asociación de

8/17/2019 Asociación De

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Asociación de capn1 y genes cast polimorfismos con la ternura de la carne

en Bos taurus ganado de carne de Argentina

I Departamento de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Mar delPlata, Balcarce, ArgentinaII Área de Gentica, Facultad de Ciencias !eterinarias, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, ArgentinaIII "a#oratorio de Carnes, Facultad de Agronom$a, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, ArgentinaI! Instituto Nacional de %ecnolog$a Agropecuaria, Balcarce, Argentina

ABSTRACTO

"a actividad del sistema proteol$tico calpa$nas & calpastatina est' estrec(amente relacionada con latenderi)ación postmortem de carne* +e investigó la asociación entre la ternura de la carne de polimorismo de

nucleótido -nico .+NP/ marcadores en el gen capn1 .+NP012, alelos C & G3 +NP405 alelos A & G/ y el elencogen región 0 6no traducida .+NP7895, alelos A & G/* %omamos muestras de nueve grupos de sacriicio :uecomprenden 010 novillos :ue (a#$an sido criados en sistemas de producción de carne de vacuno en Argentinaentre 7557 ; 755< de los cruces entre Angus, =ereord ; ganado "imousin* Frecuencias de alelos menores delos marcadores ueron 5,79 a 5,5,18 .A/, ; 5,7< a 5,40 .A/, respectivamente* "a presencia demarcadores capn1 tuvo eectos signiicativos so#re la uer)a de corte de la carne, pero sin eectos detecta#lesse demostró para el marcador CAST. "a uer)a de corte de la carne de novillos con el genotipo CC +NP012era 11? m's #a@a :ue para el genotipo +NP012 CG ; 19? menor :ue para el genotipo GG +NP012* =a#$amu; pocos novillos con el genotipo AA +NP405 ;, al contrario de los estudios anteriores, la carne de novilloscon el genotipo GG +NP405 mostró una uer)a de corte 11,4? superior a la de novillos con el genotipo+NP405 GA* De peso corporal inal, peso de la canal ; el 'rea de costilla no se vieron aectados porcual:uiera de los marcadores* stos resultados apo;an el concepto de :ue las variantes capn1 est'n asociadoscon la ternura a travs de una amplia gama de sistemas de producción de carne de vacuno*

Palabras clave: ganado vacuno, capn1, REPARTO, marcadores genticos, calidad de la carne*

Introducción

!arios marcadores genticos asociados con dierencias en la suavidad de la carne se (an reportado en los-ltimos aos* stos marcadores se dirigen dos genes correspondientes al sistema proteol$tico m's importantedel m-sculo es:ueltico, el gen de proteasa neutra activada por calcio (capn1) :ue codiica la su#unidadgrande de >calpa$na ; el gen calpastatina (CAST) :ue codiica un in(i#idor espec$ico de las calpa$nas.P'gina et al.,75573 White et al, !!"#.. +c(enel et al, !!$). %ecnolog$a marcador gentico es una

(erramienta prometedora para el me@oramiento gentico en el ganado* +in em#argo, los genes individuales noest'n li#res de posi#les interacciones con actores am#ientales :ue podr$an modular su eecto so#re un rasgodado de importancia económica, como sucede cuando se comparan las ra)as ; animales incluso individualesdentro de las ra)as* Por esta ra)ón, los nuevos marcadores de#en ser validados en cada sistema de producciónantes de su uso generali)ado por la industria* sto es especialmente importante en el caso de caracteres decalidad de res, de#ido a las propiedades de la carne de vacuno se ven uertemente aectados por actores nogenticos, como la nutrición animal, la edad ; el peso masacre, mane@o de los animales ; la manipulación dela canal, entre otros*


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"a industria de la carne en la Argentina tiene algunas caracter$sticas -nicas :ue lo dierencian claramente deotros pa$ses* "os consumidores tienen una uerte preerencia por los cortes de carne de #a@o peso, los animales

@óvenes, por:ue asocian estas caracter$sticas con una ma;or pro#a#ilidad de :ue la carne es m's tierna* Comoconsecuencia, el mercado local discrimina a las categor$as m's pesadas de novillos terminados* Adem's, lascanales se vendan poco despus de masacre por lo :ue (a; poco tiempo para el enve@ecimiento de res, un

proceso :ue avorece a#landamiento de carne*

"a ma;or$a de los estudios :ue inormaron eectos signiicativos de cual:uiera capn1 o alelos del elencodesuavidad de la carne se (an #asado en la evaluación de carne vacuna de novillos t$picos de engorda, con laeEcepción de los resultados de Nueva elanda reportados por Morris et al. .7552/* %anto la categor$a deanimales ; la gestión de la carne de vacuno tras masacre se descri#e en la ma;or$a de estos estudios no soncomunes a la industria de la carne en la Argentina* Por lo tanto, el o#@etivo de este tra#a@o ue conirmar laasociación de marcadores en la capn1 ; genes CAST con suavidad de la carne, en el ganado de los sistemas de

producción de carne t$picos de Argentina* Un o#@etivo secundario era producir una evaluación de lasrecuencias de alelos en una po#lación local*

ateriales y !TO"OS

Recursos animales y la información fenot#pica

n este estudio se utili)ó una po#lación #ovina :ue se (a involucrado en varios estudios para evaluar lasestrategias de suplementación ; & o sistemas de cru)amiento en la stación Eperimental del Instituto

Nacional de %ecnolog$a Agropecuaria .Instituto Nacional de %ecnolog$a Agropecuaria .IN%A/, Balcarce,Argentina/* %odos los animales reci#ieron una dieta #asada en la (ier#a :ue se com#inó con dierentessuplementos .granos, (enos ; ensila@es/ para modiicar la tasa de crecimiento ; la duración del per$odo deengorde* %omamos muestras de nueve grupos de sacriicio :ue contienen un total de 010 novillos :ue eran 14a 18 meses de edad ; se (a#$a criado entre 7557 ; 755< .%a#la 1/* "a decisión de pro#ar esta po#lacióneEperimental en lugar de otras po#laciones de ganado comercial se #asa en la disponi#ilidad de inormaciónenot$pica conia#le en trminos de gestión ; los antecedentes genticos de los animales* "os novillos

pertenec$an a dierentes grupos genticos e inclu;eron pura ra)a %os taurus Angus ; =ereord novillos de losre#aos eEperimentales mantenidos en la stación de Balcarce, con otros novillos procedentes de un es:uemade cru)amiento rotacional entre las mismas ra)as* "as (em#ras de la po#lación mesti)a originales se

dividieron en dos grupos :ue ueron recurrentemente acoplado a Angus o =ereord toros* n el momento en:ue se llevó a ca#o este estudio, la proporción de cual:uiera de los genes Angus o =ereord en cada grupo uede 85? o superior* %am#in (u#o F 1cru)as Angus>=ereord & =ereord ; Angus retrocru)amientos rec$procas; un grupo de novillos producida por el apareamiento de "imousin (%. taurus) toros de Angus>=ereord vacasmesti)as ."/* %odos los animales proven$an de los re#aos mantenidos en el IN%A con la eEcepción de lostoros "imousin, :ue se compraron en ranc(os privados* Con el in de (acer posi#le una estimaciónaproEimada de las recuencias allicas, los novillos ueron agrupados de la siguiente maneraH novillos :ueueron al menos 94? Angus .A/, novillos :ue ueron al menos 94? de =ereord .=/, Angus>=ereord.A=/ novillos ; "imousin ."/ novillos mesti)os* "a estructura gentica de la muestra se detalla en la %a#la1*

Cada grupo contempor'neo ue sacriicado en un matadero privado, cuando al menos el 45? de los novillosen un determinado grupo ten$a un espesor de grasa dorsal .BF%/ de 4 mm entre los 17 ; 10 costillas, estimadas

por medidas de ultrasonido* Peso inal en vivo corporal .PC/ ; el nervio 'rea de los o@os .A, estimado porecogra$a/ se registraron antes de masacre* n el momento de la masacre, con una media de peso vivo ue de007 J 00 g ; espesor de grasa dorsal ue de 4,7 J 1,4 mm como promedio entre los grupos de sacriicio* "oscad'veres ueron pesados ; el peso de la canal caliente .%+/ registran ; luego se coloca en un rerigeradordurante 7< (oras a 4 K C sin estimulación elctrica anterior, despus de lo cual un #lo:ue de iletescorrespondiente a los 11, 17 ; 10 L costillas ue retirado de cada canal r$a ; se mantuvo a >75 K C (asta :ue sedescongelaron para el estudio* Determinaciones anal$ticas se llevaron a ca#o en la Universidad de BuenosAires Carne de la#oratorio* +uavidad de la carne se estimó indirectamente como uer)a de corte arner>Brat)ler .B+F/ medido en muestras tomadas del m-sculo &on'issius luar. Filetes .7,4 cm de espesor/se descongelaron durante la noc(e a temperatura am#iente durante 7< ( ; la grasa eEterna, te@ido conectivo

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peririco ; otros m-sculos ueron retirados de cada ilete ; las muestras se colocaron en #olsas de pl'stico:ue luego se sumergieron en un #ao de agua a 95 K C durante 45 min* "os iletes cocidos se enriaron conagua corriente durante 1* Una -nica medición de uer)a pico de ci)allamiento se o#tuvo paracada n-cleo ; estos resultados se promediaron para o#tener un -nico valor B+F para cada muestra*

arcadores y genotipado

Para cada muestra, se aisló el ADN de una muestra de 125 mg retirado de los iletes congelados siguientes los procedimientos est'ndar de Maniatis et al. .187/, eEcepto para el uso de un tampón de lisis celularmodiicada .mM %ris>=Cl 45, 74 mM D%A p= 9,4, N>laurilsarcosina 7? .O & v/, 5,54 M D">ditiotreitol/* Despus de DNA con enol & cloroormo ; precipitación con etanol se resuspendió en 15 mM %ris=Cl*

+e (an utili)ado dos marcadores en el gen capn1 descrito previamente .P'gina et al., 7557/, :ue (a#$a sidonom#rado de acuerdo con la posición de las sustituciones de amino'cidos producidos por cada polimorismo

de un solo nucleótido .+NP/ como +NP012 .alelos C & G/ en capn1 el eEón ; +NP405 .alelos A & G/ en eleEón 1


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%%%%AAAAA%%GCC%%CAG%%GGGAG ce#adores AA% .(acia adelante/ ;AAGAAACA%CAAACACAG%CCACAAG%C%A .inversa/* l producto de PC se digirió con la en)ima derestricción Tsp 45I :ue distingue los alelos alternativos .A & G/* "a PC>F"P de ampliicación, la digestión; la electrooresis procedieron como se (a descrito anteriormente, eEcepto :ue la temperatura de (i#ridaciónue 27 K C*

An$lisis estad#stico

"as recuencias allicas se compararon mediante an'lisis de c(i>cuadrado* "os datos B, =C, A ;B+F se anali)aron mediante un modelo :ue inclu;ó los eectos i@os de grupo de marcadores genticos ; desacriicio ; el marcador E interacción grupal masacre gentica* Para el an'lisis de B+F, contenido en

porcenta@e de l$pidos en la carne .media 7,91 general J 1,


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Para el +NP7895 REPARTO recin descu#ierto, el grupo con un ondo predominantemente Angus .A/ten$an una ma;or recuencia del alelo A, mientras :ue lo contrario era cierto para el grupo con sede en=ereord .=/*

Anali'a Asociación

No (u#o un eecto signiicativo de am#os los polimorismos capn1 +NP012 ; +NP405 en B+F .%a#la0/* Para +NP012, el valor B+F para el genotipo CC era 15? m's #a@a :ue para el genotipo CG ; 1


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en este lugar se espera :ue sea m's avora#le a la ternura* "a eEtensión de la genotipiicación para incluir elnuevo +NP en uturos estudios, @unto con la deinición de (aplotipos, podr$a permitir una me@or clasiicaciónde las canales en trminos de su B+F* Ninguna prue#a ormal de la causalidad (a sido presentada porcual:uiera de los polimorismos descritos en capn1. "a uer)a de su asociación estad$stica con sensi#ilidaddepende del grado de vinculación con un polimorismo :ue aecta a la actividad de la calpa$na putativo, a-n

por descu#rir* l conocimiento actual sugiere :ue el alelo C en +NP012 tiene el m's uerte dese:uili#rio deligamiento con el alelo ternura putativo* Por lo tanto, una #uena deinición de (aplotipos podr$a a;udar en laidentiicación de los gametos :ue llevan el alelo avora#le del polimorismo real :ue aecta a la ternura decarne*

l +NP7889 en el gen REPARTO corresponde a la #ase de 7*895 en el GenBan AF147


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RESUMEN En la producción de carne para consumo humano, una de lascaracterísticas más importantes del producto para los consumidores es laterneza de la carne, la cual posee un componente genético asociado, genesque codifcan las enzimas que participan en el proceso de degradación de lacarne en el postmortem que pueden su!rir cam"ios en sus secuencias, deltipo polimorfsmo de un solo nucleótido #SN$%, que generan cam"ios en estas

enzimas por ende cam"ios en la característica del producto& Este hecho, hacemu importante el tener una herramienta de detección efciente rápida deestas 'ariaciones genéticas& Muestras de semen de toros procedentes delcatálogo de inseminación artifcial de (N)*$, +- muestras de te.ido deno'illos hí"ridos de /agu, !ueron sometidas a e0tracción de )N*,compro"ando la e!ecti'idad de ésta mediante medición de concentración de)N* en espectro!otómetro& Se implementó una técnica de reacción depolimerasa en cadena alelo específca #*S 1 $2R%, la cual !ue aplicada a lasmuestras con alta concentración de )N* e0traído, utilizando partidoressintetizados para los SN$ 2*$N3 1 435, 2*$N3 1 64 2*S7 1 +868& 9osresultados del *S 1 $2R !ueron confrmados con secuenciación de 'ariasmuestras& 9a e0tracción de )N* !ue más e!ecti'a en las muestras de te.ido de

no'illos /agu que en las muestras de semen, pro"a"lemente por el estado deconser'ación de la muestra, el grado de condensación del )N* en losespermatozoides la presencia de inhi"idores en el semen& 9a implementación a.uste de parámetros en el $2R se hizo de la misma !orma que lo o"ser'adoen la literatura, o"teniendo resultados similares en !recuencias genotípicas suasociación con el rasgo !enotípico, a estudios pre'ios en el tema& 9asecuenciación de las muestras de.ó en e'idencia la efciencia de la 7aqpolimerasa en la !ase de e0tensión además, identifcó la presencia de unasecuencia e0tra en el alelo 2 de 2*$N 1 435, compati"le con los :directosrepetidos; con el proceso de arrastre de e0ones que ocurren durante larecom"inación genética la e'olución de los genes& 7odos los datos nospermiten concluir que la técnica de *S 1 $2R es una herramienta e!ecti'a para

determinar 'ariaciones del tipo polimorfsmo de un solo nucleótido en genesrelacionados con características de importancia producti'a&

9as enzimas de la !amilia de las calpaínas, son estructuras proteicasheterodiméricas que se componen de una su"unidad catalítica grande de a de +< =)a #?oll et al&, +4%& Se hanidentifcado a lo menos 35 enzimas di!erentes dentro de esta !amilia #@ranco Auttenlocher, +6%, las cuales se clasifcan en típicas o atípicas dependiendode la presencia o ausencia de la su"unidad E@, una estructura compuesta dedos hélices posicionadas en !orma perpendicular enlazadas entre ellas poruna región corta de apro0imadamente 3+ aminoácidos que generalmentetiene como !unción el capturar calcio #Branden 7ooze, 3888% la unión de lamolécula al te.ido del cual procedan& *unque estas enzimas se encuentran entodos los te.idos, 'arían en cuanto a su concentración dependiendo delmicroam"iente celular #?oll et al&, +4%& En el mCsculo estriado las dosiso!ormas más comunes son la m 1 calpaína la D calpaína, enzimas a lascuales no sólo se les relaciona con el proceso de degradación de f"rasmusculares, sino tam"ién en los procesos de apoptosis #*tencio et al&, +%,regulación de ciclos, dispersión #2arragher @rame, ++%, ancla.e, motilidad ein'asión de te.ido por la célula #)edieu et al&, +4%& (ncluso en los procesos de


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miogénesis, .ugando 3 un papel crítico en las etapas tempranas de éste, comolo es en la migración del mio"lasto su !usión para !ormar el miotu"o #9eoupet al&, +5%& 9a secuencia proteica de D calpaína muestra un gran grado desimilitud entre distintos animales, lo cual demostraría la gran conser'ación deésta durante la e'olución de los mamí!eros #Smith et al&, +%& 3&+)ES2R($2(FN )E 9*S 2*9$*GN*S 9a m 1 calpaína la D calpaína son enzimas

cistein proteasas, las cuales dependen de la presencia de calcio #2aH+% para suacti'ación #?oll et al&, +4%& *l determinar su estructura, se descri"ieron hastacuatro dominios enzimáticamente acti'os #$al et al&, +4%& El dominio (corresponde a una I 1 hélice sencilla presente en el N 1 7erminal de algunascalpaínas tendría un papel importante en la esta"ilidad de la proteína& Eldominio (( corresponde a la porción proteolítica de la enzima, con un sitio acti'oconstituido por la triada 2s36, Ais+5+ *ns+a, aparenta tener una estructuramu e0i"le de"ido a que es rica en glicina ésta sería la razón aparente delpor qué esta estructura a di!erencia de los otros dominios, se mantiene

totalmente indesci!ra"le #@ranco Auttenlocher, +6%&

RE9*2(FN EN7RE 2*9$*GN*S O 7ERNEP* )E 9* 2*RNE 9as calpaínas lacalpastatina están estrechamente 'inculadas con el grado de terneza de lacarne, reportándose en mediciones del e!ecto con.unto en la !uerza deresistencia al corte de /arner 1 Bratzler #del inglesQ /arner 1 Bratzler Share@orce, /BS@% en distintas po"laciones, un má0imo de +6,- H 6,6, de'ariación con un promedio general de 36,+ H ,ado como un sistema de medición mecánica de la terneza, medianteel uso de un instrumento con !orma de guillotina que aplica determinados =ilosde !uerza para que el corte de la f"ra muscular sea e0itoso #*MS*, 3886%& Sinem"argo, el e!ecto de estas enzimas so"re la cualidad de terneza dependerátam"ién de otros !actores, como la raza del animal& *nimales de distinta razatendrán distinta cantidad por ende, distinta acti'idad de calpaínas calpastatina, lo cual generará di!erencias en el grado de terneza de la carnepro'eniente de éstos& Este e!ecto no sólo se o"ser'a en animales de una razapura en particular, tam"ién en animales hí"ridos& Un e.emplo de ésto son losestudios realizados en la Uni'ersidad de @lorida en muestras de mCsculo9ongissimus dorsi de animales progenie de la cruza de *ngus con Brahman,demostraron que la acti'idad de la D calpaína disminuía al aumentar el


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porcenta.e de Brahman en la mezcla, en desmedro de la parte *ngus, mientrasque m 1 calpaína se mantenía constante& * la 'ez, 2alpastatina demostró unincremento de acti'idad a medida que aumenta"a el porcenta.e de Brahmanen la muestra& El e!ecto tam"ién se ree.ó en /BS@, presentando unincremento en animales con más porcenta.e de esta raza, so"re la otra #$ringleet al&, 388-% #7a"la 3%&

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