aula8 desenho de primers
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Desenho de primersTRANSCRIPT
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Universidade Federal de PelotasFaculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Programa de Ps-Graduao em AgronomiaCENTRO DE GENOMICA E FITOMELHORAMENTO
IntroduoIntroduo BioinformticaBioinformtica
Professores:Luciano MaiaAntonio Costa de Oliveira
id4525199 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
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DesenhoDesenho de de oligosoligos
DesenhoDesenho de de primersprimers
Primer designPrimer designou
ou
Luciano Maia
DesenhoDesenho de de primersprimers
DesenhoDesenho de de iniciadoresiniciadoresou
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Qual a importncia do desenho de primers na biologia molecular??
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?
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?
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Borer et al. (1974) Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.J Mol Biol. 15;86(4):843-53.
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Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
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Entalpia (H) : Energia contida num sistema
Energia livre (G) : a energia til para realizar o trabalho para se obter tal sistema-chama energia livre de Gibbs.
Entropia (S):
Lembrando.termodinamica
Entropia (S): diferena entre H e G
Depende da complexidade do sistemaMaior complexidade = menor entropiaMenor complexidade = maior entropia
....desordem
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H2 + Cl2 => 2 HCl + 184,9 kJ
H = -184,9 kJ
( TC, 1 atm) (25C, 1 atm)
Exotrmica
Lembrando.termodinamica
H2 + I2 + 51,8 kJ => 2 HI
H = +51,8 k
ExotrmicaAbsorve energia
EndotrmicaLibera energia
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Lembrando.termodinamica
Reao exotrmica: reao qumica que libera calorenergia final dos produtos menor que a energia inicial dos reagentesDisso se conclui que a variao de energia negativa.Exemplo: COMBUSTIVEIS
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Lembrando.termodinamica
Reao Endotrmica: reao qumica que absorve calora energia final dos produtos maior que a energia inicial dos reagentes Desta forma a variao de energia positiva
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H2(g) + O2(g) = H2OEnergia liberada pela reao: H
H = - 68,3 kcal/mol
Energia gasta na organizao: S S = - 11,6 kcal/mol
Energia livre (G) - Saldo de energia (energia til para realizar trabalho):
Lembrando.termodinamica
G = H T . S G = - 68,300 + 11,6G = - 56,6 kcal/mol
G = espontnea a reao H
G = espontnea a reao H S (entropia desordem)
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Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
De 25 para 37C
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Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
De 25 para 37C
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Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
De 25 para 37C
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OBTENO DE PRIMERS
...
BASEADO NAS PROPRIEDADES TERMODINAMICAS DAS CADEIAS DE NUCLEOTIDEOS, SAL E TEMPERATURAS
R = 1.987 (cal/C mol) is the molar gas constant, = 50 109 concentration of the primer in its solutionT0 = 273.15 Ct = 21.6 C is an empirical temperature correction.
t may depend to ion concentration
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OBTENO DE PRIMERS
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OBTENO DE PRIMERS
Figure 2. The stability of a 25 base (CTG GTC TGG ATC TGA GAA CTT CAG G) varies with K+and Mg2+ concentrations. Competitive binding of ions to DNA is observed.
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Regras simples para desenho de primersRegras simples para desenho de primers
Tm vs TaDEFINIES...GENERALIZAES...
Temperature melting
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Temperatura de anelamento.empirico.experimental
Ta = Tm 3 CTa = Tm 5 C ??!!
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Devero ter entre 17-28 bases de tamanhodepende basicamente da TM e especifidade
A composio dever ter entre 40-60% de G+C (conteudo GC)exceto regies de final de UTR 3
Se possvel, a posio 3' terminar com G, C, CG ou GC:aumenta a estabilidade do emparelhamento
Regras simples para desenho de primersRegras simples para desenho de primers
TMs devero ser entre 55-65C
Se possvel, evitar que a 3 seja complementar ao 5para no formarem Loop
Se possvel, no deve haver complementaridade para no formar hairpin
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Tm Primer length
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G/C content GC clamp
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Self-Complementary
GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC
GGCGG T A TA GTT ACCGCC G
C T AT
1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.
2)Self Dimer : Dmero de primers senso2)Self Dimer : Dmero de primers senso
3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso
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Self-Complementary
GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC
GGCGG T A TA GTT ACCGCC G
C T AT
G: a energia requerida para quebrar a estrutura secundria.Valores de G muito negativos indicam grampos estveis e indesejados
3end Hairpin: G -2 kcal/molInternal hairpin: G -3 kcal/mol
1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.
3end Self Dimer: G -5 kcal/molInternal Self Dimer: G -6 kcal/mol
3end Crossf Dimer: G -5 kcal/molInternal Cross Dimer: G -6 kcal/mol
2)Self Dimer : Dmero de primers senso
3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso
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>seqncia_exemploATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCATCGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGA
Viso geral do desenho Viso geral do desenho de de primerprimer
GGDGATATCGGAGGGCGGGA
>sequenciaexemplo
REGIO AMPLIFICADA
PRIMER FOWARD PRIMER REVERSE
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Desenho de primersDesenho de primers
PROGRAMAS ON-LINE http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Padro ouro
Facilidade de usoDisponibilidade on line
ROZEN, S.; SKALETSKY, H. Primer3 on the WWW for general users and forbiologist programmers. Methods in molecular biology, v.132, p.365-386, 2000.
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
PROGRAMAS ON-LINE (2)http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
1) Localizar sequencia
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
2) Identificar posicoes alvo na sequencia, onde o primer dever flanquear
start stop Accession Locus O1815258 1818561 NM_001063247.11815258 1815581 exon + CDS 324 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1816286 1816530 exon + CDS 245 bp1816531 1816611 intron + 81 bp1816612 1816765 exon + CDS 154 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1817043 1817257 exon + CDS 215 bp1817258 1817350 intron + 93 bp1817351 1817468 exon + CDS 118 bp1817469 1817684 intron + 216 bp1817685 1817895 exon + CDS 211 bp1817896 1818132 intron + 237 bp1818133 1818194 exon + CDS 62 bp1818195 1818305 intron + 111 bp1818306 1818524 exon + CDS 219 bp1818525 1818561 exon + UTR 37 bp
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
>gi|115466225:1-1585 Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os06g0133900 (Os06g0133900) mRNA, complete cdsATGGCGGCGACCATGGCGTCCAACGCCGCGGCTGCGGCGGCGGTGTCCCTGGACCAGGCCGTGGCGGCGT CGGCGGCGTTCTCGTCGCGGAAGCAGCTGCGGCTGCCCGCCGCGGCGCGCGGGGGGATGCGGGTGCGGGT GCGGGCGCGGGGGCGGCGGGAGGCGGTGGTGGTGGCGTCCGCGTCGTCGTCGTCGGTGGCAGCGCCGGCG GCGAAGGCGGAGGAGATCGTGCTCCAGCCCATCAGGGAGATCTCCGGGGCGGTTCAGCTGCCAGGGTCCA AGTCGCTCTCCAACAGGATCCTCCTCCTCTCCGCCCTCTCCGAGGGCACAACAGTGGTGGACAACTTGCT GAACAGTGAGGATGTTCACTACATGCTTGAGGCCCTGAAAGCCCTCGGGCTCTCTGTGGAAGCAGATAAA GTTGCAAAAAGAGCTGTAGTCGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTTCCTGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAAG TGCAACTCTTCTTGGGGAACGCTGGAACTGCAATGCGACCATTGACAGCAGCCGTGACTGCTGCTGGTGG AAATGCAACTTATGTGCTTGATGGAGTGCCACGAATGAGGGAGAGACCGATTGGTGACTTGGTTGTCGGG TTGAAACAACTTGGTGCGGATGTCGACTGTTTCCTTGGCACTGAATGCCCACCTGTTCGTGTCAAGGGAA TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT
3) Sequencia
TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT GATGGCTGCTCCTTTGGCCCTTGGGGATGTGGAGATCGAAATCATTGACAAACTAATCTCCATTCCTTAC GTTGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAGGCAGAGCATTCTGATAGTTGGGACAGAT TCTATATTAAGGGAGGGCAGAAGTACAAATCTCCTGGAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGC GAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATCACTGGAGGCACTGTGACAGTTCAAGGTTGTGGTACGACCAGT TTGCAGGGTGATGTCAAATTTGCTGAGGTACTTGAGATGATGGGAGCAAAGGTTACATGGACTGACACCA GTGTAACCGTAACTGGTCCACCACGTGAGCCTTATGGGAAGAAACACCTGAAAGCTGTTGATGTCAACAT GAACAAAATGCCTGATGTTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTGCACTCTTCGCTGATGGTCCAACTGCTATC AGAGATGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAAACCGAAAGGATGGTTGCAATTCGGACCGAGCTAACAAAGC TGGGAGCATCGGTTGAAGAAGGTCCTGACTACTGCATCATCACCCCACCGGAGAAGCTGAACATCACGGC AATCGACACCTACGATGATCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTCGCTGCCTGCGCCGACGTGCCCGTG ACGATCAGGGACCCTGGTTGCACCCGCAAGACCTTCCCCAACTACTTCGACGTTCTAAGCACTTTCGTCA GGAACTGAACTGAGCTTTTAAAAGAGTGAGGTCTAGGTTCTGTTG
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A) Sem especificar uma regio alvoA) Sem especificar uma regio alvo
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
4) Inserir (copiar/colar) sequencia na pagina do Primer3
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
5) Configurar informaes/restries para o Primer3
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
6) Resultado (Parte 1)
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
6) Resultado (Parte 2)
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B) Especificar uma regio alvoB) Especificar uma regio alvo
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
start stop Accession Locus O1815258 1818561 NM_001063247.11815258 1815581 exon + CDS 324 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1816286 1816530 exon + CDS 245 bp1816531 1816611 intron + 81 bp1816612 1816765 exon + CDS 154 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1817043 1817257 exon + CDS 215 bp1817258 1817350 intron + 93 bp1817351 1817468 exon + CDS 118 bp1817469 1817684 intron + 216 bp1817685 1817895 exon + CDS 211 bp1817896 1818132 intron + 237 bp1818133 1818194 exon + CDS 62 bp1818195 1818305 intron + 111 bp1818306 1818524 exon + CDS 219 bp1818525 1818561 exon + UTR 37 bp
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
1) Especificando uma regio
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
2) Resultado (Parte 1)
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
2) Resultado (Parte 2)
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Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
2) Resultado (Parte 3)
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Desenho de primersDesenho de primers
PROGRAMAS stand-alone
Vector NTI
Facilidade de usoDisponibilidade programa livre
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Desenho de primersDesenho de primers
Vector NTI
1) Obter sequencia gravar em arquivo fasta
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Desenho de primersDesenho de primers
Vector NTI
2) Abrir arquivo fasta contendo no Vector
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
3) Interface do arquivo carregado no VectorNTI
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
4) Selecao de uma regiao para o desenho de primers
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
5) Menu para localizao de Primers
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
6) Menu para localizao de Primers
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
7) Resultados (1)
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
7) Resultados (2)
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
7) Resultados (3)
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Selecionando uma regiao para localizar primers no Vector
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
1) Marcar regiao Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI1) Marcar regiao Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
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Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI2) Resultado Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
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