associaÇÃo do diabete e de dieta hipercalÓrica na …
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO BACHAREL EM BIOMEDICINA
ANDRESSA SILVA LOURENÇO
ASSOCIAÇÃO DO DIABETE E DE DIETA HIPERCALÓRICA
NA PRENHEZ DE RATAS: REPERCUSSÕES FETAIS
Barra do Garças – MT
2019
I
ANDRESSA SILVA LOURENÇO
ASSOCIAÇÃO DO DIABETE E DE DIETA HIPERCALÓRICA NA PRENHEZ DE
RATAS: REPERCUSSÕES FETAIS
Monografia apresentada à banca
examinadora do Curso de Biomedicina do
Instituto de Ciências Biológicas e da
Saúde, Campus Universitário do Araguaia
– UFMT, como requisito parcial para
obtenção do título de Bacharel em
Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato
Coorientadora: Vanessa Caruline Araujo da Silva
Barra do Garças – MT
2019
IV
Dedicatória
Dedico esta monografia à minha mãe, meu porto seguro. Sempre me incentivou
aos estudos, a gostar de ler. Me ensinou que meu estudo ninguém pode tirar de mim.
Te admiro por toda sua força e sabedoria, e rezo pra que algum dia eu possa ser como
você. Sem a senhora eu não seria um terço do que sou.
V
Agradecimentos
Agradeço a Deus e a nossa mãezinha Maria, que me sustentam, aquietam meu
coração e me dão forças todos os dias.
Agradeço minha mamãe, Tânia, que deixou seus pais e se mudou pra outra
cidade pra que eu pudesse ter uma graduação, sem nem hesitar. A senhora é a
pessoa mais maravilhosa que conheço, me espelho na mulher que és.
Ao meu namorado, Mateus, por fazer seu melhor por mim, por ser meu refúgio
e meu amigo. Por todo amor, obrigada.
À minha irmã, Flávia, por ser minha companheira e amiga.
À minha cachorrinha, Bonnie, que é a alegria da casa, e a minha também.
Aos meus avós, paternos e maternos, Joaquim e Maria Lourenço, Jacinto e
Neuza Silva, e ao papai, Flávio Lourenço, por serem tão importantes e especiais, por
todo cuidado e amor.
Agradeço a minha família, que me apoia e fica feliz junto comigo. Em especial
a minha prima, Larissa, por ser minha amiga e psicóloga, me ensinando a entender e
a lidar com momentos difíceis para mim.
À minha amiga e companheira de experimento, Alice Santos, por estar sempre
comigo, por toda ajuda e brincadeiras.
À minha amiga, Carla Leite, que posso contar sempre. Agradeço por ter
encontrado uma pessoa tão especial e que me identifico tanto.
A vocês duas, Alice e Carla, obrigada por tudo, por todas as risadas e carinho,
sem vocês tudo teria sido muito mais difícil. Amo vocês.
Agradeço a minha coorientadora, Vanessa Caruline, por toda ajuda.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato, pela oportunidade e pelos
ensinamentos.
VI
Agradeço a família FisioTox. Quando entrei no laboratório eu jamais esperava
que houvesse tanto companheirismo e ajuda. Tenho muito carinho por vocês, jamais
esquecerei. Obrigada por tudo que me ensinaram.
À Catarina, Vanessa, Agréa, Larissa e Babi, por todos os momentos, e por
saber que posso contar com vocês. Vocês têm um lugar especial no meu coração.
A todos meus professores, começando desde minha professora do pré, tia
Cecília, que me alfabetizou. A meus professores do ensino fundamental, em especial
a minha tia e madrinha, Sônia, que sempre incentivou em mim a busca por
conhecimento. Aos meus professores do ensino médio, por me prepararem. A meus
professores da graduação, que compartilham comigo seus conhecimentos para que
eu me torne uma boa profissional. A todos meus professores, meu respeito e total
admiração, vocês são uma profissão muito bonita.
Aos animais que participaram da pesquisa, sem eles a pesquisa não existiria.
Ao CNPq pela bolsa de iniciação científica.
VII
É Deus que te faz entender toda poesia, que torna mais valiosa
a vida, e prova que ainda dá pra ser feliz, apenas atenda quem chama.
Rosa de Saron
VIII
RESUMO
Diabetes mellitus (DM) é uma condição crônica que ocorre quando há altos níveis de
glicose no sangue, devido uma anormalidade na produção ou no uso de insulina. O
consumo de dieta com excesso de gordura e açúcar está associado ao aparecimento
de resistência à insulina. Desta forma, nossa hipótese é que uma dieta hipercalórica
associada ao estado hiperglicêmico durante a gestação pode causar complicações
fetais mais severas que esses fatores isoladamente. Assim, o objetivo deste trabalho
foi avaliar os efeitos fetais da associação do diabete e dieta hipercalórica, oferecida
antes e durante a prenhez de ratas. Para isso, foi administrado Streptozotocin no 1º
dia de vida de ratas. Na vida adulta (90 dias), após confirmação do diabete, as ratas
foram distribuídas em quatro grupos experimentais: Não-diabético (Controle - C) com
dieta normal; Controle com dieta alterada (CA); Diabético com dieta normal (D) e
Diabético com dieta alterada (DA). Os grupos dieta alterada receberam ração
hipercalórica e água contendo 5% de sacarose. Aos 120 dias de vida, as ratas foram
acasaladas. Após diagnóstico positivo de prenhez, as ratas foram submetidas ao teste
oral de tolerância à glicose (TOTG) no dia 0 e 17º de prenhez. No 21º dia de prenhez,
as ratas foram anestesiadas e foi realizada a laparotomia para retirada do útero
gravídico para avaliações fetais. Os fetos dos grupos CA e DA tiveram baixo peso ao
nascer. As anomalias esqueléticas aumentaram nos grupos DA e D quando
comparados aos animais controles. Portanto, concluímos que a dieta inadequada
associada ao diabete provoca alterações no desenvolvimento da prole, diminuindo o
peso fetal e sítios de ossificação e aumenta anomalias esqueléticas. Assim, este
estudo constatou que a associação entre diabete e dieta inadequada influencia no
desenvolvimento fetal.
Palavras-chave: diabetes, ração hipercalórica, prenhez, malformações.
IX
ABSTRACT
Diabetes mellitus (DM) is a chronic condition that occurs when there are high levels of
glucose in the blood due to an abnormality in the production or use of insulin. The
consumption of diet with excess fat and sugar is associated with the appearance of
insulin resistance. Thus, our hypothesis is that a hypercaloric diet associated with the
hyperglycemic state during gestation may cause fetal complications more severe than
these factors alone. Thus, the objective of this study was to evaluate the fetal effects
of the association of diabetes and hypercaloric diet, offered before and during the
pregnancy of rats. For this, Streptozotocin was administered on the 1st day of life of
rats. In adulthood (90 days), after confirmation of diabetes, the rats were divided into
four experimental groups: Non-diabetic (Control-C) with normal diet; Control with
altered diet (AC); Diabetic with normal diet (D) and Diabetic with altered diet (DA). The
altered diet groups received hypercaloric ration and water containing 5% sucrose. At
120 days of age, the rats were mated. After a positive diagnosis of pregnancy, the rats
were submitted to the oral glucose tolerance test (OGTT) on day 0 and 17 of
pregnancy. On the 21st day of pregnancy, the rats were anesthetized and a laparotomy
was performed to remove the gravid uterus for fetal evaluation. The fetuses of the CA
and DA groups had low birth weight. Skeletal anomalies increased in the AD and D
groups when compared to the control animals. Therefore, we conclude that inadequate
diet associated with diabetes causes changes in offspring development, decreasing
fetal weight and ossification sites, and increases skeletal abnormalities. Thus, this
study found that the association between diabetes and inadequate diet influences fetal
development.
Key words: diabetes, hypercaloric ration, pregnancy, malformations.
X
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11
2. OBJETIVO .......................................................................................................... 15
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 15
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 15
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 16
3.1 Animais .............................................................................................................. 16
3.2 Sequência experimental ................................................................................... 16
3.3 Indução do diabete ............................................................................................ 17
3.4 Grupos experimentais ....................................................................................... 18
3.5 Tratamento com dieta padrão ou alterada ...................................................... 18
3.6 Acasalamento .................................................................................................... 20
3.7 Período de prenhez ........................................................................................... 20
3.8 Obtenção de dados ........................................................................................... 20
3.9 Análise estatística ............................................................................................. 21
4. RESULTADOS ................................................................................................... 22
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 26
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 29
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 30
11
1. INTRODUÇÃO
Diabetes Mellitus (DM) é uma condição crônica que ocorre quando há níveis
altos de glicose no sangue, devido ao pâncreas ter uma deficiência na produção de
insulina, ou do corpo em usá-la de forma ineficaz (INTERNATIONAL DIABETES
FEDERATION – IDF, 2017). Devido ser uma doença complexa, o diabete requer
cuidados médicos contínuos com estratégias de redução de risco multifatoriais, além
do controle glicêmico (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION – ADA, 2019).
Apesar das inúmeras ferramentas disponíveis para combater a doença, o
diabete e suas complicações são cada vez mais prevalentes, estando entre as 10
principais causas de morte no mundo. O diabete é um dos maiores problemas de
saúde global, sobrecarregando os sistemas de saúde, o que consequentemente
interfere nos orçamentos nacionais, retardando o crescimento econômico. Cerca de
425 milhões de pessoas têm diabete no mundo, sendo no Brasil cerca de 12,5 milhões
pessoas que apresentam a doença, representando 6,9% da população. Dessa forma,
estima-se que em 2045 cerca de 629 milhões de pessoas, entre 20 a 79 anos, terão
diabete (IDF, 2017; SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES – SBD, 2017).
Segundo a ADA (2019) as principais categorias para a classificação do diabete
são Diabetes mellitus Tipo 1 (DM1), Diabetes mellitus Tipo 2 (DM2), tipos específicos
de diabetes devido à outras causas e Diabetes mellitus gestacional (DMG). O DM1 é
causado devido a uma reação autoimune, em que o sistema imunológico tem uma
resposta contra as células β-pancreáticas, e como resultado, o organismo tem uma
deficiência relativa ou absoluta da secreção de insulina. O DM2 é definido como uma
deficiência relativa da secreção de insulina e/ou resistência periférica à insulina.
Outros tipos de diabete incluem as síndromes monogênicas do diabete (como diabete
neonatal e diabete de início da maturidade dos jovens [MODY]), doenças do pâncreas
exócrino (como fibrose cística e pancreatite) e diabete induzido por drogas ou
produtos químicos. O DMG é o diabete detectado pela primeira vez no segundo ou
terceiro trimestre de gravidez, que claramente não é diabete preexistente, tipo 1 ou
tipo 2 (IDF, 2017; ADA, 2018; ADA, 2019).
O DMG é um distúrbio heterogêneo, resultante de uma interação entre fatores
genéticos e ambientais. É caracterizado pela resistência à insulina devido ao
comprometimento da função das células β-pancreáticas (KOIVUSALO et al., 2016).
12
Durante a gravidez, os tecidos maternos tornam-se progressivamente resistentes à
insulina, devido ao aumento da secreção de hormônios diabetogênicos, como
lactogênio placentário humano, hormônio do crescimento, progesterona, cortisol e
prolactina. Na grande maioria das gestações, a demanda é prontamente atendida,
com o aumento da secreção insulina em 200% a 250%, de modo que o equilíbrio entre
a resistência e suprimento deste hormônio é mantido. No entanto, em alguns casos
esse equilíbrio não ocorre, tornando essas mulheres hiperglicêmicas (BEN-
HAROUSH; YOGEV; HOD, 2003; SOMA-PILLAY et al., 2016; KAMPMANN et al.,
2015).
Altas taxas de complicações maternas e perinatais do DMG estão associadas
com a incidência de pré-eclâmpsia e hipertensão gestacional, além de ser um fator de
risco para o desenvolvimento de DM2, sendo diagnosticado em até 10% das mulheres
após a gravidez (BELLAMY, 2009). Nos fetos, o diabete pode estar associado a um
aumento na taxa de abortos espontâneos, morte intrauterina, anomalias congênitas,
hipoglicemia, policitemia, hiperbilirrubinemia e anomalias eletrolíticas. A hipoglicemia
ocorre devido à hiperinsulinemia do feto em resposta à hiperglicemia materna,
podendo levar a complicações mais sérias, como danos neurológicos e distúrbios
cardiopulmonares. Além desses problemas, filhos de mães diabéticas tem uma maior
suscetibilidade no desenvolvimento de síndromes metabólicas, como aumento da
pressão arterial, hiperglicemia, obesidade e níveis anormais de colesterol, sendo que
esses aumentam o risco de doença cardíaca, acidente vascular encefálico e diabete
(ORNOY, 2011; KAMANA; SHAKYA; ZHANG, 2015).
Pesquisas envolvendo esta patologia estão aumentando nas últimas décadas.
Experimentos com humanos podem ser feitos se houver um equilíbrio entre os riscos,
benefícios e vulnerabilidade, maximizando os benefícios e diminuindo possíveis danos
(GRADY, 2018). Portanto, devido as razões éticas envolvendo pesquisa humana, são
necessários modelos animais para os experimentos com diabete, para entender a
base molecular, a patogênese das complicações e a utilidade de agentes terapêuticos
(GHASEMI; KHALIFI; JEDI, 2014).
Os modelos animais diabéticos têm sido muito úteis na elucidação da patologia,
já que mimetizam a condição da doença em humanos, pois são semelhantes em
muitos aspectos, como a genética, idade, sexo e metabolismo. O rato é um animal
frequentemente escolhido para um modelo reprodutível do diabete, tendo vantagens
distintas sobre outras espécies, como o tamanho, menor custo, o curto período de
13
indução e a facilidade de induzir a condição (GHASEMI; KHALIFI; JEDI, 2014;
FURMAN, 2015).
Para a indução do diabete são utilizadas drogas beta-citotóxicas, como a
Aloxana e Streptozotocin (STZ). Estas drogas são análogas da glicose, tendo a
citotoxicidade alcançada por diferentes vias, porém ambas induzem a deficiência de
insulina. A aloxana é um composto químico muito instável, podendo causar efeitos
adversos no animal, como insuficiência renal, antes mesmo do desenvolvimento do
diabete, e a morte de muitos animais devido à faixa da dose diabetogênica ser próxima
a dose letal (SZKUDELSKI, 2001). A STZ causa necrose específica das células β-
pancreáticas, e devido à sua maior estabilidade, é mais utilizada para a indução de
um estado diabético em animais experimentais (LENZEN, 2008; FURMAN, 2015; WU
e YAN, 2015). A administração de STZ pode ser feita isoladamente, em combinação
com outros produtos químicos ou com manipulações dietéticas para indução de
diabete tipo 1 ou tipo 2. DM1 pode ser induzido por uma única injeção de STZ,
enquanto DM2 pode ser induzido por pelo menos três abordagens, que incluem
injeção de STZ após administração de nicotinamida, alimentação rica em gordura
seguida de baixa injeção de STZ, e injeção de STZ durante o período neonatal (WU e
YAN, 2015).
O tratamento de DM consiste em insulina e antidiabéticos orais, além de uma
mudança de hábitos, incluindo uma dieta saudável e praticando níveis moderados de
atividade física (GHASEMI; KHALIFI; JEDI, 2014; ADA, 2018). Segundo o IDF (2017),
uma dieta saudável é baseada em água, legumes, frutas, carnes brancas, alimentos
integrais e gorduras insaturadas, devendo-se evitar bebidas açucaradas, consumo
exacerbado de álcool, carnes processadas e gorduras saturadas. Nas últimas
décadas, o estilo de vida tem demonstrado ser um fator importante na saúde, sendo
a dieta o maior influenciador. Devido ao grande número de pessoas com uma
alimentação pouco saudável, o estilo de vida tem sido de grande interesse pelos
pesquisadores (FARHUD, 2015).
Nas últimas décadas muitos países tiveram mudanças alimentares,
aumentando o consumo calórico e, consequentemente, decaindo a qualidade geral
da alimentação. Essas mudanças se devem à urbanização, que favorece alimentos
não saudáveis, como os fast foods (comida rápida), que tem alto teor calórico, grandes
quantidades de carne processada, carboidratos altamente refinados, bebidas
açucaradas e gorduras não saudáveis (LEY et al., 2014). Com o objetivo de avaliar a
14
influência do estilo de vida no desenvolvimento de doenças metabólicas, como o
diabete, têm se realizado estudos com dietas hiperlipídica e água adoçada em
modelos animais. No estudo de Barrios-Ramos et al. (2014) foram utilizados ratos
Wistar para avaliar a manifestação de determinados marcadores, como a
hiperglicemia. Os animais receberam dieta hipercolesterolêmica e água com frutose,
apresentando dislipidemia, obesidade e hiperglicemia.
Apesar do conhecimento acerca do prejuízo de uma dieta inadequada no
contexto do diabete, a prevalência de mulheres com tal alimentação, antes e durante
a gravidez, tem aumentado, tornando-se necessária a realização de mais pesquisas,
a fim de investigar os efeitos fetais causados pelo consumo de uma alimentação
imprópria. Portanto, a hipótese deste trabalho é que os fetos de ratas diabéticas
submetidas à dieta hipercalórica, antes e durante a prenhez, podem apresentar
prejuízos mais severos que essas condições separadamente.
15
2. OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos fetais de uma dieta inadequada (ração hiperlipídica e água
com sacarose) na prenhez de ratas não-diabéticas e diabéticas.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar entre os grupos, se uma dieta inadequada na prenhez apresenta
influência em relação:
• Ao perfil glicêmico materno (TOTG);
• Ao peso e classificação fetal, peso placentário e eficiência placentária dos
recém-nascidos;
• À contagem dos pontos de ossificação;
• À análise de anomalias externas;
• À análise de anomalias internas (viscerais e esqueléticas).
16
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Wistar em idade
reprodutiva (em torno de 90 dias de vida) obtidos do CEMAE (Centro de Manutenção
de Animais Experimentais) - Campus Universitário do Araguaia (CUA) da
Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). Os procedimentos e manuseio dos
animais foram realizados de acordo com as orientações fornecidas pelo Conselho
Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).
As ratas foram aclimatadas durante sete dias no Laboratório de Fisiologia de
Sistemas e Toxicologia Reprodutiva (FisioTox) da Universidade Federal de Mato
Grosso. Ficaram em gaiolas de polietileno com cama de maravalha, contendo no
máximo quatro animais, sob temperatura (21 ± 3°C), umidade (50 ± 10%) e
fotoperíodo (ciclo claro/escuro de 12 horas) controlados. Água e ração foram
oferecidas ad libitum.
Figura 1. Rata Wistar. Fonte: FisioTox
3.2 Sequência experimental
É demonstrado o desenho experimental deste estudo contendo as principais
etapas envolvendo a experimentação animal (Figura 2).
17
Figura 2. Desenho experimental do estudo. Fonte: Do autor
3.3 Indução do diabete
Após aclimatação, as ratas foram colocadas para acasalar para obtenção dos
recém-nascidos. O diabete foi induzido nas fêmeas recém-nascidas no primeiro dia
de vida (24 horas pós-nascimento), por administração subcutânea de Streptozotocin
(SIGMA Chemical Company®), diluída em tampão citrato (0,01M, pH 4,5), na dose de
100 mg/kg de peso corpóreo. As ratas dos grupos controle receberam, pela mesma
via de administração, somente o tampão citrato (JAWERBAUM e WHITE, 2010;
DAMASCENO et al., 2011; SINZATO et al., 2011). Após a indução do diabete, as
fêmeas recém-nascidas continuaram com suas mães por todo o período de
amamentação (21 dias), tendo no máximo oito filhotes por mãe devido o número de
fetos funcionais para aleitamento. Posteriormente, estes animais ficaram sob as
mesmas condições estabelecidas no período de adaptação até a padronização pelo
critério de inclusão e suas mães foram conduzidas para outros estudos.
No 90º dia de vida, as ratas foram submetidas ao teste oral de tolerância à
glicose (TOTG) para a definição dos critérios de inclusão e de exclusão frente à
indução do diabete. Após seis horas de jejum, foi coletada uma gota de sangue por
punção venosa na cauda das ratas para a determinação glicêmica (tempo zero). Logo
após as ratas receberam solução de glicose (0,2 g/mL) via intragástrica (gavage) na
dose de 2,0 g/kg de peso corpóreo. Decorridos 30, 60 e 120 minutos após a
administração da solução de glicose, as glicemias foram determinadas com o uso de
glicosímetro convencional (SINZATO et al., 2012).
18
Como critério de inclusão, foram consideradas ratas com diabete moderado
aquelas que apresentaram glicemia acima de 140 mg/dL em pelo menos dois pontos
do TOTG. Foram excluídas do estudo as ratas que não atingiram glicemia acima de
140 mg/dL em pelo menos dois pontos da curva. Foram incluídas nos grupos não-
diabéticos as ratas que, na vida adulta, apresentaram TOTG normal (pontos com
glicemias inferiores a 140 mg/dL), sendo excluídas as ratas que apresentaram TOTG
alterado (SANTOS et al., 2015).
3.4 Grupos experimentais
Considerando os quatro grupos experimentais e baseado nos experimentos
anteriores realizados em nosso laboratório com poder de 90% e confiabilidade de
95%, o tamanho amostral mínimo foi de 11 ratas por grupo. As ratas foram distribuídas
de maneira aleatória para a composição dos quatro grupos experimentais:
• Controle (C): Ratas prenhes não-diabéticas que receberam ração padrão e
água filtrada.
• Controle Dieta Alterada (CA): Ratas prenhes não-diabéticas que receberam
ração hiperlipídica e água com 5% de sacarose.
• Diabético (D): Ratas prenhes diabéticas que receberam ração padrão e água
filtrada.
• Diabético Dieta Alterada (DA): Ratas prenhes diabéticas que receberam
ração hiperlipídica e água com 5% de sacarose.
3.5 Tratamento com dieta padrão ou alterada
As ratas dos grupos CA e DA com 90 dias de vida (após o TOTG) começaram a
receber a dieta alterada, os grupos C e D continuaram recebendo a dieta padrão. A
dieta padrão consiste em ração padrão (comercial) e água filtrada. É constituída por:
Milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, óleo vegetal, carbonato de cálcio,
fosfato bicálcico, cloreto de sódio (sal comum), vitamina A, vitamina D3, vitamina E,
vitamina K3, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12, niacina, pantotenato
de cálcio, ácido fólico, biotina, cloreto de colina, sulfato de ferro, sulfato de manganês,
19
sulfato de zinco, sulfato de cobre, iodato de cálcio, selenito de sódio, sulfato de
cobalto, lisina, metionina, BHT (hidroxitolueno butilado) (Figura 3).
A dieta alterada é constituída por ração hiperlipídica (FRANCISQUETI et al.,
2017- modificado) e água com 5% de sacarose. A dieta hiperlipídica foi preparada na
Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) da Faculdade de Medicina de Botucatu
- Unesp. Para preparo da ração hiperlipídica, foram utilizados os seguintes
ingredientes nas proporções: farelo de soja, sorgo, casca de soja, amido de milho,
açúcar refinado, banha de porco, minerais: contendo: ferro, biotina, vitamina B12,
vitamina D, vitamina B6, vitamina E, vitamina A, selênio e potássio, Sal. Estes
ingredientes foram moídos, misturados e oferecidos na forma de pellets. Depois do
preparo, a ração foi mantida sob refrigeração até o momento do consumo dos animais
(Figura 4).
A tabela com a análise bromatológica é apresentada abaixo (Tabela 1):
Tabela 1. Composição da ração experimental oferecida para ratas não-diabéticas
e diabéticas antes e durante a prenhez.
Compostos
Ração
Padrão Hiperlipídica
Matéria Seca 92,55% 96,35%
Proteína Bruta 27,83% 27,78%
Lipídios 3,77% 15,77%
Fibra Bruta 47,17% 47,17%
Figura 3. Ração padrão. Fonte: Fisiotox UFMT - CUA
Figura 4. Ração hiperlipídica. Fonte: LAPGO Unesp – Botucatu
20
3.6 Acasalamento
As ratas com 120 dias de vida foram distribuídas quatro a quatro em gaiolas de
polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho durante o período
noturno. Na manhã subsequente, foi realizado esfregaço vaginal para análise do
material citológico em microscopia de luz. A presença de espermatozoides e as
características da fase estro do ciclo estral confirmaram o diagnóstico de prenhez e
este foi considerado o dia zero de prenhez (VOLPATO et al., 2008). O procedimento
para acasalamento consistiu em 15 dias consecutivos, que compreende cerca de três
ciclos estrais e foi realizado até a obtenção do número amostral. As fêmeas que não
acasalaram neste período foram consideradas inférteis e removidas do estudo
(DALLAQUA et al., 2012).
3.7 Período de prenhez
Nos dias 0 e 17 de prenhez, foi realizado novamente o TOTG para avaliação do
desenvolvimento de alterações do metabolismo glicêmico, conforme metodologia
descrita anteriormente. Com os dados das glicemias foi estimada a resposta da
captação de glicose pela área sobre a curva, utilizando o método trapezoidal (TAI,
1994).
Na manhã do 21º dia de prenhez, as ratas foram anestesiadas com tiopental
sódico (Thiopentax®) na dose 120 mg/Kg. Em seguida, as ratas foram submetidas à
laparotomia com exposição dos cornos uterinos.
3.8 Obtenção de dados
As placentas e seus respectivos fetos foram pesados em balança analítica, livres
de membrana e cordão umbilical. A eficiência placentária foi determinada pela relação
entre o peso fetal e o peso placentário (VOLPATO et al., 2015).
Após a pesagem dos fetos, foi realizada a análise das anomalias externas. Os
recém-nascidos foram examinados externamente, com análise minuciosa de olhos,
boca, implantação das orelhas, conformação craniana, membros anteriores e
posteriores, perfuração anal e cauda (DAMASCENO et al., 2008). Após o exame
externo, metade dos recém-nascidos de cada ninhada foi colocada em álcool (70%)
e, após 24 horas, foram eviscerados, diafanizados com hidróxido de potássio e
21
corados com alizarina (Figura 5B). Para análise das anomalias esqueléticas, foi
utilizado o método de Staples e Schnell (1964). Os centros de ossificação foram
contados e analisados usando parâmetros propostos por Aliverti et al. (1979).
A outra metade dos recém-nascidos de cada ninhada foi colocada em solução
de Bodian para fixação das estruturas viscerais e descalcificação dos ossos.
Completada a fixação, foi utilizado o método de secção seriada proposto por Wilson
(1965) para observação de anomalias viscerais (Figura 5A).
Figura 5. A) Esquema dos cortes de Wilson para análise visceral.
B) Ossificação fetal para análise esquelética.
Fonte: Damasceno et al. Anomalias Congênitas, 2008.
3.9 Análise estatística
Após aplicação do teste de normalidade, os dados foram analisados por Análise
de Variância (ANOVA) seguido do pós-teste de Comparações Múltiplas de Tukey para
comparação dos valores médios. Para a comparação das porcentagens, foi utilizado
o teste Exato de Fisher. As diferenças foram consideradas estatisticamente
significativas quando p<0,05.
22
4. RESULTADOS
Os dados da área sob a curva (AUC) dos dias 0 e 17 de prenhez são mostrados
na Tabela 2. O grupo D apresentou valores de AUC superiores ao grupo C. O grupo
DA apresentou aumento no valor de AUC, comparado ao grupo C e ao grupo CA.
Tabela 2. Médias e respectivos desvio-padrão da área sob a curva do teste oral de
tolerância a glicose de ratas não-diabéticas e diabéticas submetidas ou não a dieta
hipercalórica.
Grupos
C CA D DA
Dia 0 12640 ± 1592 14747 ± 1069 21500 ± 3646* 23393 ± 4734*#
Dia 17 9106 ± 1412 11194 ± 1184 15765 ± 2022* 19080 ±5484*#
Legenda: C – controle; D – Diabético; A – dieta hipercalórica.
*p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05 comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado
com o grupo D (ANOVA seguida de teste de Tukey).
23
Os animais do grupo CA e DA apresentaram diminuição no peso fetal em relação
ao C. A porcentagem de fetos pequenos para a idade de prenhez (PIP) foi aumentada,
e a fetos adequados para a idade de prenhez (AIP) foi diminuída grupos CA e DA em
relação ao C (Tabela 3).
Tabela 3. Peso e classificação fetal, peso placentário e eficiência placentária de ratas
não-diabéticas e diabéticas submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Grupos
C CA D DA
N 147 131 95 102
Peso fetal (g)a 5,6 ± 0,4 5,2 ± 0,6* 5,4 ± 0,5 5,3 ± 0,5*
Fetos PIP (%)b 6,1 23,7* 12,6 21,6*
Fetos AIP (%)b 89,8 71,7* 85,3 76,5*
Fetos GIP (%) b 4,1 4,6 2,1 1,9
Peso placentário (g) a 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,4 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1
Eficiência placentáriaa 11,6 ± 1,4 11,4 ± 2,1 11,2 ± 1,7 11,1 ± 1,93
Legenda: C – controle; D – Diabético; A – dieta hipercalórica.
Dados mostrados como média desvio-padrão (DP) (ANOVA seguida de teste de Tukey) e
proporções (%) (Teste Exato de Fisher).
*p<0,05 comparado com o grupo C.
24
A Tabela 4 mostra os sítios de ossificações fetais. Os grupos CA e DA
apresentaram diminuição de falanges anteriores e posteriores em relação ao grupo C.
O grupo DA mostrou diminuição de metatarsos e total de ossificação quando
comparado ao grupo C e D, além de diminuição no número de vértebras caudais em
relação ao grupo D.
Tabela 4. Média e desvio-padrão dos sítios de ossificação de ratas não-diabéticas e
diabéticas submetidas ou não à dieta hipercalórica.
Grupos
C CA D DA
N 70 70 52 56
Falanges Anteriores 3,7 ± 0,3 3,1 ± 0,6* 3,4 ± 0,6 3,1 ± 0,6*
Metacarpos 3,9 ± 0,2 4,0 ± 0,0 4,4 ± 1,3 4,0 ± 0,0
Falanges Posteriores 2,1 ± 0,9 1,1 ± 0,8* 1,3 ± 1,0 0,5 ± 0,3*
Metatarsos 4,9 ± 0,1 4,8 ± 0,2 4,9 ± 0,2 4,6 ± 0,2*$
Vértebras Caudais 4,2 ± 0,6 3,8 ± 0,7 4,4 ± 1,0 3,5 ± 0,3$
Esternébrios 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0
Total 25,0 ± 1,7 22,8 ± 2,0* 24,4 ± 2,5 21,8 ± 0,9*$
Legenda: C – controle; D – Diabético; A – dieta hipercalórica.
*p<0,05 comparado com o grupo C; $p<0,05 comparado com o grupo D (ANOVA seguida de
teste de Tukey).
Não houve diferença significativa entre os grupos em relação às anomalias
externas. Quanto às anomalias esqueléticas, o total de anomalias foi maior em ambos
os grupos diabéticos em relação ao C, e no grupo DA houve aumento dessa
frequência em relação ao grupo CA. Todos os grupos apresentaram aumento na
frequência de esternébrios reduzidos em relação ao grupo C, e o grupo DA mostrou
aumento na frequência dessa anomalia em relação ao grupo D. O grupo DA
apresentou aumento de esternébrios assimétricos em relação ao grupo CA. Nas
anomalias viscerais, o grupo D mostrou aumento de hidroureteres em relação ao
grupo C. No grupo DA houve aumento de hidronefrose em relação ao grupo C e D, e
ureter sinuoso em relação ao grupo C.
25
Tabela 5. Frequência de anomalias fetais de ossificação de ratas não-diabéticas e
diabéticas submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Grupos
C CA D DA Anomalias Externas Número de fetos examinados (ninhada)
146 (13) 132 (11) 97 (10) 103 (11)
Número total de fetos (%) com alteração
0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
Média % fetos com alteração
por ninhada (média DP) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Anomalias Esqueléticas Número de fetos examinados (ninhada)
77 (13) 70 (11) 53 (10) 57 (11)
Total de fetos (%) com alteração 20 (26,0%) 28 (40,0%) 24 (45,3%)* 36
(63,1%)*#$ % média de alteração por ninhada
(Média DP) 26,3 ± 16,8 38,9 ± 27,7 40,5 ± 22,6 64,0 ± 17,8
Centro vertebral assimétrico 0 (0,0%) 1 (1,4%) 1 (1,9%) 0 (0,0%) Centro vertebral bipartido 0 (0,0%) 1 (1,4%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
14ª Costela 1 (1,3%) 1 (1,4%) 1 (1,9%) 0 (0,0%) 13ª Costela reduzida 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (1,7%)
Esternébrio reduzido 14 (18,2%) 36 (51,4%)* 20 (37,8%)* 34 (59,6%)*$
Esternébrio assimétrico 7 (9,1%) 2 (2,8%) 4 (7,5%) 8 (14,0%)# Esternébrio ausente 1 (1,3%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Anomalias Viscerais Número de fetos examinados (ninhada)
69 (13) 62 (11) 44 (10) 46 (11)
Número total de fetos (%) com alteração
22 (31,9%) 26 (41,9%) 21 (47,7%) 26 (56,5%)*
Média % fetos com alteração por
ninhada (média DP) 32 ± 26,5 39 ± 20,9 53 ± 32,8 58 ± 24,9
Olhos assimétricos 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 2 (4,3%) Microftalmia 0 (0,0%) 2 (3,2%) 0 (0,0%) 1 (2,2%)
Traqueia alargada 5 (7,2%) 8 (12,9%) 3 (6,8%) 6 (13%) Uretér sinuoso 1 (1,4%) 1 (1,6%) 2 (4,5%) 5 (10,9%)*
Hidroureter 9 (13%) 10 (16,1%) 15 (34,1%)* 9 (19,6%) Cálice alargado 3 (4,3%) 4 (6,4%) 2 (4,5%) 1 (2,2%)
Hidronefrose 3 (4,3%) 3 (4,8%) 1 (2,3%) 8 (17,4%)*$ Hiperplasia da bexiga 2 (2,9%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Bexiga alargada 0 (0,0%) 1 (1,6%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Legenda: C – controle; D – Diabético; A – dieta hipercalórica.
Dados mostrados como média desvio-padrão (DP) (ANOVA seguida de teste de Tukey) e proporções (%) (Teste Exato de Fisher). *p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05 comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado com o grupo D.
26
5. DISCUSSÃO
Os modelos animais são utilizados em pesquisas experimentais devido à
semelhança com humanos, o que possibilita o estudo do diabete e suas complicações
(GHASEMI; KHALIFI; JEDI, 2014; WU e YAN, 2015). Para a indução do diabete se
utiliza a STZ nos primeiros dias de vida das ratas, na dose de 100 mg/kg
(DAMASCENO et al., 2014). Neste estudo, a administração de STZ no primeiro dia de
vida das ratas, na dose de 100 mg/kg, causou aumento nos níveis de glicemia no
TOTG, aumentando a área sob a curva (AUC), comprovando a eficácia da droga e do
método utilizado, confirmando a condição diabética.
Estudos mostram que os animais do modelo experimental do diabete moderado
apresentam pouca ou nenhuma alteração na glicemia de jejum na vida adulta, mas
sim alterações no TOTG (IESSI et al., 2010; SANTOS et al., 2015). O TOTG avalia a
capacidade de captação glicêmica dos tecidos periféricos (músculo esquelético e
tecido adiposo) e permite mostrar o desempenho da insulina endógena nesses
tecidos, representando um método sensível e específico para o diagnóstico de
intolerância à glicose (CAMPOS et al., 2007; BORAI et al., 2011). Nesta pesquisa, a
alteração no metabolismo glicêmico dos grupos diabéticos foi confirmada por valores
glicêmicos no TOTG, nos dias 0 e 17, o consequente aumento da área sob a curva
(ASC). Isso confirma a dificuldade na captação de glicose pelos tecidos quando é
administrada uma sobrecarga de glicose, gerando um quadro de intolerância à glicose
(IESSI et al., 2010; SANTOS et al., 2015). A associação com a dieta diminuiu ainda
mais a captação de glicose durante a prenhez, confirmada pelo aumento da AUC no
dia gestacional 17.
Por outro lado, o desenvolvimento fetal é um processo complexo que depende
do genótipo do feto, nutrição materna, disponibilidade de nutrientes, e uma variedade
de fatores de crescimento e proteínas de origem materna, fetal e placentária (SAITO
et al., 2010). O crescimento do feto é mais intenso na segunda metade da prenhez,
que corresponde ao intervalo entre 14º e 21º dia de prenhez. Nesse período há
aumento da glicemia materna, que ocasiona elevação de glicose no meio intrauterino,
onde os tecidos maternos diminuem a captação de glicose para que ela seja
direcionada ao feto. Esse aumento é para possibilitar o desenvolvimento e
crescimento máximo fetal, conhecido como “fenômeno do roubo glicêmico
27
fetoplacentário” (CALDERON et al., 1999; DESOYE e NOLAN, 2016; NOLAN e
PROIETTO, 1994).
No entanto, os grupos com dieta alterada apresentaram diminuição do peso
fetal, com aumento de fetos pequenos para a idade de prenhez e diminuição de fetos
com peso adequado para a idade de prenhez. Em estudo realizado por Howie et al
(2009) verificou-se que ratas Wistar que receberam uma dieta com alto teor de gordura
tiveram filhotes com peso corporal significativamente menores. Em outros estudos em
roedores, foi visto que a alimentação com dieta hiperlipídica foi responsável por pesos
diferentes na prole, assim, a restrição de crescimento pode estar relacionada a
diferentes adaptações maternas à alimentação hiperlipídica e aos componentes da
dieta, pois a nutrição materna também está relacionada à restrição de crescimento
intrauterino (HOWIE et al., 2009; SETIA e SRIDHAR, 2009).
O desempenho funcional adequado e desenvolvimento da placenta exercem
um papel fundamental para o crescimento e sobrevivência do feto no útero (LIN et al.,
2012). A eficiência placentária fornece uma análise da função e adaptação da
placenta, o quanto é sua capacidade de transferir nutrientes para o feto e fornecimento
de hormônios, tanto para o feto quanto para a mãe (FOWDEN et al., 2009). Assim,
alterações no desenvolvimento placentário podem afetar o ambiente intrauterino
através de diferentes meios (FOWDEN e FORHEAD, 2004; FOWDEN et al., 2006).
Neste estudo, os animais não apresentaram alterações no peso placentário e
eficiência placentária, indicando que a placenta foi capaz de fazer sua função de
maneira adequada. Apesar da eficácia placentária, os fetos dos grupos que
receberam a dieta alterada apresentaram diminuição do peso corpóreo. Mark et al.
(2011) sugeriu que uma dieta hiperlipídica induz distúrbios hormonais na placenta,
como a redução de concentrações de progesterona, refletindo na diminuição do peso
fetal.
De acordo com Aliverti et al. (1979), a avaliação dos centros de ossificação é
importante para determinar o estágio de desenvolvimento do feto, desse modo, estes
seriam os pontos mais afetados em fetos imaturos. Segundo Chahoud e Paumgartten
(2005) e Paula (2015), o número de sítios de ossificação é proporcional ao peso do
feto, portanto fetos que apresentam diminuição dos sítios de ossificação
consequentemente podem sofrer de retardo no desenvolvimento e apresentarem peso
corpóreo reduzido. Neste contexto, El-Sayyad (2015) observou ratas Wistar que
receberam dois tratamentos, um grupo foi induzido ao diabete com uma injeção de
28
STZ, e o outro grupo recebeu uma dieta hipercolesterolêmica, com colesterol e
manteiga de cacau em sua composição. Em ambos os grupos a prole apresentou
diminuição no comprimento de ossos, redução dos centros de ossificação, diminuição
do conteúdo de cálcio e atraso na diferenciação de condroblastos e osteoblastos,
comprometendo a integridade óssea. Isso explica os resultados obtidos no presente
estudo, onde os grupos experimentais com dieta alterada apresentaram alterações
nas ossificações em relação ao Controle, sendo esse efeito mais pronunciado no
grupo com associação com o diabete. Esse resultado, aliado à diminuição de peso
fetal, com aumento de PIP nesses grupos, confirmou que a dieta hipercalórica causou
restrição de crescimento intrauterino.
O perfil metabólico da mãe tem um impacto adicional na prole, estando
associados a hiperglicemia e resistência à insulina (SULLIVAN; NOUSEN;
CHAMLOU, 2014). Não há um mecanismo patogênico único para explicar os diversos
problemas observados em fetos de mães diabéticas, porém, muitos efeitos, incluindo
as anomalias, podem ser atribuídos principalmente à hiperglicemia materna. Dentre
esses problemas, complicações no sistema renal e sistema esquelético são
frequentes em filhos de mães diabéticas, sendo a displasia esquelética principalmente
encontrada nos membros, costelas e cauda (MOORE, 2018; BAACK et al., 2014).
Schaefer-Graf et al. (2000) verificou que crianças nascidas de mulheres com DMG
tinham regressão caudal (agenesia ou hipoplasia congênita que envolve as últimas
vértebras, principalmente os segmentos sacral e coccígeno inferior), defeitos
vertebrais e displasia renal, estando essas, estreitamente relacionadas com o
aumento da glicemia materna (PONCE et al., 2005; LEE; PANG; WANG, 2017). As
nefropatias diabéticas podem ser devido a hiperatividade da via do poliol, que consiste
em converter glicose em sorbitol. No diabete esse sorbitol é produzido em altas taxas
(ERIKSSON, 2009), explicando os defeitos encontrados nos rins da prole, que foram
ureter sinuoso, hidroureter e hidronefrose. A dieta rica em gordura também pode levar
a alterações nos rins (KNIGHT et al., 2008), deste modo, a associação entre dieta
inadequada e diabete pode resultar em anomalias renais. Em nosso estudo foi
verificado que os grupos diabéticos apresentaram aumento na frequência de
anomalias esqueléticas. A associação elevou essa frequência, com 63,1% dos fetos
apresentando alguma anormalidade esquelética, sendo as mais encontradas nos
esternébrios.
29
6. CONCLUSÃO
A dieta inadequada associada ao diabete provoca alterações no desenvolvimento
da prole, diminuindo o peso fetal e sítios de ossificação e aumenta anomalias
esqueléticas. Assim, este estudo constatou que a associação entre diabete e dieta
inadequada causa alterações no desenvolvimento fetal.
30
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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