aspek aplikasi kckt kg
TRANSCRIPT
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 1/8
2013/4/
Aspek Aplikasi dan review
KCKT & KGIrmanida Batubara
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 1
Kromatografi Metode fisik untuk pemisahan dengansenyawa yang akan dipisahkah terdistribusidiantara dua fase yaitu fase diam dan fasegerak dengan arah yang pasti (Definisi IUPAC
1993)
Jenis kromatografi
1. Kromatografi kolom
2. Kromatografi kertas
3. Kromatografi lapis tipis
4. Kromatografi gas-cair
5. Kromatografi cair kinerja tinggi (tekanan tinggi)
Review
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen yangmerupakan suatu tipe kesetimbangan dimana komponen-komponen
akan terbagi diantara fase diam dan fase gerak
K = koefisien partisi/distribusi
CS = konsentrasi analit dalam fase diam
CM = konsentrasi analit pada fase gerak
K diinginkan konstan pada berbagai konsentrasi, jika tidak konstan kita
dapat bekerja pada kisaran yang lebih sempit saat K konstan
kromatografi linier
Pada kromatografi linier laju alir yang tetap dari fase gerak bergeraksepanjang kolom K cenderung konstan
Elusi: proses dimana analit akan melewati kolom dibawa oleh fase
gerak (dapat cair atau gas)
M
S
C
CK
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
waktu retensi/retention time (tR):
waktu yang dibutuhkan molekul yang
tertahan pada fase diam untuk
mencapai detektor
waktu mati/dead time (tM): waktu yang
dibutuhkan molekul yang tak tertahan
pada fase diam untuk mencapai detektor
volume retensi: volume fase gerak
yang dibutuhkan untuk menggerakkan
molekul dari saat injeksi hingga
mencapai detektor
Baseline width (w): lebar pita senyawa
yang terukur pada garis dasar
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Faktor Kapasitas
Distribusi solut (S) diantara fase diam dan fase gerak dapat digambarkan
dengan reaksi kesetimbangan:
Sfase gerak Sfase diam
Sehingga akan berhubungan dengan koefisien partisi (KD)dan rasio
distribusi (D)
Selama solut tidak mengalami kesetimbangan dengan fase diam dan fasegerak maka koefisien partisi dan rasio distribusinya akan sama
Mol total solut akan konstan selama proses pemisahan
(mol solut)total = (mol solut)fase diam + (mol solut)fase gerak
totalgerak fase
totaldiamfase
gerak fase
diamfase
D
]S[
]S[D
]S[
]S[K
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
diamfasegerak fase
gerak fasegerak fasetotal
gerak fasegerak fase
diamfasegerak fasetotal
V)solutmol(
V)solutmol()solutmol(
V/)solutmol(
V/])solutmol()solutmol[(D
maka fraksi solut dalam fase gerak (f m):
diamfasegerak fase
gerak fase
total
gerak fase
mVDV
V
)solutmol(
)solutmol(f
Karena volume fase diam dan fase gerak tak dapat diketahui secara pastimaka persamaan di atas dapat disederhanakan dengan membagi pembilang
dan penyebut dengan Vfase gerak yang akan menghasilkan persamaan berikut:
'
gerak fasediamfase
mk 1
1
)V/V(D1
1f
gerak fase
diamfase'
V
VDk faktor kapasitas
Suatu ukuran seberapa kuat solut akan tertahan pada fase diam mengevaluasi pemisahan (optimal, k’= 2-10, tidak baik k’= 1, lambat, k’ < 1)
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 2/8
2013/4/
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Faktor kapasitas solut dapat dihitung dari kromatogram denganmenghitung waktu mati (tM) dan waktu retensi (tR)
Laju alir rerata fase gerak () bernilai sama dengan pembagian antara
panjang kolom (L) dan solut yang tak tertahan pada fase diam (tM)
Dengan alasan yang sama maka laju alir rerata solut (v):
Solut hanya dapat bergerak melewati kolom saat terbawa oleh fase gerak.
Oleh karena itu laju alir reratanya merupakan produk dari laju alir rerata
fase gerak dan fraksi solut yang terdapat pada fase gerak
v = f m
Mt
L
R t
Lv
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Substitusi dari beberapa persamaan diatas maka akan menghasilkan persamaan:
dengan adalah waktu retensi adjusted perbedaan antara waktu retensi
solut dan waktu mati
M
'R
M
MR '
'
MR
t
t
t
ttk
k 1
1
t
L
t
L
'
R t
Dalam analisis kromatografi senyawa asam berbobot molekul rendah, asam
butirat dielusi dengan waktu retenti 7.63 min. Waktu mati sebesar 0.31 min.Tentukan faktor kapasitas untuk asam butirat
K’ = tr -tm/tm
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Selektivitas Kolom
Selektivitas relatif dari suatu kolom kromatografi untuk solut yang
berdekatan dapat dilihat dari nilai faktor selektivitasnya
Faktor Selektivitas rasio antara faktor kapasitas dari dua solut akan
menggambarkan selektivitas kolom untuk salahsatu solut ()
Semakin besar nilai maka pemisahan yang terjadi semakin baik
MA,R
MB,R
'
A
'
B
tt
tt
k
k
dari kromatogram
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Dalam analisis kromatografi untuk asam berbobot molekul rendah sebelumnya,
waktu retensi asam isobutirat ialah 5.98 min. Berapa faktor selektivitas untuk
asam isobutirat dan asam butirat
Pertama tentukan faktor kapasitas untuk asam isobutirat, lalu tentukan
faktor selektivitasnya
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Pelebaran Pita Kromatografi
Pita suatu solut dapat melebar saat bergerak melewati kolom. Salah satupenyebabnya yaitu adanya difusi
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Tailing
Disebabkan oleh adanyasisi aktif yang cukup tinggi
pada fase diam
Fronting
Disebabkan oleh injeksisampel yang terlalu
banyak
Pita kromatogram yang nonideal
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 3/8
2013/4/
Isotherms and their resulting chromatographic band shapes
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Dengan mengkombinasikan persamaan-persamaan di atas makadiperoleh:
Jumlah pelat teoretis
Alternatif lainnya:
w1/2 = lebar pita pada setengah tinggi pita
2
R
2
R
2
w
t16 N
t16
wLH
2
2/1
R
w
t545,5 N
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Dalam analisis kromatografi untuk pestisida terklorinasi Dieldrin didapat puncak
dengan waktu retensi 8.68 min dan lebar baseline 0.29 min. Berapa banyakpelat teoritis yang terlibat dalam pemisahan? Jika kolom yang digunakan untuk
analisis memiliki panjang 2.0 m, berapakah tinggi pelat teoritisnya
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Kelemahan dari Teori Pelat:
1. Dengan asumsi bahwa K tidak dipengaruhi oleh konsentrasi
2. Dengan asumsi bahwa kesetimbangan akan diperoleh relatif cepat
terhadap laju alir fase gerak tidak benar, dalam kenyataannya solutmungkin melewati pelat tanpa memasukinya
3. Dengan asumsi tidak ada difusi longitudinal (= efek non ideal yangakan mempengaruhi pelebaran pita)
4. Tidak memperhatikan beberapa faktor yang dapat disebabkan olehkecepatan laju alir (cepat atau lambat) teori kecepatan
5. Dengan asumsi adanya pelat/unit diskret untuk menjelaskan proseskesetimbangan daripada proses semi kontinyu yang akan melewatikolom
1. Pompa
• Pompa tidak dapat memompa udara. Jika
udara terdapat dalam pompa apakah yang
akan rusak kolom atau pompa?
• Cek selalu: laju alir, tekanan minimum dan
maksimum, keran purge, dan pencampur fase
gerak
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 18
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 4/8
2013/4/
2. Sambungan aliran
• Cek apakah tabung pengalir berada di
tempatnya
• Apakah penyambung terikat kuat?
• Apakah penyambungnya cocok?
• Perhatikan kondisi nut dan ferrule
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 19
3. injektor
• Jangan gunakan jarumyang runcing
• Cuci selalu setelahmenggunakan bufer
• Hindari partikel masukdengan cara menyaringsampel sebelum injeksi
• Jangan gunakan wadahdari logam
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 20
3. injektor: kebocoran
• Bocor antara stator danstator ring
• Bocor pada needle portketika loading saja
• Cairan keluar olehsiphoning out
• Kebocoran terus
menerus pada needleport atau jalur vent
• Lepasnya set screwsatau kencangkan statorscrews
• Kencangkan seal needledengan mendorongdalam guide
• Tepatkan tinggi outlettubes
• Permukaan rotordilepas dan diganti
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 21
3 injektor: volume injeksi
• Jangan menginjeksilebih dari 50% volumeloop karena cairan akanberdifusi
• Mencuci needle porttube: gunakanrekomendasi daripembuat alat
• Cuci saat posisi injek
mengapa?
• Sample loopdicuci/didorong denganfase gerak
• Mengetahui injektorclogged
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 22
3. injektor: Mencuci stator dan stator
face
• Cuci ketika pompa mati,
• Lepaskan hubungan
dengan sample loop
dan ke kolom
• Gunakan syringe,
pompa dengan cairan
bersih (seperti metanol
atau air murni) melalui
ports
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 23
4. Pompa
• Cuci dengan air setelah menggunakan bufer
• Ganti seals pada waktunya
• Cek keran
• Jangan biarkan padatan masuk ke fase gerak
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 24
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 5/8
2013/4/
Kalibrasi
• Mengapa perlu kalibrasi
• Untuk detektor UV-Vis: Ketepatan panjang gelombang,
Keterulangan panjang gelombang, Linearitas absorban,Ketepatan absorban absolut
From column
To waste
Filter with a known
Absorbance(s)
Flow cell
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 25
Kalibrasi
• Mengapa perlu kalibrasi
• Untuk detektor UV-Vis: Ketepatan panjang gelombang,
Keterulangan panjang gelombang, Linearitas absorban,Ketepatan absorban absolut
From column
To waste
Filter with a known
Absorbance(s)
Flow cell
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 26
Kalibrasi
Linearity with a solution
of potassium dichromate,
0.01 to 0.20 mg/mL
Wavelength accuracywith a solution of
Holmium oxide
450 nm
640 nm
410 nm
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 27
Kalibrasi
• Harus ditulis dalamSOP/POB
• Jadwal kalibrasi harusditetapkan dandijalankan
• Semua standar dan alatharus dapat dilacakoleh NIST, seluruh alatelektrik, stopwatch dan
termometer harusdikalibrasi
• Orang yang melakukankalibrasi harusditraining dantrainingnya harusdidokumentasikan
• Seluruh peralatan harusdiletakkan tanggalkalibrasi, orang yangmengalibrasi dan
tanggal kalibrasiselanjutnya
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 28
Kalibrasi
• Lepas hubungan ke
kolom, langsung
sambungkan ke luar
kalibrasi laju alir pompa
menggunakan
stopwatch dan gelas
ukur terkalibrasi
• Kalibrasi injektor: injeksi
10 kali standar,
tentukan rerata luas
puncak dan standar
deviasi dari semua
ulangan, gunakan
volume yang cocok
sesuai dengan sample
loop
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 29
Contoh aplikasi pada industri
farmasi
• Check standar?
• System suitabilitystandar?
• Five-point calibration
• Bagaimana caramelakukan standarinternal
• as convictedcounterfeiter ElsworthRoston once observed
• “Quality is your security.”
• “The most important assets of
any business are intangible: itscompany name, brands,symbols, and slogans, and theirunderlying associations,perceived quality, nameassociations, customer base andproprietary resources such aspatents, trademarks, andchannel relationships.”
• -David Aaker, author of severalbooks on branding including:
• Managing Brand Equity, 1991
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 30
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 6/8
2013/4/
Contoh aplikasi pada industri
farmasi
Manufacturing
• Keseragaman isi
• Degradasi produk dan
senyawa yang
berhubungan
• Disolusi
• Stability studies
Discovery
• Kemurnian dan
konsentrasi
• Potensial redoks
• Konfirmasi struktur
Development and clinical
trials
• Metabolite monitoring
• Half life in the body
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 31 32
Levothyroxine sodium is a synthetic
hormone used to treat thyroid disorders.
Hyperpotent dosage - cardiac pain
palpitations, cardiac arrhythmias,
Increased risk of osteoporosis
Subpotent dosage - depression,
lack of concentration, fatigue, weight gain,
edema, loss of concentration, and constipation
IDEAL DOSAGE LEVEL
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN
33
The Future of Instrumentation and the
FDA: 21CFR11
or…
Is a Paperless Laboratory Really
Practical?
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN
Troubleshooting: baseline noise
A) Selama injeksi terjadimasalah pada fasegerak
B) Dalam sistem terdapatgelembung udara yangmenyebabkan lajuirregular noisesetara dengan laju alir.Atau elektronik noise
pada detektor yangsetara dengan laju alir
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 34
Troubleshooting: masalah
gelembung udara
• Kecepatan poma berubah
secara teratur
• Degas fase gerak
• Prime pompanya lagi
• Lakukan pengecekatan
pompa secara rutin
• Masalah muncul walau tidak
dijalankan KCKTnya
• Cek detektor
• Cek lingkungan seperti sumber
arus, radio
• Apakah suhu kolom seragam?
Fitting failure
Air bubbles in system.
Good, stable baseline
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 35
Troubleshooting: peak fronting &
tailing
Fronting
• Kolom overloaded
• Channels pada fase padat
Tailing
• Intekasi dengan silanol
• Fase diam terdegradasi
• Tidak bersih volume pada void
atau formasinya di awal kolom
• Adanya material yang ikut terelusi
• Tidak cocok analat, fase gerak
dan polaritas kolom
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 36
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 7/8
2013/4/
Troubleshooting: Kolom overload
• Resolusi hilang
• Tailing
• Pelebaran puncak
• Pengurangan waktu
retensi
• Volume injeksi kurang
dari 15% volume
puncak• 0.5min x 0.3ml/min =
0.15ml
• 1uG sampel per cm
panjang kolom untuk
kolom dengan diameter
internal 4.6mm
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 37
Troubleshooting: Matrix overload
• Ketidakmurnian sampel
matrik menyelimuti
packing kolom danmengurangi resolusi
dan waktu retensi
• Terjadi karena sampel
adalah ekstrak dari
cairan biologis
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 38
Troubleshooting: Ghost peaks
• Kontaminasi kolom
• Elusi analat dari running
sebelumnya
• Ganti dan cuci kolom
• Gunakan waktu running
lebih lama, ganti cara
cuci atau gunakan
pelarut yang lebih kuat
pada akhir running
First run Second run
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 39
Troubleshooting: ghost peak atau
noise baseline acak
• Kadang muncul karena
perbedaan pelarut
preparasi dan fase gerak
• Kadang ditemukan
noise baseline acak
yang mirip dengan
ghost peaks, turn the
column around and
flush it
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 40
Troubleshooting: puncak terpecah
• Volume sampel terlalu
besar
• Injeksi terlalu lama
• Blocked column frit
• Unswept injector flowpath
• Siapkan sampel dengan
melarutkannya dalam fasegerak dengan volume total<15% dari puncak pertama
• Gunakan pelarut yang lebihlemah
• Ganti frit, tambahkanpenyaring, saring sampel
• Ganti injektor rotor
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 41
Troubleshooting: drifting baselines
• Terjadi perubahan
seketika baseline saat
pemisahan isokratik
kontaminasi pada
kolom atau detektor
• Perubahan secara
bertahap masalah
detektor
One run Days or weeks
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 42
7/21/2019 Aspek Aplikasi KCKT KG
http://slidepdf.com/reader/full/aspek-aplikasi-kckt-kg 8/8
2013/4/
Troubleshooting: gelembung udara
datang lagi
• Ciri-ciri
• Irregular baseline
• Peningkatan waktu
analisis
• Penurunan tekanan
• Cara mengatasi
• Degas fase gerak
• Gunakan in-line
degasser
• Buka keran purge dan
jalankan sistem
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 43
Troubleshooting: drifting retention
times
• Laju alir berganti (cek
pompa)
• Tidak terkalibrasinyagradien kontroler
• Gelembung udara
• Bocor
• Kolom rusak
• Perubahan komposisi
fase gerak
• Tidak cocoknya
mencampuran fase
gerak• Menguapkan fase gerak
yang volatil
• Tidak cocoknya pH
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 44
Strategi mengurangi waktu analisis
• Kurangi panjang kolom
• Pilih kolom yang pendek dengan partikel size
yang lebih kecil
• Tingkatkan suhu fase gerak
• Tingkatkan laju alir
• Tetap perhatikan resolusinya
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 45
TERIMA KASIH
Kromatografi selesai ……………………..
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 46