aula 7 - eletroforese capilar
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Aula abordando conceitos básicos sobre eletroforese capilarTRANSCRIPT
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Disciplina:
Eletroanaltica e Tcnicas de separao (NH 3101)
Universidade Federal do ABC
Eletroforese Capilar
Bruno Lemos Batista
Santo Andr - SP
2015
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Site da disciplina
Professor Bruno Lemos:
Site no GOOGLE para disponibilizar informaes da disciplina Aulas dadas, notas, frequncia, apostila, listas, cronograma, avisos, etc. https://sites.google.com/site/tqlemos/repositorio
https://sites.google.com/site/tqlemos/repositorio -
Eletroforese
Fundamento: migrao de ons em soluo sob a influncia
de um campo eltrico (desenvolvida por A. Tiselius em 1930
que foi prmio Nobel em 1948)
Tipos de eletroforese:
Eletroforese de Zona
Eletroforese capilar em soluo livre;
Eletrocromatografia micelar;
Eletroforese capilar em gel;
Focalizao isoeltrica capilar;
Isotacoforese capilar.
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HPLC X Eletroforese Capilar Vantagens e desvantagens
HPLC: $ Colunas e Solventes.
CE:
Alta eficincia nas separaes;
Custo;
Consumo ou nulo de solventes;
Versatilidade;
Simplicidade instrumental;
tempos de anlises.
limites de deteco de zeptomol (10-21)
Desvantagem: Preparativas
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
Em HPLC: alargamento dos picos: caminhos mltiplos, difuso
longitudinal e transferncia de massa;
Em CE:
O uso de capilar eliminou:
os caminhos mltiplos
transferncia de massa (ausncia de FE)
Assim reduziu-se o H (altura do prato) e melhorou a
resoluo;
nica fonte de alargamento: difuso longitudinal
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
Aplicaes:
Determinao de DNA,
Peptdeos,
Protenas
Sdio,
Benzeno.
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
Eletroferograma similar ao cromatograma
4100 pratos
92000 pratos
Res
po
sta
do
det
ecto
r
Pico
Linha de base
Tempo de reteno
Retorno a Linha de base
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nodo ctodo
_ +
Eletroforese Capilar uma tcnica de separao de molculas
carregadas sob influncia de um campo eltrico.
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Instrumento
Fonte de alta tenso
Eletrodos
Detector (lmpada UV/Vis)
Computador
Capilar / Eletrlitos
Fluxo
Ambiente Termostatizado
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
Constituio bsica: -Fonte de alta tenso (~30kV) com dois eletrodos de Pt formando o catodo e anodo -Capilar de slica fundida -Detector (pode ser eletroqumico, UV/Vis) -Computador (gerao dos dados) Dimenses dos capilares:
-DI de 15 a 100 micrmetros (ordem de grandeza do dimetro das partculas em HPLC) -L de 30 a 100 centmetros FM o tampo (soluo tampo)
Poli-imida (15 m, confere flexibilidade)
Slica fundida (330 m de dim.)
Luz (25-75 m dim.)
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
CAPILARES:
CASSETE JANELA PARA O DETECTOR
CAPILAR
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
CAPILARES:
Caractersticas:
-Dimenses precisas e maleabilidade;
-Alta condutividade trmica;
-Baixa condutividade eltrica;
-Resistncia mecnica e ao ataque qumico (inerte);
-Alta transmitncia ptica para 190 < > 900nm.
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
CAPILARES:
-Primeiro uso: lavagem com NaOH concentrado;
-Entre as corridas: lavagem com NaOH (0,1 N ou
outras concentraes);
-Garante a reprodutibilidade dos tempos de
migrao.
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ctodo nodo
Polo positivo Polo negativo
SiO SiOH
SiO SiO
SiO
SiO
SiOH SiO
Tampo Tampo
Mobilidade eletrofortica
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Anlises por CE- Princpio da separao
1- Introduo da soluo de eletrlitos
2- Injeo da amostra (volume de nanolitros)
3- Eletrodos e Capilar Soluo Tampo
4- Aplicao de uma diferena de potencial 2 mecanismos de separao.
- - -
+ + + 1 2 3
1) Fora de atrito 2) Analito (carga positiva) 3) Fora do campo
+
Quanto maiores a carga, a fora do campo e menor o raio da partcula maior a mobilidade
eletrofortica
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SiO SiO SiO SiO SiO SiO SiO
SiO SiO SiO SiO SiO SiO SiO
Fluxo eletrosmtico Mobilidade eletrofortica
Mobilidade eletrofortica versus Fluxo eletrosmtico influncia do pH
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Anlises por CE- Princpio da separao
1) pH > 3 os grupos silanol (Si-OH comeam a ser desprotonados SiO-) 2) O excesso de ons + na soluo recobrem os Si-O-; 3) Como ainda h um excesso de ons + na soluo seu fluxo gera uma
velocidade eletrosmtica > a mobilidade eletrofortica para os os -, arrastando-os para o catodo, assim como os analitos neutros.
4) Quanto > o pH > o n de Si-O-, > fluxo eletrosmtico (p/ catodo) 5) Veletrosmose = (dist. Inj.-detect.) / (tempo migrao analitos neutros)
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos Separao dos Analitos
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
A velocidade diminui com a proximidade a parede do capilar
Anodo (+) Catodo (-)
Alta presso Baixa presso
Fluxo hidrodinmico em HPCL: pior separao no
caso apresentado, piora da resoluo comparado ao fluxo eletrosmtico (EC)
ELETROFEROGRAMA: 1) naftaleno, 2) acenafteno, 3) fluoreno, 4) antraceno e 5) fenantreno; fase mvel: NH4Ac 16,7 mmol L-1 (60%) e acetonitrila (40%); temp.: 20 C; injeo: -25 mbar por 5 s; deteco: 220 nm (linha cinza) e 250 nm
(linha preta). Capilar: 36 cm (8,5 cm efetivo e 8,0 cm de coluna)
Migrao dos ons gera calor, efeito joule, da a necessidade de se controlar a temperatura
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Fluxo eletrosmtico (induzido por campo eltrico)
Fluxo laminar (induzido por presso)
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Mobilidade aparente = mobilidade eletrofortica +
mobilidade eletrosmtica
Ctions versus nions:
Para ctions somam-se as mobilidades
Para nions a eletrosmtica deve ser maior. Se
queremos separar nions em pH baixo inverte-se a
polaridade da corrente no instrumento (refletir!).
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
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Mobilidade aparente (Map)
Map = (Ld/t) / (V/Lt)
Onde:
Ld= comprimento do capilar do ponto de injeo at o detector
Lt= comprimento total do capilar de uma extremidade a outra
V= o potencial eltrico aplicado nas extremidades
t= o tempo para o analito migrar do ponto de injeo at o
detector
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Fluxo eletrosmtico: medido pela mobilidade de um composto
neutro (da injeo at o detector UV/Vis)
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Anlise quantitativa
Picos normalizados!!!
Consiste em:
Medida da rea do pico dividida pelo t;
Em HPLC a vazo a mesma p/ todos analitos! Na EC no!!!
Em EC a mobilidade diferente e o tempo de permanncia
no detector tambm!
Precisamos ento normalizar!
Divide-se a rea do pico do analito pelo seu correspondente
tempo de migrao.
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
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Uma aplicao:
Molculas com tamanhos semelhantes:
Consiste em fazer um escalonamento de cargas:
Acetilao de uma protena qualquer:
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
NH3+
NH3+
NH3+
NH3+
NH3+
NH3+
NHAc
NH3+
Acetilao
+3
NH3+
NHAc
NHAc
NH3+
+2
Carga zero
+4
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Uma aplicao:
Molculas com tamanhos semelhantes (eletroferograma):
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Marcador
neutro Protena no
modificada (+4)
Protena modificada
(+1, mais lenta)
130 s
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Uma aplicao
Dados: comprimento total do capilar (Lt) = 84 cm; comprimento at
o detector (Ld) = 64cm; potencial (E) = 25000 V):
O fluxo eletrosmtico ou Veletrosmtica = Ld / t (analito NEUTRO!)
Ento: Veo= 0,64m / 130s = 0,0049 m/s
Mobilidadeeletrosmtica= Veo / (E / Lt)
Ento: Meo = 0,0049 / (25000/ 0,84) = 1,65 . 10-7 m2/V.s
Mobilidadeaparente= Veo / (E / Lt) (para um determinado analito)
Ento: Map = (0,64m/150s)/(25000V/0,84m)=1,43 . 10-7 m2/V.s
Map= Meo + Meletrofortica
Ento: Mef = (1,43 . 10-7) (1,65 . 10-7) = - 0,21 . 10-7 m2/V.s
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
A Mef negativa: protena com carga negativa que migra
eletroforeticamente no sentido oposto do detector. Em pH 8,3 a Meo >> Mef,
arrastando o analito para o detector
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
Resoluo:
N = [(Map x E / 2 x D) x (Ld / Lt)] Onde: N = nmero de pratos tericos (quanto > melhor) Map = mobilidade aparente (quanto > melhor) D = coeficiente de difuso (quanto < melhor) E = potencial aplicado (quanto > melhor) Ld = comprimento do capilar at o detector Lt = comprimento total do capilar
Na razo Ld/Lt constante o N no se altera, ao contrrio da HPLC
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Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)
Se o detector passa da posio A p/ B a razo Ld/Lt diminui e N diminui. Se passa de A p/ C o contrrio.
Resoluo:
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Introduo da amostra no interior do capilar: -Pode ser feita de duas formas: Injeo Hidrodinmica Injeo Eletrocintica
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Injeo Hidrodinmica
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Injeo Hidrodinmica P = diferencial de presso ao longo do capilar; d = dimetro interno do capilar; t = tempo de injeo (valor a ser encontrado); = viscosidade do tampo; Ltot = comprimento total do capilar.
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Injeo Eletrocintica
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Injeo Eletrocintica
Q = nmero de moles injetados; e = mobilidade efetiva do analito; EOF = mobilidade eletrosmtica; E = campo eltrico aplicado; r = raio do capilar; C = concentrao da amostra; t= tempo; = 3,14...
Q = (e + EOF) E t C r2
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Consideraes Relevantes Quanto a Injeo em EC
-Sempre usar a padronizao interna (padro interno); -Viscosidade da amostra e dos padres devem ser semelhantes (influncia da temperatura); -A injeo hidrodinmica geralmente mais reprodutvel; -A injeo eletrocintica: a) torna o mtodo mais sensvel para analitos com alta mobilidade eletrofortica; b) utilizada para amostras viscosas.
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Modos Empregados em EC
-Normal -Invertida -Suprimida -Micelar** (cromatografia eletrocintica micelar)
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Aqui a Vosm maior levando a partcula com carga negativa at o detector
Aqui a Vef maior levando a partcula com carga negativa at o detector
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
-A dupla camada de surfactante inverte a carga superficial no capilar.; -Inverte a direo do fluxo eletrosmtico; -Aqui a Vosm maior, levando os ons de carga + para a esquerda, at o detector.
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
-Uso de um composto que se liga a Si-O- (diaminopropano) fazendo com que a parede interna do capilar fique neutra; -Pouco resistente a pH alto; -Apenas fluxo eletrofortico.
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Cromatografia Eletrocintica Micelar Fundamentos Bsicos
-Separao de molculas neutras entre si; -Velosm>Velef ento analitos neutros no miclio so detectados mais tarde; -Quanto < tempo do analito no interior do miclio > tempo p ser detectado; -Relao com HPLC: o miclio uma FE. O analito entra e sai do miclio, como se adsorvesse na FE e solubilizasse na FM em HPLC!; -O termo transferncia de massa (CUx) deixa de ser zero!
injeo deteco
Velosm Velef
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Consideraes Importantes Quanto aos Detectores
Empregados em CE
-Seletividade
-Sensibilidade
-Faixa linear
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco por Absoro no UV-Vis
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco por Absoro no UV-Vis (aumento do passo ptico)
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco por Absoro no UV-Vis (aumento do passo ptico)
Clula bolha Clula de alta sensibilidade
Clula em formato Z
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco Indireta por Absoro no UV-Vis
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco por Fluorescncia
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco por Espectrometria de Massas
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Deteco por Espectrometria de Massas
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Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
Detectores
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O computador fornece o eletroferograma:
Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos
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Bibliografia
HARRIS, D.C. Anlise Qumica Quantitativa, 6 ed., Rio de
Janeiro: LTC, 2005.
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. Princpios de
Anlise Instrumental, 5 ed., Porto Alegre: Bookman, 2002.
Altria, K. D.; Capillary Electrophoresis Guidebook : principles, operation and application. Humana Press Inc.; Totowa- New Jersey, 1996. 349p. Da Silva, J. A. F.; Coltro, W. K. T.; Carrilho, E.; Tavares, M. F. M. Terminologia para as tcnicas analticas de eletromigrao em capilares . Quimica Nova, v. 30, p. 740-744,2007. Tavares. M.F.M.; Mecanismos de Separao em Eletroforese Capilar. Qumica Nova, v. 20, n. 5, p.493-511, 1997. Tavares. M.F.M.; Eletroforese Capilar: Conceitos Bsicos. Qumica Nova, v. 19, n. 2, p. 173-181, 1996.