.

LAMPIRANHasil medium pasca sterilisasiHasil pencucian filtrat dengan air panasHasil filtrat setelah inkubasiHasil pencucian filtrat dengan air panas

Hasil oven endapan asam sitrat dari medium cairHasil endapan asam sitrat dari medium semi padat

DAFTAR PUSTAKA

Mangunwidjaja D. dan A. Suryani. 1994.Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya. JakartaHang Y.D, D.F. Splittstoessitr, R.E.E. Woodams, dan R.M. Sherman. 1977.Citric Acid Fermentation of Brewery Waste. J. of Food Science.42 (2) : 383-388 Judoamidjojo M, E.G. Sa'id, dan L.Hartoto. 1989. Biokonversi. PAU-BIOTEK.IPB. BogorTim Dosen Praktikum Teknologi Bioproses. 2014. Buku Petunjuk Praktikum Teknologi Bioproses. Teknik Kimia FT UNNES: Semarang.Bernasconi, G. 1995. Teknologi Kimia. Jilid 2. Edisi pertama. Jakarta. PT. Pradaya Paramitahttp://renataemily.wordpress.com/2009/11/06/isolasi-inkubasi-dan-inokulasi/ diakses pada 16 April 2014http://khairulanam.files.wordpress.com/2010/08/asam-sitrat.pdf diakses pada 14 April 2014