avaliação da diversidade microbiana amostragem, processamento e detecção técnicas tradicionais
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Avaliação da diversidade microbiana
Amostragem, processamento e detecção
Técnicas tradicionais
Dificuldades na avaliação (aula anterior):
• Falta de recursos humanos capacitados• Amplitude da diversidade• Erosão da diversidade• Falta de metodologias
Porquê avaliar?
•Assegurar que microrganismos desempenhem processos
necessários a produtividade e sustentabilidade.
•Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam
tolerantes a estresses.
• Amostragem
• Processamento
• Detecção e avaliação:
- Técnicas Fenotípicas
- Técnicas Imunológicas
- Técnicas Moleculares
• Etapa crítica
• São usados equipamentos especializados
• Devem ser considerados os seguintes fatores:
- Representatividade
- Não alterar os números e as atividades
- Evitar a introdução de contaminantes
- Estocar em condições adequadas
• Utilizar amostras compostas em ambientes com
distribuição heterogênea
• Determinar o número mínimo de amostras:
Os limites de confiança e extrapolações devem ser determinadas estatisticamente.
Como minimizar o problema da representatividade
Estratégias de amostragem
Acesso - direto
Número de microrganismos - Baixo
Equipamentos
Processamento (acoplado) - Concentração em filtros
O Ar é um meio restritivo para
os microrganismo
s (*)
(*) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos
Amostragemno
Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis
Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa
Diferente de outros ambientes, no ar os microrganismos não se multiplicam
Morte dos microrganismos no ar:
dN/dt = -k.N ou ln(N/No) = -k.t
k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte)
Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais
Fatores ambientais:Umidade relativa
Temperatura
Radiação (pigmentação, reparo do DNA)
Radicais de O2
Íons
Amostragem do ar
2. Simulação respiratória
(tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar)
3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG-30
1. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen
4. Centrifugação
5. Filtração
6. Deposição - Coleta passiva
Amostrador de Andersen
Simulação respiratória
Placas após incubação
Ágar Sangue
Ágar Dextrose
Impacto em líquido: AG-30
Equipamentos para amostragem do ar:
Amostragem passivaApenas microrganismos que caem nas placas
Amostragem ativaRecuperação forçada usando um volume determinado
Método usado nas estações espaciais(Dados NASA)
Importância Aeromicrobiologia extramuro:
Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS)
Fitopatógenos (ferrugem)
Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais
Despejo de resíduos (sólidos e líquidos)
Guerra biológica
Aeromicrobiologia intramuro:
Edifícios (doenças dos Legionários-Legionella
pneumophila, bactéria aquática disseminada
pelos aparelhos de ar condicionado e água potável)
Viagens de avião
Saúde pública - gripes
Acesso - Direto ou remoto
Números - elevados ou baixos
Equipamentos -Recipientes, filtros, ROV
Processamento - diluição ou concentração
Amostragemna
Depende do nível de matéria orgânica
Equipamentos
• ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park)
• Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente
Robô controlado remotamente abre o recipiente no local de amostragem para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades.
Acesso - Remoto
Número de microrganismos - elevado
Equipamentos - observatórios, sondas
Processamento - diluição
Amostragemem
Microbiota dos sedimentos
Cowen, 2004
Existem observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas
Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.
Controle da pressão da amostra.
Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes.
Ventarolas marinhas
Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica.
Fisk et al., 1998.
Sedimentos:
• Elevada diversidade de Bacteria e Archaea
• 180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos
• Existência de diversos micro-nichos
Acesso - direto
Números de microrganismos – normalmente elevado
Equipamentos - trados, pás
Processamento - diluição
Amostragemno
Problemas:
solo
Distribuição dos microrganismos em
agrupamentos 1-5 g solo
Elevada variabilidade entre amostras
Estatística
Solo propriamente dito
Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA - 1010 /g
Características:
1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações)
2. Populações com elevadas velocidades crescimento
3. Modificações ambientais locais
4. Troca genética
Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig.
Subsolo
BIOMASSA - 107/g
Distribuição não homogênea
Alguns números sobre a estrutura do solo
Microrganismos no solo
Em cada grama de solo tipicamente franco
• 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos• > 1X 1010 células viáveis• > 4 X103 espécies• < 0,1% são cultivadas in vitro
• Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA
• Poucos membros cultivados pertencem a ordens conhecidas
Maioria diversidade é desconhecida!
• Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar
usando riqueza específica e outros índices.
• Mas as estimativas da diversidade microbiana são difíceis:• heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura • Estratégias
•FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos)•CHO (carboidratos)•Técnicas moleculares usando PCR •Sorologia
Solo
Populações - 107 /g
Importantes patogênicos para
homem
Amostragemno
Cerca de 40 % da água consumida pelo homem provem de fontes subterrâneas
Existem gradientes nestas regiões que causam a movimentação dos microrganismos, como quando a água é movimentada em grandes volumes.
Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados.
Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa.
Microbiota do subsolo
Pesquisada nas últimas décadas (dificuldades de amostragem)
Inúmeros aeróbios
oligotróficos: 103-107/gAnálise comunidades: Archaea e Bacteria
Como vivem?
Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos
Metanogênicas
(CO2) CH4
Acetogênicas
(HCO3-) acetato
Bactérias redutoras de sulfatos (BRS)
(SO4-2) gás sulfídrico
A 3,4 Km abaixo da superfície
Possibilidades:
1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”.
2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície.
3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa.
1-10 microrganismos por g de rocha (109/ g de solo rizosférico)
Densidade das comunidades é desconhecida:
- Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de
inviável)
- Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo
movimento de água e nutrientes)
- Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório
- Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas.
- Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.
Subsolo
Plantas - seiva, filosfera, tecidos
Animais - sangue, dentes, excrementos, secreções
Não destrutivas
Amostras
Processamento
Concentração - centrifugação e passagem por filtros
Diluição - diluições seriadas
Problemas:Porosidade dos filtrosComposição química
Problemas:Composição do
diluenteTempo de misturaGrau de agitação
Muito raramente as populações microbianas ocorrem em
concentrações apropriadas para
a contagem.
Enriquecimento
Enriquecimento
Para microrganismos que metabolizam uma substância particular ou que ocorrem em baixas populações na amostra.
Desenvolvido por Beijerinck
Consiste na promoção de condições favoráveis específicas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo.
Ex 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio.
Ex 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de carbono é o naftaleno.
Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos.
Ex 4: Para isolar Bacillus formadoras de esporos deve-se aquecer a cultura
Detecção dos microrganismos
Métodos:
Fenotípicos - baseados no cultivo ou avaliação de certas
propriedades do microrganismos
Imunológicos – baseados nas características sorológicas
Moleculares - baseados na constituição genotípica
FenotípicosMétodos baratos e não requeremtreinamento diferenciado
Cultivo em meio de cultura
Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.
Isolamento cultura pura identificação
Ex: Geobacter metallireducens
CH3COO - + 8Fe3+ + 4H2O 2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+
Utilizar acetato como única fonte de C permite a detecção de microrganismos que usam ferro como fonte de energia
Avaliação da abundância
Enumeração
Biomassa
Atividade
Contagem direta
Contagem indireta
Contagem direta
Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio
Fluorescência, anticorpos
Vantagens:
Não requerem separação do microrganismo.
Fornecem estimativas elevadas
Desvantagens:
Ás vezes distingue entre viáveis e não viáveis.
Não permite análises subsequentes
Lâminas para contagem direta
Contagem indireta
Contagem em placas NMP
Técnica de Diluição e plaqueamento
Diluição seriada
Plaqueamento
Amplificação sinal fenotípico
colônias
Diluições seriadas (resultado)
Enumeração NMP
NMP – número mais provável
Contagem indireta
Vantagens:
- detecção de viáveis
- seletividade (uso de meios específicos)
Desvantagens:
- permite a contagem de somente alguns tipos
- Ausência dos não cultiváveis
• Bioluminescência: detecta ATP residual
• Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente
elétrica.
Avaliação da biomassaParâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade.
Expresso em gramas e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco
Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.
Proteína
Peptideoglicano
Quitina
LPS
DNA
Dentre outros
Indireta
DiretaFiltração
CentrifuçãoPesagem
Avaliação da atividade
Fotossíntese – taxa de produção primária
Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2
Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos
Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase ...
Viáveis mas não cultiváveis (VNC)
Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção.
Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.
Outras técnicas fenotípicas
MARA - multiple antibiotic resistance activity
CSU - carbon source utilization
Detecção de hospedeiros de vírus
FAME - Fatty acids methyl ester analysis
Perfil lipídico - FAME
Tem sido usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.
Existe variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos das membranas, os quais podem ser comparados com dados catalogados.
Após comparação, identifica-se os microrganismos desconhecidos.
Detecção com corantes vitais e fluorescência
População mista de Micrococcus luteus e Bacillus cereus com células vivas em verde.Corantes DAPI , fluoresceina e vermelho Texas.
Corantes ácidos de núcleo: DAPI e verde SYTOX. Células danificadas exibem fluorescência verde.