AUTO MONTAGEM DA PROTEÍNA DO CAPSÍDEO DE VÍRUS EM MOLÉCULAS DE RNA DE DIFERENTES TAMANHOS: EXIGÊNCIA DE UMA ELEVADA MASSA

DE PROTEÍNA ESPECÍFICA EM RELAÇÃO A MASSA DE RNA

Amanda Letícia da Silveira

Bruna Canabarro Pozzebon

Mara Elisa Soares de Oliveira

Marina Guimarães Pacífico

Yasmim Freitas

INTRODUÇÃO

Partículas semelhantes a vírus podem ser formadas por auto montagem (VLPs) de proteínas do capsídeo a partir de moléculas de RNAs de comprimento crescente;

INTRODUÇÃO

Vírus do moteado clorótico do caupi (CCMV): RNA1 e RNA2: replicação viral; RNA3: proteína de movimento e capsídeo;

RNA1: 3,171 nt RNA2: 2,774 nt RNA 3: 2,173 nt

OBJETIVO

Examinar a auto montagem da CP do vírus do moteado clorótico do caupi com moléculas de RNA que variam de 140 a 12.000 nts.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados plasmídeos para clonagem de RNA;

Combinação RNA B1 e B3 por subclonagem direcional;

Amplificação dos moldes de DNA pra transcrição de RNAs curtos; (Influência do DNA no capeamento)

MATERIAL E MÉTODOS

Transcrição do RNA; (linearizou pra produzir um RNA transcrito).

Purificação da proteína do capsídeo do CCMV; (Retira o vírus da planta e realiza a extração e posteriormente verifica a concentração de proteína).

Montagem in vitro: Titulações preliminares e revelação em gel. (Estudou a montagem do vírus com diferentes concentrações de RNA).

MATERIAL E MÉTODOS

Montagem in vitro de VLPs. Colocou a concentração de RNA e misturou numa proporção de 6:1. Analisou as partículas e realizou coloração negativa.

Combinação de RNAs B1+B3: clonou, transcreveu in vitro e colocou em concentrações diferentes, para ver a concentração do RNA X Proteína e vice versa (influência na capsidação viral).

MATERIAL E MÉTODOS

Microscopia eletrônica de transmissão de VLP: Coloração negativa para comparar as partículas produzidas com a do vírus;

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

FIG 4 (A) Average capsid diameter as a function of RNA length. A plot of the average capsid diameter as a function of the length of ssRNA packaged, with each assembly carried out at the magic ratio in RNA assembly buffer (RAB), is shown. Each average contains contributions only from the capsids associated with the predominant multiplet (i.e., singlet, doublet, triplet, or quadruplet) for the corresponding RNA length (except in the case of 5,300 nt, where equal amounts of singlets and doublets were observed). The plot is divided along the abscissa into three regions: (I) the region between 140 and 1,000 nt, where we find predominantly singlet capsids that contain multiple ssRNA molecules; (II) the region between1,500 and4,000 nt, where each singlet capsid contains only one RNA molecule (the point denoted by an asterisk corresponds to the wt CCMV virion); and (III) the region above4,000 nt corresponding to the appearance of multiplet capsids sharing anRNAmolecule. The error bars represent the full width at half-maximum for each distribution. (B) Fraction of multiplets as a function ofRNAlength. The negative-stainTEMimages at the top of the panel show typical structures observed for singlets (A), doublets (B), triplets (C), and quadruplets (D). The frequency of multiplet capsids (bottom panel)—defined as the fraction of capsids present in the transmission electron microscopy as doublets (), triplets (o), and quadruplets ()—increases with ssRNA length after 3,200 nt. Singlets (OE) predominate for smaller lengths. Hand-drawn best-fit lines have been added to aid the eye in following the appearance and disappearance of the different multiplet populations as RNA length increases.

RESULTADOS

RESULTADOS DISCUSSÃO

FIG. 6 Distribuição dos diâmetros da cápside que aparecem nos singuletos e multipletos para cada comprimento de RNA empacotado. Contribuições dos singuletos, dupletos, tripletos, quádruplos são mostrados em preto, vermelho, verde e azul, respectivamente. A distribuição na parte superior esquerda é para peso de CCMV. Em cada distribuição das contagens foram normalizados para que a dimensão mais abundante. O número total de partículas medidas são mostradas em parênteses.

CONCLUSÕES

O RNA variando de 140 a 12.000nt pode ser embalado completamente por CCMV CP;

Proporção ideal de Proteína/RNA é de 6:1, para o encapsulamento;

RNAs curtos com até 2000nt são empacotados em estruturas T2 e T3 com 1 a 4 moléculas de RNA no capsídeo;

Os RNAs longos com até 4500nt são empacotadoss por 2 ou mais capsídeos T3 ou T4;

Os RNAs intermediários são empacotatos em capsídeos T3.