Aspirinska intoleranca pri astmatičnih bolnikih

Samo Maglica

V seminarski nalogi je predstavljen matematični model presnove arahidonske kisline, s katerim je  mogoče  preučevati  vzroke za pojav astmatičnega  napada  pri  astmatičnih  bolnikih, kot nezaželenega stranskega učinka zaužitja aspirina in drugih nesteroidnih protivnetnih zdravil. 

Mentor: asist. mag. Andrej Dobovišek

Maribor, 2010

2

Kazalo 1  Uvod ..................................................................................................................................... 3 

2  Presnova arahidonske kisline ............................................................................................... 3 

2.1 Osnove encimske kinetike ................................................................................................ 5 

2.2 Matematični model presnove arahidonske kisline ............................................................ 6 

3  Analiza rezultatov .............................................................................................................. 10 

4  Zaključek............................................................................................................................ 11 

3

1 Uvod Opazovanja, o  katerih  poročajo  v kliničnih  raziskavah [1,2], kažejo,  da  se  pri  10%  do  20% astmatičnih bolnikih 30 min do 60 min po zaužitju aspirina ali katerega drugega nesteroidnega protivnetnega zdravila kot neželen učinek  pojavi astmatični  napad. Ta pojav se imenuje aspirinska intoleranca, astmatični  bolniki pa aspirinsko intolerantni astmatiki (AIA). Razumevanje aspirinske intolerance je iz medicinskega stališča izjemnega pomena takrat, ko je astmatične bolnike potrebno zdraviti z omenjenimi zdravili, npr. pri revmatoidnem artritisu.

Čeprav  je  sam mehanizem  učinkovanja  nesteroidnih  protivnetnih  zdravil že  dobro  znan, pa mehanizma, ki privede do nastanka astmatičnega napada pri AIA, še ne znamo povsem natančno pojasniti. Znano je, da zdravilo učinkuje na celično presnovo arahidonske kisline (AA) v belih krvnih celicah kot so eozinofilci. V teh celicah zdravilo inhibira oz. zavre delovanje encimov prostaglandin sintaz 1 in 2 (PGHS1 in PGHS2) in s tem preusmeri celično presnovo AA po poti, v kateri se tvorijo t.i. cisteinil-leukotrieni (cys-LTs), ki so znani kot snovi, ki povzročajo vnetje. Eksperimentalno  je  potrjeno,  da  je  pri  razvoju  astmatičnega  napada  ključnega  pomena  cistenil leukotrien C4 [3]. Vendar pa je opisan mehanizem značilen  tako  za  astmatike, kakor tudi za neastmatike. Zakaj se torej astmatični napad pojavi le pri 10% do 20% astmatičnih bolnikov? Na to  vprašanje  še  ne  znamo  natančno  odgovoriti, obstajajo  pa  različne  hipoteze zasnovane na eksperimentalnih podatkih, ki poskušajo to pojasniti.

Klinična opažanja na astmatičnih bolnikih kažejo, da  je po zaužitju zdravila koncentracija cys-LTs v urinu AIA kar 2-krat do 10-krat višja kot v urinu aspirinsko tolerantnih astmatikov (ATA) [1]. Po drugi  strani  pa biokemijske  raziskave kažejo,  da  je  ekspresija oz.  totalna koncentracija encima leukotrien C4 sintaza (LTC4S) pri AIA 5-krat višja kot pri ATA [1] in ekspresija encima PGHS2 kar 6-krat nižja  [4]. Prav ti dve eksperimentalno odkriti dejstvi naj bi bili  ključnega pomena pri razlagi aspirinske intolerance. Razlike v koncentraciji teh dveh encimov bi lahko povzročile neprimerno višjo koncentracijo cys-LTs v belih krvnih celicah AIA in s tem tudi večji izpust vnetnih mediatorjev iz celic v kri. To je tudi osrednja hipoteza, ki jo raziskovalci na FNM UM raziskujejo z matematičnim modelom, da bi hipotezo ovrgli ali potrdili.

V seminarski nalogi bom najprej opisal presnovo AA. Nato bom predstavili osnove encimske kinetike in celovit matematični  model  presnove  AA, ter z njim preučeval učinkovanje nesterodinih protivnetnih zdravil na presnovo AA in tvorbo oz. sintezo LTC4. Ob upoštevanju različnih modelnih pogojev bom simuliral stanje aspirinske tolerance oz. intolerance. Rezultate bom predstavili in komentiral v zadnjem poglavju.

2 Presnova arahidonske kisline Arahidonska kislina je  esencialna maščobna  kislina,  ki  se  nahaja  v  celičnem  tkivu  človeškega telesa. Presnova AA poteka po dveh poteh, to sta t.i. ciklooksigenazna in lipoksigenzna pot, kot to prikazuje slika 1. Pretvorba AA v končne  produkte poteka preko encimskih reakcij. V nadaljevanju bom opisali mrežo encimskih reakcij, ki tvorijo presnovo oz. metabolizem AA.

4

Ciklooksigenzna pot poteka preko encimov PGHS1 in PGHS2. Ta encima sta nujna pri uravnavanju fizioloških in patofizioloških procesov pri vnetnih obolenjih. Pri normalnem poteku encimske reakcije se AA preko teh dveh encimov pretvori v vnetne in protivnetne prostanglandine (piPGs in aiPGs). aiPGs inhibirajo delovanje encima 5-lipoksigenaza (5-LO) in zato zavirajo presnovo AA po lipoksigenazni poti. S tem posledično zavirajo tudi nastanek leukotriena C4 (LTC4), prvega izmed cys-LTs.

Slika 1. Presnova AA. Vsaka puščica ponazarja kemijsko reakcijo. Nad puščicami so zapisane kratice encimov, ki katalizirajo te reakcije. Če nad puščico ni kratice encima, tedaj te reakcije ne katalizira encim. Inhibitorni učinek zdravila na encima PGHS1 in PGHS2, ter inhibitorni učinek aiPGs na encim 5-LO je ponazorjen z znakom -. Z vj, kjer je j = 1…9, so  označeni tokovi v presnovi AA.

V lipoksigenazni poti encim 5-lipoksigenaza (5-LO) katalizira prvo reakcijo, v kateri se AA pretvori v molekulo leukotriena A4 (LTA4). Molekula LTA4 se lahko naprej pretvori po dveh poteh.  Ali  se  veže  na encim leukotrien A4 hidrolazo (LTA4H),  pri  čemer  nastane  molekula leukotriena B4 (LTB4), ali pa se veže  na  encim  leukotrien  C4 sintazo (LTC4S), ki pa ob prisotnosti molekule glutationa (GSH), molekulo LTA4 pretvori v molekulo LTC4. Končni produkti obeh metaboličnih poti AA, to so aiPGs, piPGs in LTC4, se nato izločijo iz celic v kri. Kadar je v organizmu prisotno zdravilo, molekule zdravila prodrejo v notranjost celic, kjer zavirajo delovanje encimov PGHS1 in PGHS2, kar je s črtkano črto in znakom – prikazano tudi na sliki 1. S tem se za določen čas prekine sinteza aiPGs, posledično pa se presnova AA sprosti po lipoksigenazni poti, s čimer se pospeši sinteza LTC4, ki se nato izloči iz celice. LTC4 se veže na receptorje mišičnih celic dihalnih poti in povzroči njihovo krčenje. To se kaže kot astmatični napad.

5

2.1 Osnove encimske kinetike 

Hitrosti encimskih reakcij na  sliki  1  opišemo  s  t. i. Michaelis-Mentenovo kinetiko. Najbolj preprosta encimska reakcija poteka po mehanizmu prikazanem na sliki 2a. Na sliki 2a je E molekula encima in S molekula substrata. Ti  dve  molekuli  se  vežeta  v  molekulo  vmesnega produkta ES, ki nato razpade na encim E in končni produkt P [3]. Hitrost encimske reakcije je definirana  kot  časovni  odvod  koncentracije  produkta  P po  času. Za mehanizem, ki je predstavljen na sliki 2a lahko  pokažemo,  da  je  hitrost v reakcije odvisna od koncentracije substrata v skladu z enačbo:

𝑣 = #$%&[(]*$+[(]

      , (1)

kjer je [S] koncentracija substrata in Km Michaelis-Mentenova konstanta. Z vmax označimo maksimalno hitrost reakcije, ki je odvisna od totalne koncentracije encima [E]T:

𝑣./0 = 𝑘2[𝐸]4       , (2)

kjer je k2 kinetična  konstanta.  Pod  kinetično  shemo na sliki 2a je prikazan tudi graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata.

V seminarski nalogi bomo obravnavali tudi reakcije, kjer določena substanca inhibira oz. zavira encimsko  reakcijo. Takšno substanco  imenujemo  inhibitor. Kinetična shema encimske  reakcije ob prisotnosti inhibitorja je prikazana na sliki 2b. V  takšni  reakciji  inhibitor, v našem primeru zdravilo, s substratom 'tekmuje' za vezavno mesto na encimu. Gre za t. i. kompetitivno inhibicijo. Nesteroidna zdravila so prav kompetitivni inhibitorji encimov PGHS1 in PGHS2. Hitrost reakcije za tak primer je podana z enačbo:

𝑣 = #$%&[(]*$ 5+[(]

         , (3)

pri čemer je:

𝛼 = 1 + [9]*:

, (4)

kjer je [I] koncentracija inhibitorja, Ki pa razmerje kinetičnih konstant k-i/k+ i. Pod kinetično shemo na sliki 2b je prikazan tudi graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije inhibitorja.

6

a) b)

Slika 2. a) Kinetična  shema osnovne encimske reakcije (zgoraj) in graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata (spodaj). b) Kinetična  shema encimske reakcije ob prisotnosti inhibitorja (zgoraj) in graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije inhibitorja (spodaj).

2.2 Matematični model presnove arahidonske kisline  

V tem poglavju bomo predstavili model presnove AA. Model tvori  sistem  šestih nelinearnih diferencialnih  enačb  1.  reda,  ki  opisuje  časovno  spreminjanje  modelnih spremenljivk, ki so koncentracije [AA], [aiPGs], [piPGs], [LTA4], [LTB4] in [LTC4]. Časovno  spreminjanje koncentracije arahidonske kisline opiše enačba: 

;[<<];=

= 𝑣> − 𝑣@ − 𝑣A − 𝑣B     , (5)

kjer so v0, v1, v3 in v5 hitrosti kemijskih reakcij v skladu s kinetično shemo, prikazano na sliki 1. Enačba, ki opisuje časovno spreminjanje metabolita [LTA4], je:

;[C4<D];=

= 𝑣B − 𝑣E − 𝑣F        , (6)

kjer so v5, v6 in v8 hitrosti encimskih reakcij 5, 6 in 8. Časovno spreminjanje [aiPGs], [piPGs], [LTB4] in [LTC4] opišejo dodatne štiri diferencialne enačbe, ki imajo naslednjo obliko:

;[0];=

= 𝑣G − 𝑣G+@ , (7)

pri čemer smo modelno spremenljivko splošneje označili z x, hitrosti kemijskih reakcij pa smo opremili z indeksom j, ki zavzame vrednosti j = 1, 3, 6, 8. Pri tem velja: x = piPGs za j = 1, x = aiPGs za j = 3, x = LTA4 za j = 5, x = LTC4 za j = 6 in x = LTB4 za j = 8.

V  nadaljevanju  bomo  podali  še  opis  hitrosti  posameznih  encimskih  reakcij t.j. tokov, ki so označeni na sliki 1. Hitrosti reakciji 1, 3 in 5 opiše enačba [5,6]:

7

𝑣G =#$%&H[<<]*$H5H+[<<]

       ,

kjer je j = 1, 3 ali 5 in je vmaxj maksimalna hitrost ustrezne encimske reakcije. Kmj je Michaelis-Mentenova konstanta reakcij. Za j = 1 in 3 velja [5]:

𝛼 = 1 + [9]*:H+ [9]

*:H*:H,      ,

kjer je [I] koncentracija zdravila Kij in Kij' pa sta ravnovesni konstanti vezave zdravila na encima PGHS1 in PGHS2. Z j = 5 velja:

𝛼 = 1 + [/IJKL]*:H

     ,

kjer je K i5 konstanta inhibicije encima 5-LO, [aiPGs] pa koncentracija protivnetnih prostaglandinov.  Reakcije  1,  3  in  5  smo  torej  v  osnovi  opisali  z  enačbama  (3)  in  (4). Hitrost reakcij 8 in 9 opišemo z osnovnim nastavkom, ki je podan z enačbo (1) [7,8]:

𝑣F =#$%&H[0]*$H+[0]

     ,

kjer je j = 8 in 9 in pri čemer velja: x = LTA4 za j = 8 in x = LTB4 za j = 9. Hitrosti reakcij 2, 4, 7 in 9 opišemo kar z linearno funkcijo [9,10], ki jo za j = 2, 4, 7, in 9 splošneje zapišemo kot:

𝑣G = 𝑘G[𝑥]    ,

pri čemer so kj kinetične konstante z x pa smo ponovno splošneje označili metabolite, pri čemer velja: x = piPGs za j = 2, x = aiPGs za j = 4, x = LTC4 za j = 7 in x = LTB4 za j = 9. Najbolj zanimivo in hkrati tudi najkompleksnejšo kinetiko ima reakcija 6. Hitrost te reakcije je podana z enačbo [11]:

𝑣E =#$%&N[C4<D]

<+O[C4<D]+P[C4<D]Q     ,

kjer so A, B in C konstante.

V modelu upoštevamo tudi časovno spreminjanje koncentracije zdravila, ki je podan z naslednjo funkcijo:

[𝐼](𝑡) = V     [𝐼]./0 W𝑡 𝑡@X Y ;   0 < 𝑡 ≤ 𝑡@[𝐼]./0𝑒_(=_=`)/b;   𝑡 ≥ 𝑡@

d     ,

kjer je [I] koncentracija zdravila. Vrednost koncentracije opazujemo na dveh časovnih intervalih. Čas, v katerem koncentracija zdravila v telesu naraste na maksimalno vrednost označimo s t1. Pri

8

večjih časih se koncentracija eksponentno zmanjšuje s karakterističnim časom , ki je podan v tabeli 1. Vrednosti modelnih parametrov so podane v tabeli 1.

Parameter Opis parametra V rednost parametra Referenca Reakci ja 1 vmax1 Maksimalna hitrost reakcije 1 0,65 µMs-1 [5,12] Km1 Michaelis-Mentenova konstanta 2,5 µM [5,12] Ki1 Konstanta inhibicije PGHS2 0,091 µM [5,12] Ki1' Konstanta inhibicije PGHS2 11,2 [5,12] Reakci ja 2 k2 Kinetična konstanta 0,0028 s-1 [9] Reakci ja 3 vmax3 Maksimalna hitrost reakcije 3 0,65 µMs-1 [5,12] Km3 Michaelis-Mentenova konstanta 3,0 µM [5, 12] Ki3 Konstanta inhibicije PGHS1 10 µM [5,12] Ki3

' Konstanta inhibicije PGHS1 0,0033 [5,12] Reakci ja 4 k4 Kinetična konstanta 0,0028 s-1 [9] Reakci ja 5 vmax5 Maksimalna hitrost reakcije 5 86 µMs-1 [6] Km5 Michaelis –Mentenova konstanta 25,4 µM [6] Ki5 Konstanta inhibicije 0,03 µM [6] Reakci ja 6 vmax6 Maksimalna hitrost reakcije 6 0,23 µMs-1 [11] A Konstanta 56 µM [11] B Konstanta 1,4 [11] C Konstanta 0,17 µM-1 [11] Reakci ja 7 k7 Kinetična konstanta 0,0015 s-1 [10] Reakci ja 8 vmax8 Maksimalna hitrost reakcije 8 3,7 µMs-1 [7] Km8 Michaelis-Mentenova konstanta 27 µM [7] Reakci ja 9 vmax9 Maksimalna hitrost reakcije 9 5,74 µMs-1 [8] Km9 Michaelis-Mentenova konstanta 239 µM [8] Ostali parametri vo Hitrost dotoka AA 0,7 µMs-1 - [I]o Začetna koncentracija zdravila 0 - [I]max Maksimalna koncentracija zdravila 50 µM [13] t1 Čas maksimalne koncentracije zdravila 300s [13] Karakteristični čas  1430 s

Tabela 1: Opis in vrednosti modelnih parametrov

9

Osnovne modelne enačbe (5), (6) in (7) numerično  integriramo v programu Berkeley Madonna 8.3.18. z integracijsko metodo Runge-Kutta 4. reda. Osredotočimo smo se na analizo časovnih potekov ključnega metabolita LTC4.

Namen matematičnega  modela je simulirati stanje aspirinske tolerance oz. intolerance. V ta namen na osnovi vrednosti modelnih parametrov definiramo različna  modelna  stanja.  Kot izhodiščno stanje izberemo stanje aspirinske tolerance ATA. To modelno stanje je definirano z vrednostmi modelnih parametrov, ki so podane v tabeli 1. Pri definiciji modelnih stanj, ki bi lahko ustrezala aspirinski intoleranci pa izhajamo iz naslednjih eksperimentalnih izhodišč: i) [LTC4S]T pri AIA je 5-krat višja kot pri ATA [1] in ii) [PGHS2]T pri AIA je 6-krat nižja kot pri ATA [4]. Parametra [LTC4S]T in [PGHS2]T v predstavljenem modelu sicer ne nastopata eksplicitno, ker pa je totalna koncentracija encima [E]T po enačbi (2) sorazmerna z maksimalno hitrostjo reakcije vmax, je 5-krat  povišano  vrednost  [LTC4S]T v modelnem  stanju  AIA  možno simulirati s 5-krat višjo vrednostjo parametra vmax6 v primerjavi z izhodiščnim modelnim stanjem ATA. Na  enak način  je z 6-krat  nižjo vrednostjo parametra vmax1 glede na stanje ATA možno simulirati tudi 6-krat  nižjo  vrednost [PGHS2]T v stanju AIA. Med posameznimi aspirinsko tolerantnimi in intolerantnimi modelnimi stanji bomo torej razlikovali glede na vrednosti parametrov vmax1 in vmax6. Glede  na  razpoložljive  eksperimentalne  podatke  je možno  definirati naslednja intolerantna stanja: AIA1- modelno stanje s 5-krat višjo [LTC4S]T, ki ga opišemo s 5-krat višjo vrednostjo parametra vmax6 kot v stanju ATA. AIA2 – modelno stanje z 6-krat nižjo [PGHS2]T,  ki  ga  opišemo  s 6-krat  nižjo  vrednostjo  parametra  vmax6 kot v stanju ATA. AIA3-stanje, v katerem upoštevamo oba  efekta,  t.j.  povišano vrednost  [LTC4S]T in  znižano vrednost [PGHS2]T in je tako definirano s 5-krat  višjo  vrednostjo  parametra vmax6 in 6-krat  nižjo vrednostjo parametra vmax6 kot  v  stanju ATA.  Za  izhodiščno  stanje  so  vsi  parametri  podani  v tabeli 1, za stanja AIA1, AIA2 in AIA3 pa so vrednosti modelnih parametrov vmax1 in vmax6 podane v tabeli 2, vsi ostali parametri pa so enaki kot v stanju ATA.

Parameter A I A1 A I A2 A I A3 vmax1 0,65 μMs-1 0,11 μMs-1 0,11 μMs-1 vmax6 1,15 μMs-1 0,23 μMs-1-1 1,15 μMs-1-1

Tabela 2: Vrednosti parametrov vmax1, vmax6 v modelnih stanjih AIA1, AIA2 in AIA3

 

 

 

10

3 Analiza rezultatov  Časovni  potek  [LTC4]  v  posameznih modelnih  stanjih  pred  in med  učinkovanjem  zdravila  so prikazani na sliki 3. Časovni signal zdravila smo sprožili ob času t = 125 min.

Slika 3. Časovni potek [LTC4] v celici za  različna modelna stanja ATA (črna  krivulja), AIA1

(rdeča krivulja), AIA2 (zelena krivulja) in AIA3 (modra krivulja).

Ko opazujemo časovne poteke [LTC4] za različna modelna stanja, ugotovimo, da se pri vseh AIA stanjih [LTC4] poveča v primerjavi z ATA po zaužitju zdravila. Pri AIA1 in AIA2 je maksimalna vrednost [LTC4] praktično enaka, vendar [LTC4] doseže maksimalne vrednosti ob različnih časih od  začetka  učinkovanja  zdravila.  Neprimerno višja, kot v stanjih ATA, AIA1 in AIA2 je maksimalna vrednost [LTC4] pri AIA3. Tako visoka vrednost [LTC4] pri AIA3 bi lahko sprožila astmatični napad.

Poglejmo, če je  časovna  skala  izračunanih  rezultatov v  skladu  z  eksperimentalnimi  opažanji. Zanima  nas  čas  od  zaužitja  zdravila  do  pojava  astmatičnega  napada.  Po  eksperimentalnih opažanjih  [1] bi  ta  čas naj  bil  nekje med 30 min in 60 min. Po drugi strani pa v referenci [3] dobimo  podatek,  da  se  mišične  celice  dihalni  poti  skrčijo  približno  15  min  po  tem,  ko  jih stimuliramo z LTC4. Če privzamemo, da je stimulacija mišičnih celic z LTC4 v človeškem telesu najintenzivnejša  v  trenutku,  ko  je  vrednost  [LTC4]  največja,  tedaj  lahko  pričakovani  čas  do astmatičnega pojava v grobem ocenimo kot vsoto časovnega  intervala od pričetka učinkovanja zdravila do trenutka, ko [LTC4] zavzame maksimalno vrednost (tmax) in časovnega intervala od stimulacije do razvoja sile v mišici tk. Vrednost tmax lahko za posamezno intolerantno stanje odčitamo  iz krivulj  na  sliki 3,  za vrednost tk pa uporabimo podatek iz reference [3]  in znaša  tk = 15 min. Iz grafa za stanje AIA3 odčitamo vrednost tmax = 33 min. Če temu prištejemo še eksperimentalno  določeno  vrednost,  dobimo  za  zakasnitev  med  zaužitjem  zdravila  in astmatičnim napadom končno izračunano vrednost tk +tmax = 33 min + 15 min = 48 min, kar

11

je v skladu s kliničnimi  opažanji reference [1]. S tem lahko potrdimo, da je v okviru matematičnega modela  izhodiščna hipoteza  točna. Encima LTC4S in PGHS2 zares vplivata na povišano koncentracijo LTC4. Še več, ko v modelu uporabimo eksperimentalne podatke, lahko precej natančno napovemo čas, ko bi lahko pričakovali astmatični napad. 

4 Zaključek V  seminarski  nalogi  sem  predstavil matematični model,  ki  kvantitativno  opisuje metabolizem arahidonske  kisline  v  človeškem  telesu. Z  modelom  je  mogoče  uspešno napovedati pojav astmatičnega napada pri bolnikih z AIA. S tem je tesno povezan pojav aspirinske intolerance, ki sem ga v seminarju tudi razložil.

Literatura [1] A. Szczeklik, D. Stevenson, Aspirin-induced asthma: Advances in pathogenesis and management, Journal of Allergy and Clinical Immunology 104 (1), 5 (1999).

[2] Zbornik sestanka: Aspirinska intoleranca in rinitis, Bolnišnica Golnik - Klinični oddelek za pljučne bolezni in alergijo, 2006.

[3] H. Setoguchi, J. Nishimura, K. Hirano, S. Takahashi, H. Kanaide, Leukotriene C4 enhances the contraction of porcine tracheal smooth muscle trough the activation of Y-27632, a rho kinase inhibitor, sensitive pathway, British Journal of Pharmacology 132 (1), 111 (2001).

[4] C. Picado, J. C. Fernandez-Morata, M. Juan, J. Roca-Ferrer, M. Fuentes, A. Xaubet, J. Mullol, Cyclooxygenase-2 mRNA is downexpressed in nasal polyps from aspirin-sensitive asthmatics, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 160 (1), 291 (1999).

[5] O. H. Callan, O. Y. So, D. C. Swinney, The kinetic factors that determine the affinity and selectivity for slow binding inhibition of human prostaglandin H synthase 1 and 2 by indomethacin and flurbiprofen, Journal of Biological Chemistry 271 (7), 2548 (1996).

[6] D. Aharony, R. Stein, Kinetic mechanism of guinea pig neutrophil 5-lipoxygenase, Journal of Biological Chemistry 261 (25), 11512 (1986).

[7] Haeggström, T. Bergman, H. Jörnvall, O. Rådmark, Guinea-pig liver leukotriene A4 hydrolase. Purification, characterization and structural properties, European Journal of Biochemistry, 174 (4), 717 (1988).

[8] B. K. Lam, L. Gagnon, K. F. Austen, R. J. Soberman, The mechanism of leukotriene B4 export from human polymorphonuclear leukocytes, Journal of Biological Chemistry 265 (23), 13438 (1990).

[9] M. Gonchar, M. Sergeeva, A. Mevkh, S. Varfolomeyev, Kinetics of prostanoid synthesis by macrophages is regulated by arachidonic acid sources, European Journal of Biochemistry 265 (2), 779 (1999).

12

[10] W. F. Owen Jr. , R. J. Soberman, T. Yoshimoto, A. L. Sheffer, R. A. Lewis, K. F. Austen, Synthesis and release of leukotriene C4 by human eosinophils, Journal of Immunology 138 (2), 532 (1987).

[11] N. Gupta, M. Gresser, A. Ford-Hutchinson, Kinetic mechanism of glutathione conjugation to leukotriene A4 by leukotriene C4 synthase, Biochimica et Biophysica Acta 1391 (2), 157 (1998).

[12] O. Y. So, L. E. Scarafia, A. Y. Mak, O. H. Callan, D. C. Swinney, The dynamics of prostaglandin H synthases. Studies with prostaglandin h synthase 2 Y355F unmask mechanisms of time-dependent inhibition and allosteric activation, Journal of Biological Chemistry 273 (10), 5807 (1998).

[13] G. A. Higgs, J. A. Salmon, B. Henderson, J. R. Vane, Pharmacokinetics of aspirin and salicylate in relation to inhibition of arachidonate cyclooxygenase and anti-inflammatory activity, Proceedings of the National Academy of Sciences 84 (6), 1417 (1987).