avaliaÇÃo da toxicidade aguda de um novo composto … · 2016-11-10 · mmol de...
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Departamento de Química
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE UM NOVO COMPOSTO
COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTI-ALZHEIMER
Aluna: Daphne Schneider Cukierman
Orientador: Nicolás A. Rey
1. Introdução
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que representa,
atualmente, a forma mais comum de demência em idosos. O alemão Alois Alzheimer publicou
o primeiro estudo descrevendo esta doença há mais de um século, relatando sintomas de
falhas na memória, paranóia, problemas comportamentais e de linguagem, cérebro atrófico e
sinais de deposições protéicas anômalas no cérebro, denominadas placas senis e emaranhados
neurofibrilares [1]. Os emaranhados neurofibrilares são agregados anormais de fibras
citoplasmáticas que ocorrem nos corpos celulares neuronais, enquanto as placas são formadas
principalmente pelo peptídeo Aβ, considerado fundamental no desenvolvimento da patologia
e representando o conceito fundamental da hipótese da cascata amiloide, que descreve o
acúmulo desse peptídeo como sendo causal na etiologia da doença [2-5]. A observação de
ambas as placas amilóides extracelulares e os emaranhados neurofibrilares no interior das
células serve como um diagnóstico patológico definitivo da DA [6].
O peptídeo Aβ é encontrado em diferentes formas no cérebro de pacientes com DA,
cada uma com funções e propriedades específicas. A agregação dos monômeros de Aβ gera
oligômeros fibrilares que são a forma de aglomeração de maior toxicidade [7,8]. As principais
formas de Aβ presentes no sistema nervoso central são Aβ1-40 e Aβ1-42, sendo a última a forma
responsável pela formação dos oligômeros e, portanto, das placas senis, devido à sua maior
tendência de agregação [9-12]. Uma vez formados os agregados extracelulares, uma resposta
inflamatória é induzida e há danos nas células do sistema colinérgico, que é relacionado com
os processos de aprendizagem e memória [13].
Já os emaranhados neurofibrilares intracelulares são formados por outra proteína,
denominada tau, associada aos microtúbulos [14]. Esta proteína se torna hiperfosforilada no
cenário da DA, passando a ser insolúvel e agregando-se em fibrilas e emaranhados que podem
eventualmente levar à morte dos neurônios [4,15-18]. Diversos estudos apontam para uma
relação entre o acúmulo de Aβ e a hiperfosforilação da proteína tau [4,19-24]. Entretanto, este
desequilíbrio ainda é pouco compreendido.
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Alguns estudos apresentam evidências de que íons metálicos endógenos, tais como
zinco(II) e cobre(II), podem contribuir para a agregação do peptídeo Aβ, facilitando, assim, o
acúmulo das placas amilóides [17,25-30]. Por exemplo, estudos in vitro indicam que o zinco e
o cobre induzem a agregação rápida de Aβ sintético em ambiente aquoso [31,32], enquanto
estudos de quelação de metais demonstraram a dissolução dos agregados Aβ em extratos de
cérebros de pacientes acometidos pela doença e a inibição do acúmulo de placas amilóides em
ratos transgênicos modelos de DA [33,34]. Além disto, os metais que possuem atividade
redox induzem também o aumento de estresse oxidativo no cérebro através da formação de
espécies reativas de oxigênio, que são tóxicas e podem causar graves disfunções celulares
[35,36]. Existem também relatos que pacientes com DA apresentam concentrações elevadas
de cobre no cérebro, estando este associado tanto ao Aβ quanto aos emaranhados
neurofibrilares [37,38]. Diversos estudos também revelam que o Cu e o Zn competem pelos
mesmos resíduos de Aβ, tendo o Zn uma ligação mais rápida e favorecida [39,40].
Assim, a desregulação dos níveis normais de metais pode ser responsável pela
agregação e depósito de Aβ, assim como o acúmulo de ferro dentro dos neurônios, causando
danos oxidativos e neurodegeneração [31,35,41-46]. Desta maneira, procura-se investigar as
interações entre os metais e o peptídeo.
Diversos estudos clínicos têm sido realizados ao longo dos anos com o objetivo de
buscar um tratamento para a patologia, porém, atualmente, ainda não existe uma cura para a
DA. Entretanto, conta-se com medicamentos que ajudam a controlar parcialmente alguns de
seus sintomas. Por exemplo, a memantina, um fármaco aprovado pelo FDA (do inglês, Food
and Drug Administration), órgão de Administração de Comidas e Remédios dos Estados
Unidos, é usada para tratar sintomas de DA moderada e severa, e regula a atividade do
glutamato, um neurotransmissor envolvido na aprendizagem e memória que é danificado
durante os processos da DA. Além disto, busca-se também limitar o acúmulo de Aβ nos
tecidos através da diminuição de sua produção, porém esta abordagem tem se mostrado
complicada na prática. Além dos medicamentos que tratam os sintomas atualmente
disponíveis, é também comum a prescrição de fármacos para o controle da depressão e a
vitamina E, um antioxidante que pode proteger as células do cérebro e outros tecidos do corpo
de desgaste químico e estresse oxidativo.
Visando evitar o acúmulo de Aβ nos tecidos a partir de uma abordagem baseada em
uma das hipóteses mais atuais referentes à DA, a hipótese metálica, onde é investigada a
importância de metais fisiológicos na patologia, diversos estudos analisaram a possibilidade
de agentes quelantes de metais para a remoção dos mesmos e a consequente solubilização do
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peptídeo Aβ [47,48]. Os resultados, porém, mostram graves efeitos adversos devido ao uso
prolongado desses quelantes. Portanto, os agentes quelantes não são ideais, pois, em sua
maioria, não possuem as propriedades necessárias para atravessar a barreira hematoencefálica
e não são específicos para os íons metálicos complexados com o Aβ, levando a uma quelação
indiferenciada de metais fisiológicos essenciais [49,50].
Uma classe emergente de agentes terapêuticos que podem vir a retardar ou prevenir o
progresso da demência na DA são os MPACs, compostos atenuadores da interação metal-
proteína (do inglês, Metal Protein Attenuating Compounds), que diferem conceitualmente de
agentes quelantes tradicionais por possuírem afinidade moderada por íons metálicos. Desta
maneira, ao invés de se ligarem e removerem sistematicamente os íons dos tecidos, os MPACs
restauram a homeostase dos metais fisiológicos, reduzindo o estresse oxidativo ao competir
com o peptídeo Aβ pela ligação com biometais, prevenindo a sua oligomerização induzida por
Zn2+
e Cu2+
e a produção de radicais livres [34,35,51,52].
Neste contexto, podemos citar o clioquinol, um quelante pequeno e lipofílico, que se
mostrou um possível fármaco para a terapia da DA devido à sua alta afinidade por íons Zn2+
e
Cu2+
[53-56]. Esta molécula apresentou resultados positivos em um estudo que adotou um
modelo transgênico da doença para a redução da formação de placas amilóides do cérebro
[57]. Seu mecanismo de ação foi atribuído à remoção de metais a partir das placas. Entretanto,
foram observados efeitos colaterais severos, o que estimulou a busca de análogos para a
continuação das pesquisas [55,58-60]. O ligante PBT2, parte de uma nova geração de
compostos derivados do clioquinol, reduziu a agregação de Aβ, limitou a toxicidade dos
oligômeros e redistribuiu íons metálicos nos neurônios, sendo utilizado em ratos modelos da
doença e fase 2 de estudos clínicos [58,61-63].
À medida que a hipótese metálica ganha cada vez mais fundamento com a evolução da
compreensão da doença, novas abordagens para o tratamento da DA são propostos neste
campo de pesquisa, buscando-se um tratamento que atinja as causas da doença, e não somente
seus sintomas.
2. Objetivo
Este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos biológicos, em termos de toxicidade
e segurança de uso, de um composto com potencial anti-Alzheimer em modelos biológicos
sadios (ratos Wistar). Os efeitos do composto, denominado PCIH, nos animais foram
investigados através de diversas técnicas analíticas, bioquímicas e proteômicas, que permitem
a avaliação do potencial farmacológico do mesmo.
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3. Material e métodos
3.1. Síntese do ligante
A síntese foi realizada em um balão de reação de 50,0 mL, onde foram diluídos 10,0
mmol de 2-piridinacarboxaldeído em 10,0 mL de uma solução 50 % (V/V) etanol / água.
Gotejou-se a esta solução 10,0 mmol de isoniazida, solubilizada em 20,0 mL da mesma
solução. O sistema foi mantido sob agitação constante e refluxo por 30 min. Em seguida, a
mistura reacional foi resfriada para a formação de precipitado. O precipitado formado
apresentou cor branca cristalina, e foi filtrado e lavado com éter dietílico, e seco à temperatura
ambiente.
3.2. Caracterização do ligante
3.2.1 Espectroscopia Vibracional no Infravermelho Médio e Afastado
Obteve-se o espectro de IV médio do composto em um espectrômetro Perkin Elmer
2000 FT-IR, utilizando pastilhas de KBr. O espectro foi analisado na faixa de 4000 a 450 cm-
1. O espectro de IV afastado foi obtido no mesmo espectrômetro, utilizando pastilhas de
polietileno. As principais bandas características dos grupos funcionais presentes no ligante
foram comparadas com o espectro e dados disponíveis na literatura para confirmar a
identidade do produto.
3.2.2. Análise Elementar
A análise dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio foi realizada em duplicata,
de forma simultânea a partir da curva de calibração obtida com padrões secos e de alta pureza,
em um analisador elementar (CHN), modelo EA112, da Thermo Electron.
3.2.3. Testes de Estabilidade
A estabilidade do PCIH foi determinada através de análise de varredura em
espectrofotômetro de absorção molecular na região do UV-Vis, modelo Perkin Elmer Lambda
35, entre os comprimentos de onda de 200 até 800 nm, em temperatura ambiente. A
estabilidade hidrolítica do ligante foi verificada por espectroscopia UV-Vis. O composto foi
avaliado nas condições de injeção nas cobaias, DMSO 10%, ao longo de 12 h.
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3.2.4. Ensaios de toxicidade aguda
Todos os experimentos envolvendo o uso de cobaias foram aprovados por uma
Comissão de Ética da PUC-Rio e universidades colaboradoras (protocolo no
CEUA/036/2013), e estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal
adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório/Colégio Brasileiro
de Experimentação Animal, em conformação com o Guia da Sociedade Norte Americana de
Neurociências e Comportamento para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório [64].
Os ratos Wistar machos adultos sadios tinham entre 180 e 240 dias de vida. Foram
utilizados apenas machos, para evitar a influência do ciclo estral das fêmeas nos parâmetros
analisados. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Psicologia da PUC-
Rio, em temperatura controlada (24 ± 1°C) e com os ciclos circadianos mantidos (12h/12h
luz-escuridão).
Utilizou-se um grupo controle (n=4), não submetido a nenhum tratamento, um grupo
veículo (n=4), injetado apenas com a solução utilizada na solubilização do ligante (solução
salina contendo 10% DMSO), e um grupo injetado com o composto de interesse (n=8). Os
ratos foram injetados intraperitonealmente com o composto em solução salina contendo 10%
DMSO mantendo a relação de 200 mg por kg de peso corpóreo das cobaias. Os animais foram
mantidos em observação, com alimentação e água fornecidas ad libitum, por 72 h. Após as 72
h os ratos foram sacrificados por guilhotinagem. Os órgãos de interesse, cérebro, fígado,
coração e rins, foram extraídos, limpos com água ultra-pura e pesados antes de serem
aliquotados para as diferentes análises e congelados a -20o C. Eventuais modificações
macroscópicas na anatomia interna das cobaias foram anotadas e levadas em consideração no
tratamento dos dados.
3.3. Avaliação do estresse oxidativo nos animais injetados
Foram realizadas a quantificação do tripeptídeo glutationa reduzida (GSH) e da
metaloproteína metalotioneína (MT), que atuam como biomarcadores de estresse oxidativo, e
reguladora de homeostase metálica, respectivamente, permitindo sua avaliação nas cobaias
injetadas com o composto em comparação com as cobaias de controle.
3.3.1. Extração e quantificação de GSH
A GSH foi extraída a partir de uma porção úmida congelada dos órgãos de interesse. A
porção foi pesada em triplicata e homogeneizada em tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1
,
contendo 0,25 mol L-1
sacarose, pH 7,0, em atmosfera parcialmente inerte (fluxo de
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nitrogênio) para minimizar a oxidação da proteína. As amostras foram centrifugadas, a 11.000
x g por 30 minutos a 4 ºC, e os sobrenadantes foram separados, armazenados em microtubos
estéreis, passados novamente pelo fluxo de nitrogênio e congelados até análise.
As concentrações de GSH foram calculadas utilizando GSH (Sigma-Aldrich,
Alemanha) como padrão externo, plotando uma curva analítica de no mínimo 5 pontos. As
amostras foram quantificadas de acordo com a literatura [65]. Ácido 5,5’ – ditio-bis-(2–
nitrobenzóico) (DTNB) 0,25 mmol L-1
em tampão fosfato 0,1 mol L-1
de pH 8,0 foram
acrescentados às amostras e aos pontos da curva na proporção de 1:1. Após incubação ao
abrigo da luz por 15 min, as absorvâncias das amostras foram lidas em espectrofotômetro
(Perkin Elmer Lambda 35, EUA) a 412 nm.
3.3.2. Extração e quantificação de MT
A extração de MT foi baseada na extração térmica proposta por Erk e colaboradores
[66], com modificações. A MT foi extraída a partir de uma alíquota liofilizada dos órgãos de
interesse. Uma porção de cada órgão foi pesada em triplicata e homogeneizada em tampão de
Tris-HCl 20 mmol L-1
pH 8,6, Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) 0,5 mmol L-1
, como
agente antiproteolitico, e β-mercaptoetanol 0.01%, como agente redutor, para evitar a
oxidação da MT. As amostras homogeneizadas foram centrifugadas 20.000 x g por 60 min a 4
ºC, de modo que a MT se encontrasse nos sobrenadantes, que foram separados em microtubos
estéreis, e submetidos à aquecimento a 70 oC durante dez minutos em banho-maria
termostatizado (Kacil, BM-02). As alíquotas foram novamente centrifugadas, a 20.000 x g por
30 minutos a 4 ºC, de modo que a MT se encontrasse nos sobrenadantes, que foram separados
e armazenados em microtubos estéreis, sendo este volume medido. Todo o sobrenadante foi
transferido para microcolunas de separação Vivaspin® (Sartorius Stedim Biotech GmbH,
Alemanha) e centrifugadas a 15.000 x g por 30 minutos a 4 ºC. Como o tamanho de corte
molecular das colunas é menor que o tamanho da proteína de interesse (3000 Da), as MT
permaneceram na parte superior da coluna e todas as proteínas menores que este tamanho de
corte passaram pela coluna e foram então descartadas. O volume final na parte de cima da
coluna foi medido, separado em microtubos estéreis e congelado até análise [66,67].
A quantificação de MT foi realizada por espectrofotometria através da reação de
Ellman [65] utilizando GSH (Sigma-Aldrich, Alemanha) como padrão externo, plotando uma
curva analítica de no mínimo 5 pontos. As concentrações de MT nas amostras foram
calculadas utilizando a relação de 1 mol de MT sendo equivalente a 20 mols de GSH [68-70].
As amostras foram tratadas com uma solução de EDTA 4 mmol L-1
contendo 1 mol L-1
de
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HCl e DTNB, 0,43 mmol L-1
em uma solução 2 mol L-1
de NaCl e tampão fosfato 0,2 mol L-1
de pH 8,0. Após incubação ao abrigo da luz por 30 min, as absorvâncias das amostras foram
lidas em espectrofotômetro (Perkin Elmer Lambda 35, EUA) a 412 nm.
3.2.3. Quantificação de biometais
A quantificação dos biometais foi realizada em alíquotas liofilizadas dos órgãos das
cobaias. Aproximadamente 100 mg de cada amostra foram acidificados com 1 mL de ácido
nítrico subdestilado (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), e mantidas em descanso overnight. O
material de referência (MRC) utilizado foi o DORM-4 (Dogfish muscle – músculo de peixe-
cão, NRC, Canadá), em duplicata. Após o descanso, as amostras foram aquecidas a 80-100 °C
durante aproximadamente 4 horas para digestão. Após o resfriamento, as amostras e os MRC
foram avolumados a 10 mL e duas diluições (de 10x e 100x) foram preparadas. Três brancos
de análise foram preparados da mesma forma. Os elementos de interesse, 57
Fe, 65
Cu e 66
Zn,
foram determinados por ICP-MS, modelo ELAN DRC II (Perkin Elmer, Sciex, Norwalk, CT,
EUA), no modo padrão, sem o uso de célula de reação. As amostras foram introduzidas
usando um nebulizador do tipo Meinhard com uma câmara ciclônica twister. Durante a
análise, 103
Rh foi utilizado como padrão interno em concentração de 20 mg L-1
. Os resultados
foram obtidos através da média das três leituras feitas para cada amostra, após calibração
externa com soluções de calibração multielementares obtidas através de diluições apropriadas
da solução padrão (Merck IV).
3.2.7. Análises estatísticas
Utilizou-se teste estatístico ANOVA para analisar as diferenças entre os grupos nos
ensaios de avaliação do estresse oxidativo do composto nas cobaias. Diferenças foram
consideradas significativas quando p < 0,05.
4. Resultados e discussão
4.1. Síntese e caracterização do ligante
A síntese, que possui apenas uma etapa, foi realizada com 67% de rendimento. Trata-
se de um processo ambientalmente correto, gerando apenas água como subproduto. A reação
de condensação entre a 2-piridinacarboxaldeído e a isoniazida está representada na Figura 1
abaixo.
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Figura 1 – Reação de síntese do PCIH.
O espectro do ligante na região média do infravermelho é mostrado na Figura 2, a
seguir. As principais bandas do espectro estão listadas após a figura.
Figura 2 – Espectro vibracional no IV médio do ligante PCIH.
Os grupos OH e NH são muito característicos e suas vibrações de estiramento são
observadas por volta de 3500 - 3300 cm-1
[71]. No espectro de infravermelho do PCIH foi
observada uma banda alargada muito intensa em 3270 cm-1
, atribuída à presença de água no
composto. A absorção ν(NH) não foi observada, uma vez que a larga e intensa banda de água
a cobre completamente no espectro.
Grupos funcionais que apresentam momento dipolo significativos, tais como o grupo
carbonílico, possuem absorções intensas no IV. A banda de absorção de estiramento do grupo
carbonílico, ν(C=O), aparece em uma região relativamente livre de outras vibrações (1800-
1600 cm-1
) [72]. Para o PCIH, ν(C=O) origina uma das bandas mais fortes do espectro de
infravermelho, atribuída em 1663 cm-1
.
As absorções dos estiramentos do grupo azometina, ν(C=N), costumam ser próximas
ao do estiramento do grupo carbonílico [71]. As bandas de estiramento C=N de bases de
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Schiff alquiladas são encontradas geralmente na faixa de 1674 - 1649 cm-1
, dentro da região
comum de absorção para ν(C=O) [73,74]. Para o PCIH, é possível perceber que o sinal
assinalado em 1663 cm-1
corresponde, na verdade, à banda indicada somada à um ombro. À
este ombro atribuiu-se a absorção do estiramento do grupo azometina, ν(C=N).
No espectro é possível também observar as bandas características da presença de anel
aromático, tais como as bandas relacionadas à ligação dupla entre carbonos e à ligação dupla
entre carbono e nitrogênio da piridina. Estas diversas bandas ocorrem na região entre 1600-
1450 cm-1
.
A análise elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN) mostrou-se
satisfatória, apresentando resultados próximos dos valores teóricos. Análise elementar -
percentual encontrado (percentual calculado): C 55,3 (54,96); H 5,4 (5,38); N 21,8 (21,36). O
ligante sintetizado corresponde ao PCIH ∙ 2H2O e apresenta fórmula molecular C12H14N4O3 e
massa molar 262,26 g mol-1
.
O ligante mostrou estabilidade hidrolítica nas condições utilizadas para a injeção nas
cobaias, ou seja, em solução de 10% DMSO/água, onde, após 12 horas, 90% do composto
ainda estava em sua forma original, sem quebra hidrolítica. O espectro obtido está
apresentado na Figura 3 abaixo.
Figura 3 – Espectro de absorvância molecular UV-Vis do PCIH ao longo de 12 h.
4.2. Ensaios de toxicidade aguda e avaliação do estresse oxidativo
Durante as 72 h de observação entre a injeção e o sacrifício não ocorreu nenhuma
mortalidade das cobaias injetadas tanto com o veículo quanto com o PCIH. Os ratos sadios
injetados com o PCIH não apresentaram mudanças comportamentais durante este período e,
após o sacrifício, os órgãos retirados para análise não mostraram anomalias macroscópicas,
quando comparados com o grupo controle e o grupo injetado apenas com o veículo.
A toxicidade aguda diz respeito aos efeitos tóxicos que são produzidos por exposições
a uma substância por um curto período de tempo, na qual, em geral, as manifestações ocorrem
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rapidamente. A injeção de PCIH correspondente a 200 mg do composto por quilo de peso
corpóreo das cobaias se encaixa neste contexto, sendo considerada uma superdose. O fato das
cobaias não morrerem durante o período de 72 h, seu comportamento normal e a falta de
alterações morfológicas macroscópicas nos órgãos são, quando tomados em conjunto, fortes
indicadores de que o ligante é atóxico em altas concentrações, considerando-se uma exposição
aguda.
A glutationa reduzida (GSH) corresponde à primeira defesa do corpo contra radicais
livres, ou seja, ela age como um poderoso antioxidante que protege as células dos danos
gerados por estas espécies [75]. A presença difundida de íons metálicos com atividade redox
no contexto da doença de Alzheimer induz o estresse oxidativo no cérebro do paciente, pois
certos íons metálicos como, por exemplo, Fe2+
e Cu2+
, produzem espécies reativas de
oxigênio (EROs) através de reações de Fenton. As EROs são espécies altamente reativas que
reagem com biomoléculas tais como lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos, causando danos
que podem levar até a morte celular [76]. Assim, a investigação dos níveis de GSH nas
cobaias no contexto deste trabalho teve como objetivo analisar os efeitos do PCIH com
relação a um parâmetro de estresse oxidativo. Uma vez que as cobaias utilizadas são modelos
de ratos Wistar sadios, ou seja, não apresentam sintomas da doença de Alzheimer, as cobaias
do grupo controle foram consideradas como apresentando estresse oxidativo normal ao
organismo nos tecidos estudados, e os níveis de GSH medidos para este grupo são
equivalentes aos valores normais de ratos sadios. Os resultados desta análise estão
apresentados na Figura 4.
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Figura 4 – Níveis de GSH em cérebro, fígado, rins e coração de ratos Wistar saudáveis,
injetados com DMSO 10% e injetados com PCIH.
Não houve diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os grupos controle,
veículo e ratos injetados com PCIH para os níveis de GSH no cérebro, no fígado e nos rins,
mostrando que o ligante não gerou estresse oxidativo nestes órgãos. No coração houve
diminuição estatisticamente significativa da GSH nas cobaias injetadas com o PCIH.
As metalotioneínas (MTs) são uma família de proteínas de baixo peso molecular cuja
principal função biológica está relacionada à homeostase de elementos essenciais e a
detoxificação de elementos não essenciais, atuando também contra o estresse oxidativo [77].
Cerca de 30% dos aminoácidos da cadeia das MTs correspondem a cisteínas, que apresentam
um grupo tiol em sua cadeia lateral. Por se tratarem de ácidos macios, os grupos sulfidrila
possuem alta afinidade por metais, podendo ligar-se a íons macios tais como Zn2+
e Cu2+
, que
estão presentes em altas concentrações em determinadas áreas do cérebro, devido à
homeostase desregulada dos mesmos característica da DA [78].
No contexto do presente trabalho, avaliou-se os níveis de MTs como parâmetro
indicativo de deshomeostase metálica gerado pela injeção do PCIH. Os resultados para
cérebro, fígado, rins e coração das cobaias injetadas com o PCIH, das cobaias injetadas
apenas com o veículo e do grupo controle estão apresentados na Figura 5.
Figura 5 – Níveis de MTs em cérebro, fígado, rins e coração de ratos Wistar saudáveis,
injetados com DMSO 10% e injetados com PCIH.
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Tanto para o cérebro, quanto para o fígado, observou-se que a injeção das cobaias com
o veículo causou um aumento estatisticamente significativo (p<0.05) no nível de MTs quando
comparado ao grupo controle. Resultados similares, de aumento do nível do RNA mensageiro
referente a MT em ratos expostos à DMSO foram reportados [79]. Entretanto, a presença do
ligante dissolvido no veículo parece amenizar o efeito tóxico do mesmo, uma vez que os
níveis de MTs foram mantidos à normalidade no grupo injetado com PCIH. Não houve
diferença estatisticamente significativa para nenhum dos grupos nos rins, e no coração houve
decréscimo estatisticamente significativo para o grupo injetado com o ligante em relação ao
grupo controle.
Um tratamento com um MPAC se difere daquele com agentes quelantes tradicionais,
pois não busca a eliminação dos metais envolvidos na patologia, uma vez que estes não se
apresentam em excesso, e sim a redistribuição dos mesmos promovendo a restauração da
homeostase metálica no cérebro.
Buscando avaliar o perfil do ligante como um MPAC, quantificou-se os metais
fisiológicos Fe, Cu e Zn nos diferentes órgãos dos 3 grupos de ratos e os resultados estão
dispostos na Figura 6 a seguir.
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Figura 6 – Níveis de Zn, Fe e Cu em cérebro, fígado, rins e coração de ratos Wistar saudáveis,
injetados com DMSO 10% e injetados com PCIH.
Os pequenos decréscimos na concentração de ferro observados no cérebro e no fígado
eram esperados, uma vez que o PCIH é uma molécula quelante de ferro utilizada no
tratamento de doenças que apresentam excesso de ferro no organismo. Não foi observada
nenhuma alteração estatisticamente significativa na quantidade de ferro nos rins e no coração.
Em todos os órgãos houve aumento estatisticamente significativa (p<0.05) nos níveis de zinco
apenas para o grupo injetado com o PCIH, não havendo diferenças entre o grupo controle e o
grupo injetado com o veículo. Houve também um pequeno aumento estatisticamente
significativo (p<0.05) nos níveis de Cu nos rins dos ratos injetados com o PCIH em
comparação com os ratos controle.
O grupo de pesquisa do LABSO-Bio também vem conduzindo, em parceria com o
Instituto Max Planck da Argentina, experimentos in vitro de RMN uni-(1H) e bidimensionais
(1H-15N HSQC) envolvendo Cu(II)-Aβ e Zn(II)-Aβ na presença de PCIH, que demonstraram
que o ligante inibe a interação de Aβ com os biometais por um mecanismo que parece
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envolver o seu sequestro, evitando seu depósito ligados ao peptídeo, ressolubilizando o
mesmo.
5. Conclusões
Neste trabalho estudou-se uma hidrazona derivada do agente anti-tuberculose
isoniazida e seu potencial para atuar como um MPAC no tratamento da doença de Alzheimer.
A síntese do ligante PCIH envolve uma única etapa, ambientalmente correta, apresentando
alto rendimento e elevada eficiência atômica. A confirmação da sua identidade molecular e
estrutural foi possível através de técnicas analíticas. A análise elementar do PCIH confirma
que o produto obtido apresenta teores dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio
similares ao valor teórico proposto. A espectroscopia vibracional de absorção no
infravermelho médio permitiu o estudo de particularidades da molécula, tais como o
estiramento do grupo funcional formado, C=N. O ligante mostrou-se estável nas condições
utilizadas para a injeção nas cobaias, onde, após 12 horas, apresentou 90% da sua forma
original.
Por sua vez, os testes in vivo com ratos sadios injetados com 200 mg kg-1
de PCIH
mostraram que não houve mortalidade ou mudanças comportamentais das cobaias durante as
72 h de observação entre a injeção e o sacrifício. Os níveis dos biomarcadores de estresse
oxidativo e homeostase metálica estudados não apresentaram diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos controle e ratos injetados com o PCIH, tanto no cérebro, quanto
no fígado e nos rins, indicando que o composto é atóxico. A diminuição dos níveis destes
parâmetros no coração deve ser estudada a fim de se compreender melhor o significado destes
resultados.
A avaliação dos níveis de biometais, em conjunto com os dados obtidos com os
experimentos realizados in vitro indicam o grande potencial do PCIH para atuar como um
MPAC no tratamento da doença de Alzheimer sem causar deshomeostase metálica ou estresse
oxidativo.
O principal objetivo que deseja-se atingir ao se propor compostos que possam agir
como MPACs no tratamento da DA é a desagregação do peptídeo Aβ através da captura de Cu
e Zn, e a conseguinte redistribuição destes metais no cérebro. Pequenos efeitos colaterais tais
como a diminuição dos níveis de GSH e MT no coração e o aumento de Cu nos rins podem
ser eventualmente considerados aceitáveis, ou até mesmo não estarem presentes em dosagem
clínica do possível fármaco. Deve-se estudar o significado e as consequências destes
resultados para que seja possível traçar um melhor perfil farmacológico do composto. Os
Departamento de Química
resultados deste trabalho, juntamente com outros resultados publicados sobre o composto pela
linha de pesquisa do grupo LABSO-Bio mostram que, de forma geral, as hidrazonas são
excelentes candidatas para futuros testes e estudos bioquímicos no contexto de sua utilização
como um potencial MPAC no tratamento da doença de Alzheimer.
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