aula 03 - enzimas
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Profª Bianca Seminotti
2012/2
Comentário inicial Condições fundamentais para a vida:
Auto-replicação Capacidade de catálise eficiente e seletiva das reações químicas
Ex.: sacarose → CO2 + H2O Processo altamente exergônico (termodinamicamente
favorável), porém muito lento (cineticamente desfavorável)à CATÁLISE
Conceito de enzimas
Catalisador biológico cuja natureza é na maioria proteica
Existem raras enzimas com natureza ribonucleica, são moléculas de RNA com atividade enzimática, as RIBOZIMAS
Características gerais das enzimas
Eficiência catalítica > catalisadores sintéticos ou inorgânicos A enzima não é consumida na reação Aceleram reações químicas Atuam em pequenas concentrações Apresentam alto grau de especificidade por seus substratos (substâncias que são transformadas) Não alteram o equilíbrio das reações Atuam em soluções aquosas, em condições brandas de T e pH Por atuarem geralmente em condições amenas, as enzimas minimizam reações colaterais indesejadas, como: decomposição, isomerização e rearranjos, responsáveis pela formação de produtos indesejados
Importância das enzimas ü Agem em sequências organizadas, as vias metabólicas
q Degradação de nutrientes → conservação de energia química q Síntese de macromoléculas à partir de precursores mais simples
ü Enzimas reguladoras: controlam as vias metabólicas ü Deficiências enzimáticas: erros inatos do metabolismo ü Alterações de atividade enzimática presentes em doenças ü Alvo da ação de muitas drogas (medicamentos) ü Indústria química-farmacêutica; antibióticos ü Diagnóstico laboratorial, ELISA, PCR
ü Indústria de alimentos: fermentos, produtos lácteos ü Agricultura: pesticidas, agrotóxicos
Características Estruturais das Enzimas
vProteínas c/ massa molecular variável: 12.000 a mais de 1 milhão
vA atividade catalítica depende da integridade da conformação protéica: vA atividade é, geralmente, destruída ou diminuída quando
a enzima é desnaturada, dissociada em subunidades (perda das estruturas secundárias, terciária ou quaternária)
vA atividade é totalmente destruída quando a enzima é clivada em seus AA constituintes (perda da estrutura primária)
Primária: Sequência de AA
Secundária: Arranjos estáveis da sequência de AA
Terciária: Enovelamento tridimensional do pep;deo
Quaternária: Mais de 1 subunidade
Estruturas primária, secundária, terciária e quaternária são essenciais para a atividade catalítica
Características Estruturais das Enzimas Algumas enzimas requerem componentes não
proteicos para a atividade: Cofator: um ou mais íons inorgânicos Coenzima: molécula orgânica complexa, geralmente derivada de vitaminas
Grupo prostético Cofator ou coenzimas ligados firmemente à
molécula enzimática
Holoenzima: enzima completa e ativa (proteína + coenzima e/ou íons metálicos ligados)
Apoenzima ou apoproteína: parte protéica
Atuam como transportadores transitórios de grupos funcionais
Proteínas
Ribozimas
RNAs
Simples Apoenzima
Conjugadas Cofator/Coenzima
+ apoenzima
Holoenzima
Estrutura Enzimática
NOMENCLATURA DAS ENZIMAS
1o dígito -‐ classe 2o dígito -‐ subclasse 3odígito -‐ sub-‐subclasse 4odígito -‐ indica o substrato
Sistema oficial da União Internacional de Bioquímica As enzimas são classificadas e denominadas de acordo com a natureza da reação química que catalisam. Existem 6 classes, várias sub-classes e sub-subclasses
Cada enzima - no de código (E.C.- Enzyme Comission) com 4 dígitos que caracterizam o tipo de reação
Nomenclatura e Classificação das enzimas
Nomenclatura e Classificação das enzimas
Evita ambiguidades IdenIficação da enzima através da reação que ela catalisa
ATP + Glicose → ADP + Glicose-‐6-‐P Nome alternaIvo, trivial ou recomendado: Hexoquinase Nome sistemáIco: ATP-‐glicose fosfotransferase
E.C. 2.7.1.1 2. classe: transferases 7. subclasse: fosfotransferase 1. fosfotransferase com grupo hidroxil como aceptor 1. glicose como aceptor
ou a clivagem de ligações C-‐O, C-‐N, C-‐C, eliminação
3. Hidrolases
5. Isomerases Epimerases
Determinadas mutases Racemases
6. Ligases Carboxilases Sintetases
Esterases Lipases
Nucleosidases e NucleoIdases PepIdases Fosfatases Sulfatases
4. Liases Aldolases Descarboxilases Hidratases Sintases
Transaminases
1. Oxidorredutases Desidrogenases Desaturases Hidroxilases Oxidases Oxigenases Redutases
2. Transferases Quinases Determinadas mutases Fosforilases Polimerases
Transaldolases e transcetolases
•Sintetase (ligase) à obtém energia para uma nova ligação a parIr da quebra de uma ligação de alta energia • Sintase (liase) à obtém energia de outras fontes
Como funcionam as enzimas As enzimas fornecem o ambiente específico onde dada reação é energeIcamente mais favorável A reação ocorre no interior de uma cavidade na enzima chamada de sí-o a-vo
qSítio ou centro ativo é formado por resíduos de AA que contornam este local da enzima; geralmente são resíduos de AA que estão distantes na sequência da estrutura 1ª (justificando o tamanho das proteínas)
qOs grupos substituintes dos resíduos dos AA se ligam ao substrato e catalisam a sua transformação
qPoucos AA são responsáveis pela catálise qO sítio ativo promove a aproximação e correta orientação para
catálise qFormação do complexo ES: ponto de partida para os
tratamentos matemáticos que definem o comportamento cinético e das descrições teóricas dos mecanismo enzimáticos
Como funcionam as enzimas
As enzimas afetam a velocidade mas não o equilíbrio químico das reações
ΔG‡ ⇒ energia de ativação ΔG° ⇒ variação de energia livre padrão: 298K, 1 atm, 1M ΔG’° ⇒ variação de energia livre padrão nos sistemas biológicos em pH 7
Enzimas
Alguns princípios explicam o poder catalítico e a especificidade das enzimas
Rearranjos das ligações covalentes (substrato ↔ cadeia lateral dos AA, cofatores e coenzimas) Interações não covalentes (enzima ↔ substrato): pontes de H, interações hidrofóbicas e iônicas, que são otimizadas no estado de transição...ENERGIA DE LIGAÇÃO
ENERGIA DE LIGAÇÃO üÉ a principal fonte de energia livre usada pelas enzimas
para diminuir as energias de ativação das reações üContribui para a especificidade (habilidade de
discriminar entre o seu substrato e uma molécula competidora) e para a catálise
As interações fracas entre a enzima e o substrato são otimizadas no estado de transição
Como uma enzima usa a energia de ligação para diminuir a energia de ativação de uma reação?
Modelo Chave – Fechadura? SíIo aIvo complementar ao substrato
Modelo Chave – Fechadura?
SíIo aIvo complementar ao estado de transição (Linus Pauling)
Não
ü OK
As interações fracas entre a enzima e o substrato são otimizadas no estado de transição
Sem enzima
Enzima complementar ao substrato
Enzima complementar ao estado de transição
Grupos catalíticos específicos contribuem para a catálise
q Energia de ligação...interações fracas enzima ↔ substrato
qInterações covalentes enzima ↔ substrato § Catálise ácido-base geral § Catálise covalente § Catálise por íons metálicos
Catálise ácido-base geral
qFormação de intermediários carregados instáveis que tendem a se degradar nos reagentes
qEstabilização através da transferência de prótons para ou de um substrato, facilitando a conversão em produto
qParticipação de ácidos orgânicos fracos (doadores de H+)e bases orgânicas fracas (aceptoras de H+)...cadeias laterais de AA
Catálise ácido-base específica: reações não enzimáticas, onde a transferência de prótons ocorre entre moléculas de água ou outros doadores ou aceptores de prótons fracos (H3O+ e OH-)
Catálise ácido-base geral
Resíduos de AA presentes no síIo aIvo que parIcipam da catálise ácido-‐base geral
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Princípios de Bioquímica. Lehninger. Michael M. Cox, David L. Nelson. 4ª e 5ª Eds. Editora Sarvier. Capitulo 6 Bioquímica Médica Básica de Marks - Uma Abordagem Clínica. Colleen Smith, Michael Lieberman, Allan D. Marks. 2ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 115 Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Thomas M. Devlin. 6ª Ed. Editora Blücher. Nutritional Biochemistry. Tom Brody. 2ª Ed. Editora Academic Press. Alimentos: a química de seus componentes. T.P. Coultate. 3ª Ed. Artmed.
http://bcs.whfreeman.com/lehninger5e/content/cat_030/index.html
CinéLca EnzimáLca
CinéLca enzimáLca
Determinar a velocidade da reação e
como ela é alterada por diferentes condições experimentais permite estudar o
mecanismo de uma reação enzimáLca.
E + S ES EP E + P
A concentração do substrato afeta a velocidade das reações catalisadas por enzimas
[S] = concentração de substrato V0 = velocidade inicial (quando a [S] é muito maior que a [E] Vmáx = velocidade quando o aumento de V0 é muito pequeno à medida que a [S] aumenta Km = constante de Michaelis-‐Menten -‐ [S] onde V0 aInge metade da Vmáx
Variação do Km entre enzimas e diferentes substratos para a mesma enzima
Inibição EnzimáLca
Inibição enzimáLca Inibidores à agentes moleculares que interferem a catálise
(diminuir ou interromper as reações enzimáIcas) Ex: Inibires da ciclooxigenase (ácido aceIlsalicílico, ibuprofeno,
nimesulida)
Inibidores de protease (tripsina) provenientes da soja crua (leguminosas)
INIBIDORES
REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS SUICIDAS
COMPETITIVOS ACOMPETITIVOS MISTOS
↑ Km
Não altera Vmáx
Inibição reversível compeLLva
O inibidor (I) compete com o substrato pelo síIo aIvo (forma o complexo EI) e não ocorre catálise Compostos com estrutura semelhante ao substrato (idenIficação da porção molecular que se liga à enzima) Muitos produtos da reação enzimáIca inibem a enzima dessa forma
Como a ligação do Inibidor é reversível,
adicionar mais Substrato reduz o efeito inibitório
Álcool desidrogenase intoxicação por metanol
Álcool desidrogenase
Metanol à Formaldeído
Ø Formaldeído é tóxico para os tecidos Ø Cegueira
Ø Tratamento: infusão intravenosa lenta de etanol, que compete com o metanol pela enzima álcool desidrogenase, impedindo a formação de formaldeído, enquanto o metanol é eliminado pelo sistema renal
Inibição reversível acompeLLva
O Inibidor (I) liga-se a um sítio na enzima distinto do sítio ativo (ligação ao complexo ES) Observado para enzimas com 2 ou mais substratos
↓ Km aparente ↓ Vmáx
Inibição reversível
AcompeLLva CompeLLva
Inibição reversível mista
O inibidor liga-se a um sítio distinto do sítio ativo (ligação à enzima livre ou ao complexo ES ) Observado para enzimas com 2 ou mais substratos
Inibição Irreversível
Se combina com um grupo funcional na molécula da enzima, destrói ou forma um
ligação bastante estável (covalente) _ inaIvação permanente da enzima
Inibidores suicidas São pouco reaIvos até se ligarem ao síIo aIvo;
Ao invés de formar o produto, ele gera um composto muito reaIvo que combina
irreversivelmente com a enzima
Inibição Irreversível ORGANOFOSFORADOS (Contaminantes de alimentos)
à Inibidores irreversíveis da aceIlcolinesterase
DIFP
Fatores que alteram a aLvidade enzimáLca (velocidade)
A aLvidade enzimáLca (velocidade) é afetada pelo pH
Pepsina Hidrólise de ligações pep;dicas no estômago pH óImo de 1,6
Glicose-‐6-‐fosfatase Hepatócitos, liberação de glicose pH óImo de 7,8
Manutenção de condições como: (1) temperatura, (2) concentração de substrato, (3) concentração de enzima
A aLvidade enzimáLca (velocidade) é afetada pela temperatura
↑ T à aumento na velocidade das reações
“↑ energia vibracional dos substratos”
↑↑↑ T à desnaturação protéica
(perda de estruturas secundária e terciária)
T óIma (humanos ≈ 40-‐45°C)
A aLvidade enzimáLca (velocidade) é afetada pela temperatura
Temperatura óIma ENZIMA TEMPERATURA ÓTIMA (°C)
AIvação térmica
Desnaturação térmica Pepsina
Tripsina Urease
31,6 25,5 20,8
ManLdas constantes as condições de: -‐ pH ó óLmo -‐ concentração de substrato -‐ concentração de enzima É escolhida uma temperatura
pouco abaixo da óIma.
A aLvidade enzimáLca (velocidade) é afetada pela quanLdade de enzima
É escolhida uma quanLdade de enzima da ascendente da curva
ManIdas fixas as condições de: -‐ temperatura óIma -‐ pH óImo -‐ [substrato] em excesso
Bibliografia } } } }
Principios de Bioquímica. Lehninger. Michael M. Cox, David L. Nelson. 4ª e 5ª Eds. Editora Sarvier. Capítulo 6 Bioquímica Médica Básica de Marks - Uma Abordagem Clínica. Colleen Smith, Michael Lieberman, Allan D. Marks. 2ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 9 Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Thomas M. Devlin. 6ª Ed. Editora Blücher. Nutritional Biochemistry. Tom Brody. 2ª Ed. Editora Academic Press.
http://bcs.whfreeman.com/lehninger5e/content/cat_030/index.html
Enzimas reguladoras
Comentário inicial
ë Vias metabólicas (anabólicas e catabólicas) tem uma série de etapas catalisadas por diferentes enzimas
Substrato à à à à à Produto
ë Enzimas reguladoras: modulam a velocidade da rota em resposta a diversos sinais
ë Primeira enzima da via ë Economia de energia
Como são moduladas as Enzimas Reguladoras?
Regulação alostérica
Enzimas alostéricas Conceito
q Possuem sítios reguladores diferentes do sítio catalítico q A ligação de efetores (+ ou -) alteram a conformação
da enzima (ativa e inativa) e consequentemente sua atividade enzimática
q Os efetores podem ser inibitórios ou estimulatórios, alterando a afinidade da enzima pelo substrato
q Ocorre um efeito à distância do modulador, via sítio regulador, sobre o sítio ativo
Enzimas alostéricas Classificação
Enzima homotrópica: substrato = modulador
�Efetores homotrópicos
ë Frequentemente ação positiva
ë Idéia de cooperatividade (≈ hemoglobina) ë Sítio catalítico = sítio regulatório
Enzima heterotrópica: modulador ≠ substrato
�Efetores heterotrópicos
ë Incluem a inibição por retroalimentação (produto inibe enzima chave da via metabólica)
Sítios ativos e alostéricos
Enzimas alostéricas Inibição por retroalimentação
ëA enzima alostérica é frequentemente inibida pelo produto final da via
ëQuando a concentração do produto excede o requerimento celular
ëReduzindo a atividade da enzima alostérica, toda a via tem sua atividade reduzida, desde que seus substratos estão em concentração reduzida
Regulação por modificação covalente
Enzimas reguladas por modificação covalente
ëGrupos moduladores que se ligam covalentemente à enzima: fosforila, adenila, uridila, metila e grupos adenosina difosfato ribosila
ëEsses grupos são adicionados e removidos da enzima alvo por enzimas separadas
Enzimas reguladas por interação proteína- proteína
ëProteína causa uma alteração conformacional no sítio ativo ou bloqueia o sítio ativo (impedimento estérico)
ëPodem ativar ou inibir a enzima a qual estão ligadas
Ex.: proteína quinase A, proteína quinase Ca+- Calmodulina-dependente
Enzimas reguladas por remoção de fragmento peptídico (Zimogênios)
Enzimas reguladas por remoção de segmentos peptídicos (clivagem proteolítica)
ëPrecursor inativo (zimogênio ou proproteína ou proenzima) é clivado para formar a enzima ativa
Ex: quimotripsinogênio, tripsinogênio, pró-colágeno, proteínas da coagulação sanguínea (fibrinogênio)
ëClivagem específica, expondo o sítio ativo da enzima ëMecanismo de ativação irreversível
ëInativação ocorre por ligação de proteínas inativadoras, que se ligam ao sítio ativo das enzimas
Ex.: Inibidor pancreático da tripsina
Enzimas reguladas pela expressão gênica
Enzimas reguladas pela expressão gênica
Algumas enzimas não são sintetizadas continuamente
pelas células Ex: indução de enzimas da via
glicolítica por insulina
Enzimas reguladoras moduladas por sequestro para compartimento
diferente do local sua atuação
Regulação da hexoquinase IV (glicoquinase) por sequestro no núcleo celular: o inibidor é uma proteína nuclear que mantém a hexoquinase IV no núcleo liberando-a para o citosol quando a [glicose] no hepatócito estiver alta
Regulação múltipla
ëMuitas enzimas são reguladas de diferentes formas, alostericamente, covalentemente, ...
Por quê?
ëControle da atividade de enzimas importantes, chaves nas vias metabólicas
ëEvitando o desperdício de energia ëPromovendo a síntese dos produtos necessários em cada “momento celular”
ëManutenção da VIDA
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Princípios de Bioquímica de Lehninger. Michael M. Cox, David L. Nelson. 5ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 6 Bioquímica Médica Básica de Marks - Uma Abordagem Clínica. Colleen Smith, Michael Lieberman, Allan D. Marks. 2ª Ed. Editora Artmed. Capítulo 9 Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Thomas M. Devlin. 6ª Ed. Editora Blücher. Nutritional Biochemistry. Tom Brody. 2ª Ed. Editora Academic Press. Capítulo Alimentos: a química de seus componentes. T.P. Coultate. 3ª Ed. Artmed.
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