aula5 cultivo controle microrganismos
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Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Departamento Acadêmico de Química e Biologia
Disciplina: Biologia Celular e Microbiologia
Cultivo e Controle de Microrganismos
Profa. Lucia Regina R. Martins
novembro/2009
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Cultivo de Microrganismos
� na natureza e em materiais infecciosos os microrganismos existem como culturas mistas
colônia: visível crescimento� a partir de 1 célula vegetativa, 1 esporo ougrupo de microrganismos
Meios de cultura:
• material nutriente apropriado para o cultivo de microrganismos• pode ser preparado em laboratório ou comercial• composição depende das necessidades nutricionais/tipo de microrganismo
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Material inoculado no meio de cultura (inóculo)
Incubação em estufa microbiológica
Multiplicação celular
células individuais formam grande número de células = colônia
cultura pura = colônia formada a partir de ancestral único,característica homogênea
característica macroscópica da colônia = típica da espécie
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Meios de cultura
Critérios:
- nutrientes necessários- água- ajuste de pH- presença de oxigênio- temperatura ótima
-Inicialmente deve ser estéril: proliferação apenas de microrganismos do inóculo -Inicialmente deve ser estéril: proliferação apenas de microrganismos do inóculo
Ágar:
�polissacarídeo complexo de algas marinhas, agente solidificante para os meios de cultura� não-degradável pela maioria de microrganismos� liquefaz a 100oC, solidifica a 40oC� tubo (ágar inclinado ou em coluna) e placas de Petri
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Meios de cultura
I – Meios Quimicamente Definidos
Composição definida;Fonte de energia, fatores orgânicos e inorgânicos de crescimento- Organismos exigentes = “fastidiosos” (ex.: Neisseria gonorrhoeae, Lactobacillus)
II – Meios ComplexosII – Meios Complexos
- nutrientes: extratos de carne, plantas, leveduras, produtos de digestão protéica (peptonas)- pequenas variações na composição química exata- usado de forma geral para bactérias heterotróficas e fungos- pode ser: caldo nutriente ou ágar nutriente
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Meios de cultura e Métodos para Anaeróbios
Meios de cultivo = Redutores: �reagentes que retiram oxigênio dissolvido (tioglicolato de sódio)
• recipientes fechados• aquecimento dos tubos antes da utilização (elimina O2 dissolvido)• em Placa de Petri: sistema fechado (jarras)
� retirada de oxigênio: reações químicas (NaHCO3 + NaBH4)� enzima (oxirase)� câmara com gás inerte
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Técnicas Especiais de Cultivo
- Cultura de células: organismos intracelulares obrigatórios (riquétsias e clamídias)- em organismos vivos (ex.: Mycobacterium leprae)- capnofílicos (estufas de CO2 ou jarra com vela, reagentes em embalagens):
-Ex.: algumas bactérias patogênicas do TGI (Campylobacter)
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Meios de cultura
1. Seletivo2. Diferencial
�utilizados para a determinação da presença de microrganismos específicos
1. MEIOS SELETIVOS
- Favorece o crescimento apenas do microrganismo de interesse- ex.: ágar sulfeto de bismuto → isolamento de Salmonella typhi em fezes- ex.: ágar sulfeto de bismuto → isolamento de Salmonella typhi em fezes
ágar verde brilhante (corante que inibe Gram-positivas, seletivo para Salmonella)ágar Sabouraud dextrose pH 5,6: favorece fungos e inibe bactérias
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2. MEIOS DIFERENCIAIS
- permite identificação de colônias de bactérias de interesse, em meio a outras espécies- quando cultura pura: reações características
- ex.: ágar sangue→ identifica bactérias capazes de hemóliseStreptococcus são classificados como alfa-hemolíticos (halo esverdeado demetemoglobina), beta-hemolíticos (halo claro de hemólise ao redor da colônia),não-hemolíticos (sem alteração)
beta-hemólise alfa-hemólise
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3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS
Staphylococcus aureus – ↑ tolerância a NaCl, fermenta manitol produzindo ácido→ Meio Ágar Sal Manitol
� favorece o isolamento e reconhecimento de espécies de interesse� requer conhecimento de peculiaridades de cultivo, características bioquímicas, etc.
7,5% NaCl = seletivoindicador de pH = diferencial
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Ágar MacConkey:
- contém sais biliares e cristal violeta: inibe Gram-positivas (seletivo)- lactose: diferencia Gram-negativas fermentadoras (rosa) de não-fermentadoras (incolor)- caracteriza salmonellas patogênicas
3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS
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Meios de enriquecimento
� estimula o crescimento da bactéria de interesse (estão em menor quantidade)� normalmente líquido� pode ser considerado seletivo� transferência de inóculo → estágio de crescimento → transferência de inóculo
� ex.: amostras de solo e fezes (caldo enriquecido com fenol)caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelascaldo Tioglicolato para Clostridium perfringenscaldo Tioglicolato para Clostridium perfringens
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Método de esgotamento por estrias superficiais
alça de inoculação estéril e meio nutriente sólidopadrão de espalhamento do inóculo após incubação = colônias isoladas → transfere para meio nutriente = cultura pura
Obtenção de culturas puras:� utilizada na obtenção de colônias individualizadas� características homogêneas� permite a caracterização e identificação� método de semeadura é fundamental
após incubação = colônias isoladas → transfere para meio nutriente = cultura pura
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Conservação de culturas puras
�curto período (dias) = refrigerador (4 a 10oC)
� longo período: congelamento rápido em líquido (freezer -50 a -95oC)liofilização (ampolas acondicionadas em temperatura ambiente)
retomam a viabilidade pela adição de meio líquido nutriente
• coleções de culturas puras (padrão) : American Type Culture Collection (ATCC)
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Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianas
Pode ser representado por gráficos de crescimento X tempo� número de microrganismos: métodos diretos (contagem)
métodos indiretos (medida da atividade metabólica)
Tipos de divisão celular bacteriana:
- fissão binária- brotamento- brotamento- conidiósporos (Actinomicetes)- fragmentação de filamentos
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Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianas
Tempo de Geração
- é o tempo necessário para uma célula se dividir - número de bactérias dobra a cada geração - número de células = 2n (n =número de gerações)- tempo de geração médio = 1 – 3 horas- números muito grandes → usa-se escala logarítmica
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Escala logarítimica X aritmética para crescimento de populações bacteriana
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Fases do Crescimento
� demonstrado pela Curva de Crescimento bacteriano� experimentalmente: contagem da população em intervalos regulares de tempo� inóculo = pequeno número de células → meio líquido → acompanhamento
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Fases do Crescimento
1. Fase Lag
- pouca divisão celular → estado de latência- duração: horas a dias- metabolismo celular é ativo → enzimas e proteínas
2. Fase Log (crescimento exponencial)
- divisão celular ativa e intensa- tempo de geração é constante - maior atividade metabólica- grande sensibilidade a alterações ambientais
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Fases do Crescimento
3. Fase estacionária
- velocidade de divisão celular decai- número de células mortas = número de células novas- atividade metabólica decresce- fatores que contribuem para seu início: escassez de nutrientes, acúmulo de metabólitos, alterações de pH- fermentadores industriais: substituem o meio de crescimento constantemente = fase Log é indefinidaé indefinida
4. Fase de declínio (morte celular)
• número de céls mortas > > número de céls novas• população se reduz a uma fração mínima ou é completamente exterminada
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Quantificação do Crescimento Microbiano
� utiliza amostras pequenas (~ 1 ml de meio líquido, 1 g de meio sólido) � diluições seriadas de alíquotas de material (material concentrado)� tamanho total da população microbiana = extrapolações matemáticas
Métodos
1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelb) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio
2. Quantificação Indiretaa) Turbidimetriab) Peso secoc) Atividade metabólica
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1. Contagem em placa
- contagem do número de colônias (unidades formadoras de colônias - UFC)- sujeito a erros: considera cada colônia proveniente de 1 bactéria- vantagem: quantifica células viáveis- desvantagem: tempo de espera (~24h) → produção de alimentos perecíveis - padronização (FDA): somente placas com 25 – 250 colônias → diluição seriada da amostra
Quantificação Direta do Crescimento Microbiano
1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio
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1. Contagem em placa – diluição seriada
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Quantificação do Direta Crescimento Microbiano
� pour plate (em profundidade)� espalhamento em placa
1. Contagem em placa – técnicas para semeadura
ágar fundido a 50oC
� pour plate (em profundidade)
- volume do inóculo: 0,1 - 1,0 mL;- desvantagens: bactérias sensíveis ao calor;
aspecto das colônias pode auxiliar no diagnóstico
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�espalhamento em placa
1. Contagem em placa – técnicas para semeadura
- volume do inóculo: 0,1 mL- placa com ágar solidificado- espalhamento homogêneo com alça de vidro- crescimento apenas superficial
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� quando a amostra contém poucas bactérias: método de filtração
Ex.: água - bactérias são concentradas na superfície de membranas filtrantes especiais- volume amostra: ~100 mL- filtro é transferido para Placa de Petri contendo meio nutriente líquido: formação decolônias na superfície da membrana
1. Contagem em placa – técnicas para semeadura
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Quantificação Direta do Crescimento Microbiano
1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio
2. Método do Número Mais Provável (MNP)
- método estatístico (95% de probabilidade)- princípio: ↑ no bactérias = ↑ no diluições para crescimento negativo- aplicação: bactérias que não crescem em meio sólido; uso de meio líquido diferencial
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Quantificação Direta do Crescimento Microbiano
1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio
3. Contagem direta ao Microscópio
- utiliza lâmina especial (Petroff-Hausser) → 25 quadrados grande “quadriculados”- pequeno volume de amotra: preenchimento da câmara (pode utilizar corantes)- contagem em quadrados grandes e média- volume no quadrado grande = 1/1,25 X 106 mL- no de bactérias = no contado X 1,25 X 106 (para 1mL de amostra)
desvantagens:• bactérias móveis• céls. mortas• necessário grande no
vantagens:• não precisa incubação• resultado imediato
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Quantificação do Crescimento Microbiano
2. Quantificação Indiretaa) Turbidimetriab) Peso seco (bactérias/fungos filamentosos)→ filtraçãoc) Atividade metabólica → determinação do metabólito
�Aplicação: pesquisa e indústria
a) Turbidimetria
- proliferação de bactérias em meio líquido = ↑ densidade células = ↑ turbidez
- utiliza espectrofotômetro (colorímetro): quantidade de bactérias é inversamente
proporcional à quantidade de luz que atinge o detectorproporcional à quantidade de luz que atinge o detector
- pode ser usado para gráficos de crescimento bacteriano X tempo (associado à contagem)
- desvantagem: insensível a pequena quantidade de bactérias.
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Controle do Crescimento Microbiano
�Medidas utilizadas para prevenir contaminações que podem ter consequências danosas à saúde...
Você sabe o que é....
Esterilização?Esterilização?Desinfecção?Degerminação?Sanitização?Anti-sepsia?
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... alguns conceitos:
1. Esterilização:
�destruição de todas as formas de vida microbiana (vegetativa e esporos)�métodos: aquecimento, filtração (líquidos e gases), gases esterilizantes (óxido de etileno)
2. Esterilização comercial:�não é completa; �utiliza técnica para destruir endosporos de Clostridium botulinum (calor)�esporos de bactérias termofílicas permanecem
3. Desinfecção:- destrói formas vegetativas de microrganismos patogênicos em superfícies ou substâncias inertes- não atinge esporos- métodos: substâncias químicas (“desinfetante”), radiação UV, água fervente ou vapor
4. Anti-sepsia- destruição de formas vegetativas de microrganismos em tecido vivo- substâncias químicas: “anti-séptico”
Sepse = contaminação bacteriana; Asséptico = objeto/área livre de patógenos
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... alguns conceitos:
5. Degerminação- remoção mecânica de microrganismos em uma área delimitada- ex.: limpeza de pele com álcool antes da aplicação de injeção
6. Sanitização- processo utilizado para reduzir a contagem microbiana a níveis seguros- minimiza chances de transmissão de doenças- ex.: lavagem de talheres, copos e pratos em água quente ou seguido de aplicação de desinfetante químicoaplicação de desinfetante químico
PRODUTOS
Biocida/germicida: substância que leva à destruição de microrganismos� fungicida, bactericida, viricida
Bacteriostático, fungistático: substância que inibe o crescimento de bactérias
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Taxa de Morte Bacteriana
- é a percentagem de bactérias que morrem por unidade de tempo
�normalmente: tratamento com substâncias antimicrobianas → taxa de morte constante
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Fatores de Influenciam a efetividade de antimicrobianos:
1. Carga microbiana (↑ no bactérias = ↑ tempo)
2. Ambiente: presença de matéria orgânica, temperatura, pH
3. Tempo de exposição
4. Características microbianas
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Métodos de Controle Microbiano
1. Físicos
• Calor (úmido, seco, pasteurização)• Filtração• Baixas temperaturas• Alta pressão• Dessecação• Pressão osmótica• Radiação
2. Químicos
• Radiação • desinfetantes e anti-sépticos• halogênios• álcoois, fenóis• agentes tensoativos• compostos quaternários de amônio• conservantes de alimentos• antibióticos• esterilizantes gasosos• agentes oxidantes• aldeídos
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Métodos de Controle Microbiano
1. Físicos
• Calor (úmido, seco, pasteurização)
�Ação: desnaturação de proteínas (enzimas)
�aplicação: considerar degradação de outras substâncias/danos a materiais
Resistência ao calor tem grande variabilidade → parâmetros para esterilização:
• Ponto de Morte Térmica (PMT): menor ToC que destrói todos em 10 minutos (susp.líq)
• Tempo de Morte Térmica (TMT): menor tempo necessário para a destruição de todos
em uma certa ToC (cult. Líq.)
• Tempo de Redução Decimal (TRD): tempo necessário para destruição de 90% das
bactérias em uma certa ToC
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Calor úmido
- Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos (e esporos) e grande parte de vírus em 10 minutos�alguns vírus (hepatite) e endosporos resistem por mais tempo...
- Autoclave: maior temperatura devido à pressão (esterilização efetiva)
Métodos Físicos de Controle Microbiano
� destrói todos os microrganismos e endosporos em 15 min
� danifica alguns materiais
1 atm = 14,7 lb/pol2
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•Autoclave
�tempo de esterilização depende do volume, permeabilidade e conteúdo do material
Métodos Físicos de Controle Microbiano
�Marcadores de esterilização: etiquetas, marcadores de temperatura e tempo, uso de endosporos.
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Calor úmido
- Pasteurização:
-objetivo: eliminar microrganismos patogênicos;utilizado em alimentos perecíveis (leite, sorvete, iogurte, cerveja)
- tempo de pasteurização diferente
Pasteurização do leite: (teste de fosfatase)
- clássica: 63oC por 30 min
Métodos Físicos de Controle Microbiano
- clássica: 63oC por 30 min- alta temperatura e tempo curto (HTST): 72oC por 15 s (serpentina)
Esterilização do leite: (armazenagem posterior sem refrigeração)-Tratamento de temperatura ultra-elevada (UHT)- câmara de vapor: de 74oC a 140oC → 3 s → resfriamento rápido
Tratamentos equivalentes:
↑ ToC ↓tempo = mesma eficiência
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Calor seco
� Destruição por oxidação (combustão direta ou carbonização lenta)
Tipos:
- chama direta (bico de Bunsen)- incineração - em ar quente (estufa): 170oC por 2h
Métodos Físicos de Controle Microbiano
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Métodos Físicos de Controle Microbiano
Filtração:
- Membranas especiais (porosidade): 0,45 μm; 0,22 μm; 0,01μm- uso em materiais sensíveis ao calor: meios de cultura, vacinas, enzimas, etc.
Para o ar: filtros HEPA (0,3 μm)
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Métodos Físicos de Controle Microbiano
Baixas Temperaturas:
- Refrigeração comum = bacteriostáticos (0 – 7oC)�Listera monocytogenes: bastonete gram-positivo;infecta adultos (assintomático ou meningite – letalidade50%); transmissão pelas fezes; em gestantes(assintomático na mãe, meningite após nascimento,natimorto)
- Congelamento rápido: formas latentes (ainda viáveis)
- Congelamento lento: mais letal→ ciclos congelamento-descongelamento são usados
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Métodos Físicos de Controle Microbiano
Dessecação:
-liofilização: microrganismos permanecem viáveis, porém latentes na ausência de água- aplicação: preservação de espécies microbianas em laboratório,
conservação de alimentos (café)
- resistência microbiana à dessecação é variávelex.: Mycobacterium tuberculosis (meses)
Neisseria gonorrhoeae (1 hora)endosporos: indefinidoendosporos: indefinidovírus são resistentes
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Métodos Físicos de Controle Microbiano
Radiação:
os efeitos sobre os microrganismos dependem:- comprimento de onda- intensidade- duração da exposição
Radiações esterilizantes: - ionizante - não-ionizante
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Métodos Físicos de Controle Microbiano
Radiação ionizante
• raios gama, raios X, feixes de elétrons de alta energia• comprimento de onda menor que 1nm
�Principal efeito da radiação = ionização da água → radicais hidroxila reativos e tóxicos
Poder de penetração:raios gama (elementos radioativos) > raios X > feixes de elétrons
�Principal efeito da radiação = ionização da água → radicais hidroxila reativos e tóxicos� reação com componentes celulares = morte microbiana
Tempo de esterilização: feixes de elétrons (segundos de exposição) > raios gama (horas)
Aplicações:Conservação de alimentos (carnes, vegetais, etc.)Produtos farmacêuticos, materiais descartáveis de uso odontológico/médico:
-seringas, luvas, cateteres, suturas...
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Métodos Físicos de Controle Microbiano
Radiação não-ionizante• comprimento de onda acima de 1nm: luz UV
� mecanismo: danifica estrutura do DNA, inibem a replicação� comprimento de onda mais eficaz ± 260 nm
Aplicação:• lâmpadas germicidas (microrganismos do ar):
-Salas cirúrgicas, enfermarias, câmaras microbiológicas• desinfecção de produtos médicos
Desvantagem:Desvantagem:• baixo poder de penetração: a exposição deve ser direta• lesão à retina humana;• exposição prolongada = queimaduras e câncer de pele.
Efeito antimicrobiano da luz solar (> 280nm):� leva à formação de oxigênio livre no citoplasma (tóxico)� pigmentos = proteção
Microondas:• não apresentam efeito direto sobre microrganismos (efeito indireto, pelo calor)