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Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com
cacaueiro
Alinne Batista Ambrósio
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira
Co-orientadora: Dra. Odalys García
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SUMÁRIO
Introdução
- Doença vassoura-de-bruxa
- Hormônios vegetais
- Por que a giberelina?
• Objetivos
• Metodologia
•Resultados preliminares
• Riscos
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INTRODUÇÃO
• Vassoura-de-bruxa
AIME AND PHILLIPS-MORA, 2005.
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• Sintomas
- Hipertrofia
- Hiperplasia
- Superbrotamento
- Frutos partenocárpicos
Introdução
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.
Introdução
auxina
giberelina
citocininas
etileno
ácido abscísico
• Hormônios vegetais
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DHPatógeno
Hospedeiro
Doença
Introdução• Desbalanço hormonal
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Introdução• Desbalanço hormonal
- O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormôniosproduzidos pela planta
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• Desbalanço hormonal
- Patógenos de plantas são capazes de eles mesmos produzirem fitohormônios
Introdução
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• Desbalanço hormonalIntrodução
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Introdução
Produção Alteração
• Na vassoura-de-bruxa
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POR QUE GIBERELINA?
• Giberelina ativa a divisão celular
Introdução
GAs CDKs G1 >>> S
G2 >>> M
Divisão de células meristemáticas
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Introdução
POR QUE GIBERELINA?
• A giberelina induz a elongação de tecidos intactos da planta mediados por proteínas, como expansinas e xiloglucano endotransglicosilase (XET)
GAs Expansinas e XETAfrouxamento
da parede celular
Aumento do tamanho da célula
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POR QUE GIBERELINA?Introdução
XET
Expansinas
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IntroduçãoPOR QUE GIBERELINA?
• A giberelina induz a expressão de invertases e amilases
Planta sadia
Me = medulaMu = canal de mucilagem
Me
Mu
Planta infectada
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Introdução• Sintomas
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Tratamento de sementes de arroz
com extrato de esporos de M. perniciosa em
comparação com tratamento com
giberelina.
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Introdução
Tratamento de plântulas de cacau com extrato de esporos de M. perniciosa
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• Giberelina
- GAs são diterpenóides
- Gibberella fujikuroi
- Hormônio vegetal que está envolvido na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta, incluindo germinação de sementes, crescimento do caule, indução de floração e maturação de frutos
- 136 GAs vêm sendo identificadas em plantas, fungos e bactérias
Introdução
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IntroduçãoGiberelinas ativas
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Gibberellin A12 aldehyde
P450-1P450-1
Gibberellin A7
Geranylgeranyl diphosphateent-Kaurene
Gibberellin A4 Gibberellin A14 aldehyde
ent-7alpha-Hydroxy-
kauroic acid ent-Kaurenoic acid
P450-4P450-4
P450-1P450-1P450-1P450-1
P450-1 e 2P450-1 e 2
ggs2ggs2 CPS / KSCPS / KS
GA4 GA4 desaturasedesaturase
Introdução
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Gene Clusterização/singlets banco M. perniciosa
BLAST NR bp total E value
GA4 desatura
se
CP02-S3-038-509-B10-E.F Gibberella fujikuroi des gene for GA4 desaturase
--- 0.0
P450-4 CP02-S2-040-354-G04-M.FCP02-S3-038-547-G02-S.FCP02-PF-096-002-E07-C.G
cytochrome P450-4 (ent-kaurene oxidase)
898770942
2e-124e-164e-13
P450-1 CP02-S2-038-269-G11-M.FCP02-S3-038-547-G02-S.F
cytochrome P450-1 (GA14-synthase 914770
2e-154e-16
ggds CP02-S2-032-338-A12-E.FCP02-S3-033-416-E10-C.G
geranylgeranyl diphosphate synthase
538909
1e-212e-17
P450-2 CP02-S3-040-626-G08-C.F P450II GA20 oxidase 1041 2e-16
GfCPS/KS CP02-S3-000-110-H11-C.F GfCPS/KS [Gibberella fujikuroi] 1019 1e-09
P450 -3 CP02-S2-000-144-G06-L.H cytochrome P450 -3 C13 oxidase) 569 3e-20
DELLA BINT-RT-001-014-B09-E.FBIEM-NT-001-006-F10-E.F
GIA/RGA-like gibberellin response modulator
657894
2e-424e-43
Cdc2 BINT-SP-001-017-A07-E.FBINT-SP-001-050-B02-E.F
putative receptor-like serine-threonine protein kinase
624527
4e-681e-53
GID1 receptor BINT-SP-001-023-C09-E.F Gibberellin receptor GID1 (Gibberellin-insensitive dwarf protein 1)
8e-14
Introdução
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27642 505
952 aa
Contig8670 Contig15446
182
CPS-KS
Introdução
1
4
392 aa
333
GGPP
Contig14680
Contig7333
22
1 342 aa
278
G4 des
Contig13951 Contig2062
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Introdução
Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo
Lavoura de EdvaldoLavoura do vizinho
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• Regulação da síntese de giberelina.
Introdução
AREA (NIT2) GAs
Nitrogênio
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Introdução
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Hipótese de trabalho
M. perniciosa na fase é capaz de sintetizar giberelina que deve produzir um desbalanço hormonal no cacaueiro criando as condições favoráveis para o estabelecimento do fungo e o desenvolvimento da doença.
Testar a hipótese formulada é algo fundamental para a compreensão da doença Vassoura-de-bruxa. Se ela for verdadeira, teremos conseguido a chave para o controle do problema através
do manejo do nitrogênio na planta.
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OBJETIVOS
1. Mapeamento físico
2. Quantificação da produção de giberelina durante a interação e a partir de sobrenadante do fungo (biotrofico e necrotrofico)
3. Analise de expressão dos genes em diferentes fases do ciclo de vida (esporos, micelio biotrofico e micelio necrotrofico)
4. Estudos de complementação de mutantes funcionais
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METODOLOGIAS
• Pulse field e Southern blot
• Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS)
• Real -Time PCR
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METODOLOGIAS
• Complementação de mutantes (Transformação dos mutantes de G. funjikuroi )
- Race – PCR
- Screening dos genes da síntese de GA em biblioteca de M. perniciosa em fago lambda EMBL3/BamH I
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RACE - PRC
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RACE - PRC PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 81. Hind III
2. 5’ / CPS-KS (1)
3. 5’ / CPS-KS (2)
4. CPS-KS (3) / 3’
5. 5’ / G4 (1)
6. G4 (2) / 3’
7. 5’ / GGPP (1)
8. GGPP (2) / 3’
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1. Hind III
2. cDNA necrotrófico
3. cDNA biotrófico
4. DNA genômico
5. Controle negativo
6. cDNA necrotrófico
7. cDNA biotrófico
8. DNA genômico
9. Controle negativo
G4-des
GGPP
1
2 3 4 65 97 8
RESULTADOS PRELIMINARES
Teste expressão
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1
2 3 4 65 97 8 1. Hind III
2. cDNA necrotrófico
3. cDNA biotrófico
4. DNA genômico
5. Controle negativo
6. cDNA necrotrófico
7. cDNA biotrófico
8. DNA genômico
9. Controle negativo
G4-des
CPS-KS
RESULTADOS PRELIMINARES
Teste expressão
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RESULTADOS PRELIMINARES
Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS
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• Identificação e quantificação de giberelinas durante interação
- Extratos de plantas diferentes (resistente e susceptível)
- Diferentes partes da planta
- Diferentes estádios
• Identificação e quantificação de giberelinas do sobrenadante - colaboração com grupos de pesquisa da Argentina
RESULTADOS PRELIMINARES
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RISCOS
• A expressão gênica não é evidencia de que o fungo produza o composto ativo
• Complexidade da caracterização de hormônios vegetais (em especial de giberelinas) devido à diversidade de precursores e de rotas biossíntéticas
• No Brasil não existem grupos estabelecidos com experiência na quantificação e identificação de giberelinas e existem poucos grupos com essa especialidade no mundo