avaliação da resposta imunitária celular a antígenos...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF Pós Graduação em Clínica Médica – Pneumologia Tese de Doutorado
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Rio de JaneiroMarço de 2009
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Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de
Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Drª Maria Helena Feres Saad
Profª Drª Leila de Souza Fonseca
Rio de JaneiroMarço de 2009
Cabral, Vinicius Ribeiro Avaliação da resposta imunitária celular a antígenos micobacterianos no
sangue periférico de pacientes tuberculosos e contatos saudáveis / Vinicius Ribeiro Cabral. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2009.
xi, 136 f. : il. ; 31 cm.
Orientador: Maria Helena F. Saad e Leila de Souza Fonseca. Tese (Doutorado) – UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-
Graduação em Clínica Médica – Pneumologia, 2009. Referências Bibliográficas: f. 108-124.
1. Tuberculose pulmonar - imunologia. 2. Tuberculose pulmonar -diagnóstico. 3. Mycobacterium tuberculosis - imunologia. 4. Antígenos de bactérias - imunologia. 5. Imunidade celular. 6. Linfócitos T - imunologia. 7. Citocinas - imunologia. 8. Imunofenotipagem. 9. Expressão gênica. 10. Humanos. 11. Feminino. 12. Masculino. 13. Adulto. 14. Meia-idade. 15. Estudos Prospectivos. 16. Pneumologia – Tese. I. Saad, Maria Helena Féres. II. Fonseca, Leila de Souza. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica – Pneumologia. IV. Título.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Rio de Janeiro, 11 de Março de 2009.
Aprovada por:
_______________________________________
Presidente: Drª. Maria Helena Féres Saad, Pesquisadora Titular - FIOCRUZ
_______________________________________
Drª. Danuza de Almeida Esquenazi, Profª Adjunta - UERJ
_______________________________________
Drª.Maria Cristina Vidal Pessolani, Pesquisadora Titular - FIOCRUZ
_______________________________________
Drº. Neio Lucio Fernandes Boechat, Profº Adjunto - UFRJ
_______________________________________
Drº. Walter Martin Roland Oelemann, Prof° Adjunto - UFRJ
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RREESSUUMMOO
CABRAL, Vinicius Ribeiro. Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
A tuberculose é a doença infecciosa que mais mata no mundo, mas ainda permanece um
mistério como ocorre a interação do parasita com o hospedeiro. O objetivo neste trabalho foi
avaliar o perfil de resposta imunitária celular de pacientes com tuberculose pulmonar e seus
contatos recentes e indivíduos sadios de área endêmica, utilizando antígenos brutos ou
recombinantes, tais como 16 kDa, AlaDH, ESAT-6/CFP-10 e 38 kDa/CFP-10. Foi utilizado a
citometria de fluxo para imunofenotipagem e caracterização de células importantes na resposta
imunitária ao M.tuberculosis (MTB). A expressão gênica (por qPCR) e produção in vitro (por
ELISA) de algumas citocinas também foram avaliadas. Nossos resultados com os antígenos
brutos apresentaram-se heterogêneos, tanto para a proliferação celular, como para o perfil de
produção de IFN-γ, onde os voluntarios TCT+ apresentaram menor produção de IFN-γ quando
estimulados com as cepas resistentes e os indivíduos TCT- reconheceram determinadas cepas
cluster, indicando que esta variabilidade parece estar relacionada a capacidade de resposta dos
indivíduos, bem como a característica da cepa infectante. Na caracterização celular frente à
estimulação com antígenos recombinantes de MTB, observamos tendência de queda na
proliferação celular nos pacientes TB, principalmente para linfócitos Tcit, em relação aos
voluntários saudáveis, o que foi refletido na queda da expressão gênica, produção de IFN-γ e
frequência de respondedores. Entre os indivíduos não-TB, os TCT+ mostraram redução
significativa na expansão de linfócitos T CD4+ e CD8+ de memória e efetores, além de NK e
NKT para os antígenos combinados. Nos indivíduos contatos recentes de pacientes com TB com
TCT+ observamos expansão de células NK e NKT que, embora não significativa, pode ter
aumentado a produção média de IFN-γ destas pessoas. Quanto ao tempo de tratamento, os
pacientes TB tratados a <60 dias tiveram os linfócitos Tcit aumentados pelo AlaDH e 16kDa,
sendo que este último também elevou a média dos Tcit de memória, mas apenas nos pacientes
tratados 60 dias. Nestes pacientes, foi evidenciado o aumento de IFN-γ para o ESAT-6/CFP-
10 e para todos os antígenos na IL-10. Nos individuos TCT+ respondedores para IFN-γ, para o
antígeno 16kDa associado as combinacoes, 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10, sugere que estes
podem ser farramenta util para identificar infecção latente. Observou-se, ainda, que o hábito
alcoolista diminuiu a média de linfócitos Taux nos pacientes TB para a combinação 38kDa/CFP-
10, o que indica que um estudo mais aprofundado deva ser realizado. A expressão gênica para
IFN-γ refletiu os resultados obtidos no ELISA, principalmente para 38kDa/CFP-10, ESAT-
6/CFP-10, 16kDa e PPD, porém o mesmo não ocorreu para IL-10. Este estudo mostrou um
achado ainda nao descrito na literatura, concernente ao padrao de resposta de IFN- aos
antígenos 16kDa e a combinaçao 38kDa/CFP-10 simular a descrita para ESAT-6/CFP-10/16
kDa, sugerindo o potencial de ambas como ferramenta para auxiliar em ensaios de liberação de
IFN-γ para detecção de infecção latente. ESAT-6/CFP-10 poderiam ser utilizadas como
ferramenta discriminatória em ensaios de liberação de IFN-γ para detecção de infecção latente,
embora uma população maior deva ser avaliada para confirmar estes dados.
ii
AABBSSTTRRAACCTT
CABRAL, Vinicius Ribeiro. Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
Tuberculosis is the infectious disease that kills more people in the world, but still remains a mystery the interaction of the parasite with the host. The objective of this study was to evaluate the profile of cellular immune response of patients with pulmonary tuberculosis and its recent contacts and healthy individuals from endemic area, using crude or recombinant antigens, such as 16 kDa, AlaDH, ESAT-6/CFP-10 and 38 kDa/CFP-10. Flow cytometry was assayed for immunophenotyping and characterization of cells important in immune response to M.tuberculosis (MTB). The gene expression (by qPCR) and production in vitro (by ELISA) of some cytokines were also evaluated. Our results with crude antigens were heterogeneous for both cell proliferation and to the profile of IFN-γ production, where individuos TCT+ showed lower production of IFN-γ when stimulated with the resistant strains and that TCT-recognized certain cluster strains, indicating that this variability seems to be related to the responsiveness of individuals and the characteristic of the infecting strain. Whencharacterized cell stimulation by recombinant antigens of MTB, was observed a trend of decrease in cell proliferation for TB patients, mainly to T citotoxic lymphocytes in relation to healthy volunteers, which was reflected in the decrease of gene expression, production of IFN-γ and frequency of responders. Among the non-TB, the TCT+individuos elicited significant reduction in the expansion of T CD4+ and CD8+, memory and effector lymphocytes and NK and NKT cells to combinations of antigens. In individuals contact recent of TB patientes with TCT+ was find expansion of NK and NKT cells which, although not significant, may haveled an increase average production of IFN-γ of these contact. According to the tratment, patients TBtreated <60 dayshad the T citotoxic lymphocytes increased by AlaDH and 16kDa, while the latter also increased the average of memory T citotoxic lymphocyte, but only in TB patients 60 days. In these patients, was shown the increase of IFN-γ for ESAT-6/CFP-10 and for all antigens in IL-10. TCT+ individuos was found to increase the response of IFN-γ for the 16kDa and both combination 38kDa/CFP-10 and ESAT-6/CFP-10 antigens; it seems to be useful to identifiy latent infection. Also was observed that the alcoholic habit has decreased the average of T helper lymphocytes in TB patients for the combination 38kDa/CFP-10, indicating that further study should be conducted. The gene expression for IFN-γ reflected the results obtained by ELISA, especially for 38kDa/CFP-10, ESAT-6/CFP-10, 16kDa and PPD, but this has not occurred for IL-10. We conclude that the 16kDa antigen and combinations 38kDa/CFP-10 and ESAT-6/CFP-10 could be used as a discriminatory tool in testing the release of IFN-γ for detection of latent infection.However, futher study must be done to confirm the present data. This study showed a new find concerning the 16kDa antigen and combination 38kDa/CFP-10 eliciting IFN-response pattern similar that described for ESAT-6/CFP-10/16 kDa, suggesting the potential of both combinations as tool in testing the release of IFN-γ for detection of latent infection.
iii
LLIISSTTAA DDEE IILLUUSSTTRRAAÇÇÕÕEESS
Figura 1 Distribuição mundial dos novos casos de Tuberculose no mundo e no Brasil, com taxas de incidência, prevalência e mortalidade. Dados de 2006 adaptados de WHO, 2008.
3
Figura 2 Esquema representativo do envelope celular de M.tuberculosis. Adaptado de Riley, (2006).
6
Figura 3 Gráfico representando a curva de acúmulo de fluorescência (preto) utilizando o modelo logístico de 5 parâmetros e a representação da função da sua primeira (vermelho) e segunda (verde) derivada. O ponto de interseção da linha vertical verde, que parte do ponto de máxima da função da segunda derivada, na curva de acúmulo de fluorescência, corresponde ao Cq (CpD2) e na curva de eficiência (azul) corresponde à eficiência da reação (Eff.). Fonte: Spiess e cols. (2008).
40
Figura 4 Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares (CD3CD4+) e T citotóxicos (CD3CD8+), após estimulação com cepas clínicas com menos de 4 cópias de IS6110 e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-).
43
Figura 5 Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos, após estimulação com cepas clínicas de 10 e 11 cópias de IS6110 e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo.
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Figura 6 Citometria de Fluxo representativa do voluntário C com teste cutâneo a tuberculina (TCT) negativo, mostrando a expressão de CD4+ e CD8+ para o controle não-estimulado e estimulado com a cepa 270, a qual induziu diminuição na expressão de Linfócitos T cit (CD8+). Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.
45
Figura 7 Citometria de fluxo representativa no voluntário J com teste cutâneo a tuberculina positivo mostrando diminuição de células T CD4+ após estimulação com as cepas cluster resistentes a tuberculostáticos 081 e 282, mas com manutenção da expressão e número absoluto de células CD8+. Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.
46
Figura 8 Média de produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-) de acordo com o perfil de susceptibilidade as drogas tuberculostáticas das cepas clínicas de M.tuberculosis usadas como estímulo.
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Figura 9a Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados específicos para MTB.
52
Figura 9b Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com os antígenos micobacterianos combinados, específicos para MTB.
53
iv
Figura 10a Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados, específicos para MTB. * (p<0,05).
54
Figura 10b Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos isolados e combinações, específicos para MTB. * (p<0,05).
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Figura 11a Porcentagem média de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD e recombinantes simples específicos para MTB.
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Figura 11b Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.
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Figura 12a Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD e recombinantes simples, específicos para MTB. (* p<0,05).
60
Figura 12b Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.
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Figura 13 Reatividade média da produção de IFN- e IL-10 testados por em saio imunoenzimático (ELISA) no sobrenadante de cultura de PBMC, de pacientes com tuberculose ativa (TBa), e indivíduos não-TB, categorizados quanto a reação positiva (TCT+) ou negativa (TCT-) para o teste cutâneo à tuberculina estimuladas com diferentes antígenos de MTB.
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Figura 14 Concentração de IFN- e IL-10 produzido pelos indivíduos não-TB TCT+ e TCT-, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, recombinantes simples e combinados, específicos para MTB. (* p<0,05).
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Figura 15 Resposta média da produção de IFN- e IL-10 por pacientes TBa no início (TBi <60d) e com mais de 60 dias (TBt>60d) de tratamento. Resultados obtidos por teste imunoenzimático (ELISA). (*=p<0,05).
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Figura 16 Expressão gênica para FoxP3 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
76
Figura 17 Expressão gênica para FoxP3 nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.
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v
Figura 18 Expressão gênica para IFN- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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Figura 19 Expressão gênica para IFN- nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.
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Figura 20 Expressão gênica para IL-1 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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Figura 21 Expressão gênica para IL-6 (A) em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos. (B) expressão gênica nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão.
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Figura 22 Expressão gênica para IL-8 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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Figura 23 Expressão gênica para IL-10 de pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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Figura 24 Expressão gênica para TGF- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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vi
LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS
Tabela 1 Características, seqüência e condições dos oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR
39
Tabela 2 Características fenotípicas e genotípicas das cepas clínicas de MTB usadas na estimulação in vitro de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-)
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Tabela 3 Heterogeneidade de resposta da produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo. Os símbolos indicam positivo ou não para a produção de IFN-
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Tabela 4 Características demográficas, clínicas e laboratoriais dos sujeitos deste estudo: pacientes com tuberculose ativa (TBa), contatos recente de pacientes com tuberculose ativa (CTr) e controles de área endêmica (Cae).
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Tabela 5 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB, estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.
52, 53
Tabela 6 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-), e estímulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.
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Tabela 7 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.
58, 59
Tabela 8 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.
61, 62
Tabela 9 Freqüência e significância estatística da resposta imune por IFN- produzido pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (PPD -), estimulados com antígenos micobacterianos.
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Tabela 10 Freqüência e significância estatística da resposta imune por IL-10 produzida pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-), estimulados com antígenos micobacterianos.
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vii
LLIISSTTAA DDEE SSIIGGLLAASS EE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS
16kDa Proteína de choque térmico de 16kDa
38kDa Lipoproteína ligante de fosfato de 38kDa
a.C. Antes de Cristo
AC Células Apresentadoras de Antígeno
AIC Akaike’s Information Criterion
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AlaDH Alanina-L dehidrogenase
APC Flourocromo Aloficocianina
BAAR Bacilo Álcool-ácido Resistente
BCG Mycobacterium bovis – Bacilo Calmette-Guérin
Cae Controle de área endêmica
CD “Clusters of Differentiation” = Grupos de diferenciação
Célula NK / NKT Células Natural Killer / Natural Killer de linhagem T
CFP-10 Proteína do filtrado de cultura de 10 kDa
Cq Ciclo de quantificação
CTLA-4 Antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico
CTr Contato recente de paciente com tuberculose ativa
Cy 5.5 Fluorocromo Cyan 5.5
DC Célula Dendrítica
DEPC Dietilpirocarbonato
DNA Ácido Desoxiribonucléico
DTT 1, 4-Dithiothreitol
Eff Eficiência
ELISA “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”
ESAT-6 Alvo antigênico precocemente secretado de 6kDa
ETH Etionamida
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
FITC Fluorocromo Isotiocianato de Fluoresceína
GITR Receptro de glicocorticóide associado ao TNF
GPI Glicosilfosfatidilinositol
HIV Vírus da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
HSP Proteínas de choque térmico
viii
HUCFF Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
IFN- Interferon-gama
IGRA Interferon Gamma Release Assay
IL Interleucina
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-2 Interleucina 2
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
IL-10 Interleucina 10
IL-12 Interleucina 12
IL-17 Interleucina 17
IL-24 Interleucina 24
INH Isoniazida
IOC Instituto Oswaldo Cruz
IPTG Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo
IS6110 Elemento de Inserção 6110, presente no genoma de MTB
LAM Lipoarabinomanana
LAMICEL Laboratório de Microbiologia Celular
MANr Receptor de manose do macrófago
MDR Multidroga resistência
MDR Multidroga resistência
ML Mycobacterium leprae
MTB Mycobacterium tuberculosis
MTC Complexo M. tuberculosis
não-TB Voluntário ausente de sintomas para tuberculose
nTreg / iTreg Linfócito T regulatório natural / induzido
OMS Organização Mundial de Saúde
ORFs Open reading frame – Janela aberta de leitura
pb Pares de bases (nucleotídeos)
PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico
PBS Tampão Fosfato Salina
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PE Fluorocromo Ficoeritrina
ix
PHA Phaseosus vulgaris - fitohemaglutinina
PPD Proteína purificada derivada de cultura do MTB
PZA Pirazinamida
qPCR Reação em cadeia da Polimerase em tempo real
R Resistente
RD Região de Diferenciação
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RFP Rifampicina
RI Resposta Imunitária
RNA Ácido Ribonucléico
RNAm Ácido Ribonucléico Mensageiro
RT-PCR Reação em cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa
S Sensível
SM Estreptomicina
SPSS Statistical Package for Social Sciences
Taux / Tcit Linfócitos T auxililar e T citotóxico
TB Tuberculose
TBa Tuberculose ativa
TBi<60d Paciente Tuberculoso com menos de 60 dias de tratamento
TBt≥60d Paciente Tuberculoso com mais de 60 dias de tratamento
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TCR Receptor de Células T
TCT+ / TCT- Teste cutâneo à tuberculina positivo ou negativo
TGF-β Fator de crescimento transformante - beta
Th1 e Th2 Linfócitos T auxiliares de Perfil tipo 1 e 2
TLR Receptores “Toll-Like”
TMB Trimetilbenzidina
TNF Fator de Necrose Tumoral
Treg Linfócito T regulatório
T Células T com receptores TCR tipo Gama-delta
x
SSUUMMÁÁRRIIOO
1) INTRODUÇÃO_________________________________________________ 1
1.1) Bacteriologia da Tuberculose ____________________________________ 41.2) A doença ___________________________________________________ 71.3) O diagnóstico ________________________________________________ 81.4) Os avanços moleculares no diagnóstico da TB _______________________ 91.5) A imunologia _______________________________________________ 12
2) OBJETIVO GERAL____________________________________________ 25
2.1 ) Objetivos Específicos ________________________________________ 25
3) PACIENTES E MÉTODOS ______________________________________ 26
TIPO DE ESTUDO _______________________________________________ 26
POPULAÇÃO AMOSTRAL E SELEÇÃO DOS PACIENTES ____________ 27
PERÍODO E LOCAIS DE ESTUDO _________________________________ 28
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ______________________________________ 28
CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO ______________________________________ 29
ENTREVISTA DOS PACIENTES___________________________________ 30
PROCEDIMENTOS ______________________________________________ 30
Materiais ______________________________________________________ 30Coleta do espécime clínico ________________________________________ 31Teste Cutâneo da Tuberculina ______________________________________ 31Cultura de leucócitos totais do sangue periférico ________________________ 32ELISA para pesquisa de IFN-γ e IL-10 _______________________________ 33Marcação das células do sangue periférico para análise em citômetro de fluxo _ 34
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA _______________________________ 35
Isolamento de RNA______________________________________________ 35Remoção do DNA contaminante ____________________________________ 36Quantificação dos níveis de expressão________________________________ 37Análise de agrupamento hierárquico dos perfis de expressão gênica _________ 38Testes estatísticos _______________________________________________ 38
4) RESULTADOS ________________________________________________ 41
4.1) Estimulação in vitro de PBMCs de voluntários TCT+ e TCT- com o corpo bacteriano total de diferentes cepas clínicas de MTB. ____________________ 41
4.2) Perfil de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos após estimulação com as cepas clínicas de MTB. ___________________________________________ 45
4.3) Resposta de IFN- entre os voluntários sadios TCT+ e TCT- estimulados com diferentes cepas clínicas de MTB________________________________ 47
xi
4.3) Resposta de IFN- entre os voluntários sadios TCT+ e TCT- estimulados com diferentes cepas clínicas de MTB________________________________ 47
4.4) Produção de IFN- em voluntários sadios TCT+ e TCT- após estimulação com cepas de MTB resistentes ou sensíveis às drogas.____________________ 48
4.5) Características clínicas, demográficas e epidemiológicas dos indivíduos arrolados para os testes com antígenos recombinantes. ___________________ 49
4.6) Caracterização celular de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) após estimulação com antígenos micobacterianos recombinantes. ____ 51
4.7) Análise da produção de citocinas Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10) _________ 63
4.7) Análise da produção de citocinas Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10) _________ 63
4.8) Freqüência de positividade para IFN- e IL-10 no sobrenadante de PBMC dos pacientes TBa e indivíduos não-TB estimulados com diferentes antígenos micobacterianos, determinado pelo método imunoenzimático (ELISA) _______ 69
4.9) Análise dos dados clínicos, epidemiológicos e demográficos relacionados a população com resultado de imunofenotipagem e produção de citocinas ______ 72
4.10) Expressão gênica de diversas citocinas na resposta imunitária ao MTB _ 76
5) DISCUSSÃO __________________________________________________ 84
6) CONCLUSÕES_______________________________________________ 104
7) PERSPECTIVAS _____________________________________________ 107
8) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS _____________________________ 108
ANEXO A ___________________________________________________ 125ANEXO B____________________________________________________ 128ANEXO C____________________________________________________ 129ANEXO D ___________________________________________________ 130
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
1
11)) IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO
A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa que assola a humanidade
desde tempos remotos (ROSEMBERG, 2001). Data de 3.700 a.C. os primeiros relatos
comprovados de infecção micobacteriana, encontrados no Egito Antigo (MORSE e
cols., 1964; MANCHESTER, K., 1984). A moléstia era conhecida entre os gregos, e
Hipócrates a definiu como “doença de tísica” devido ao progressivo definhamento
imposto ao organismo. Galeno, Plínio e Capadócia a descreveram como sendo
relativamente comum entre romanos, mas só tornou-se epidêmica durante a Revolução
Industrial na Europa a partir do século XVIII (AYVAZIAN 1993; LIMA 2001). É uma
doença que possui características de evolução crônica e tem como agente etiológico
Mycobacterium tuberculosis (MTB) que é uma bactéria álcool-ácido resistente, aeróbica
e de crescimento lento (GROSSET, 1993).
Devido à facilidade de propagação e gravidade da doença, a TB foi considerada
por muito tempo um sério problema de saúde pública, sendo uma das causas mais
comuns de morte entre adultos. Entre os anos 1950 e 1980, o número de casos
decresceu em países desenvolvidos, como os Estados Unidos, principalmente pelos
programas de controle da tuberculose humana, com a introdução de um esquema de
tratamento eficiente com múltiplas drogas (HINES II e cols., 1995).
Na década de 70, com a introdução de esquemas terapêuticos de curto período
contendo rifampicina, acreditava-se que a doença seria erradicada, nos países
desenvolvidos, até o final do século passado, deixando assim de receber a merecida
importância de políticos, formadores de políticas públicas e da comunidade científica
dos países desenvolvidos. Porém, com o advento da Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida (AIDS), ocorreu um aumento da incidência de TB associada ao quadro de
imunodepressão da doença, principalmente nos países desenvolvidos (RODRIGUES &
Vinicius Ribeiro Cabral
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SMITH, 1990; KOCHI, 1991). Em seguida a situação epidemiológica da TB foi
agravada pela emergência de cepas multidroga-resistentes (MDR) devido
principalmente à elevada taxa de abandono do tratamento, levando a Organização
Mundial de Saúde (OMS), em 1993, a reconsiderar a TB um problema de saúde pública
mundial (RAVIGLIONE e cols., 1995).
A tuberculose é a terceira maior causa mundial de mortalidade, sendo a doença
infecciosa que sozinha mais mata no mundo. Dados atuais da OMS estimam 9,2
milhões de novos casos de TB, incluindo 4,1 milhões de novos casos BAAR+ (44% do
total) e 0,7 milhões de casos HIV-positivos (8% do total). A estimativa de casos
prevalentes é de 14,4 milhões e de 0,5 milhões de casos de TB multirresistente. O
número de notificações aumentou em 2006 para 5,1 milhões de novos casos, sendo 2,5
milhões BAAR+ (50%). Aproximadamente 1,5 milhões de pessoas HIV-negativos e 0,2
milhão HIV-positivo evoluíram a óbito em 2006. A maioria dos casos de TB no mundo
concentra-se em 22 países, com aproximadamente 80% dos casos, que são monitorados
e avaliados anualmente pela OMS. A Índia, China, Indonésia, África do Sul e Nigéria
são os 5 países com o maior número absoluto de casos. O Brasil ocupa o 16º lugar nesta
lista, com incidência de 50/100.000 hab. e taxa de mortalidade de 4/100.000 hab.
(Figura 1 - WHO, 2008). Ainda segundo a OMS, estima-se que nas próximas duas
décadas, 200 milhões de pessoas ficarão doentes e 35 milhões morrerão de tuberculose
no mundo se não forem identificados novos métodos diagnósticos, novas vacinas e
medicamentos, que auxiliem na implementação de estratégias mais apropriadas para a
identificação dos indivíduos doentes, e com infecção latente, levando ao efetivo
tratamento e favorecendo o real controle da TB (WHO, 2004).
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Figura 1: Distribuição mundial dos novos casos de Tuberculose no mundo e no Brasil, com taxas de incidência, prevalência e mortalidade. Dados de 2006 adaptados de WHO, 2008.
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1.1) Bacteriologia da Tuberculose
As Micobactérias
Taxonomicamente, as micobactérias são classificadas no gênero
Mycobacterium, o qual é o único representante da família Mycobacteriaceae, na ordem
Actinomycetales. Diversos organismos estão incluídos nesta ordem, porém
micobactérias e outros grupos correlatos são facilmente distinguíveis pela sua
capacidade de síntese do ácido micólico. Espécies micobacterianas são tradicionalmente
diferenciadas com base em características fenotípicas (RASTOGI e cols., 2001).
O gênero Mycobacterium originou-se da observação que bastonetes, mantidos
em cultura líquida, formam películas semelhantes às dos fungos (“mico” = fungo).
Micobactérias são bacilos imóveis, gram-positivos, aeróbios obrigatórios, não
formadores de esporos, possuindo alto conteúdo lipídico na parede celular. Esta parede
composta, predominantemente, de ácidos micólicos (mais de 50% do seu peso seco) que
confere aos espécimes deste grupo um caráter álcool-ácido resistente (WHEELER &
RATLEDGE, 1994). Esta característica está relacionada ao fato das micobactérias se
deixarem corar com corantes básicos e não se descorar sob ação de solução álcool-
ácido, característica esta utilizada como ferramenta para auxiliar o diagnóstico das
micobacterioses. Até o momento, são conhecidas 138 espécies de micobactérias
(http://www.bacterio.net) as quais podem ser divididas em três grupos: as que infectam
aves, animais de sangue frio, e as que causam tuberculose em mamíferos (HINES II e
cols., 1995).
Do ponto de vista dos cuidados para cultivo, as espécies do gênero
Mycobacterium formam um espectro natural, que vai desde as micobactérias saprófitas,
que crescem exuberantemente em meios não-enriquecidos, a 45ºC, ao bacilo da
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tuberculose que cresce discretamente em meios enriquecidos a 37ºC, e ao
Mycobacterium leprae que não foi até agora cultivado em meios artificiais (GROSSET,
1993).
As principais micobacterioses humanas são causadas por M .tuberculosis como
parasita intracelular facultativo e por M.leprae, parasita intracelular obrigatório, agentes
etiológicos da tuberculose e da hanseníase, respectivamente. Estes microrganismos são
ainda causa de morbidade e mortalidade significativas nos países em desenvolvimento
(MURRAY e cols., 1992).
Mycobacterium tuberculosis
O bacilo da tuberculose humana se apresenta sob a forma de bastonetes de 0,2
– 0,6m de largura por 2,4 – 4m de comprimento, disposto isoladamente, aos pares em
forma de V ou em pequenos grumos. Ramificações e espessamento em clava são, por
vezes, observados em esfregaços de culturas antigas. MTB se cora irregularmente pelo
método de coloração de Gram. Para evidenciá-lo, a coloração mais utilizada é a de
Ziehl-Neelsen (GROSSET, 1993).
A parede celular de MTB é extremamente complexa, composta por uma dupla
camada lipídica, interligada por peptidioglicanos. A camada interna é constituída de
ácidos micólicos ligados a peptidioglicanos através de arabinogalactanas (um polímero
de arabinose e galactose). A camada mais externa é constituída de glicolipídios
anfipáticos, com um pólo basal lipídico e um pólo apical polissacarídico (FENTON &
VERMUELEN, 1996). Este envelope celular é composto não só por ácidos micólicos,
mas também por lipídios incomuns como o ácido micocerosídico, fenoltiocerol,
lipoarabinomananas e arabinogalactanas (COLE e cols., 1998). As lipoarabinomananas
são potenciais fatores de virulência e podem se ligar a leucócitos, modulando a resposta
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imunitária (STRONMEIER & FENTON, 1999). Os ácidos micólicos são ácidos graxos
-hidroxilados com uma cadeia lateral de -alquil (ASSELINEAU, J.; LEDERER, E.,
1950). A parede celular do MTB contém 3 classes de ácidos micólicos: alfa- ceto- e
metoximicolatos. Todos possuem um número variado de anéis de ciclopropano nas
configurações cis e trans e são ligados covalentemente às camadas internas de
peptidioglicanos (figura 2) (GEORGE, e cols., 1995; YUAN, e cols., 1995; BARRY, e
cols., 1998). Os ácidos micólicos estão relacionados com sua característica de álcool-
ácido resistência e, juntamente com outras proteínas secretadas ou exportadas de M.
tuberculosis têm sido descritos como importantes moduladores da resposta imune do
hospedeiro (DAFFÉ & ETIENNE, 1999, DE SOUZA e cols. 2008).
Figura 2: Esquema representativo do envelope celular de M.tuberculosis. Adaptado de Riley, (2006)
Com o avanço científico alcançado nas últimas décadas, os métodos
moleculares tornaram-se ferramentas de extrema utilidade na análise dos mecanismos
genéticos de virulência e patogenicidade da tuberculose. Com o sequenciamento do
genoma de MTB H37Rv, já concluído, observou-se que contém 4,41 milhões de pares
Anel de ciclopropano
Porina
Lipoarabinomanana com capa de manose
Acil-glicolipídeos Lipídios livres Complexos
Ac. Micólicos oxigenados
-Ac. Micólicos
Arabinogalactana
Peptídeoglicano
Proteínas da membrana plasmática Lipoproteínas
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de bases (pb) no seu ácido desoxiribonucléico (DNA) e em torno de 4.000 genes que
codificam proteínas, sendo conhecida a função de ao menos 52% do total. O genoma é
rico em seqüências de DNA repetitivos, particularmente seqüências de inserção, e
grande quantidade de pares G+C (65,5%). O conteúdo G+C é relativamente constante
ao longo do genoma, indicando que a transferência horizontal de ilhas de
patogenicidade, de composição atípica de bases, é provavelmente ausente (COLE e
cols.,1998). Apenas 376 supostas proteínas não apresentam homologia com proteínas
conhecidas e são presumivelmente únicas de MTB (CAMUS e cols., 2002). Estudos
avaliando antígenos relevantes podem levar a descoberta de alvos antigênicos
específicos para obtenção de diagnósticos mais precisos e de vacinas com maior
eficiência para o tratamento e prevenção da tuberculose.
1.2) A doença
Em 1882, Robert Koch isolou o agente causador da tuberculose humana,
iniciando assim uma nova etapa nas pesquisas sobre a doença que acomete o homem há
mais de 6.000 anos (HINES II e cols., 1995). Desde então, cerca de setenta tipos
diferentes de tratamentos à base de soroterapia foram testados, utilizando bacilos
atenuados experimentalmente mortos pelo calor, além de extratos antigênicos protéicos,
lipídicos, lipoprotéicos e glicídicos. Entre eles, o mais difundido foi à vacina de
Friedman, provinda de micobactéria isolada de tartaruga (ROSEMBERG, 2001).
A infecção tuberculosa humana pode ser causada também por M. bovis,
M.bovis BCG e M. africanum. Estes organismos estão agrupados juntamente com M.
tuberculosis, M. microti, M. canetti, M.pinnipedii e M. caprae no Complexo M.
tuberculosis (MTC), de acordo com suas características sorológicas, bacteriológicas,
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bioquímicas e por sua estreita relação filogenética e patogênica (ARANAZ e cols.,
1999; GRIFFIN e cols., 1995; VAN SOOLINGEN e cols., 1997).
A transmissão da infecção se dá, predominantemente, por via aérea instalando-se
nos pulmões, podendo atingir outros órgãos e evoluir para uma infecção generalizada.
1.3) O diagnóstico
A etapa mais importante no combate ao controle da tuberculose é a identificação
precoce da infecção e do indivíduo doente e seu imediato e completo tratamento,
quebrando assim a cadeia de transmissão. Mas, uma considerável dificuldade
permanece neste âmbito, devido à morosidade para se confirmar o diagnóstico
laboratorial através da cultura, que apesar de sensível necessita de até 8 semanas para
realização. Assim, na prática clínica, o tratamento do paciente é iniciado sem o
benefício do diagnóstico laboratorial (GUZMÁN e cols., 2003). A bacterioscopia,
método diagnóstico mais empregado por ser de baixo custo, simples, rápido e de fácil
execução, é falha na identificação de casos paucibacilares, incluindo as formas extras
pulmonares. A técnica é sensível em espécimes com concentração de bacilos
>5.000/mL e tem baixa especificidade, não discriminando bactérias mortas das vivas e
espécies saprófitas contaminantes presentes no espécime clínico (GLASSROTH, 1993).
Outro sério problema nas políticas de controle da TB se refere à dificuldade
diagnóstica diferencial da doença. Nos hospitais gerais, são admitidos pacientes com
outras co-morbidades, como a infecção pelo HIV, diabete mellitus, insuficiência renal
crônica, neoplasias malignas e outras situações de imunossupressão que usualmente
estão associadas a apresentações incomuns da TB, como a TB pulmonar paucibacilar e a
pleurisia tuberculosa.
Vinicius Ribeiro Cabral
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Tais situações clínico-radiológicas e laboratoriais dificultam sobremaneira o
diagnóstico da TB ativa pelo médico assistente, bem como retardam o início de uma
investigação apropriada. Neste cenário, aumenta a morbi/mortalidade destes pacientes
com TB ativa e também aumenta o risco de transmissão de M. tuberculosis. Estima-se
que uma pessoa bacilífera possa contaminar de 10 a 15 pessoas por ano na comunidade
com a qual tem contato. O risco de contágio de contatos casuais é de 0,2 a 2% e de
contatos recentes é de 5 a 20% , sendo este número exacerbado em ambiente hospitalar
e carcerário (KRITSKI, 2000).
Testes para auxiliar no diagnóstico da tuberculose ativa e latente são necessários
e os baseados na resposta imune são alternativas atraentes e vários trabalhos têm sido
descritos na última década, porém poucos têm sido submetidos a um cuidadoso sistema
de avaliação quanto o seu potencial em diferentes populações de área endêmica
(PERKINS & KRITSKI, 2002; CHO, 2007). Com a maior disponibilidade de antígenos
purificados específicos de M. tuberculosis, a tarefa principal dos investigadores é
conhecer o potencial dos antígenos na modulação da resposta imune do hospedeiro, o
que favorece a identificação de moléculas que se complementem discriminando a
infecção nos seus vários estágios.
1.4) Os avanços moleculares no diagnóstico da TB
Com o avanço da ciência a procura de novos alvos com potencial diagnósticos
para a tuberculose foi direcionada para o campo molecular. Após a elucidação completa
do genoma de M. tuberculosis, foram identificados uma série de genes ausentes na BCG
e presentes no complexo MTB, bem como diferentes ORFs (seqüência aberta de leitura)
potencialmente codificadores de proteínas (COLE e cols., 1998). Isto trouxe a esperança
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em encontrar moléculas com potencial vacinal e de imunodiagnóstico diferencial da
tuberculose (PYM e cols., 2003). Variados antígenos protéicos têm sido expressos e
caracterizados por recombinação genética, e alguns deles têm se mostrado promissores
na modulação da resposta celular e na produção específica de anticorpos pelo
hospedeiro.
Os antígenos protéicos codificados pela família de genes ESAT-6, são os mais
estudados até o momento. O antígeno ESAT-6 e a proteína de filtrado de cultura de
10kDa (CFP-10) estão localizados no mesmo óperon na RD1 (região de diferenciação
1), presente somente no genoma de micobactérias patogênicas do complexo MTC –
exceto M. kansassi, M. szulgai e M. marinum – e no M. leprae e ausente em todas as
cepas BCG, são codificados pelos genes esxA ou esat6 e esxB ou lhp, respectivamente, e
se caracterizam por serem secretados e terem baixo peso molecular (PITTIUS e cols,
2001; PYM e cols., 2003).
O ESAT-6 é descrito como um potente indutor da resposta imunitária celular.
Estudo realizado no Brasil mostrou que embora os indivíduos com teste cutâneo à
tuberculina (TCT) positivo sejam frequentemente mais reativos para a produção de
inteferon gama (IFN-) in vitro, quando estimulados com os antígenos ESAT-6
combinado ao CFP-10, não apresentam diferença para os pacientes com TB ativa
(CARDOSO e cols., 2002), o que foi confirmado também por TAVARES e cols.
(2007), que comparam a resposta imune de pacientes TB e indivíduos TCT+ e TCT- a
diferentes combinações de antígenos. Neste trabalho, também foi demonstrado que a
combinação dos antígenos 38kDa/CFP-10 apresentava uma ação sinérgica, em relação
aos antígenos testados individualmente, na indução da produção in vitro de IFN- em
pacientes com TB ativa. A freqüência de pacientes respondedores era similar à obtida
com a combinação internacionalmente utilizada – ESAT-6/CFP-10 (70% x 73%,
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respectivamente). Mas entre os indivíduos TCT +, a frequência variou
significativamente entre estas duas combinações (88% e 58%, respectivamente).
Por outro lado, 90% dos indivíduos infectados não desenvolvem a doença, o que
leva à pergunta se a resposta induzida pelos antígenos ESAT-6/CFP-10 não estaria, em
parte, relacionada à memória imunológica, após o clearance dos bacilos. Ou se parte da
reatividade observada poderia ser cruzada pela exposição dos indivíduos a outras
micobactérias ambientais, que partilham estes antígenos com MTB (ANDERSEN e
cols., 2000, KUNST, 2006). Poucos estudos envolvendo avaliação de resposta imune
de pacientes e contatos são realizados em área endêmica, existindo um vácuo de
conhecimento sobre a contribuição dos diferentes antígenos micobacterianos, hoje
facilmente clonados e expressos, no diagnóstico da TB ativa e latente em áreas
endêmicas, tal como o 38kDa/CFP-10.
Um dos antígenos mais conhecidos de MTB é o 38kDa, uma lipoproteína ligante
de fosfato. Ela foi o primeiro componente isolado do antígeno 5 e foi descrita como
específica do complexo MTC. Tem sido utilizado em testes sorológicos para
tuberculose, apresentando resultados variados de sensibilidade e especificidade,
principalmente por causa de reações cruzadas com outros antígenos na TB pulmonar
(WILKINSON e cols., 1997; SAMANICHI e cols, 2001).
O antígeno 16kDa (16.3kDa ou Heat Shock Protein - HSP) tem um papel crucial
na habilidade de MTB sobreviver em estado latente, em fase estacionária, persistindo no
hospedeiro mesmo dentro de um ambiente celular hostil (CHANG e cols., 1996). Este
antígeno pode estabilizar a estrutura celular durante longos períodos, permitindo ao
bacilo sobreviver ao ambiente pobre em oxigênio do granuloma. Embora seja
classificado como uma HSP, o 16kDa foi encontrado somente no complexo MTC. Em
Vinicius Ribeiro Cabral
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estudos com indivíduos sadios TCT positivos, observou-se baixa resposta celular por
IFN- e alta produção de anticorpos, sugerindo que este antígeno seria um candidato útil
para teste diagnóstico (WILKINSON e cols., 1998). Recentemente, este antígeno foi
descrito como possível marcador de infecção latente em área endêmica, induzindo
resposta de IFN- mais elevada entre controles sadios de área endêmica (DEMISSIE e
cols, 2006).
1.5) A imunologia
1.5.1) A resposta imune inata e a ativação da resposta imune adaptativa
A resposta imune inata é uma forma evolutivamente conservada de
manutenção da homeostase e defesa do organismo encontrada nos seres vivos. A
evolução do processo imune criou um sistema de regulação extraordinariamente
complexo, onde moléculas e células da resposta imunitária (RI) inata influenciam – de
maneira recíproca – a resposta imunitária adaptativa para manter o equilíbrio
homeostásico, induzir resposta protetora eficaz e ao mesmo tempo evitar dano tecidual e
auto-imunidade (LAMBRECHT e cols., 2001). Características importantes da RI inata
incluem (a) habilidade de reconhecer patógenos e/ou dano tecidual e (b) habilidade de
sinalizar a presença destes eventos para células da resposta imune adaptativa.
A ativação da RI inata é desencadeada através do reconhecimento dos
imunógenos por receptores que reconhecem regiões evolutivamente conservadas
encontradas em diversos patógenos. O reconhecimento destes padrões moleculares
conservados permite ao sistema imune determinar a natureza do agente infeccioso.
Estudos atuais conferem grande importância para os receptores “Toll-Like” (TLR) da
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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resposta inata. Os TLRs são proteínas transmembranares que possuem em sua porção
extracelular domínios repetidos ricos em leucina e na porção citoplasmática homologia
com a família de receptores de IL-1, e se associam a moléculas de sinalização
intracelular como o MyD88 (MEDZHITOV e cols., 1997). Até o momento, foram
descritas ao menos 13 moléculas diferentes para esta família de receptores, os quais são
essenciais para o reconhecimento de imunógenos, tanto por células dendríticas (DC)
como por macrófagos (BANCHEREAU e cols., 2000).
As células apresentadoras de antígenos (ACs), como macrófagos e DC, são
parte importante da RI e ajudam a fazer a ligação entre a resposta inata e a adaptativa.
São também cruciais na diferenciação dos linfócitos T auxiliares para um perfil pró-
inflamatório (Th1) ou antiinflamatório (Th2). Ambos os tipos de células são capazes de
fagocitar MTB, mas enquanto as DCs são fagócitos profissionais e liberam citocinas
que arregimentam células do fenótipo Th1, os macrófagos precisam de ativação para
realizar fagocitose e secretam também interleucina 10 (IL-10) que tem efeito inibitório
na resposta imune protetora (HICKMAN e cols., 2002).
As citocinas presentes no local de infecção, bem como a rota de entrada do
patógeno, o tipo e sua concentração no hospedeiro são fatores determinantes para
diferenciação dos linfócitos. A secreção de IL-4, IL-5 e IL-13, importantes na resposta a
patógenos extracelulares direcionam a RI para um perfil Th2. Por outro lado, o perfil
Th1 parece essencial na defesa contra patógenos intracelulares. Este perfil necessita de
produção de citocinas como o IFN- pelas células Th1, a IL-23 e IL-27, que são
produzidas predominantemente por macrófagos e DCs ativadas, e a IL-12 produzida por
células fagocíticas que também estão envolvidas na resposta a patógenos intracelulares
como MTB (ROBINSON & O’GARRA, 2002).
Vinicius Ribeiro Cabral
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1.5.2) A Imunidade humoral na tuberculose
A importância da imunidade humoral durante a infecção tuberculosa, ainda
está pouco esclarecida, principalmente quanto ao papel dos linfócitos B na produção de
anticorpos específicos, apresentação de antígenos aos linfócitos T e produção de
citocinas que promovem a regulação do perfil de resposta imune.
Embora o papel da imunidade mediada por anticorpos na infecção tuberculosa
permaneça incerta, a exposição ao MTB provoca a produção de anticorpos específicos a
diversos antígenos micobacterianos (ANDERSEN e cols., 2000; BOTHAMLEY, 1995;
DANIEL & DEBANNE, 1987; SAAD e cols., 1996), passíveis de utilização como
marcadores da infecção tuberculosa. Em estudo realizado em voluntários vacinados com
BCG duas vezes em intervalo de tempo de 6 meses, observou-se que os vacinados
apresentavam aumento de anticorpos específicos para o antígeno micobacteriano
lipoarabinomanana (LAM). Estes anticorpos favoreciam a inibição da multiplicação
micobacteriana através do aumento do efeito inibitório de neutrófilos e
macrófagos/monócitos, além de aumentarem significativamente as células envolvidas
na resposta imunitária e a produção de IFN- em células T auxiliares e citotóxicas.
Portanto, estes achados sugerem que os anticorpos específicos para micobactéria
favorecem ambas as respostas inata e mediada por células (DE VALLIERE e cols.,
2005).
Turner e colaboradores (2001) investigaram o papel da IL-4 e linfócitos B,
quanto à hipótese do desenvolvimento da resposta imunopatológica na TB pulmonar e a
manutenção da integridade do granuloma estarem ligados ao aumento da IL-4 e dos
linfócitos B, respectivamente. Utilizando modelo murino experimental de tuberculose
crônica, demonstraram não haver influência das células B e produtos da resposta Th2 na
progressão da infecção tuberculosa crônica em camundongos.
Vinicius Ribeiro Cabral
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Existem alguns trabalhos na literatura que apontam para uma relativa
importância de variados componentes do sistema complemento na infecção tuberculosa.
Experimentos realizados in vitro demonstraram que quando se bloqueia os receptores
para C3, a fagocitose de micobactérias por monócitos e macrófagos humanos é reduzida
entre 70 e 90% (SCHLESINGER, 1993; SCHLESINGER e cols. 1990). Ademais, MTB
não-opsonizado pode ligar-se diretamente aos receptores de C3 (CYWES e cols., 1997)
e de C4 (ZAFFRAN & ELLNER, 1997). Entretanto, o melhor receptor caracterizado
para fagocitose de MTB é o receptor de manose do macrófago (ManR), que reconhece
resíduos terminais de manose na parede celular das micobactérias (SCHLESINGER,
1993; SCHLESINGER e cols., 1996).
1.5.3) A resposta imunitária celular adaptativa
A tuberculose é o exemplo de infecção por bactéria intracelular em que a
imunidade protetora e a hipersensibilidade tardia patológica co-existem. MTB não
produz nenhuma exotoxina ou endotoxina conhecida. Assim, as lesões teciduais são
causadas principalmente pela resposta do hospedeiro. A infecção pulmonar primária
freqüentemente se localiza nos alvéolos próximos à pleura, onde ocorre uma reação
inflamatória aguda inespecífica com presença principalmente de eosinófilos
(APPELBERG, 1992). Nesta reação inicial ocorre, em muitos casos, inibição do
crescimento bacilar através do confinamento dos bacilos e da atividade da imunidade
mediada pelos macrófagos alveolares (MARIANO, 1995). Mais de 90% dos indivíduos
infectados permanecem assintomáticos, mas a bactéria pode sobreviver nos pulmões e,
por algum tipo de falha da homeostase, ter seu processo de multiplicação reativado. O
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desenvolvimento de doença no indivíduo infectado também pode ocorrer por re-
infecção exógena.
De 6 a 8 semanas após a infecção, os linfonodos regionais são alcançados, e os
linfócitos T CD4+ (Cluster of Differentiation) e T CD8+ são ativados. Estas células T
produzem INF-, que ativa os macrófagos potencializando sua habilidade de eliminar os
bacilos fagocitados. O fator de necrose tumoral (TNF) produzido pelas células T e
macrófagos também possui um papel importante na inflamação local durante a ativação
de macrófagos, formação do granuloma (KINDLER e cols., 1989), e possui
propriedades imunorregulatórias (ORME & COOPER, 1999; TSENOVA e cols., 1999;
EHLERS, 2003). Os camundongos deficientes – tanto para o gene do TNF, quanto para
o receptor p55 de TNF – são altamente susceptíveis às infecções micobacterianas
(KANEKO e cols., 1999; ROACH e cols., 2001). Entretanto, MTB é capaz de
sobreviver no interior dos macrófagos, porque componentes da sua parede celular
inibem a fusão dos lisossomos com os fagossomos. Os fagolisossomos são ricos em
próton-ATPase (próton adenosina-trifosfatase) conferindo um ambiente de pH ácido,
hostil para a micobactéria (SMALL, 1994).
A IL-12, outra importante citocina secretada por macrófagos infectados com
MTB, é um heterodímero formado pelas cadeias p35 e p40. Estudo recente observou
que camundongos não produtores da fração p40 apresentam doença progressiva quando
infectados por MTB por via aérea, não ocorrendo o mesmo, entretanto, em animais
deficientes para p35, porque estes animais são capazes de sintetizar a IL-23 que é
dímero de p40 e p19 (COOPER e cols., 1997, 2002). A IL-12 também ativa os
linfócitos, estimulando-os a produzir IFN- e IL-2, o que leva a um perfil de resposta
celular Th1 e inibição de resposta Th2, e a falta de IL-12 ou IL-27 impede o macrófago
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
17
de controlar o crescimento micobacteriano (ROBINSON & NAU, 2008).
Aparentemente, IL-12 é uma citocina regulatória que conecta a resposta inata e resposta
adaptativa ao MTB (O’NEILL & GREENE, 1998; SIELING e cols, 1994;
TRINCHIERI, 1995, WU e cols, 2007)
A IL-6 é uma citocina pirogênica e atua sobre os macrófagos que a liberam e
nos da vizinhança, mas também tem efeito sistêmico na produção de proteínas de fase
aguda, como a proteína C reativa e o surfactante pulmonar. Seu efeito na infecção por
MTB é ambíguo, pois tem ação pró e antiinflamatória, inibindo a produção de TNF e
IL-1. É produzida no estágio inicial da infecção micobacteriana e pode aumentar a
susceptibilidade à infecção por MTB, associada a uma produção deficiente de IFN-,
antes do estabelecimento efetivo da resposta celular adaptativa (SAUDERS e cols,
2000; SHINDLER e cols, 1990; LADEL e cols., 1997; LAW e cols., 1996).
A IL-8 (também conhecida por CXCL8) é uma quimiocina produzida por
vários tipos celulares em resposta a IL-1, TNF e lipolissacarídeos, com capacidade
quimiotática de neutrófilos e linfócitos T, para o local de infecção com MTB.
DLUGOVITZKT E COLS (1997) observaram um aumento de IL-8 suficiente para
atrair linfócitos, mas não neutrófilos, no líquido pleural de pacientes com pleurisia
tuberculosa, diferencialmente em relação a pacientes com outras pneumopatias. Em
trabalhos recentes, foi identificada a expressão diferencial de IL-8 aumentada em
monócitos estimulados com MTB (SONG e cols, 2003) e juntamente com a expressão
gênica de FoxP3 e IL-12, a IL-8 foi considerada uma potencial ferramenta na
diferenciação entre infecção latente e tuberculose ativa (WU e cols, 2007).
A IL-1 é outra citocina próinflamatória com importante papel na defesa do
hospedeiro contra a tuberculose. Durante a doença é expressa em excesso,
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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principalmente no sítio de infecção. A deficiência de receptores para IL-1 ou genes
deficientes para IL-1 e IL-1 dificulta a formação do granuloma (JUFFERMANS e
cols, 2000). Trabalho recente de Djoba Siawaya e cols (2009) sugere que a expressão de
IL-1 apresenta-se diferencial entre pacientes com TB ativa e controles TCT positivos.
O Fator de Crescimento transformante (TGF-) é uma citocina antiinflamatória
produzida por monócitos e DC durante a tuberculose, por ação seletiva de LAM
micobacteriano. Assim como a IL-10, é produzida em larga escala durante a infecção e
provoca supressão da resposta imune mediada por células, inibindo a proliferação de
linfócitos T e produção de IFN-, além de induzir células T regulatórias. Em
macrófagos, impede a ativação, liberação de citocinas próinflamatórias e apresentação
de antígenos. O TGF- está envolvido no dano tecidual e fibrose na TB, devido a
produção e deposição de colagenases pelos macrófagos nos tecidos adjacentes (DAHL e
cols, 1996; TOOSSIE e cols, 1998; OTHIENO e cols., 1999)
A IL-4 tem papel importante na tuberculose, principalmente por suprimir a
produção de IFN- e ativação de macrófagos (APPELBERG e cols, 1992, POWRIE &
COFFMAN, 1993). Em camundongos, a progressão da tuberculose e reativação da
infecção latente são associadas a um aumento dos níveis de IL-4, porém sua inibição
não promove a proteção contra tuberculose. Van Crevel e colaboradores (2002)
detectaram aumento da produção de IL-4 em humanos com tuberculose cavitária, porém
outros dados do mesmo grupo mostram que os resultados são inconsistentes, e ainda
permanece a dúvida se a IL-4 é causa ou reflexo da tuberculose ativa em humanos.
A IL-10 é produzida pelos macrófagos após fagocitose de MTB e/ou ligação
com LAM micobacteriano (DAHL e cols, 1996; SHAW e cols., 2000). Linfócitos T
reativos ao MTB também são capazes de produzir a IL-10, inclusive durante a TB ativa,
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
19
no sangue circulante e no local de infecção (GEROSA e cols, 1999). A IL-10
antagoniza a resposta de citocinas pró-inflamatórias inibindo a produção de IFN-, TNF
e IL-12 e induz a produção de IL-4 pelos linfócitos (FULTON e cols, 1998; HIRSCH e
cols., 1999). Existe alta produção de IL-4 em pacientes com TB ativa anérgicos, seja
antes ou após o tratamento, sugerindo que a IL-10 suprime uma resposta imunitária
efetiva (BOUSSIOTIS e cols.,2000).
O IFN- tem seu papel protetor na TB bem estabelecido, principalmente no
contexto da imunidade de células T antígeno-específica (FLYNN e cols, 1993). A
produção in vitro de IFN- específica para antígenos micobacterianos pode ser usada
como marcador auxiliar de infecção (VAN CREVEL e cols., 1999). O IFN- é
produzido por diversos tipos celulares e como resposta inata ao MTB infectante, as
células NK podem produzir a citocina, por exposição direta a oligodeoxinucleotídeos
micobacterianos ou em resposta a IL-12 e IL-18 (LHO, e cols, 1999). Macrófagos
ativados também produzem IFN- na TB assim como linfócitos T e células CD1-
restritas, quase que exclusivamente no início da infecção.
1.5.4) Tipos celulares importantes na TB
Alguns estudos demonstraram que MTB, tanto in vivo quanto in vitro, estimula
a expressão da forma do receptor de antígenos de células T (TCR), sendo estas
células T capazes de reconhecer antígenos micobacterianos protéicos e antígenos não-
protéicos apresentados em associação às moléculas CD1, assim como as células
CD4CD8-/- TCR CD1-restritas (JANIS e cols., 1989, PORCELLI e cols., 1992;
CONSTANT e cols., 1994; KAUFMANN, 1996; TANAKA e cols., 1995). Este é o
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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único exemplo conhecido de reconhecimento de antígenos não-peptídicos por células T.
Antígenos glicolipídicos bacterianos são tipicamente apresentados a células T por
moléculas CD1, abundantes em DC. Linfócitos T reconhecem estes antígenos não-
protéicos sem necessitar de apresentação (KAUFMANN, 2007). Este tipo celular,
apesar de limitado a uma fração pequena dos linfócitos, pode contribuir na imunidade
antibacteriana, principalmente na fase inicial da infecção (LIN & OTTENHOFF, 2008).
Existem poucos estudos envolvendo células T+ durante a infecção tuberculosa, entre
estes um trabalho utilizando Mycobacterium bovis BCG (BCG) demonstrou a produção
de INF- e TNF por estas células, porém não de IL-2, IL-4, IL-5, e IL-10 quando em
contato com antígenos micobacterianos, onde também foi demonstrada sua importância
na diferenciação e liberação de INF- por células CD8+ (DIELI e cols., 2003).
A célula natural killer (NK) é outro tipo celular que parece também contribuir
para a resposta imune protetora contra MTB, mas a supressão destas células in vivo não
modifica o curso da infecção (JUNQUEIRA-KIPNIS e cols., 2003). Estas células estão
associadas a respostas contra patógenos intracelulares e são capazes de produzir IFN-
rapidamente, além de outras citocinas imunoreguladoras, assim como a lise de alvos
celulares específicos, sem necessidade de ativação prévia (BANCROFT, 1993; BRILL e
cols., 2001). Sua importância na TB já foi abordada, inclusive para as células NKT,
outra população celular que tem origem linfóide (APOSTOLOU e cols., 1999; BRILL e
cols., 2001; NIRMALA e cols., 2001; ZAHRAN e cols., 2006; GODFREY e cols.,
2004).
Os linfócitos T auxiliares (CD4+) são os mais importantes agentes na proteção
contra a TB. Eles fazem a ponte entre a ativação de células, seja por liberação de
citocinas ou no contato célula-célula. Outro grupo de igual importância são os linfócitos
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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citotóxicos (CD8+) que, apesar de não atuarem diretamente na apresentação de
antígenos de MTB, são ativados pelas células CD4+ para aniquilar os macrófagos
infectados. A importância destas células na tuberculose já é bem conhecida (BOOM e
cols., 2003; FLYNN & CHAN, 2001), e modelos animais mostraram que a deficiência
de células T CD8+ pode resultar em susceptibilidade a tuberculose (FLYNN e cols.,
1992). Um subgrupo funcional de células T auxiliares é conhecido por linfócitos T
regulatórios (Treg), para os quais já foram descritas duas subpopulações distintas, uma
que pode ser induzida na periferia, chamada de linfócitos T regulatórios induzíveis
(iTregs: CD4+CD25+), e a outra sai do timo já com função regulatória, chamada de
linfócitos T regulatórios naturais (nTregs: CD4+CD25+FoxP3+) (SAKAGUCHI, e cols,
2008).
Um dos marcadores de Treg mais utilizados é o FoxP3 um fator de transcrição
nuclear da família forkhead que ativa a rápida expressão de CD25, o antígeno-4
associado ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), o receptor de glicocorticóide relacionado
ao TNF (GITR) e a liberação de IL-10 em células CD4+, reprimindo a transcrição de
genes para a produção de IFN-, IL-4 e IL-2. Este tipo celular é gerado principalmente
no timo (nTreg), mas pode ser ativado nos órgãos linfóides periféricos (iTreg) e sua
sobrevida depende de IL-2 e TGF- (SHEVACH, 2004). Ruprecht e cols. (2005), nos
indica que o receptor de superfície CD27 pode estar relacionado com a atividade
supressora de células Treg FoxP3+ durante o processo inflamatório e também serviria
de marcador de superfície para células CD4+CD25+ com atividade regulatória, o que
torna muito mais fácil a identificação destas células. Outro trabalho interessante foi a
identificação de células com função supressora e fenótipo CD8+CD25+FoxP3+ em
pacientes com câncer coloretal (CHAPUT e cols., 2008). Na tuberculose, a presença de
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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células Treg está associada à doença ativa, principalmente por sua característica
antagônica ao perfil Th1 (HANEKOM, 2005).
1.5.4) caracterização do problema
Existem muitas controvérsias quanto à definição de TB latente. Seja definida
pela reação de hipersensibilidade tardia positiva provocada por antígeno bruto de MTB,
ou por reatividade de anticorpos específicos em testes imunodiagnósticos. A
identificação e tratamento da tuberculose latente permaneceram como um enigma, tão
grande quanto a interação do hospedeiro com MTB durante a doença ativa.
Considerando uma das hipóteses que tentam explicar o estado de TB latente, a
teoria “dinâmica” propõe que o bacilo permaneceria no granuloma, em divisão mínima
e morte celular constantes, até o desaparecimento total dos bacilos. Portanto, nem todos
os indivíduos que tenham se infectado albergariam o bacilo após um tempo, como tem
sido sugerido por mais de 10 anos (CARDONA, 2007). Considerando que o
sequenciamento de MTB disponibilizou uma serie de antígenos cujo potencial
imunodiagnóstico ainda é pouco explorado principalmente em áreas endêmicas, um
estudo avaliando antígenos quanto ao seu potencial para auxiliar na discriminação entre
pacientes com TB ativa e contatos é de grande relevância.
Neste trabalho, além de estimular as células de pacientes e contatos com a
combinação utilizada mundialmente (ESAT-6/CFP-10), em estudo prévio foi também
avaliada a combinação 38kDa/CFP-10, que foi sugerida como estimuladora de
linfócitos T do sangue periférico de pacientes e controles na mesma magnitude do
ESAT-6/CFP10 (TAVARES e cols, 2007), mas com frequencia diferente em indivíduos
sadios TCT+ e respondedores de área endêmica. Outros antígenos como o 16kDa,
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
23
sugerido ter potencial para identificar infecção latente, juntamente com o ESAT-6/CFP-
10, também foi avaliado comparando os resultados com os obtidos em conjunto com o
38kDa/CFP-10. Outro antígeno pouco estudado, a L-alanina dehidrogenase (AlaDH),
também foi avaliado.
A proteína AlaDH de 40kDa, possui epítopos rconhecidos por células B que
podem ser detectados nas cepas de M. tuberculosis, mas não entre as cepas vacinal BCG
e atípicas. É uma proteína secretada, estando presente em filtrado de cultura de MTB.
Seu potencial imunodiagnóstico tem sido pouco explorado, mas a proteína foi descrita
estar implicada na adaptação de micobactérias em ambiente anaeróbios, que pode estar
relacionado ao estado de infecção latente (HUTTER & SINGH, 1998).
A caracterização das populações celulares e seu papel na modulação da resposta
ao MTB são importantes para a compreensão dos mecanismos de ação do sistema
imunitário. Trabalhos recentes descrevem as subpopulações de linfócitos durante os
eventos da doença – principalmente no sangue periférico – para melhor entender como
as células interagem entre si e com os bacilos. As subpopulações de linfócitos T+
aparentemente necessitam de um contínuo estímulo antígeno-dependente para
manterem-se em quantidades suficientes para auxiliar na regulação dos níveis de
citocinas do tipo Th1 e as células Treg possuem um importante papel no controle da
autoimunidade, suprimindo outros linfócitos T de maneira contato-dependente/citocina-
independente. Neste estudo foi realizada a imunofenotipagem das células do sangue
periférico estimuladas com os antígenos descritos acima.
Estudos, em modelo animal, demonstraram uma associação entre a virulência de
M.tuberculosis e falha no desenvolvimento de resposta Th1. Outros estudos sugerem
que várias cepas podem diferir em seu potencial de transmissão, mostrando interação
complexa e induzindo resposta imune divergente no hospedeiro. A maioria destes
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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estudos é realizada com cepas específicas e geograficamente restritas, como a cepa
Beijing (LOPEZ e cols., 2003; BARCZAK e cols,. 2005). Neste estudo foi avaliada a
diversidade de reposta imunitária, dos indivíduos sadios de área endêmica, à cepas
clínicas de transmissibilidade corrente (cluster) em nosso meio. Portanto, valendo-se de
estudos anteriores de determinação dos perfis genéticos de cepas isoladas de pacientes
internados avaliamos a resposta celular induzida por um painel cepas de padrão clusters
ou único, resistentes ou sensíveis aos tuberculostáticos, investigando o perfil de células
CD4+ e CD8+ e da citocinas Th1(IFN-) utilizando célula micobacteriana intacta.
Portanto neste estudo, sangue periférico obtido de pacientes com TB ativa
(TBa), voluntários com contato recente com pacientes com TB e indivíduos sadios de
área endêmica foi estimulado com antígenos purificados específicos, individualmente
ou combinados, obtidos por recombinação genética, e antígeno bruto (cepas clinicas de
M. tuberculosis), avaliando-se o seu potencial para induzir proliferação de diferentes
populações de células T e produção de citocinas Th1 e Th2 .
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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22)) OOBBJJEETTIIVVOO GGEERRAALL
Avaliar perfil de resposta imunitária celular de pacientes com tuberculose
pulmonar e seus contatos recentes e indivíduos sadios de área endêmica.
2.1 ) Objetivos Específicos
Avaliar a atividade imunológica celular frente a antígenos recombinantes de M.
tuberculosis, de pacientes com TB ativa, caracterizando os grupos de células
envolvidos no processo;
Avaliar a atividade imunológica celular frente a antígenos recombinantes e cepas
clínicas de M. tuberculosis, de voluntários saudáveis TCT+ ou TCT-,
caracterizando os grupos de células envolvidos no processo;
Determinar a capacidade de produção de citocinas de perfil Th1 (IFN-γ) e Th2
(IL-10) no sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes TB e contatos,
específicas para antígenos recombinantes de MTB;
Identificar antígeno ou antígenos com possível papel na identificação de TB
latente.
Verificar a modulação da expressão gênica em pacientes TB e voluntários
saudáveis, no sangue periférico estimulado previamente com os antígenos
micobacterianos.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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33)) PPAACCIIEENNTTEESS EE MMÉÉTTOODDOOSS
TTIIPPOO DDEE EESSTTUUDDOO
Estudo prospectivo transverso-observacional, onde foram utilizados os métodos
clínico-laboratoriais padronizados na rotina, para obtenção de amostras de sangue
periférico de pacientes com tuberculose pulmonar ativa (TBa) e controles. O grupo
controle foi distribuído em contato recente com pacientes tuberculosos, nos últimos 2
anos (CTr), e pessoas sem contato recente, mas de área endêmica para TB (Cae) com
TCT positivo ou negativo.
O sangue periférico obtido foi processado para avaliação do imunofenótipo das
células do sangue periférico após estimulação com: i) antígeno vivo íntegro, utilizando
diferentes cepas clínicas de M. tuberculosis com diferentes genótipos e perfis de
susceptibilidade às drogas e ii) antígenos recombinantes purificados de MTB, isolados
ou combinados, obtidos por recombinação genética. Parte do material foi utilizado para
estimar a produção de citocinas por método imunoenzimático (ELISA) no sobrenadante
das culturas de leucócitos e por real time RT-PCR na detecção de expressão do RNAm
de diferentes citocinas das células estimuladas com os diferentes antígenos
recombinantes. A amostragem foi obtida após análise e consentimento prévio do comitê
de ética em pesquisa da FIOCRUZ, e dos centros colaboradores: Posto de Saúde
Augusto Amaral Peixoto – Guadalupe (Dr. Paulo Albuquerque); Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho – HUCFF (Dra. Fernanda C.Q.Mello); Centro de Saúde
Germano Sinval Faria – FIOCRUZ (Dra. Elyne Angstrom e Dra. Else Gribel).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO AAMMOOSSTTRRAALL EE SSEELLEEÇÇÃÃOO DDOOSS PPAACCIIEENNTTEESS
Pacientes TBa: 21 indivíduos com diagnóstico de tuberculose pulmonar, com
bacteriologia positiva ou não, que se enquadraram nos critérios para definição de casos,
estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS), como descrito a seguir nos
critérios de inclusão.
Controles:
15 Indivíduos sadios, contatos recentes de pacientes com TB pulmonar
ativa confirmada (CTr), com informação do teste de reação à tuberculina
(PPD), clínica e radiologicamente examinados para exclusão de TB,
atendidos nas unidades de saúde que fazem controle de contatos dos
pacientes TB diagnosticados. Estes contatos e seus casos índices fazem
parte de estudo em andamento e já aprovado para tratamento preventivo
de TB no HUCFF/UFRJ.
17 indivíduos sadios sem história passada ou recente de contato de
pacientes TB (Cae) e com informação do resultado do teste cutâneo à
tuberculina, foram arrolados voluntariamente entre os estudantes e
profissionais da FIOCRUZ/RJ para as análises com citometria e real
time RT-PCR. Outros 11 indivíduos foram da mesma maneira
voluntários para os estudos realizados com as cepas clínicas.
Todos os indivíduos que participaram deste estudo foram voluntariamente
incluídos, após assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE (anexo
1) e após responder ao questionário padronizado de informações clínicas, laboratoriais e
demográficas (anexo 2). As entrevistas foram realizadas somente pelo doutorando
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
28
Vinicius Ribeiro Cabral, com o consentimento prévio do responsável de cada unidade
de saúde visitada.
PPEERRÍÍOODDOO EE LLOOCCAAIISS DDEE EESSTTUUDDOO
A amostra populacional estudada foi recrutada da demanda espontânea dos
seguintes locais: Posto de Saúde Augusto Amaral Peixoto – Guadalupe, Rio de
Janeiro/RJ; Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF no serviço de
Pneumologia; Centro de Saúde Germano Sinval Faria – FIOCRUZ, para inclusão no
estudo entre Março de 2007 e Setembro de 2008.
CCRRIITTÉÉRRIIOOSS DDEE IINNCCLLUUSSÃÃOO
- Pacientes com TB ativa confirmada (TBa) segundo critério da OMS 2002.
Confirmado bacteriologicamente (casos definidos de TB), indivíduos com
duas amostras positivas para BAAR em exames direto ou cultura positiva para
M.tuberculosis ou uma amostra positiva para BAAR e presença de alteração
radiológica.
Casos bacteriológicamente negativos: Indivíduos com exame direto e cultura
negativos, mas que apresentavam à radiografia de tórax infiltrado(s) em
lobo(s) superior(s) com ou sem cavitação.
Para aqueles que além das alterações radiológicas, apresentaram sintomas
sistêmicos ou respiratórios, foi também considerada a ausência de melhora
clínica e radiológica após 10 dias de amoxicilina. O diagnóstico de TB foi
baseado na melhora radiológica após quimioterapia para TB.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
29
Em indivíduos com história de tratamento anterior para TB que apresentaram
deteriorização das alterações radiológicas quando comparadas com
radiografias anteriores, o diagnóstico de novo episódio de TB foi baseado na
melhora clínica e radiológica após quimioterapia para TB.
Os pacientes foram testados para o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV),
pelo menos uma vez nos últimos 3 meses antes da coleta do espécime clínico.
Todos os pacientes arrolados no estudo, possuem ficha clínica preenchida, onde
constam informações pessoais e da doença, todas confidenciais e de uso exclusivo para
a pesquisa, conforme o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
- Controles:
i) Contatos recentes de TB pulmonar ativa (CTr): indivíduos com
bacterioscopia negativa, teste cutâneo a tuberculina positivo (≥10 mm) ou
negativo (<10mm) e imagem radiológica excludente de TB, quando possível.
ii) Controles de Área Endêmica (Cae): indivíduos com bacterioscopia
negativa (quando necessário), teste cutâneo à tuberculina positivo ou negativo
e sem história de tratamento anterior para TB ou contato com paciente TB nos
últimos 2 anos.
CCRRIITTÉÉRRIIOOSS DDEE EEXXCCLLUUSSÃÃOO
Indivíduo com outra doença imunosupressora;
Uso de drogas imunossupressoras do tipo corticoterapia, imunomoduladores e
outros;
Menores de 18 anos e maiores de 65 anos;
Mulheres grávidas;
Vinicius Ribeiro Cabral
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Antecedentes ou suspeita atual de neoplasia;
Pacientes tratados empiricamente para tuberculose, porém, sem melhora clínica
e/ou radiológica após tratamento para TB;
Indivíduo sem ficha individual de identificação e/ou sem assinatura do TCLE;
EENNTTRREEVVIISSTTAA DDOOSS PPAACCIIEENNTTEESS
Após esclarecimento sobre os objetivos do estudo e do consentimento por
escrito, os pacientes responderam a um questionário padronizado contendo questões
referentes aos seus dados clínicos, laboratoriais e demográficos (anexo 1).
PPRROOCCEEDDIIMMEENNTTOOSS
Materiais
Os antígenos micobacterianos recombinantes foram fornecidos pelo Dr.
Mahavir Singh (Helmholtz Center for Infection Research/Lionex, Alemanha), dentro do
acordo de Cooperação Brasil x Alemanha firmado com o Laboratório de Microbiologia
Celular (LAMICEL/IOC/FIOCRUZ). Os antígenos recombinantes ensaiados neste
estudo foram: 16kDa e AlaDH., 38kDa, ESAT-6 e CFP-10. Estes três últimos foram
utilizados nas seguintes combinações: 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10. Os antígenos
foram obtidos por recombinação genética. Resumidamente, os genes codificantes de
cada antígeno foram submetidos à amplificação por PCR, os fragmentos obtidos foram
clonados em vetor plasmidial e as proteínas foram expressas em Escherichia coli (após
indução com IPTG) e purificadas (amylose resin affinity chromatography).
Contaminação das frações antigênicas foram purificadas pelo sistema Mono Q anion
exchange chromatography. Purificação final foi feita por diálise e as proteínas foram
aliquotadas e liofilizadas. A fitohemaglutinina (PHA – Cultilab, PR/Brasil) e o
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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Derivado Protéico Purificado de MTB (PPD RT23 – Statens Serum Institut, Dinamarca)
foram usados como controles da resposta imunitária.
As cepas clínicas de M.tuberculosis utilizadas neste estudo foram isoladas de
pacientes atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto/UERJ e se encontram
estocadas na biblioteca de cepas mantida no LAMICEL/IOC. As informações de
resistência aos antimicrobianos e perfil genético das cepas foram obtidas de banco de
dados mantidos no LAMICEL onde a tipagem molecular foi realizada em estudos
prévios (Tese de mestrado de Silvia Maria de Almeida Machado intitulada
“Genotipagem por RFLP e spoligotyping no estudo da diversidade genética de cepas de
Mycobacterium tuberculosis isoladas de pacientes atendidos no Hospital Universitário
Pedro Ernesto (HUPE) - Rio de Janeiro”, defendida em outubro de 2007). As cepas
clusters por RFLP foram aquelas que apresentaram o mesmo perfil genético isoladas de
dois ou mais pacientes.
Coleta do espécime clínico
O sangue periférico dos voluntários do estudo foi coletado em seringas estéreis
heparinizadas, nas unidades de saúde colaboradoras, com consentimento prévio do
responsável pelo local e sem prejuízo da rotina de trabalho. Um total de 50mL de
sangue foi coletado, homogeneizado, acondicionado em frasqueira de transporte e
imediatamente levado ao LAMICEL/IOC para realização dos procedimentos.
Teste Cutâneo da Tuberculina
Aplicação, pela técnica de Mantoux, de injeção intradérmica de 0,1 mL de PPD
RT-23 (2UT). O antígeno foi injetado na pele da face anterior do antebraço esquerdo e o
resultado foi lido após 72 horas, pela inspeção e palpação transversal da zona de
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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endurecimento, pelo mesmo profissional que aplicou o antígeno. As provas de Mantoux
com endurecimento de 0 a 4mm foram consideradas negativas, fracamente positivas as
de 5 a 9 mm (pode ocorrer reação cruzada com outras micobactérias e vacinados pela
BCG a menos de dois anos) e fortemente positivas provas com diâmetro de
endurecimento maior ou igual a 10mm (doentes de TB, vacinados recentes pela BCG,
TB latente e contato recente com M.tuberculosis).
Cultura de leucócitos totais do sangue periférico
Ao sangue periférico foi adicionado meio de cultura RPMI 1640 v/v (LGCBio)
e 30mL desta solução foram depositados sobre 20mL de ISOLYMPH (Gallard-
Schlesinger, Noruega) e centrifugadas a 400x g por 30 minutos, à 25°C. A fase superior
contendo plasma e RPMI 1:1 foi guardada e a camada central de leucócitos totais foi
obtida por aspiração. Estas células foram transferidas para novo tubo e adicionadas de
tampão de lise de hemáceas – ACK (0,15M NH4Cl, 1,0M KHCO3, 0,1mM Na2EDTA,
pH 7,4, Sigma, Saint Louis, CA/USA) deixadas em temperatura ambiente (t.a.) por 10
minutos e lavadas com 30mL de RPMI 1640 por centrifugação a 400x g/4°C. O
sobrenadante foi descartado e as células novamente lavadas com 15mL de RPMI 1640
por centrifugação a 400x g/4°C. Após descartar o sobrenadante, as células do sangue
periférico (PBMC) foram ressupensas em 2mL de meio RPMI 1640 completo
(adicionado de L-glutamina [10.000 U.I.] 1:100, estreptomicina-penicilina [10.000 U.I.]
1:100, 25mM HEPES, 10% de soro autólogo) e quantificadas em câmara de Neubauer
com corante de viabilidade celular azul de Trypan (Hyclone, Logan, UT/USA). Foram
utilizadas placas de cultura de 6 poços (NUNC) com um total de 10x106 células em
cada grupo experimental na estimulação com os antígenos recombinantes e placas de
cultura de 24 poços (NUNC) com 1x106 células por grupo experimental na estimulação
com as cepas clínicas de MTB. Os antígenos purificados foram ensaiados na
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33
concentração de 5g/mL nos respectivos poços da placa de cultura e os antígenos brutos
foram adicionados na proporção de 1:10 bacilos de cada uma das cepas clínicas
testadas. O material foi identificado e as placas colocadas em incubadora à 37ºC com
atmosfera de 5% CO2 por cinco dias.
ELISA para pesquisa de IFN-γ e IL-10
Citocinas do perfil Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-10) da resposta imunitária, foram
detectadas através do kit comercial de ensaio imunoenzimático (ELISA) da R&D
Systems, utilizando as instruções do fabricante e sendo o limite de detecção mínimo de
8pg/mL para o kit de IL-10 e 6,25pg/mL para IFN-γ. Resumidamente, as placas de
reação de 96 poços (NUNC IMMUNOSORP, CA/USA) foram adsorvidas com os
anticorpos primários por 22-24h em t.a., lavadas com 200µL de tampão de lavagem
[PBS pH 7,2: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4,
adicionado de 0,05% de Tween20 (ICI Américas)] por 4 vezes. Depois foi realizado o
bloqueio da placa com PBS adicionado de 1% de Soro Albumina Bovina (BSA), e
deixado em t.a. por 1 hora. Após nova lavagem, as amostras foram adicionadas (100µL)
em triplicata, e deixadas por 2 horas em t.a.. Mais uma etapa de lavagem para retirar o
material excedente, e o anticorpo secundário foi adicionado aos poços e incubado em
t.a. por 2 horas. Outra etapa de lavagem e então foi adicionada a solução de
estreptavidina (previamente diluída em reagente diluente 1:200 do estoque) e incubado
por 20 minutos em t.a. ao abrigo da luz. Nova lavagem realizada e foi então adicionado
o substrato cromogênico de trimetilbenzidina (TMB – ZYMED, San Francisco –
CA/USA), reagindo por 20 minutos em t.a. ao abrigo da luz e posteriormente foi
adicionada a solução de parada (2N H2SO4 MERCK/ RJ/Brasil) e realizada a leitura
imediata em espectrofotômetro de placas, mensurando o comprimento de onda de
450nm (Bio-Tek® Instruments, LA/EUA). Os dados foram obtidos em densidade óptica
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(absorbância) e convertidos em concentração através da comparação com valores de
uma curva-padrão de 4 parâmetros logísticos. Os grupos experimentais foram testados
em triplicata.
Marcação das células do sangue periférico para análise em citômetro de fluxo
As células utilizadas foram obtidas da cultura de leucócitos totais após 5 dias de
estimulação com os antígenos micobacterianos recombinantes ou as cepas clínicas. As
células foram centrifugadas a 500x g e ressuspendidas em tampão salina fosfato (PBS)
com azida sódica 0,01% com soro fetal bovino 1% (Gibco, CA/USA), contadas em
câmara de Neubauer com corante de viabilidade celular (azul de Trypan). Foram
utilizados anticorpos monoclonais com os seguintes marcadores: anti-CD3 Fluoresceína
Isotiocianato (FITC) para população de linfócitos, anti-CD8 aloficocianina (APC) para
linfócitos T citotóxicos, anti-CD56/NCAM APC para células NK (R&D Systems,
USA), anti-CD62L ficoeritrina (PE) para selectina-L, anti-CD16 PE para o receptor Fcγ
tipo IIIA, anti-CD4 Cyan 5.5 e anti-CD4 PE para linfócitos T auxiliares (BD
PharMingen, San Diego, CA), anti-CD25 APC para cadeia α do receptor de IL-2, anti-
CD27 FITC para o receptor de TNF (eBioscience), sendo as preparações incubadas em
gelo, ao abrigo da luz por 30 minutos. As células foram centrifugadas a 500x g,
ressuspendidas em PBS/azida 0,01% com paraformaldeído 1% para fixação, e a
aquisição foi feita em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, CA/USA). As
análises foram feitas utilizando o programa CELLQuest (BD Biosciences, CA/USA).
Vinicius Ribeiro Cabral
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35
AANNÁÁLLIISSEE DDAA EEXXPPRREESSSSÃÃOO GGÊÊNNIICCAA
Isolamento de RNA
A expressão gênica de citocinas importantes no processo de resposta imunitária
foi verificada através da técnica de real time RT-PCR. Após o tempo de cultivo das
PBMC com os antígenos recombinantes, 3x106 células foram recolhidas e lavadas com
tampão PBS para retirada do meio de cultivo, por centrifugação a 500x g/4°C. A
extração do ácido ribonucléico (RNA) total foi realizada através do protocolo básico
com TRIZOL (Invitrogen, USA), onde 1mL foi adicionado nas células em microtubo
livre de DNAse/RNAse (AXYGEN Scientific Inc, CA/USA) e deixado por 5 minutos
em t.a.. Em seguia 200µL de clorofórmio foram adicionados e homogeneizados para
extração do RNA total. O material então foi centrifugado a 12000x g por 15 minutos à
4°C e a fase aquosa superior foi transferida para novo microtubo. Foram então
adicionados 500µL de Isopropanol (Sigma, USA) e o material foi deixado por 14 horas
a -70°C. Nova centrifugação foi realizada a 12000x g por 30 minutos a 4°C, descartado
o sobrenadante, o precipitado foi lavado (sem homogeneizar) com etanol 70% gelado e
centrifugado com 10000x g por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi retirado com
cuidado e com o microtubo quase seco, foi adicionada água mili-Q tratada com
dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma/USA) para retirada de DNAse/RNAse. O material
foi quantificado por espectofotômetro através da medida de absorbância no
comprimento de onda de 260ηm, em um NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer
(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE/EUA). A pureza do RNA foi avaliada
através da razão entre dois valores de absorbância: (i) A260ηm / A280ηm para identificar
contaminação protéica e (ii) A260ηm / A230ηm para identificar contaminação por solventes
orgânicos. Ambos os valores devem ser superiores a 1,8 para estimar uma solução com
RNA de boa qualidade (IMBEAUD e cols., 2005).
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Remoção do DNA contaminante
De modo a remover possível DNA genômico contaminante das preparações de
RNA total realizadas, utilizou-se DNase I recombinante (DNA-free™, Ambion Inc.,
Austin – TX/EUA), seguindo-se o protocolo de tratamento rotineiro fornecido pelo
fabricante. Resumidamente, foi adicionado 1µL de DNAse para cada 5µg de amostra
de RNA total, previamente diluído em água tratada com DEPC, para um volume final
de 15µL. A solução permaneceu por 30 minutos à 42°C e foi adicionado 5µL do
inativador da DNAse, por 2 minutos, seguido de centrifugação à 4°C por 20 minutos em
12000x g. A fase aquosa transparente superior contendo o RNA foi transferida para
microtubo limpo e quantificado novamente por espectrofotômetro.
O RNA total foi então transformado em cDNA para realização do PCR em
tempo real. Inicialmente, foram identificados 2 tubos para cada amostra, sendo um
microtubo para a reação positiva (RT) e outro para o controle negativo (NRT). Foi
adicionado em cada microtubo 500ng de RNA total, e 1µL de primer OLIGOdT 12-18
(Invitrogen/USA), e colocado em banho-seco por 10 minutos a 55°C. Em seguida, foi
adicionado o mix de reação para os tubos RT [Tampão 5x (4µL), DTT (2µL), RiboLock
inibidor de RNAse (1µL), dNTPs 2,5mM de cada (1µL), RevertAid H Minus M-MuLV
transcriptase reversa (1µL)] e para os tubos NRT [(Tampão 5x (4µL), DTT (2µL),
RiboLock inibidor de RNAse (1µL), dNTPs 2,5mM de cada (1µL), água RNAse-free
(1µL)], sendo um total de 20µL de reação. O material foi colocado em banho-seco por
60 minutos a 42°C, seguindo-se inativação da enzima por 10 minutos a 70°C. No final
do processo foi adicionado 80µL de água tratada com DEPC.
O cDNA foi então utilizado para a realização da PCR em tempo real, com
iniciadores para 2 genes constitutivos (18s, RLP13a) e 13 genes alvo (FoxP3, IFN-γ, IL-
Vinicius Ribeiro Cabral
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1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, IL- 24, TGF-β, TNF – veja tabela 1).
Foram realizadas duplicatas experimentais e controles de placa e de reação. Após
padronização o cDNA foi utilizado diluído a 1:10 e 5µL desta solução foi adicionado a
reação da PCR. A PCR foi realizada no aparelho ABIPRISM 7000 Sequence Detector
System em placas ópticas de 96 poços no volume final de 15µL, sendo adicionados,
além do cDNA, 10µL do mix de reação (SYBR GREEN 2x – Applied Biosystems e
0,5µL dos primers a 12,5mM) em cada poço.
Quantificação dos níveis de expressão
A partir dos dados de acúmulo de fluorescência das triplicatas da reação da PCR
em tempo real de cada amostra, utilizou-se um modelo logístico ou sigmóide de 3, 4 ou
5 parâmetros para desenhar a curva de amplificação a partir do pacote qPCR (SPIEES e
cols., 2008). A escolha do melhor modelo, ajustado pela minimização do erro médio
quadrático dos valores de fluorescência das triplicatas nos 40 ciclos, baseou-se no
Akaike’s Information Criterion (AIC). O ciclo de quantificação (Cq) foi determinado
pelo ponto de interseção de uma linha perpendicular, oriunda do ponto de máxima da
função de segunda derivada do modelo logístico utilizado, na curva de amplificação
(figura 3). O uso deste ponto de máxima característico é conveniente uma vez que ele se
encontra numa região de eficiência constante na fase exponencial da curva de
amplificação, além de ser invariante do poço e placa aonde ocorre à reação de PCR
(REBRIKOV & TROFIMOV, 2006). A eficiência (Eff) foi calculada para cada amostra
utilizando a razão do dado de fluorescência do ciclo de quantificação sobre o do ciclo
anterior.
Posteriormente, os dados de EffCq de cada amostra, foram processados em conjunto
de acordo com VANDESOMPELE e cols. (2002) para servir de entrada para o pacote
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geNorm, o qual determina os genes mais estáveis ou normalizadores dentro do seu
grupo de estudo. Os níveis de expressão normalizados são obtidos pela divisão dos
dados brutos de expressão de cada amostra pelo seu respectivo fator de normalização,
que é representado pela média geométrica dos níveis de expressão dos genes
normalizadores.
Análise de agrupamento hierárquico dos perfis de expressão gênica
Os dados dos níveis de expressão normalizados em função logarítmica de base 2
foram utilizados para a análise de agrupamentos. Foram avaliadas as distâncias
Manhattan, Euclidiana e Minkowski e os métodos de ligação single linkage, complete
linkage e ward. Os grupos formados foram validados pela medida de silhouettes e a
melhor distância e algoritmo de agrupamento foram determinados pelo coeficiente de
correlação co-fenético. Todas as análises acima descritas foram realizadas com o auxílio
de pacotes do programa R, versão 2.8.1 (www.r-project.org).
As analises acima descritas foram realizadas em colaboração com o Dr. Marcelo
Ribeiro Alves do Laboratório de Hanseníase/IOC/FIOCRUZ.
Testes estatísticos
A análise estatística foi realizada no software Statistical Package for Social
Sciences (SPSS versão 15). As médias aritméticas, desvios-padrão, e erros-padrão
foram calculados e realizados os testes estatísticos Mann-Whitney (para 2 grupos não
pareados - não paramétrico), teste T-Student-Neuman-Keuls e Kruskal-Wallis (para
mais de 3 comparações). Os dados foram considerados significativos quando p< 0.05.
As análises foram feitas em colaboração com a MsC. Isabela Gama Sardella, do
Laboratório de Microbiologia Celular/IOC/FIOCRUZ.
Vinicius Ribeiro Cabral
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Tabela 1: Características, seqüência e condições dos oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR.
Nota: em negrito são mostrados os genes constitutivos utilizados (housekeeping-genes).
Gene Proteína Seqüência do oligonucleotídeoConcentraçã
o finalTamanho do
produtoTM do produto
18s Subunidade 18s ribossomal5´ AGGATGAGGTGGAACGTGTG 3´5´ CTTCACGGAGCTTGTTGTCC 3´
400 nM 125pb 79°C
RLP13aProteína de Ligação Ribossomal 13a
5´ GACAAGAAAAAGCGGATGGT 3´5´ GTACTTCCAGCCAACCTCGT 3´
400 nM 142pb 84°C
FoxP3 Fator de Transcrição forkhead P35´ TCCCAGAGTTCCTCCACAAC 3´5´ GATGGCGTTCTTCCAGGTG 3´
500 nM 194pb 81°C
IFN-γ Interferon-gama 5´ TGACCAGAGCATCCAAAAGA 3´5´ GGACATTCAAGTCAGTTACCG 3´
500 nM 130pb 76°C
IL-1β Interleucina 1-beta5´ CAAAATACCTGTGGCCTTGG 3´5´ TTTTTGGGATCTACACTCTCCAG 3´
500 nM 105pb 79°C
IL-2 Interleucina 25´ CAAACCTCTGGAGGAAGTGC 3´5´ TTCAGATCCCTTTAGTTCCAG 3´
500 nM 112pb 78°C
IL-4 Interleucina 45´ ACGCACCATGAGAAGGACAC 3´5´ ACAGGACAGGAATTCAAGCC 3´
500 nM 134pb 86°C
IL-6 Interleucina 65´ GAAAATCATCACTGGTCTTTTGG 3´5´ GCATCTAGATTCTTTGCCTTTTT 3´
500 nM 150pb 79°C
IL-8 Interleucina 85´ CTGCGCCAACACAGAAATTA 3´5´ TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA 3´
500 nM 118pb 79°C
IL-10 Interleucina 105´ GATGCCCCAAGCTGAGAAC 3´5´ ATCGATGACAGCGCCGTAG 3´
300 nM 104pb 83°C
IL-12 Interleucina 125´ GTGGAGGTCAGCTGGGAGTA 3´5´ TTTCTTTTCTCTCTTGCTCTTGC 3´
500 nM 105pb 79°C
IL-17 Interleucina 175´ GCCCAAATTCTGAGGACAAG 3´5´ TCATTGCGGTGGAGATTCCA 3´
500 nM 142pb 82°C
IL-24 Interleucina 245´ CAAACAGTTGGACGTAGAAG 3´ 5´ TGACACAGGGAACAAACCAG 3´
500 nM 143pb 83°C
TGF-βFator de Crescimento Transformante-beta
5´ CAGCAACAATTCCTGGCGATA 3´5´ AAGGCGAAAGCCCTCAATTT 3´
500 nM 136pb 84°C
TNF Fator de Necrose Tumoral5´ CCCCAGGGACCTCTCTCTA 3´5´ GAGGGTTTGCTACAACATGG 3´
400 nM 101pb 84°C
_ _ Vinicius Ribeiro Cabral
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Figura 3: Gráfico representando a curva de acúmulo de fluorescência (preto) utilizando o modelo logístico de 5 parâmetros e a representação da função da sua primeira (vermelho) e segunda (verde) derivada. O ponto de interseção da linha vertical verde, que parte do ponto de máxima da função dasegunda derivada, na curva de acúmulo de fluorescência, corresponde ao Cq (CpD2) e na curva de eficiência (azul) corresponde à eficiência da reação (Eff.). Fonte: Spiees e cols. (2008).
Vinicius Ribeiro Cabral
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41
44)) RREESSUULLTTAADDOOSS
4.1) Estimulação in vitro de PBMCs de voluntários TCT+ e TCT- com o corpo
bacteriano total de diferentes cepas clínicas de MTB.
Este estudo foi realizado para avaliar a habilidade de diferentes cepas clínicas
de M.tuberculosis, com diferentes características genotípicas (determinada pela posição
e número de cópias de IS6110) e de resistência à tuberculoestáticos, na indução de
resposta imunitária em voluntários sadios (tabela 2). Foram utilizadas PBMC de 11
voluntários saudáveis, sendo 6 pessoas com reação positiva para o teste cutâneo à
tuberculina (TCT+) e 5 pessoas com reação negativa (TCT-).
Tabela 2: Características fenotípicas e genotípicas das cepas clínicas de MTB usadas na estimulação in vitro de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-).
Cepa ClínicaN° cópias
IS6110Cluster MDR
Resistência aos antimicrobianos
046 10 Sim Sim INH/RFP/PZA
065 10 Sim Não S
081 10 Sim Não INH/ETH/PZA
213 11 Sim Não PZA
215 4 Sim Não S
238 2 Sim Não INH
270 a 9 Não Não S
274 a 9 Não Não S
282 8 Sim Sim INH/RFP/SMa: Infecção policlonal; IS6110: seqüência de inserção 6110, elemento repetido presente nas cepas do Complexo M. tuberculsosis; MDR: Multi Droga Resistência; INH- isoniazida, RFP- rifampicina, PZA- pirazinamida; SM- estreptomicina, ETH - etionamida,; S: sensível à todas as drogas.
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A estimulação foi realizada utilizando o bacilo vivo, recém retirado de meio de
cultivo sólido rico (Löwenstein-Jensen), e quantificado na proporção de 1:10
(PBMC:bacilos), para os ensaios de estimulação in vitro. Após o quinto dia de
estimulação o sobrenadante de cultura foi recolhido, livre de células, para quantificação
de Interferon gama (IFN-), as PBMC foram tipadas para avaliação de linfócitos Taux e
Tcit. Foram utilizadas a cepa de M. tuberculosis H37Rv e o antígeno PPD como
controles experimentais. Duas das cepas clínicas utilizadas foram obtidas do mesmo
paciente e, embora tenham apresentado o mesmo número de cópias de IS6110, na
tipagem genotípica, estas diferiam quanto ao tamanho, caracterizando em uma infecção
policlonal.
A estimulação com as cepas clínicas, mostrou-se diferencial em relação ao
perfil genético do bacilo. A estimulação de PBMC de voluntários TCT+ com as cepas
clínicas portando baixo número de cópias da IS6110 (até 4 cópias) levou a redução
significativa da média de números absolutos de linfócitos Taux e Tcit quando
comparados com os controles não-estimulados (p= 0,013 e p= 0,005) e com os que
receberam estímulo com o antígeno PPD (p=0,044 e p=0,021). Nos indivíduos não
reatores ao teste tuberculínico, a diferença foi encontrada apenas em relação ao controle
não estimulado, para ambos os tipos de linfócitos (p=0,028 e 0,004 respectivamente;
Figura 4).
Vinicius Ribeiro Cabral
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Figura 4: Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares (CD3CD4+) e T citotóxicos (CD3CD8+), após estimulação com cepas clínicas com menos de 4 cópias de IS6110e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-).
No estímulo realizado com cepas clínicas de 8 e 9 cópias de IS6110, foi
observada uma tendência de queda na média absoluta de células T aux e Tcit, embora
sem diferença significativa. Entretanto, nos indivíduos com reação tuberculínica
positiva (TCT+) foi observado um maior decréscimo de ambos os tipos celulares, em
relação aos outros voluntários, mas sem diferença significativa.
Linfócitos CD3CD8+ Indivíduos TCT+
Controle PPD H37Rv <4 Cópias IS61100
5
10
15
20
25*
*
p=0,005
p=0,021
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Linfócitos CD3CD4+ Indivíduos TCT-
Controle PPD H37Rv <4 Cópias IS6110
0
5
10
15
20
25
* p=0,028
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Linfócitos CD3CD8+ Indivíduos TCT-
Controle PPD H37Rv <4 Cópias IS61100
5
10
15
20
25* p=0,004
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Linfócitos CD3CD4+ Indivíduos TCT+
Controle PPD H37Rv < 4 cópias IS61100
5
10
15
20
25*
*
p=0,013
p=0,044
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Vinicius Ribeiro Cabral
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44
Similarmente, a utilização de cepas clínicas com 10 e 11 cópias de IS6110
provocou uma redução generalizada na média de células em ambos os voluntários
TCT+ e TCT-, porém diferença significativa foi evidenciada apenas em relação ao
controle não estimulado (p<0,04; figura 5).
Figura 5: Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos, após estimulação com cepas clínicas de 10 e 11 cópias de IS6110 e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo.
Linfócitos CD3CD4+ Indivíduos TCT+
Controle PPD H37Rv 10 a 11cópias IS61100
5
10
15
20
25 * p=0,013
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Linfócitos CD3CD8+ Indivíduos TCT+
Controle PPD H37Rv 10 a 11cópias IS61100
5
10
15
20
25* p=0,04
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Linfócitos CD3CD8+ Indivíduos TCT-
Controle PPD H37Rv 10 a 11cópias IS61100
5
10
15
20
25
p=0,022*
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Linfócitos CD3CD4+ Indivíduos TCT-
Controle PPD H37Rv 10 a 11cópias IS61100
5
10
15
20
25
* p=0,027
Nú
mer
o d
e C
élu
las
x 10
5
Vinicius Ribeiro Cabral
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4.2) Perfil de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos após estimulação com as
cepas clínicas de MTB.
As subpopulações celulares de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos foram
analisadas após 5 dias de estimulação com as cepas clínicas, na cultura de PBMC dos
voluntários TCT+ e TCT-. No voluntário C TCT- foi observada diminuição do número
de células CD8+ apenas quando estimuladas com a cepa 270, sensível aos
quimioterápicos, em relação ao controle não-estimulado. Entretanto, a expressão de
CD4+ manteve-se semelhante ao controle não estimulado. Esta cepa foi obtida junto
com a cepa 274, do mesmo paciente, sendo geneticamente distintas, mas apresentaram
resultados diferentes de estimulação para linfócitos CD8+ (figura 6).
Figura 6: Citometria de Fluxo representativa no voluntário C com teste cutâneo a tuberculina(TCT) negativo, mostrando a expressão de CD4+ e CD8+ para o controle não-estimulado e estimulado com a cepa 270, a qual induziu diminuição na expressão de Linfócitos T cit (CD8+). Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.
N° Células x 105/mLImunofenótipo
Controle Cepa 270
CD3+ 15,3 7,4
CD3CD4+ 4,4 2,3
CD3CD8+ 2,1 0,7
Cepa 270
Controle
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Por outro lado, o voluntário J/TCT+ mostrou queda no número de células CD4+
e manutenção da expressão e número de células de CD8+, quando estimuladas com as
cepas cluster 081 e 282. Estas cepas são resistentes aos antibióticos utilizados no
tratamento da TB (figura 7).
Figura 7: Citometria de fluxo representativa no voluntário J com teste cutâneo a tuberculina positivo mostrando diminuição de células T CD4+ após estimulação com as cepas cluster resistentes a tuberculostáticos 081 e 282, mas com manutenção da expressão e número absoluto de células CD8+. Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.
Nde células x 105/mLImunofenótipo
Controle Cepa 081 Cepa 282
CD3+ 21,3 14,9 10,7
CD4+ 9,8 3,3 2,1
CD8+ 4,9 3,3 2,4
Sem estímulo
Cepa 081
Cepa 282
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47
4.3) Resposta de IFN- entre os voluntários sadios TCT+ e TCT- estimulados
com diferentes cepas clínicas de MTB
A resposta de produção de IFN- frente à estimulação com o painel de cepas
clínicas de MTB dos voluntários TCT+ e TCT- foi heterogênea conforme mostrado na
tabela 3. O antígeno PPD foi utilizado com controle e apenas os indivíduos TCT+
foram responsivos. A cepa clínica multidroga resistente 046 foi reconhecida
positivamente pela maioria dos indivíduos testados (8/10), dos quais 62,5% eram TCT+
e 37,5% eram TCT-, enquanto que para a cepa 238, apenas um dos indivíduos TCT+
(>20mm) foi capaz de produzir IFN- (1/10). A cepa 270 foi a única reconhecida apenas
pelos voluntários TCT+, mas a cepa 274 (infecção policlonal) não foi capaz de
estimular a produção de IFN- em um destes voluntários (H). Em geral, a produção
desta citocina foi positivamente associada com o tamanho da resposta ao teste cutâneo à
tuberculina. Os voluntários TCT+ mostraram maior produção de IFN- que os TCT-
(Tabela 3).
Vinicius Ribeiro Cabral
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48
Tabela 3. Heterogeneidade de resposta da produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo. Os símbolos indicam positivo ou não para a produção de IFN-.
4.4) Produção de IFN- em voluntários sadios TCT+ e TCT- após estimulação
com cepas de MTB resistentes ou sensíveis às drogas.
Ao avaliar a resposta imune por IFN- dos voluntários considerando o teste de
susceptibilidade às drogas das cepas testadas, foi observado que entre os voluntários
sadios TCT- havia uma produção média significativamente menor de IFN- (p<0,05),
quando estimulados com cepas de ambos os perfis de susceptibilidade, comparados aos
voluntários TCT+. Mas houve tendência de queda da produção de IFN- quando os
indivíduos TCT+ foram estimulados com as cepas resistentes às drogas
tuberculostáticas, porém sem diferença significativa (Figura 8).
065(S)5
+++++++-++-K) >20
+++-++++++-J) 15
+++-+---++-I) 13
--+-+--+++-H) 13
+++-+++-+--G) 10
--------++-F) 5
---------+-E) 0
+---+++-+--D) 0
-------+++-C) 0
-----------A e B) 04
282(R)1,5
274(S)
270(S)
238(R)2,5
215(S)5
213(R)2,5
081(R)3,5
046(R)1,5
ControleID/PPD(mm)
ID – Identificação dos voluntários; 1 MDR: multi droga resistência; 2 monoresistente; 3Resistência múltipla; 4 resposta de dois indivíduos; 5- Cepas Cluster; S - Sensível às drogas; R - Resistente às drogas.
Cepas clínicas de MTB
H37Rv
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49
Figura 8: Média de produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-) de acordo com o perfil de susceptibilidade as drogas tuberculostáticas das cepas clínicas de M.tuberculosis usadas como estímulo.
4.5) Características clínicas, demográficas e epidemiológicas dos indivíduos
arrolados para os testes com antígenos recombinantes.
No período de Julho de 2007 à Setembro de 2008, foI coletado sangue de 21
pacientes TBa e 32 indivíduos não-TB, dos quais 15 foram classificados como contatos
recentes de pacientes com TB ativa (CTr) e 17 controles de área endêmica (Cae). As
suas características clínicas, demográficas e laboratoriais, estão descritas na tabela 4.
Não foi encontrada diferença significativa na média de idade, de gênero e quanto ao
hábito tabagista e de consumo de álcool nos diferentes grupos, embora a maioria dos
indivíduos sejam não-tabagista e não-alcoolista.
p<0,05
ResistentesSensíveis
TCT negativo
TCT positivo
0
100
200
300
400
500
600
IFN
-ga
ma
(pg
/mL
)
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Tabela 4 – Características demográficas, clínicas e laboratoriais dos sujeitos deste estudo: pacientes com tuberculose ativa (TBa), contatos recente de pacientes com tuberculose ativa (CTr) e controles de área endêmica (Cae). N.A.: não aplicável.
Número Absoluto (%)Características
Total TBa CTr Cae
Total 53 (100) 21 (100) 15 (100) 17 (100)
Idade (x ± DP) 37,5±13,0 37,2±15,5 47,6±12,8 34,1±8,6
Gênero
Feminino 27 (51) 12 (57) 8 (53) 7 (41)
Masculino 26 (49) 9 (43) 7 (47) 10 (59)
Bacterioscopia:
Positiva 12 (24) 12 (62) NA
Negativa 9 (18) 7 (33) 2 (13) NA
NR 30 (59) 1 (5) 13 (87) 17 (100)
Cultura:
Positiva 3 (6) 3 (14) NA
Negativa 11 (21) 9 (43) 2 (13) NA
NR 39 (73) 9 (43) 13 (87) 17 (100)
Marca BCG
Sim 47 (89) 17 (81) 14 (93) 16 (94)
Não 6 (11) 4 (19) 1 (7) 1 (6)
TCT (mm)
TCT+ (≥ 10) 10 (32) NA 8 (53) 3 (18)
TCT - 21 (68) NA 7 (47) 14 (82)
TB anterior
Positiva 8 (15) 8 (38)
Negativa 45 (85) 13 (62) 15 (100) 17 (100)
Tratamento TB
TB trat. (≥60 dias) 10 (48) 10 (48) NA NA
TB inic. (<60 dias) 11 (52) 11 (52) NA NA
Alcoolista
Sim 24 (45) 8 (38) 6 (40) 10 (59)
Não 29 (55) 13 (62) 9 (60) 7 (41)
Tabagismo
Sim 12 (23) 6 (29) 4 (27) 2 (12)
Não 36 (68) 11 (52) 11 (73) 14 (82)
Ex-tabagista 5 (9) 4 (19) 1 (6)
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51
4.6) Caracterização celular de células mononucleares do sangue periférico
(PBMC) após estimulação com antígenos micobacterianos recombinantes.
A imunofenotipagem das células do sangue periférico foi realizada para verificar
o perfil celular frente à estimulação com os antígenos micobacterianos recombinantes
isolados 16kDa e AlaDH, ou combinados 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10; o antígeno
PPD foi utilizado como controle experimental e a fitohemaglutinina (PHA) foi usada
como controle mitogênico. As populações celulares verificadas foram: CD3CD4+ para
linfócitos T auxiliares e CD3CD8+ para linfócitos T citotóxicos, além da marcação com
CD62L para as os linfócitos de memória (Taux e Tcit); células NK CD16CD56+ e NKT
CD3CD16CD56+; e células Treg induzidas CD4CD25+ ou Treg naturais
CD4CD25CD27+.
Foram tipados um total de 14 pacientes TB e 21 indivíduos não-TB e observou-
se que o número absoluto bem como o percentual dos diferentes fenótipos celulares
estão mais baixos entre os pacientes com TBa, embora sem diferença significativa. Isto
foi observado principalmente nas células controle (não estimuladas e estimuladas com
PHA). Apenas os linfócitos Tcit apresentaram-se, em média absoluta,
significativamente diminuídos nos pacientes TBa, tanto para estímulo não específico
PHA (p=0,022), como para os antígenos micobacterianos (p<0,028), exceto para o
AlaDH (p=0,058) e 38kDa/CFP-10 (p=0,077). Os linfócitos T citotóxicos de memória
apresentaram-se com média absoluta reduzida apenas para o estímulo do antígeno PPD
(p=0,023; Tabela 4). Entretanto, significância no número absoluto de células e no
percentual de expressão dos receptores só foi observada nos indivíduos estimulados
com o antígeno ESAT-6/CFP-10 para os linfócitos T citotóxicos (p=0,025) (Tabela 5 e
Figura 9a e 9b).
Vinicius Ribeiro Cabral
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52
Tabela 5: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB, estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
TBa Não-TB
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
PPD CD3CD4 178,2 ± 23,8 47,5 209,2 ± 19,2 45,6 > 0,05
CD3CD8 82,4 ± 9,4 * 21,7 115,2 ± 9,0 26,1 0,0275
Razão CD4/CD8 2,4 ± 0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05
CD4CD62L 89,5 ± 1,3 24 113,7 ± 14,6 25,5 > 0,05
CD8CD62L 42,6 ± 5,3 * 11,7 66,2 ± 6,2 15 0,0231
CD16CD56 6,3 ± 2,4 1,8 15,6 ± 7,5 4,6 > 0,05
CD3CD16CD56 1,0 ± 0,3 0,3 10,7 ± 7,1 3,5 > 0,05
CD4CD25 3,0 ± 1,0 0,9 5,9 ± 1,4 1,5 > 0,05
CD4CD25CD27 18,6 ± 4,4 5,5 31,9 ± 5,8 7,6 > 0,05
16 kDa CD3CD4 148,0 ± 11,7 43,9 206,2 ± 22,4 46,5 0,0772
CD3CD8 74,1 ± 7,1 22,1 109,3 ± 11,7 26,0 0,0275
Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05
CD4CD62L 74,8 ± 9,5 21,4 111,3 ± 19,2 25,4 > 0,05
CD8CD62L 37,8 ± 5,2 11,0 53,6 ± 5,1 13,4 0,0617
CD16CD56 5,5 ± 1,9 1,7 14,7 ± 8,2 4,0 > 0,05
CD3CD16CD56 0,7 ± 0,3 0,2 11,1 ± 7,8 3,2 > 0,05
CD4CD25 2,7 ± 0,9 0,8 5,8 ± 2,0 1,4 > 0,05
CD4CD25CD27 15,8 ± 3,8 5,0 29,5 ± 5,8 7,3 > 0,05
AlaDH CD3CD4 165,7 ± 14,5 45,1 198,6 ± 20,6 46,2 > 0,05
CD3CD8 80,0 ± 7,3 21,9 103,1 ± 8,4 25,5 > 0,05
Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05
CD4CD62L 90,1 ± 12,6 23,7 105,1 ± 16,0 25,5 > 0,05
CD8CD62L 41,6 ± 5,5 11,4 55,3 ± 6,6 13,5 > 0,05
CD16CD56 4,9 ± 1,5 1,6 12,5 ± 5,9 4,3 > 0,05
CD3CD16CD56 0,8 ± 0,2 0,2 8,5 ± 5,6 3,5 > 0,05
CD4CD25 1,5 ± 0,5 0,5 3,2 ± 0,7 0,8 > 0,05
CD4CD25CD27 10,9 ± 2,6 3,6 26,5 ± 6,3 6,5 0,0665
Figura 9a: Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados específicos para MTB.
0
10
20
30
40
50
TBa N-TB TBa N-TB TBa N-TB
PPD 16 kDa AlaDH
% d
e cé
lulas
T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
% d
e cé
lula
s
Vinicius Ribeiro Cabral
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53
Tabela 5 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB, estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
TBa Não-TB
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
38kDa CD3CD4 151,9 ± 14,8 44,5 177,4 ± 18,3 45,0 > 0,05
+ CD3CD8 72,3 ± 8,1 21,1 96,1 ±9,3 25,2 0,0772
CFP10 Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05
CD4CD62L 76,1 ± 11,3 21,8 90,6 ± 13,6 23,4 > 0,05
CD8CD62L 36,2 ± 7,0 9,9 46,0 ± 5,6 11,6 > 0,05
CD16CD56 5,2 ± 1,8 1,6 12,5 ± 6,9 4,0 > 0,05
CD3CD16CD56 0,8 ± 0,3 0,2 8,8 ± 0,3 3,1 > 0,05
CD4CD25 2,0 ± 0,6 0,6 4,8 ± 1,4 1,3 > 0,05
CD4CD25CD27 15,1 ± 2,9 4,9 25,7 ±4,7 7,4 > 0,05
ESAT-6 CD3CD4 149,0 ± 16,2 43,9 195,9 ± 20,2 46,0 > 0,05
+ CD3CD8 66,7 ± 8,3 * 19,6 * 104,8 ± 12,0 25,1 0,0252
CFP10 Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05
CD4CD62L 71,4 ± 1,3 22,4 96,4 ± 15,4 22,9 > 0,05
CD8CD62L 34,1 ± 7,0 9,7 46,1 ± 5,3 10,8 > 0,05
CD16CD56 4,8 ± 1,6 1,4 16,0 ± 9,1 4,3 > 0,05
CD3CD16CD56 0,8 ± 0,3 0,2 12,5 ± 8,9 3,5 > 0,05
CD4CD25 2,6 ± 0,7 0,9 5,5 ± 1,8 1,4 > 0,05
CD4CD25CD27 15,8 ± 3,5 5,1 27,9 ± 4,9 7,3 > 0,05CD3CD4/CD8+: células T aux/cit, CD4/CD8CD62L+: células T aux/cit de memória; CD16CD56+: Células NK; CD3CD16CD56+: Células NKT; CD4CD25+: linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27+: linfócitos Treg naturais.
Figura 9b: Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com os antígenos micobacterianos combinados,específicos para MTB.
0
10
20
30
40
50
TBa N-TB TBa N-TB
38 kDa/CFP-10 ESAT-6/CFP-10
% d
e ce
lulas
T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
% d
e cé
lula
s
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54
Considerando a tendência de aumento no número absoluto dos diferentes
fenótipos celulares nos indivíduos não-TB, estes foram analisados quanto à reatividade
ao teste cutâneo à tuberculina. Foi observando que o aumento no número absoluto de
células está associado aos indivíduos TCT- (n=21), principalmente para aqueles cujas
células foram estimuladas com os antígenos combinados 38kDa/CFP-10 e ESAT-
6/CFP-10. Diferença significativa foi observada para os valores absolutos de linfócitos
Taux e Tcit, efetores e de memória, além das células NK e NKT (p<0,045), embora sem
diferença significativa para o percentual de expressão dos receptores de superfície
celular, exceto nas células NK estimuladas com o antígeno 38kDa/CFP-10 e 16kDa
(p<0,045; tabela 6 e figuras 10a & 10b). Diferentemente, nos indivíduos TCT+ (n=10),
apenas o estímulo com o antígeno PPD e com o inespecífico (PHA), provocaram
aumento médio do percentual e/ou número absoluto na população de células nTreg
(p=0,037).
Figura 10a: Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados, específicos para MTB. * (p<0,05).
0
10
20
30
40
50
PPD+ PPD- PPD+ PPD- PPD+ PPD-
PPD 16 kDa AlaDH
% de
celul
as T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
*
*
% d
e cé
lula
s
* *
TCT+ TCT+ TCT+TCT- TCT- TCT-
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Tabela 6: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-), e estímulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
TCT + TCT - -
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
PPD CD3CD4 222,9 ± 40,6 45,0 199,5 ± 21,2 44,7 > 0,05
CD3CD8 128,8 ± 20,9 27,4 106,0 ± 8,5 24,7 > 0,05
Razão CD4/CD8 1,7 ± 0,1 2,1 ± 0,3 > 0,05
CD4CD62L 55,3 ± 27,6 13,6 109,1 ±22,8 23,5 > 0,05
CD8CD62L 74,0 ± 11,4 16,4 58,9 ± 7,5 13,4 > 0,05
CD16CD56 7,1 ± 2,0 1,4 24,6 ± 17,5 7,7 > 0,05
CD3CD16CD56 1,0 ± 0,3 0,3 20,3 ± 1,9 6,7 > 0,05
CD4CD25 10,6 ± 4,2 2,5 4,5 ± 1,9 1,3 > 0,05
CD4CD25CD27 54,3 ± 11,8 * 12 * 21,5 ± 5,9 5,5 0,016
16 kDa CD3CD4 185,0 ± 33,1 47,4 227,3 ± 31,6 45,2 > 0,05
CD3CD8 95,2 ± 13,7 25,8 122,0 ± 18,5 25,4 > 0,05
Razão CD4/CD8 1,9 ± 0,1 2,0 ± 0,3 > 0,05
CD4CD62L 31,2 ± 15,4 13,3 128,1 ± 30,2 24,3 > 0,05
CD8CD62L 43,0 ± 7,2 13,0 58,6 ± 6,6 12,7 > 0,05
CD16CD56 4,5 ± 1,0 1,2 24,7 ± 19,4 6,7 * 0,045
CD3CD16CD56 0,8 ±0,2 0,3 21,3 ± 4,4 6,0 > 0,05
CD4CD25 3,7 ± 1,4 0,9 8,2 ± 4,4 2,0 > 0,05
CD4CD25CD27 32,3 ± 9,0 8,1 29,7 ± 8,9 7,0 > 0,05
AlaDH CD3CD4 201,9 ± 38,2 46,4 201,2 ± 24,9 45 > 0,05
CD3CD8 107,1 ± 18,6 25,7 102,6 ± 8,0 24,7 > 0,05
Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,1 2,1 ± 0,3 > 0,05
CD4CD62L 38,9 ± 19,8 13,7 109,8 ± 23,5 23,8 > 0,05
CD8CD62L 53,4 ± 16,3 13,3 54,4 ± 6,7 12,4 > 0,05
CD16CD56 5,4 ± 1,5 1,1 19,8 ± 13,8 7,5 > 0,05
CD3CD16CD56 0,6 ± 0,3 0,2 16,2 ± 1,1 6,7 > 0,05
CD4CD25 4,1 ± 1,6 0,8 3,1 ± 1,1 1,0 > 0,05
CD4CD25CD27 31,7 ± 8,5 7,1 23,1 ± 8,2 5,9 > 0,05
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Tabela 6 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-), e estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.S.E.M. = erro-padrão da média.
TCT + TCT - -
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
38kDa CD3CD4 114,6 ± 19,5 42,8 209,7 ± 21,6 45,1 0,006
+ CD3CD8 61,8 ± 7,2 23,8 112,2 ± 11,7 24,8 0,005
CFP10 Razão CD4/CD8 1,8 ±0,2 2,1 ± 0,3 > 0,05
CD4CD62L 20,9 ± 12,5 11,4 108,0 ± 19,9 23,1 0,020
CD8CD62L 18,5 ± 7,1 7,9 55,1 ± 8,2 11,8 0,010
CD16CD56 1,7 ± 0,5 0,5 22,2 ± 16,2 * 7,2 * 0,030
CD3CD16CD56 0,2 ± 0,1 0,1 17,3 ± 2,6 6,2 0,045
CD4CD25 2,5 ± 0,8 0,9 6,9 ± 2,6 1,8 > 0,05
CD4CD25CD27 21,0 ± 5,9 7,5 28,6 ± 6,7 7,2 > 0,05
ESAT-6 CD3CD4 127,1 ± 12,8 46,4 233,0 ± 27,3 44,7 0,010
+ CD3CD8 65,3 ± 5,9 24,3 125,2 ± 17,7 24,6 0,003
CFP10 Razão CD4/CD8 2,0 ± 0,1 2,1 ±0,4 > 0,05
CD4CD62L 25,9 ± 15,8 10,7 109,3 ± 23,9 22,5 0,037
CD8CD62L 18,3 ± 7,1 6,9 55,0 ± 8,2 11,1 0,006
CD16CD56 2,8 ± 1,3 1,0 27,9 ± 21,3 7,4 0,050
CD3CD16CD56 1,9 ± 1,6 0,7 23,0 ± 3,7 6,4 > 0,05
CD4CD25 2,5 ± 0,8 0,8 8,1 ± 3,7 1,9 > 0,05
CD4CD25CD27 22,8 ± 5,8 7,4 30,9 ± 7,4 7,2 > 0,05CD3CD4/CD8+: células T aux/cit, CD4/CD8CD62L+: células T aux/cit de memória; CD16CD56+: Células NK; CD3CD16CD56+: Células NKT; CD4CD25+: linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27+: linfócitos Treg naturais.
Figura 10b: Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos isolados e combinações, específicos para MTB. * (p<0,05)
05
101520253035404550
PPD+ PPD- PPD+ PPD-
38 kDa/CFP-10 ESAT-6/CFP-10
% d
e ce
lulas
T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
*
% d
e cé
lula
s
*
TCT+ TCT- TCT+ TCT-
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
57
Os indivíduos não-TB também foram categorizados quanto à exposição recente
a pacientes com TBa (CTr; n=15) ou exposição ambiental (Cae; n=17). Em geral, a
média absoluta e percentual de expressão de células iTreg, NK, NKT e nTreg, estão
aumentados nos indivíduos classificados como CTr, não havendo diferença entre os
reatores (8/15) e os não reatores (7/15) ao teste cutâneo à tuberculina. Por outro lado,
em geral, o número absoluto e percentual de células Taux e Tcit de memória, mostrou-
se mais elevado entre os indivíduos Cae estimulados com todos os antígenos, embora
sem diferença significativa, sendo esta evidenciada apenas na população de linfócitos
Taux de memória para os antígenos PPD e 38kDa/CFP-10 (p<0,05; tabela 7 e figura 11a
e 11b).
0
10
20
30
40
50
60
CTr Cae CTr Cae CTr Cae
PPD 16 kDa AlaDH
% c
elul
as T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
Figura 11a: Porcentagem média de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD erecombinantes simples específicos para MTB.
% d
e cé
lula
s
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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Tabela 7: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
CTr Cae
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
PPD CD3CD4 205,9 ± 28,7 42,5 212,4 ± 25,7 48,6 > 0,05
CD3CD8 113,1 ± 14,1 24,4 117,3 ± 11,3 27,9 > 0,05
Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,4 > 0,05
CD4CD62L 89,3 ± 15,8 20,3 138,2 ± 27,3 30,7 0,05
CD8CD62L 59,6 ± 8,8 13,1 72,9 ± 9,0 16,9 > 0,05
CD16CD56 25,5 ± 17,5 7,8 5,7 ± 2,0 1,3 > 0,05
CD3CD16CD56 20,1 ± 17,5 6,6 1,3 ± 0,6 0,3 > 0,05
CD4CD25 9,7 ± 3,0 2,5 2,2 ± 0,8 0,6 > 0,05
CD4CD25CD27 40,6 ± 9,7 9,3 23,2 ± 6,5 5,8 > 0,05
16 kDa CD3CD4 227,0 ± 32,2 44,6 185,5 ± 31,5 48,4 > 0,05
CD3CD8 119,8 ± 18,6 24,2 98,8 ± 14,0 27,8 > 0,05
Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,4 > 0,05
CD4CD62L 106,2 ± 26,9 20,6 116,5 ± 28,1 30,2 0,062
CD8CD62L 49,8 ± 6,7 10,8 57,3 ± 8,1 16,1 > 0,05
CD16CD56 24,6 ± 19,4 6,8 4,7 ± 1,7 1,1 > 0,05
CD3CD16CD56 21,2 ± 19,4 6,0 1,0 ± 0,5 0,3 > 0,05
CD4CD25 8,5 ± 4,4 2,0 3,2 ± 0,9 0,9 > 0,05
CD4CD25CD27 34,7 ± 9,4 7,9 24,3 ± 6,8 6,6 > 0,05
AlaDH CD3CD4 210,7 ± 28,0 43,5 186,5 ± 31,0 48,9 > 0,05
CD3CD8 108,3 ± 11,3 23,6 97,9 ± 12,7 27,5 > 0,05
Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,4 > 0,05
CD4CD62L 93,3 ± 19,4 20,1 116,9 ± 27,0 30,8 > 0,05
CD8CD62L 50,0 ± 10,7 10,5 60,7 ± 7,8 16,5 > 0,05
CD16CD56 20,1 ± 13,8 7,5 4,8 ± 1,7 1,2 > 0,05
CD3CD16CD56 15,9 ± 13,8 6,7 1,0 ± 0,7 0,3 > 0,05
CD4CD25 4,7 ± 1,4 1,1 1,7 ± 0,5 0,6 > 0,05
CD4CD25CD27 25,8 ± 6,7 5,7 27,2 ± 11,9 7,4 > 0,05
Vinicius Ribeiro Cabral
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Tabela 7 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
CTr Cae
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
38kDa CD3CD4 161,0 ±23,1 41,8 193,7 ± 30,0 48,1 > 0,05
+ CD3CD8 83,1 ± 10,8 22,2 109,1 ± 16,5 28,1 > 0,05
CFP10 Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,3 2,0 ± 0,4 > 0,05
CD4CD62L 71,6 ± 19,1 17,2 109,7 ± 19,8 29,6 0,020
CD8CD62L 25,9 ± 6,4 6,3 66,0 ± 10,0 16,8 > 0,05
CD16CD56 20,3 ± 16,3 6,9 4,7 ± 1,7 1,1 > 0,05
CD3CD16CD56 17,1 ± 16,3 6,1 0,6 ± 0,1 0,2 > 0,05
CD4CD25 6,3 ± 2,6 1,8 3,3 ± 1,1 0,9 > 0,05
CD4CD25CD27 25,6 ± 6,4 7,1 25,8 ± 7,0 7,7 > 0,05
ESAT-6 CD3CD4 182,2 ± 29,2 43,3 209,7 ± 28,1 48,7 > 0,05
+ CD3CD8 94,7 ± 18,6 22,5 114,9 ± 15,1 27,8 > 0,05
CFP10 Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,3 2,0 ± 0,4 > 0,05
CD4CD62L 66,2 ± 20,1 15,7 126,6 ± 24,4 30,1 > 0,05
CD8CD62L 24,9 ± 6,5 5,3 67,3 ± 8,8 16,2 > 0,05
CD16CD56 25,7 ± 21,4 7,0 6,3 ± 2,2 1,5 > 0,05
CD3CD16CD56 22,9 ± 21,4 6,4 2,0 ± 1,6 0,7 > 0,05
CD4CD25 7,6 ± 3,8 1,9 3,4 ± 1,0 0,9 > 0,05
CD4CD25CD27 27,6 ± 7,3 7,2 28,1 ± 6,6 7,3 > 0,05CD3CD4/CD8+: Células T aux/cit, CD4/CD8CD62L+: Células T aux/cit de memória; CD16CD56+: Células NK; CD3CD16CD56+: Células NKT; CD4CD25+: Linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27+: Linfócitos Treg naturais.
Figura 11b: Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.
0
10
20
30
40
50
60
CTr Cae CTr Cae
38 kDa/CFP-10 ESAT-6/CFP-10
% c
elul
as T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62L
CD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
% d
e cé
lula
s
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Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
60
Embora os pacientes com TBa tenham apresentado menor estimulação pelos
antígenos testado e controles, avaliamos se o tratamento com tuberculostáticos interfere
na expressão das populações celulares. Em geral, não houve diferença nas populações
celulares entre os pacientes tratados >60 dias (TBt≥60d.; n=10) e pacientes ainda não
tratados ou tratados a menos de 60 dias (TBi<60d; n=11). Entretanto, o percentual de
linfócitos Tcit aumentou significativamente com o estímulo dos antígenos 16kDa e
AlaDH nos TBi<60d (p=0,043), enquanto que os linfócitos Taux de memória estão em
média mais elevados entre os TBt≥60d na estimulação com 16kDa (p=0,008). Embora
sem diferença significativa, os antígenos 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 levaram a
um aumento de expressão destas células nos pacientes TBt≥60d (tabela 8, figuras 12a e
12b).
Figura 12a: Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD e recombinantes simples, específicos para MTB. (* p<0,05)
0
10
20
30
40
50
TBi<60d TBt≥60d TBi<60d TBt≥60d TBi<60d TBt≥60d
PPD 16 kDa AlaDH
% c
elul
as T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
**
* *
% d
e cé
lula
s
* *
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Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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Tabela 8: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
TBi<60d TBt≥60d
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
PPD CD3CD4 170,8 ± 20,8 46,3 183,7 ± 62,2 48,4 > 0,05
CD3CD8 93,3 ± 19,7 24,8 74,2 ± 9,2 19,4 > 0,05
Razão CD4/CD8 2,7 ± 0,2 2,1 ± 0,6 > 0,05
CD4CD62L 82,6 ± 15,4 20,6 98,5 ± 14,2 28,6 > 0,05
CD8CD62L 37,6 ± 5,7 10,3 49,2 ± 12,3 13,7 > 0,05
CD16CD56 7,2 ± 4,0 1,9 5,1 ± 3,0 1,6 > 0,05
CD3CD16CD56 0,9 ± 0,5 0,2 1,1 ± 0,6 0,3 > 0,05
CD4CD25 4,2 ± 1,5 1,5 1,4 ± 0,5 0,5 > 0,05
CD4CD25CD27 22,3 ± 7,8 6,2 13,6 ± 3,4 4,5 > 0,05
16 kDa CD3CD4 131,2 ± 18,4 39,4 160,7 ± 16,4 47,3 > 0,05
CD3CD8 85,7 ± 15,7 25,6 * 65,3 ± 6,8 19,5 0,043
Razão CD4/CD8 2,6 ± 0,2 1,8 ± 0,6 0,059
CD4CD62L 61,3 ± 12,1 16,9 93,0 ± 13,1 27,3 * 0,008
CD8CD62L 33,7 ± 6,7 9,6 43,2 ± 9,8 12,8 > 0,05
CD16CD56 6,0 ± 3,1 1,8 4,9 ± 2,5 1,6 > 0,05
CD3CD16CD56 0,4 ± 0,2 0,1 1,1 ± 0,6 0,3 > 0,05
CD4CD25 3,4 ± 1,4 1,0 1,6 ±0,6 0,5 > 0,05
CD4CD25CD27 17,0 ± 6,3 5,2 14,2 ± 4,0 4,7 > 0,05
AlaDH CD3CD4 141,5 ± 24,4 40,2 183,9 ± 12,9 48,8 > 0,05
CD3CD8 93,0 ± 10,6 25,2 * 70,2 ± 6,2 19,3 0,043
Razão CD4/CD8 2,7 ± 0,2 1,8 ± 0,5 0,059
CD4CD62L 81,2 ± 20,3 19,7 101,9 ± 10,0 29,1 > 0,05
CD8CD62L 36,7 ± 6,6 10,2 48,2 ± 10,3 13,1 > 0,05
CD16CD56 5,1 ± 2,2 1,6 4,7 ± 2,6 1,5 > 0,05
CD3CD16CD56 0,7 ± 0,2 0,2 0,9 ± 0,5 0,3 > 0,05
CD4CD25 2,2 ± 0,8 0,7 0,6 ± 0,2 0,2 > 0,05
CD4CD25CD27 11,7 ± 4,2 3,9 9,9 ± 3,3 3,3 > 0,05
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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Tabela 8 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) etratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD, recombinantes simples e combinados específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.
TBi<60d TBt≥60d
Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor
38kDa CD3CD4 123,7 ± 21,8 40,3 173,1 ± 9,6 47,7 > 0,05
+ CD3CD8 71,9 ± 15,7 22,5 72,6 ± 9,1 20,0 > 0,05
CFP10 Razão CD4/CD8 2,6 ± 0,2 2,0 ± 0,5 > 0,05
CD4CD62L 69,9 ± 15,3 18,1 84,3 ± 5,8 26,8 0,059
CD8CD62L 36,2 ± 8,8 9,4 36,2 ± 11,6 10,7 > 0,05
CD16CD56 5,3 ± 2,6 1,7 5,2 ± 3,0 1,4 > 0,05
CD3CD16CD56 0,6 ± 0,3 0,2 1,0 ± 0,7 0,3 > 0,05
CD4CD25 1,7 ± 0,9 0,8 2,4 ± 0,8 0,2 > 0,05
CD4CD25CD27 14,6 ± 4,2 4,7 15,6 ± 4,3 5,2 > 0,05
ESAT-6 CD3CD4 123,7 ± 24,5 39,1 167,9 ± 3,6 47,6 > 0,05
+ CD3CD8 67,5 ± 14,9 20,6 66,2 ± 9,7 18,9 > 0,05
CFP10 Razão CD4/CD8 2,7 ± 0,2 2,0 ± 0,5 0,059
CD4CD62L 64,5 ± 13,8 19,3 80,6 ± 9,2 26,5 > 0,05
CD8CD62L 32,7 ± 8,4 9,3 36,0 ± 11,8 10,1 > 0,05
CD16CD56 5,2 ± 2,5 1,6 4,3 ± 2,6 1,2 > 0,05
CD3CD16CD56 0,7 ± 0,2 0,2 0,9 ± 0,6 0,3 > 0,05
CD4CD25 2,6 ±1,1 0,9 2,6 ± 0,8 0,8 > 0,05
CD4CD25CD27 15,8 ± 5,2 5,1 15,8 ± 4,6 5,0 > 0,05CD3CD4/CD8: células T aux/cit, CD4/CD8CD62L: células T aux/cit de memória; CD16CD56: Células NK; CD3CD16CD56: Células NKT; CD4CD25: linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27: linfócitos Treg naturais.
Figura 12b: Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início de tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.
0
10
20
30
40
50
60
TBi<60d TBt≥60d TBi<60d TBt≥60d
38 kDa/CFP-10 ESAT-6/CFP-10
% c
elul
as T
CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27
% d
e cé
lula
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Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
63
4.7) Análise da produção de citocinas Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10)
A produção de citocinas do perfil Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10) no sobrenadante da
cultura de PBMC estimuladas com antígenos recombinantes micobacterianos foi
avaliada em 18 pacientes TBa e 32 indivíduos não-TBa, dos quais 11 TCT+ e 21 TCT-.
Houve produção espontânea de ambas as citocinas nos controles não estimulados: TBa:
25,1 ± 6,3; indivíduos TCT+: 132,2 ± 40,3; indivíduos TCT-: 29,6 ± 7,8 para IFN- e
TBa: 566,4 ± 203,9; indivíduos TCT+: 64,0 ± 36,1; indivíduos TCT-: 404,0 ± 136,4
para IL-10.
A média de produção de IFN- foi mais elevada entre os indivíduos TCT+ em
relação aos pacientes TBa e indivíduos TCT- (p≤0,015); com os antígenos 16kDa
(131,5 ± 49,7) e ESAT-6/CFP-10 (130,3 ± 28,2) mostrando as maiores reatividades
médias, seguido do AlaDH (119,2 ± 51,3), PPD (117,3± 44,0), e da combinação
38kDa/CFP-10 (105,7 ± 34,5), porém sem diferença significativa (figura 13).
Nos pacientes TBa, a maior reatividade média foi obtida para a combinação
ESAT-6kDa/CFP-10 (68,0 ± 22,4), seguida do 38kDa/CFP-10 (59,7 ± 18,4), AlaDH e
PPD (43,1±18,8 e 37,7±7,4 respectivamente); já entre os indivíduos TCT-, os antígenos
ESAT-6kDa/CFP-10 (44,8 ±14,2) e 38kDa/CFP-10 (37,9 ±16,1) contribuíram com a
maior reatividade média de IFN-,bem como o antígeno PPD (44,4 ±9,3) Para ambos
os grupos de indivíduos o antígeno 16kDa foi o menos reconhecido (16,2 ± 4,0; 19,0 ±
5,5 respectivamente – figura 13).
A análise da produção de IL-10 mostrou resultado inverso ao IFN-, pois a
produção média de IL-10 foi menor nos indivíduos TCT+ que nos indivíduos com TBa
e indivíduos TCT- (p<0,03), com o antígeno 16kDa responsável pela maior reatividade
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
64
média (139,6 ± 50,8). Os antígenos que melhor induziram a produção de IL-10 nos TBa
e sadios não reatores ao teste tuberculínico, foram o 38kDa/CFP-10 (741,2 ±256,3) e
ESAT-6kDa/CFP-10 (841,8 ±360,7) e o 16kDa, além do antígeno PPD (756,6 ±279,2;
688,6 ± 210,3 respectivamente – figura 13).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
200,0
TBa PPD+ PPD-
IFN
-gam
a (p
ico
gra
mas
/mL
)
PPD
16K
ALADh
38CFP
ESAT CFP
* p≤0,015
Figura 13 – Reatividade média da produção de IFN- e IL-10 testados por ensaio imunoenzimático (ELISA) no sobrenadante de cultura de PBMC, de pacientes com tuberculose ativa (TBa), e indivíduos não-TB, categorizados quanto a reação positiva (TCT+) ou negativa (TCT-) para o teste cutâneo à tuberculina estimuladas com diferentes antígenos de MTB.
0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
1200,0
1400,0
TBa PPD+ PPD-
IL-1
0 (
pic
og
ram
as/
mL
)
PPD
16K
AlaDh
38kDa/CFP-10
ESAT6/CFP-10
* p<0,03
TCT+ TCT-
TCT+ TCT-
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
65
Ao avaliar a reatividade por IFN- e IL-10 nos indivíduos não-TB/TCT positivos
e negativos, dicotomizados quanto a exposição à tuberculose (CTr e Cae), observou-se
que a maior produção média de IFN- está associada aos CTr/TCT+ e, embora a média
de IFN- para o ESAT-6/CFP-10 esteja mais elevada esta não difere estatisticamente
das médias induzidas pelos outros antígenos. Embora TCT+, o grupo Cae apresentou
intensidade média de IFN- similar ao grupo Cae não reator ao PPD, para os antígenos
AlaDH, e as combinações 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10, exceto o 16kDa cuja
média de IFN- foi mais elevada para Cae/PPD+, embora sem diferença significativa. O
grupo de voluntários Cae contém apenas três indivíduos, onde um deles mostrou-se alto
produtor de IFN- (>362,8pg/mL) para todos os antígenos testados, o segundo indivíduo
foi médio produtor para o antígeno 16kDa (90,6pg/mL) e foi baixo produtor de IFN-
para todos os outros antígenos, exceto 38kDa/CFP-10 (52,14pg/mL), o terceiro
indivíduo foi baixo produtor para todos os antígenos exceto para o ESAT-6/CFP-10
(76,8pg/mL , figura 14).
A produção média de IL-10 nestes mesmos indivíduos mostrou-se invertida com
média mais elevada associada ao grupo Cae/TCT- para o antígeno 16kDa (p=0,048). A
combinação de ESAT-6/CFP-10 nos PPD não reatores foi também forte indutora de IL-
10, diferencialmente em relação ao grupo CTr/TCT+ (p<0,05; figura 14).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
66
0
20
40
60
80
100
120
140
160
CTr Cae CTr Cae
TCT+ TCT-
IFN
-ga
ma
(p
ico
gra
ma
s/m
L)
PPD
16kDa
ALADh
38CFP
ESAT CFP
617,2
•90,6
•
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
CTr Cae CTr Cae
TCT+ TCT-
IL-1
0 (
pic
og
ram
as
/mL
)
PPD
16K
AlaDh
38kDa/CFP-10
ESAT6/CFP-10
*
Figura 14: Concentração de IFN- e IL-10 produzido pelos indivíduos não-TB TCT+ e TCT-, categorizados quanto à exposição para tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, recombinantes simples e combinados, específicos para MTB. (* p<0,05).
617,2
•
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
67
Analisando a resposta imune celular por IFN- e IL-10 nos pacientes TBa quanto
ao tempo de tratamento observou-se maior produção média de IFN- nos pacientes
TBt>60d apenas quando estimulados com a combinação ESAT-6/CFP-10 (92,8 23,9),
porém sem diferença significativa quando comparado com as médias dos outros
antígenos testados. Embora a média de resposta por IFN- para ESAT-6/CFP-10 (63,8
21,9) e 38kDa/CFP-10 (63 26,6) entre os TBi<60d tenham sido similares, estas se
comportam diferentemente dos TBt>60d, pois para o 38kDa/CFP-10, bem como para os
outros antígenos, houve um decréscimo na média de produção de INF- (38,8 10,6),
embora sem diferença significante. O antígeno 16kDa não se mostrou um bom indutor
de IFN- nos pacientes TBa tratados ou não tratados (figura 15).
Na avaliação da resposta para IL-10, produção significativa foi observado para o
grupo TBt>60d vs. TBi<60d para todos os antígenos micobacterianos (p<0,028), exceto
para o antígeno PPD (p=0,318; figura 15).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
68
0
20
40
60
80
100
120
140
TBi <60d TBt ≥60d
IFN
-ga
ma
(pic
og
ram
as/
mL
)
PPD
16K
AlaDh
38kDa/CFP-10
ESAT6/CFP-10
0
500
1000
1500
2000
2500
TBi <60d TBt ≥60d
IL-1
0 (
pic
og
ram
as/
mL
)
PPD
16K
AlaDh
38kDa/CFP-10
ESAT6/CFP-10
*
Figura 15: Resposta média da produção de IFN- e IL-10 por pacientes TBa no início (TBi <60d) e com mais de 60 dias (TBt>60d) de tratamento. Resultados obtidos por teste imunoenzimático (ELISA). (*=p<0,05).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
69
4.8) Freqüência de positividade para IFN- e IL-10 no sobrenadante de PBMC
dos pacientes TBa e indivíduos não-TB estimulados com diferentes antígenos
micobacterianos, determinado pelo método imunoenzimático (ELISA)
A análise da freqüência de positividade para o IFN- (≥50pg/mL) no teste de
ELISA mostra que os indivíduos TCT+ foram significativamente mais respondedores
(p<0,005) que os indivíduos TCT- e TBa, para todos os antígenos testados. Maior
freqüência de positividade foi obtida com o antígeno combinado 38kDa/CFP-10 (90%),
seguido dos antígenos ESAT-6/CFP-10, 16kDa, PPD (81% respectivamente) e AlaDH
(73 %) para os indivíduos TCT+. No grupo TCT-, a frequência de produtores de IFN-,
é menor que entre os pacientes TB ativa, porém sem diferença significativa.
Analisando o grupo não-TB quanto a exposição a TB observou-se que o maior
número de respondedores se encontra entre os CTr, principalmente para a combinação
38kDa/CFP-10 e antígeno PPD (100%; tabela 9). É interessante notar que entre os
CTr/TCT+ 7 de 8 que foram positivos para a produção de IFN- quando estimulados
com o antígeno 16kDa, e também o foram para o AlaDH e ESAT-6/CFP-10; mas o
38kDa/CFP-10 induziu IFN- em todos os CTr, apresentando melhor reatividade.
Resultado similar foi obtido com os indivíduos Cae/TCT+ onde 2 de 3 que foram
positivos para IFN- quando induzidos com o 16kDa o foram também para o
38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10.
Considerando os CTr/TCT- apenas 2 de 7, que foram positivos para IFN-
quando induzidos com o 16kDa, também o foram para ambas as combinações. Já no
grupo Cae/TCT- a freqüência de respondedores foi baixa e não obedeceram ao padrão
observado acima para os antígenos 16kda, e as combinações, onde o único indivíduo
positivo para 16kDa, foi negativo para as combinações (tabela 9).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
70
Tabela 9: Freqüência e significância estatística da resposta imunitária por IFN- produzido pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (PPD -), estimulados com antígenos micobacterianos.
Número de positivos/total (%)TB TCT+ TCT-
PPD 7/18 (39) 9/11 (81) * 8/21 (38)16kDa 1/18 (6) 9/11 (81) * 4/21 (19)AlaDH 5/18 (28) 8/11 (73) * 3/21 (14)38kDa/CFP-10 7/18 (39) 10/11 (90) * 6/21 (29)ESAT-6/CFP-10 7/18 (39) 9/11 (81) * 7/21 (33)
* = p<0,05
Número de positivos/total (%)TCT + TCT -
CTr Cae CTr Cae
PPD 8/8 (100) 1/3 (33) 3/7 (43) 5/14 (36)16kDa 7/8 (87,5) 2/3 (67) 2/7 (29) 1/14 (7)AlaDH 7/8 (87,5) 1/3 (33) 1/7 (14) 2/14 (14)38kDa/CFP-10 8/8 (100) 2/3 (67) 4/7 (57) 2/14 (14)ESAT-6/CFP-10 7/8 (87,5) 2/3 (67) 4/7 (57) 3/14 (21)
A frequência de positividade para IL-10 (≥200pg/mL) para os grupos testados
apresenta resultados contrários aos obtidos para IFN- onde os grupos TB e TCT-
respondem com uma maior freqüência de positividade, em relação ao grupo TCT+. A
queda de produção de IL-10 no grupo TCT+ foi significante para todos os antígenos
micobacterianos (p<0,05). Quando os indivíduos não-TB foram dicotomizados em CTr
e Cae, observou-se que os respondedores distribuem-se em maior frequência entre o
grupo Cae, seja para os indivíduos TCT+ ou TCT-. Não observamos resposta entre os
TCT+/CTr, mas contrariamente, o grupo TCT-/CTr foi forte respondedor, para todos os
estímulos antigênicos (tabela 10).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
71
Tabela 10: Freqüência e significância estatística da resposta imunitária por IL-10 produzida pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-), estimulados com antígenos micobacterianos.
Número de positivos/total (%)TB TCT+ TCT-
PPD 11/18 (61) 2/11 (18) * 12/21 (57)16kDa 12/18 (67) 1/11 (9) * 14/21 (67)AlaDH 8/18 (44) 2/11 (18) * 14/21 (67)38kDa/CFP-10 9/18 (50) 2/11 (18) * 15/21 (71)ESAT-6/CFP-10 9/18 (50) 2/11 (18) * 12/21 (57)
* = p<0,05
Número de positivos/total (%)TCT + TCT -
CTr Cae CTr CaePPD 0/8 (0) 2/3 (67) 6/7 (86) 6/14 (43)16kDa 0/8 (0) 1/3 (33) 6/7 (86) 8/14 (57)AlaDH 0/8 (0) 2/3 (67) 6/7 (86) 8/14 (57)38kDa/CFP-10 0/8 (0) 2/3 (67) 6/7 (86) 9/14 (64)ESAT-6/CFP-10 0/8 (0) 2/3 (67) 4/7 (57) 8/14 (57)
Entre os pacientes TBa com BAAR positivo, dois eram mais bacilíferos
(BAAR++) e não responderam para nenhum dos antígenos testados; já os menos
bacilíferos [BAAR+ 36%(4/11)] responderam por IFN- ao antígeno PPD e ESAT-
6/CFP-10 em 27%, ao AlaDH e 38 kDa/CFP-10, e o antígeno 16kDa foi reconhecido
por apenas um paciente recém diagnosticado e ainda sem início de tratamento. Os
pacientes TBa paucibacilares (BAAR-) foram em sua maioria respondedores para o
ESAT-6/CFP-10, 38 kDa/CFP-10 e PPD (3/4, respectivamente) seguido do AlaDH
(1/4) e o 16kDa não foi reconhecido por nenhum deles. Para IL-10 todos os bacilíferos
(BAAR++ e BAAR+) responderam aos antígenos 16kDa (64 %) e PPD (54 %) e para os
paucibacilares 2/4 responderam para todos os antígenos, respectivamente.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
72
4.9) Análise dos dados clínicos, epidemiológicos e demográficos relacionados a
população com resultado de imunofenotipagem e produção de citocinas
Através do banco de dados montado com as informações dos sujeitos do estudo
por questionário padronizado, foram avaliadas a relação entre a estimulação das PBMC
com os antígenos micobacterianos recombinantes e as características clínicas,
epidemiológicas e demográficas.
4.9.1) Análise quanto aos diversos grupos celulares:
Pacientes TBa: os pacientes TBa apresentaram diferenças significativas em
algumas subpopulações de linfócitos. No grupo de alcoolistas, houve decréscimo da
média celular para linfócitos Taux estimulados com 38kDa/CFP-10 (p=0,043) e na
razão Taux/Tcit, quando da estimulação com ESAT-6/CFP-10 (p=0,043), em relação
aos indivíduos não-TB; Entre os pacientes tabagistas a estimulação com a combinação
de antígenos 38kDa/CFP-10 provocou queda significativa da média de linfócitos Taux
de memória (p=0,020).
Pacientes no inicio (TBi<60d) ou em tratamento para TB (TBt>60d) : avaliamos
se o tratamento possuía alguma influência na modulação da resposta imunitária em
pacientes antes e durante o tratamento para TB. A estimulação com os antígenos
micobacterianos provocou um discreto aumento na razão CD4/CD8, sendo que o
antígeno 16kDa elevou a porcentagem de linfócitos Taux de memória (p=0,008) e os
antígenos PPD, 16kDa e AlaDH aumentaram a porcentagem de linfócitos Tcit de
memória nos pacientes durante o tratamento com tuberculoestáticos (p=0,04).
A estimulação com os antígenos micobacterianos também foi importante na
modulação da porcentagem de linfócitos Taux de memória nos pacientes com
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
73
bacterioscopia positiva para BAAR. Os antígenos 16kDa e os combinados provocaram
queda significativa no percentual celular (p<0,05).
Contatos Recentes de pacientes com TBa e Controles de Área Endêmica: no
grupo de indivíduos com exposição recente a pacientes com TB, o fato de ser alcoolista,
foi associada a redução no número absoluto de linfócitos NKT (p =0,045). Entretanto a
redução desta população celular foi exacerbada sob estimulação com os antígenos
16kDa (p=0,019), AlaDH (p=0,004) e a combinação ESAT-6/CFP-10 (p=0,002). As
células NK também tiveram sua média absoluta reduzida significativamente pela
estimulação do antígeno AlaDH (p=0,045) e percentualmente pelo 16kDa (p=0,04).
Outro grupo de células que sofreu decréscimo percentual nos alcoolistas, foram as
iTregs estimuladas com o antígeno 16kDa (p=0,03).
A utilização de tabaco regularmente também modulou negativamente a razão
entre os linfócitos Taux eTcit (razão CD4/CD8) nos indivíduos CTr (p =0,006). Sob
estimulação dos antígenos 16kDa, AlaDH, e as combinações de 38kDa e ESAT-6 com o
CFP-10, esta redução numérica e percentual tornou-se mais acentuada (p =0,003). Esta
modulação foi reflexo da redução nas populações de linfócitos Taux sob estímulo de
38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 (p=0,05) e de linfócitos Tcit para os estímulos 16kDa
(p=0,05) e AlaDH (p=0,01).
Como esperado, indivíduos com reação positiva ao teste cutâneo à tuberculina
apresentaram redução no número absoluto de células estimuladas com o antígeno PPD,
sendo significativo para as os linfócitos nTreg (p =0,022) e linfócitos Tcit de memória
(p =0,05). O estímulo com os antígenos combinados, provocou queda na contagem de
linfócitos Tcit efetores e de memória, além dos linfócitos Taux de memória (p =0,05).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
74
Para os indivíduos controle de área endêmica, nenhuma das características
clínicas foi significante, na modulação da média celular. Entretanto o percentual de
linfócitos nTreg foi reduzido pela estimulação com 16kDa, nas PBMC de indivíduos
alcoolistas (p=0,03).
4.9.2) Análise quanto à produção de citocinas Th1 e Th2:
Quando os indivíduos foram analisados quanto ao hábito tabagista, nenhuma
diferença significativa foi encontrada. Entretanto o mesmo não acontece nos indivíduos
alcoolistas, já que os antígenos 38kDa e ESAT-6 em combinação com o CFP-10,
induziram maior reatividade média ao IFN- nas pessoas que mantinham este hábito
(p<0,048). Outros dados como vacinação por BCG e idade não apresentaram relação
com o perfil de produção de citocinas.
Pacientes TB ativa: o único grupo que apresentou significativa diferença na
estimulação de IFN- foi de pacientes com TCT+, o que é esperado, pois todos os
doentes deste estudo são TCT+ (p=0,017). O fato do indivíduo já ter tido tuberculose
anteriormente, é significativo na reatividade do antígeno 16kDa (p=0,05) e do AlaDH
(p=0,018). Nenhum outro fator como tabagismo ou alcoolismo influenciou
diferencialmente a resposta das citocinas.
Pacientes no inicio (TBi<60d) ou em tratamento para TB (TBt>60d) : o tempo
de tratamento influenciou na capacidade de resposta específica da citocinas frente a
estimulação de antígenos micobacterianos. Para o IFN-, apenas o antígeno PPD
induziu resposta positiva significativa nos pacientes tratados por ≥60 dias (p=0,016); já
para a IL-10, o tratamento foi associado a capacidade de responder a todos os antígenos
recombinantes (p<0,028).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
75
Contatos Recentes de pacientes com TBa e Controle de Área Endêmica: No
grupo CTr reatividade média de IFN-foi positivamente associada ao estímulo com
16kDa (p=0,047). A produção média de IL-10 foi significativa para a estimulação com
os antígenos AlaDH, 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 (p<0,
Quando estes indivíduos foram agrupados pela reatividade ao teste cutâneo à
tuberculina, os indivíduos TCT+ positivamente associados para a produção média de
IFN-, para todos os antígenos testados, incluindo o antígeno PPD (p<0,035). Já na
produção de IL-10, o estímulo com os antígenos AlaDH e PPD foram os únicos que
mostraram associação positiva (p=0,037; p=0,030 respectivamente).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
76
4.10) Expressão gênica de diversas citocinas na resposta imunitária ao MTB
A formação da resposta imunitária contra a tuberculose é complexa e envolve
muitas citocinas diferentes. Nesta parte dos resultados, procuramos visualizar a
expressão de diferentes genes para citocinas (FoxP3, IFN-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e
TGF-) na TB ativa e em indivíduos controles não-TB. A expressão gênica para FoxP3
foi maior entre os não-TB para todos os antígenos testados, inclusive os controles PHA
e PPD. É interessante notar que o estímulo com o antígeno 16kDa foi o único com
diferença significativa na baixa expressão de FoxP3 na comparação TBa vs. não-TB
(p=0,012; figura 16).
Figura 16: Expressão gênica para FoxP3 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
Analisando a expressão média de FoxP3 pelos linfócitos T de indivíduos não-
TB, estimulados ou não com os antígenos micobacterianos, observa-se que o antígeno
Expressão de FoxP3 mRNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/
CFP-10
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP
-10
ESAT-6/C
FP-1
0-20
-10
0
10
20
p=0,012
Não-TB TBa
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
77
PPD e o 38kDa/CFP-10 foram significativamente indutores da expressão média de
FoxP3 (P<0,05; figura 17). Nos pacientes TBa, não houve diferença entre os valores
não estímulados e estimulados como os antígenos.
Figura 17: Expressão gênica para FoxP3 nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.
O IFN- é um grande ativador inflamatório, pois induz ao perfil Th1 e aumenta a
expressão de MHC tipo 2 nos macrófagos. Foi evidenciado que a expressão média de
mRNA para IFN- nos pacientes TBa foi aumentada apenas para os antígenos
combinados, mas em nível menos elevado que para os indivíduos não-TB. Diferença
significativa da expressão média de INF- nestes dois grupos só foi observada para o
antígeno PPD (figura 18). A expressão gênica para IFN- em células T não estimuladas
vs. estimuladas, com os diferentes antígenos, analisada no grupo de indivíduos não-TB,
mostrou que apenas os antígenos PPD, 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 induzem
expressão significativa do gene para INF- (p<-0,05; figura 19).
Expressão de FoxP3 mRNA em não-TB
N.E.
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-10
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
@ @
@ = p<0,05 em relação ao não estimulado (N.E.)
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
78
Figura 18: Expressão gênica para IFN- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
Figura 19: Expressão gênica para IFN- nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.
Expressão de IFN mRNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/
CFP-1
0PHA
PPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP
-10
ESAT-6/C
FP-10
-20
-10
0
10
20
30
p=0,048
Não-TB TBa
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
Expressão de IFN- mRNA em não-TB
N.E.
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-10
-40
-30
-20
-10
0
10
@
@ = p<0,05 em relação ao não estimulado (N.E.)
@ @
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
79
Analisando a produção de RNA mensageiro (RNAm) para IL-1, uma citocina
com papel semelhante ao TNF na mediação da inflamação local, observamos que houve
uma tendência de aumento na expressão da citocina no grupo TBa, porém sem diferença
significativa (figura 20), o mesmo ocorrendo quando comparadas a expressão nas
células não estimuladas vs. estimuladas com os antígenos micobacterianos.
Expressão de IL-1 mRNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-10
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP
-10
ESAT-6/C
FP-10
-30
-20
-10
0
10
20
30
Não-TB TBa
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nor
mal
izad
o
Figura 20: Expressão gênica para IL-1 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
A expressão gênica para IL-6, uma citocina pirogênica que age em resposta a IL-
1, atuando no fígado para produção de proteínas de fase aguda, mostrou níveis mais
baixos nos pacientes com TBa vs. indivíduos não-TB para todos os estímulos
antigênicos, mas diferença significativa só foi observada para a estimulação com
combinação 38kDa/CFP-10 (p=0,048; figura 21A). A expressão média de RNAm para
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Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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IL-6 nas células T não estimuladas vs. estimuladas, com os diferentes antígenos,
mostrou que apenas o estímulo inespecífico PHA e o antígeno PPD foram
significativamente diferentes (p=0,05) (figura 21B).
Figura 21: Expressão gênica para IL-6 (A) em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos. (B) expressão gênica nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão.
Expressão de IL -6 m RNA em não-T B
N.E.
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kDa/C
FP-10
ESAT-6/C
FP-10
-30
-20
-10
0
10
@
@ = p<0,05 em re lação ao não estimulado (N.E.)
@
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
E xpres são de IL6 m RNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-10
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/
CFP-10
-30
-20
-10
0
10
20
30
p =0 ,0 4 8
Não-TB TB a
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
A
B
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A IL-8 tem atividade quimiotática, também muito importante na modulação da
resposta inflamatória, e por isso foi analisada. Os níveis médios de expressão de IL-8
estão mais elevados para os indivíduos não-TB, porém com nível de expressão
significativamente aumentado apenas para a combinação de antígenos 38kDa/CFP-10
(p=0,048; figura 22).
Figura 22: Expressão gênica para IL-8 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
Expressão de IL-8 mRNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-1
0PHA
PPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/
CFP-1
0-30
-20
-10
0
10
20
p=0,048
Não-TB TBa
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
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Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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A IL-10 é uma citocina importante na regulação da resposta imunitária, pois tem
papel antagônico ao IFN-. Embora os valores médios de expressão da IL-10 tenham
sido menores nos pacientes tuberculosos, a diferença não foi significativa entre os
antígenos, comparando com os indivíduos não-TB, bem como entre as células não
estimuladas vs. estimuladas (figura 23).
Expressão de IL-10 mRNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP
-10
ESAT-
6/CFP
-10
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP
-10
ESAT-
6/CFP
-10
-30
-20
-10
0
10
20
Não-TB TBa
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nor
mal
izad
o
Figura 23: Expressão gênica para IL-10 de pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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Assim com o a IL-10, o TGF- possui atividade anti-inflamatória, pois inibe a
proliferação de macrófagos e células T efetoras. A expressão de TGF- entre os
pacientes TBa foi menor que nos indivíduos não-TB, principalmente para os antígenos
recombinantes micobacterianos, apesar de não haver diferença significativa (Figura 24).
Expressão de TGF- mRNA
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-10
PHAPPD
16kD
a
Ala-D
h
38kD
a/CFP-1
0
ESAT-6/C
FP-10
-20
-10
0
10
20
Não-TB TBa
Nív
el d
e E
xpre
ssão
No
rmal
izad
o
Figura 24: Expressão gênica para TGF- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.
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55)) DDIISSCCUUSSSSÃÃOO
Talvez o mais antigo microorganismo patogênico conhecido, co-evolui com a
humanidade desde tempos imemoriáveis. Mycobacterium tuberculosis parece estar tão
bem adaptado ao ambiente de seu hospedeiro que, mesmo com os recentes avanços das
ciências e a completa elucidação do seu genoma, permanece como um dos grandes
males da humanidade e, aumentou em número de casos associado à infecção por HIV,
principalmente nos países desenvolvidos, e ganhou status de “reemergente” (WHO,
2008). Há apenas 127 anos, o bacilo foi descrito e até hoje não foi descoberta uma
vacina e o tratamento, além de demorado e tóxico, é feito com medicamentos que já não
contemplam as recentes micobactérias multidroga resistentes.
O diagnóstico precoce diferencial, principalmente em populações de áreas
endêmicas é uma necessidade premente, assim como o entendimento sobre a relação
parasita-hospedeiro. O presente trabalho foi realizado para verificar determinados
aspectos da resposta imunitária ao MTB, no perfil celular, frente à estimulação com
cepas clínicas de MTB e antígenos recombinantes.
Através do banco de cepas do laboratório, foi selecionado um painel de cepas
clínicas de MTB com diferentes padrões de cópias do elemento de inserção IS6110,
pertencendo ou não a cluster, e de susceptibilidade às drogas tuberculostáticas. Os
resultados obtidos com a estimulação destas cepas mostraram heterogeneidade na
proliferação de células e na expressão de moléculas de superfície nas PBMC dos
voluntários TCT+ e TCT-. A estimulação com as cepas com menos de 4 cópias de
IS6110 provocou queda na média absoluta de linfócitos Taux e Tcit, tanto em relação às
PBMC não-estimuladas como em relação ao estímulo com o antígeno PPD, sendo
significativa apenas nos indivíduos TCT+. Cepas com 10 ou 11 cópias de IS6110
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
85
também modularam negativamente a proliferação celular, porém em menor escala.
Segundo alguns autores, determinadas cepas endêmicas prevalentes e com poucas
cópias de IS6110 possuem uma alta taxa de virulência e transmissão e estão associadas
com o tipo de resposta imunitária não-protetora, com supressão da produção de IL-1,
IFN-γ e TNF (VALWAY e cols. 1998; MANCA e cols. 1999; SHARMA e cols. 2003).
Em nosso estudo, foi também observado que cepas cluster foram menos reconhecidas
pelos voluntários TCT+, que as cepas não cluster.
É sabido que nos indivíduos primariamente infectados, a defesa imunitária bem
sucedida é caracterizada por forte resposta de hipersensibilidade tardia cutânea, mediada
por população de células T CD4+. Estes indivíduos sensibilizados produzem resposta
proliferativa de CD4+ e IFN- quando estimulados com antígenos tais como o PPD.
Estas células de memória não só controlam o foco de infecção inicial como também
seriam capazes de proteger o organismo contra reinfecção exógena. O
comprometimento desta população celular, como ocorre nos indivíduos infectados por
HIV, leva à infecção progressiva, reativação endógena ou aumenta a susceptibilidade a
reinfecção. (BOOM, 1996). Por outro lado, as células T CD8+, embora não seja clara
sua função na TB, têm sido descritas importantes na infecção por MTB, pois elas
participariam diretamente da lise de células infectadas, poderiam induzir apoptose e
secretar citocinas como IFN-γ e IL-4 (SCHLUGER & ROM, 1998). Em nosso estudo, o
voluntário J é sensibilizado (TCT+) e, embora tenha mostrado decréscimo na
quantidade de linfócitos Taux 52% maior em relação ao controle para a cepa 081 e 29%
maior para a cepa 282, foi respondedor para a produção de IFN- para todas as cepas,
exceto a cepa 238. Já o voluntário C, não reator (TCT-) apresentou redução 14% maior
que o controle nas células Tcit para a cepa 270, sem alteração das células Taux, não
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
86
sendo capaz de produzir IFN-, embora tenha se mostrado reativo para outras duas
cepas cluster (tabela 3).
Estes resultados mostram que existe variabilidade entre os voluntários na
quantidade de células ativadas e na produção de IFN- e esta variabilidade parece estar
relacionada à capacidade de resposta dos indivíduos, bem como a característica da cepa
infectante (tabela 3). A hipótese de estes resultados serem decorrentes de problemas
operacionais foi descartada, já que cada voluntário foi testado para todo o painel de
cepas na mesma série de experimentos. É interessante notar que indivíduos de área
endêmica TCT-, reconhecem determinadas cepas micobacterianas, principalmente cepas
prevalentes (cluster). Estes achados podem ser relevantes na busca de alvos para vacina,
pois considerando que os indivíduos apresentam resposta imunitária variada a diferentes
cepas, uma vacina eficaz deve conter moléculas indutoras de resposta imunitária
abrangente, isto é, que não estimule apenas as células CD4+, pois possivelmente outras
populações de células T devem contribuir para a proteção (KAUFMANN, 2006). De
acordo com Zhang e colaboradores (1998), a limitada quantidade de informações
disponíveis sobre as características de crescimento de MTB em células humanas, reflete
a dificuldade na análise e eliminação de fatores controversos na resposta imune ao
MTB.
Recentemente, em estudo realizado na Rússia, foi descrito que a supressão da
resposta imunitária humoral e celular está associada a maior resistência às drogas da
cepa de MTB infectante (PROBL TUBERK BOLEZN LEGK, 2008). Outro estudo
verificou redução de IFN-, para o antígeno PPD, produzido pelas PBMC de pacientes
infectados com cepas MDR-TB, em relação aos indivíduos TCT+ saudáveis, estando
associado à proliferação e contagem de linfócitos TCD4+ (LEE e cols. 2002). Em nosso
estudo, com PBMC de indivíduos saudáveis TCT+, observou-se que as cepas
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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infectantes resistentes às drogas levaram a menor produção média de IFN- quando
comparadas com as cepas sensíveis, embora sem diferença estatística. Estes resultados
sugerem que mesmo havendo resposta proliferativa às cepas estudadas, as cepas droga-
resistentes podem também estar suprimindo a resposta Th1 como observado, em maior
em estudos realizados em pacientes MDR-TB.
Para determinar possíveis modificações na média e percentual de linfócitos
periféricos em pacientes e contatos, a imunofenotipagem de diferentes populações
celulares foi realizada após estímulo com diferentes antígenos recombinantes
purificados. Estudos anteriores demonstraram variação na porcentagem e número
absoluto de linfócitos, relacionados à raça, sexo e idade (TOLLERUD e cols. 1989;
SHAHABUDDIN, 1995). No nosso estudo, estas diferenças não foram verificadas.
Corroborando resultados anteriores, foi observado tendência de queda no
número absoluto e percentagem de todos os grupos celulares nos pacientes TBa (AL-
MAJID & ABBA 2008, RODRIGUES e cols. 2002, JONES e cols. 1997). Um aspecto
interessante na tipagem celular foi a diminuição significativa no número absoluto e/ou
porcentagem dos linfócitos T citotóxicos nos TBa, quando estimulados com antígenos
brutos (PPD) e os recombinantes 16kDa e ESAT-6/CFP-10 (tabela 5). Resultado, este
similar ao obtido por Rodrigues e colaboradores (2002) em pacientes TB recém
diagnosticados e em controles operacionais de São Paulo, porém diferente dos obtidos
por Al-Majid & Abba (2008) em pacientes da Arábia Saudita, que nenhuma diferença
encontraram. Outros autores, entretanto, observaram contagens altas de CD8+ em TBa,
no Iran e Minas Gerais, que revertaram após tratamento (PESSARAN e cols 2005,
BARCELOS e cols 2006).
Por outro lado, diferentemente desses autores, para os linfócitos Tcit de
memória, verificamos redução na estimulação com o antígeno PPD (p=0,0231). Não se
Vinicius Ribeiro Cabral
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conhece bem a função destas células na TB, porém é sabido que antígenos
micobacterianos podem ser processados através do MHC-classe 1, por uma via
alternativa que não requer penetração do antígeno no citosol, o que pode promover um
mecanismo adicional de ativação de células T CD8+ (CANADAY e cols. 1999;
ACKERMAN & CRESSWELL, 2004). Em modelo murino, é sugerido que os
linfócitos Tcit sejam necessários no controle do estágio tardio da infecção por MTB
(Van PINXTEREN e cols. 2000). Baseado nestes dados é possível que a presença destas
células na TB esteja associada com a regulação do balanço Th1/Th2, porém,
considerando que os linfócitos CD8+ são mais freqüentes no local da infecção, isto
explicaria sua reduzida expressão no sangue periférico (ROSSI e cols. 1967). O fato de
Rodrigues e colaboradores (2002) terem obtido aumento na população de células
TCD8+ de memória, pode estar relacionada ao marcador por eles utilizado (CD38). Este
marcador de superfície foi observado, até o momento, apenas em pacientes HIV+ e no
diabetes mellitus tipo 1 (EVANS e cols. 1998; PEAKMAN e cols. 1994).
Ao analisarmos o perfil de células dos indivíduos não-TB divididos pela reação
ao teste tuberculínico, os indivíduos TCT+ apresentaram declínio da média absoluta de
diversos tipos celulares com estimulação dos antígenos micobacterianos,
significantemente para as combinações 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 (tabela 6),
exceto para as células Treg. Rodrigues e colaboradores (2002) obtiveram resultado
similar na estimulação com o antígeno PPD para as células TCD4+ e TCD8+, embora
nossos resultados não tenham sido significativos para este antígeno, sugerindo que em
nossa população, os antígenos combinados estimulam melhor as células TCD4+ e
TCD8+, ambas importantes na imunidade contra a tuberculose. Em modelos animais, é
mostrado que a deficiência de células T CD8+ pode resultar em susceptibilidade à
tuberculose (FLYNN e cols. 1992; BOOM e cols. 2003; FLYNN & CHAN, 2001). Nos
Vinicius Ribeiro Cabral
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89
indivíduos TCT+ da Arábia Saudita, foram descritos valores mais elevados de linfócitos
Taux e Tcit, que em nossa população, porém as células foram analisadas ex-vivo e é
sabido que os antígenos purificados induzem proliferação mais modesta (AL-MAJID &
ABBA, 2008; BOOM, 1996).
Para as células NK, tem sido descrito que os indivíduos TCT- possuem maior
número médio celular que os TCT+ quando testados ex-vivo (BARCELOS e cols.
2008). Em nosso estudo, apenas os indivíduos TCT- estimulados com as combinações
38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 e o antígeno 16kDa apresentaram números de células
e/ou percentual elevados significativamente. Já para as NKT, encontramos diferença
significativa apenas na estimulação com o 38kDa/CFP-10, mas Barcelos e
colaboradores (2008) mostraram-nas reduzidas em relação ao TCT+. Essa diferença
pode estar relacionada ao tamanho da amostragem, pois estes autores utilizaram 5 TCT-,
enquanto em nosso estudo foram avaliados 21 indivíduos TCT-. Por outro lado, quando
analisamos os não-TB dicotomizados quanto à exposição a tuberculose, os indivíduos
contato recente de pacientes TBa (CTr) apresentam números de NK e NKT em média
mais elevados que os controles de área endêmica (Cae), sugerindo que estas células
estivessem envolvidas no reconhecimento inicial e controle de possível infecção destes
indivíduos expostos.
As células NK são capazes de reconhecer o bacilo BCG (ESIN e cols. 2004), e
reconhecem diretamente moléculas micobacterianas solúveis, sem necessidade de
ativação prévia por linfócitos Taux (BANCROFT, 1993; BRILL e cols., 2001). As
células CD56+ podem facilitar o controle da infecção por MTB em TCT+, através da
produção precoce de IFN- que provavelmente mantém a freqüência de células
respondedoras para MTB e expande a atividade citotóxica das células NK
(APOSTOLOU e cols., 1999; ZAHRAN e cols., 2006; GODFREY e cols., 2004). As
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
90
células NKT são importantes contra infecções por parasitas intracelulares,
principalmente por ter ação rápida, antes da ativação da resposta imunitária adquirida,
sendo capazes de reconhecer antígenos independentemente de apresentação via MHC II
(DIELI e cols. 2003) e possuir atividade antimicobacteriana direta, através de liberação
de granulisina (GANSERT e cols. 2003). Possuem também atividade regulatória,
secretando citocinas pró ou antiinflamatórias que levam à limitação da infecção, mas
ainda não está claro como contribuem para este balanço (TANIGUSHI e cols. 2003; van
KAER, 2004).
Os linfócitos T CD4+ regulatórios já foram descritos como duas subpopulações
distintas, onde uma destas pode ser induzida na periferia, chamada de linfócitos T
regulatórios induzíveis (iTregs: CD4+CD25+), e a outra sai do timo já com a função
regulatória, chamada de linfócitos T regulatórios naturais (nTregs:
CD4+CD25+FoxP3+) (SAKAGUCHI, e cols. 2008). Entretanto, Ruprecht e cols.
(2005), descreveram que o receptor de superfície CD27 pode ser relacionado com a
atividade supressora de células Treg FoxP3+ durante o processo inflamatório, local e
sistemicamente, e também serviria de marcador para células CD4+CD25+ com
atividade regulatória. Portanto, neste estudo, CD4+CD25+CD27+ e as CD4+CD25+
foram utilizados para estudar as células nTreg e iTregs.
Ambos os linfócitos T regulatórios foram modulados nos indivíduos TCT+. Nos
diversos estímulos antigênicos, percebemos um quadro heterogêneo de resposta: os
antígenos 16kDa e AlaDH promoveram um aumento discreto na média de linfócitos
Treg para os TCT+, enquanto os antígenos 38kDa e ESAT-6 combinados com o CFP-
10, promoveram pequeno decréscimo em relação ao grupo TCT- (figura 6), embora
apenas para o antígeno PPD aumento significativo no percentual das nTreg tenha sido
observado. Estes achados podem ser indicativos de infecção recente, já que no trabalho
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
91
de Chen e cols. (2007) foi observada maior quantidade de linfócitos Treg nos pacientes
com TBa, estimulados com BCG e ESAT-6, em relação aos voluntários saudáveis Em
nosso estudo, entretanto, os TBa tiveram discreta diminuição das Treg, apenas para os
antígenos PPD, 16kDa e AlaDH; já as combinações apresentaram média do número
absoluto de células similar entre TBa e TCT+, sugerindo que estes antígenos modulam
diferentemente estas populações celulares.
Os achados acima podem ser explicados pelo fato da tuberculose ser uma doença
transmitida pessoa a pessoa e, portanto, a exposição dos indivíduos saudáveis, pode
acontecer por meio de um doente tuberculoso bacilífero ou por contato ambiental
esporádico. O estado do Rio de Janeiro é área endêmica de TB com incidência
aproximada de 92/100.000 pessoas (RELATÓRIO DE SÉRIES HISTÓRICAS DA
SAÚDE, 2007), o que significa que mesmo os indivíduos sem contato recente com
pacientes TBa, possuem risco de contrair a infecção. Segundo alguns autores,
freqüência de 0,2 a 2% foi estimada para o risco de infecção em área endêmica e de até
20% no contato freqüente com pacientes TBa (KRITSKI, CONDE & de SOUZA,
2000). Portanto, a observação de que os CTr apresentam tendência de aumento na
média de células iTreg, NK e NKT para todos os estímulos, sem diferença entre os
TCT+ e TCT-, e nos indivíduos Cae, aumento significativo dos linfócitos Taux e Tcit
de memória os antígeno PPD e 38kDa/CFP-10, pode estar relacionada a epidemiologia
da TB em nosso meio (tabela 7 e figura 11a e 11b).
Analisamos a influência do tratamento com tuberculostáticos em pacientes
tratados a ≥60 dias (TBt≥60d.) e pacientes não tratados ou tratados a menos de 60 dias
(TBi<60d). Os estímulos de 16kDa e AlaDH provocaram significativo aumento de
linfócitos Tcit, chegando a diminuir a razão de células CD4+/CD8+, nos pacientes
TBi<60d . Estes dados estão de acordo com os achados de Rodrigues e colaboradores
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
92
(2002), que observaram uma recuperação dos níveis de células CD8+ após o tratamento
para TB. Nosso estudo também encontrou números aumentados de linfócitos Taux de
memória no estímulo com 16kDa para os TBt≥60d, o que corrobora os achados de
Caccamo e colaboradores (2002)(tabela 8). Este aumento do número de linfócitos para
os pacientes TBt≥60d, pode ser atribuído à liberação das células reativas ao MTB – que
estavam seqüestradas no local de infecção, para o sangue periférico, após o tratamento
para TB (WILKINSON e cols. 1998; DIELI e cols. 1999).
Grande expectativa vem sendo gerada na comunidade científica com a
possibilidade de introdução de novas ferramentas de diagnóstico para auxiliar no
controle da TB. Testes alternativos são necessários principalmente para os casos
paucibacilares, onde a microscopia falha na identificação dos bacilos, e a cultura,
embora seja mais sensível, é morosa e laboriosa e, portanto, usualmente o paciente
inicia tratamento sem o benefício do diagnóstico. O diagnóstico da TB latente é outra
preocupação para a saúde pública, pois o teste mais utilizado é ainda o TCT. Assim,
novas estratégias são desejadas para se detectar o doente bem como prevenir a infecção
e/ou doença.
A elucidação do genoma de M. tuberculosis, M. bovis BCG e M. avium abre um
leque de possibilidades de conhecimentos e obtenção de antígenos relevantes para
avaliações de seus potenciais diagnóstico e vacinal (COLE e cols. 1998). A
identificação de antígenos micobacterianos que ativem a proliferação de células T e a
secreção de IFN-γ é critico no desenvolvimento de vacinas para TB. Vários antígenos,
principalmente os secretados, têm sido objeto de estudos mostrando serem capazes de
induzir resposta imune celular. Entre estes se destacam o ESAT-6 e CFP-10, cujo
potencial vem sendo exaustivamente descrito na literatura internacional para
diagnóstico da TB latente, na forma de ensaios para detecção de IFN- liberado pelas
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
93
células do sangue periférico estimuladas com estes antígenos ou suas combinações,
conhecidos com IGRA (Interferon gamma Release Assay). Porém estudos de meta
análise não corroboram a utilidade para o teste (SRENSEN e cols. 1995; AREND e
cols. 2000; MENZIES e cols. 2007, PAI e cols. 2008, 2009).
Assim, novas estratégias são desejadas para se detectar o doente precocemente,
bem como prevenir a infecção e/ou doença. No presente estudo foram testadas as
combinações ESAT-6/CFP-10; e 38kDa/CFP-10, esta última ensaiada, anteriormente,
em nosso meio mostrando resultados similares ao ESAT-6/CFP-10; e os antígenos
16kDa e AlaDH quanto a capacidade de induzir a produção de INF- e IL-10 nas PBMC
utilizadas no estudo de imunofenotipagem.
Alguns autores descrevem a produção espontânea de citocinas e esta é
considerada normal nos países em desenvolvimento, sendo observada tanto em pessoas
saudáveis, como em pacientes com TB (BHATTACHARYYA e cols. 1999; AL-
ATTIYAH e cols. 2006). Por outro lado, sabe-se que a produção espontânea de
citocinas, não está associada com qualquer diferença significativa em comparação a
produção induzida. O IFN- tem sido descrito como a segunda citocina com maior
produção espontânea, principalmente por células T e NKT (JASON e cols. 2000;
WALKER e cols. 2002). Em nosso estudo, produção espontânea de citocinas foi
observada, sendo que para o IFN- o perfil quantitativo foi decrescente, isto é, TCT+
>TCT- >TBa e para a IL-10 perfil inverso foi encontrado.
Acompanhando os resultados de quantificação das populações celulares, a
produção de IFN- após estímulos específicos mostrou-se, em geral, diminuída nos
pacientes em relação ao controle TCT+. Os antígenos 16kDa e ESAT-6/CFP-10 foram
os que induziram maior reatividade média, seguido do AlaDH, PPD e 38kDa/CFP-10;
entretanto considerando o ponto de corte do teste, a positividade para os TCT+ não
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
94
refletiu exatamente esta ordem pois maior positividade foi evidenciada para a
combinação 38kDa/CFP-10 (90%) seguidos do ESAT-6/CFP-10, 16kDa e PPD (81%,
respectivamente). Esta alta positividade para o 38kDa/CFP-10 não foi compartilhada
por estudo anterior em nosso meio (TAVARES e cols. 2007). Mas esta diferença pode
estar relacionada à população selecionada para o estudo, pois este autor utilizou apenas
indivíduos sem história conhecida de TB e, portanto, população menos exposta ao
bacilo, enquanto que no presente estudo foram utilizados também contatos recentes de
pacientes com TB (Ctr), sendo estes os mais respondedores entre os TCT+. A produção
elevada de IFN- nos TST+ não foi acompanhada por uma quantificação média maior
das populações celulares, tais como CD4+ e CD8+. A resposta proliferativa, em geral, é
resultado da capacidade de expansão de células T CD4+, com secreção ativa e autóctone
de IL-2, que também é secretado em menor quantidade pelas CD8+ não ativadas. Hoje
sabemos que a produção de IFN- na TB é associada a ambos os tipos de células
(LALVANI e cols. 1998, SHAMS e cols 2001, MASUNGI, 2002). Por outro lado,
outras células linfocitárias tais como NK e NKT são descritas como altas produtoras de
IFN- (BARCELOS e cols 2008, BATONI e cols 2005, GODFREY e cols 2000). E
assim, como outros autores, nosso estudo mostrou expansão para estas células
estimuladas com todos os antígenos no grupo Ctr/TCT+, sugerindo participação destas
populações na alta produção de IFN- nestes indivíduos. Entretanto, outros estudos
devem ser realizados para confirmar estes dados, quantificando o IFN- produzido
especificamente para as células CD4+/CD8+, pelas NK e suas subpopulações, ja que
alguns autores sugerem que as células NK CD56High seriam as mais produtoras de IFN-
(SCHIERLOH e cols, 2005, BARCELOS e cols. 2008).
Adicionalmente, mostramos que o antígeno 16kDa foi capaz de diferenciar os
indivíduos TCT+, dos TCT- e pacientes TBa, corroborando os dados de Demissie e
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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colaboradores (1999). Nos indivíduos TCT+ o antígeno 16kDa induziu a produção
média de IFN- em magnitude similar ao ESAT-6/CFP-10. Contrariamente, o 16kDa se
mostrou em média o menos reativo para os TCT- e TBa (Tabela 9, figura 13). Ao
analisarmos estes TCT+ quanto a exposição à TB, verificou-se um padrão de resposta
peculiar onde todos os indivíduos CTr/PPD+ respondedores para o 16kDa o foram
também para o 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10, exceto um indivíduo que não
respondeu a este último antígeno. Os indivíduos CTr/TCT- (2/7) e Cae/TCT+ (2/3)
apresentaram este mesmo padrão de resposta (tabela 9).
O antígeno ESAT-6 é secretado em maior quantidade após 4 a 6 meses de
tratamento, pode ocorrer em níveis aumentados no início da infecção e em níveis
reduzidos na infecção tardia por MTB (DEMISSIE e cols. 2006). Os genes que
codificam o ESAT-6 e o CFP-10 se encontram no mesmo óperon, inseridos na região de
diferença 1 (RD1) e ambas as proteínas são secretadas (PITTIUS e cols. 2001; PYM e
cols. 2003). Em testes sorológicos mostram-se pouco sensíveis, mas com alta
especificidade (BRUSASCA e cols. 2001). Estes antígenos têm sido exaustivamente
investigados para o imunodiagnóstico baseado na resposta de células T. O CFP-10,
embora menos sensível, se mostra mais especifico que o ESAT-6 (AREND e cols. 2000,
TAVARES e cols. 2007). Atualmente, ESAT-6, combinado com CFP-10 e antígeno
TB9.7, vêm sendo preconizado como marcadores de infecção latente em ensaio
comercial de liberação de IFN-γ (IGRA), mas não existe evidência de habilidade
preditiva na identificação de TB latente em áreas endêmicas com estes antígenos (PAI,
RAMSAY & O´BRIEN 2008). Nestas áreas a exposição dos indivíduos sadios da
comunidade é maior; sabe-se que dos indivíduos infectados 5% a 10% provavelmente
vão adoecer durante a sua vida, portanto a maioria não adoecerá.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
96
Segundo alguns autores, há evidências que sugerem que células T de memória
podem permanecer no sistema imunitário na ausência do antígeno (KAUFFMAN,
2006). Pela teoria dinâmica, proposta por Cardona (2007), os bacilos latentes teriam
uma meia vida durante o seu ciclo de replicação limitada e morte, até a sua eliminação
do organismo humano. Assim os testes baseados no ESAT-6 poderiam estar indicando,
principalmente em áreas endêmicas, presença de memória celular e não exatamente
infecção latente.
O antígeno 38kDa, um dos mais estudados antígenos de M. tuberculosis devido
a sua alta especificidade, tem sido usado como reagente imunodiagnóstico com
potencial para distinguir entre infectados e doentes. A resposta imune celular in vitro
obtida anteriormente em trabalho do nosso grupo, confirma que em populações de área
endêmica para TB, este antígeno induz resposta nos indivíduos expostos, mas não nos
TST- (TAVARES e cols. 2007a). Wilkinson e colaboradores (1998b) demonstraram que
o antígeno 38kDa induz produção de IFN-γ por células CD8+ restritas ao MHC de
classe I e que esta produção era mais elevada nos indivíduos sadios TST+ que nos
pacientes, sugerindo que as células T induzidas por este antígeno conferem proteção em
humanos.
Já o antígeno 16kDa (originalmente descrito como proteína de 14kDa e
conhecido por HspX ou Rv2031c) (CHANG e cols. 1996) tem mostrado significante
imunogenicidade em estudos sorológicos apresentando elevada sensibilidade na
meningite tuberculose e na TB infantil, indicando ser um antígeno imunogenicamente
seletivo nos estágios iniciais da infecção tuberculosa e na tuberculose primária (UMA
DEVIA, RAMALINGAM & RAJA 2002; 2003). Wilkinson e cols. (1998a)
investigando a resposta mediada por linfócitos T e B em humanos estimulados com o
antígeno 16kDa, observaram maior taxa de respondedores para linfoproliferação e IFN-
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
97
em indivíduos sadios TST+. Em nosso meio, estudos anteriores mostraram resultados
similares com resposta por IFN- no grupo saudável TST+ (TAVARES e cols 2007a).
Os nossos achados, aliados as características dos antígenos descritos acima,
podem estar evidenciando que a utilização concomitante do 16kDa, 38kDa/CFP-10 ou
ESAT-6/CFP-10 pode se constituir em um indicador para a TB latente em áreas
endêmicas. Demissie e cols (2006) em estudo realizado na Etiópia sugeriram que forte
resposta ao 16kDa em indivíduos respondedores para o ESAT-6 estaria associada com
infecção latente. Nossos resultados corroboram estes achados, pois foram observados
CTr/TCT+/- respondedores para o 16kDa e ESAT-6/CFP-10, bem como 38kDa/CFP-
10, mas também evidenciamos indivíduo CTr/TCT+ respondedor ao 16kDa e 38
kDa/CFp-10, porem não respondedor ao ESAT-6/CFP-10. Outro fato evidenciado em
nosso estudo é que para estes indivíduos o antígeno AlaDH acompanhou os resultados
do 16kDa.
Nos indivíduos Cae/TCT- não deveria ser evidenciada resposta para estes
antígenos, mas considerando a endemicidade do estado do Rio de Janeiro para TB,
compreende-se que estes indivíduos possam ter maior freqüência de contatos com TB e
a resposta imunitária ser estimulada, embora não obedecendo o padrão acima. . Entre os
Cae/TCT+, 2/3 responderam para os antígenos 16 kDa, ESAT-6/CFP1- e 38 kDa/CFP-
10, porém enquanto um respondeu fortemente para estes antígenos, o outro respondeu
apenas para o 38kda/CFP-10 e o 16kDa. O terceiro indivíduo Cae/TCT-, embora
respondedor para ESAT-6/CFP-10, não reconheceu os outros dois antígenos ou o
AlaDH. Os dois indivíduos respondedores são funcionários do laboratório, porém não
exercem nenhuma atividade de contato com micobactérias ou pacientes a mais de 5
anos, mas parecem estar latentemente infectados. Porém o terceiro embora seja
funcionário do mesmo laboratório e trabalhar com cepas de micobactérias há pelo
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
98
menos 10 anos, foi respondedor apenas para o ESAT-6/CFP-10 o que pode representar
resposta de memória.
Assim como citocinas Th1, principalmente IFN-, estão implicadas na resposta
imunitária protetora, as citocinas Th2, como por ex. a IL-10, estão relacionadas à
reativação de TB crônica. A IL-10 é produzida por macrófagos bem como células Treg
e elas antagonizam a resposta por citocinas próinflamatórias regulando negativamente a
produção de IFN- e TNF (REDPATH e cols. 2001). A frequência de positividade para
IFN- nos pacientes TBa foi menor que a obtida anteriormente em nosso meio para
todos os antígenos testados (CARDOSO e cols 2002, TAVARES e cols 2007a, 2007b).
Entretanto, em estudo realizado no Gâmbia, resultados similares em TBa foram obtidos
para ESAT-6 (43% x 39%) (VEKEMANS e cols. 2001). Esta diferença pode estar
relacionada ao estágio da doença, pois o envolvimento avançado do parênquima
pulmonar leva a diminuição da produção de IFN-, embora a gravidade da doença esteja
mais relacionada com a citocinas Th2, como por exemplo IL-4 e IL-10. Nossos
pacientes em sua maioria estão no inicio do tratamento (<60 dias) e, portanto, na fase
ativa da doença e a alta produção média de IL-10 relacionada ao TCT+ pode indicar que
a presença desta citocina encontra-se associada com a imunopatogenia da doença
pulmonar e que forte resposta por IL-10 foi produzida, enquanto observada fraca
resposta de IFN- (VERBON e cols 1999, SEAH e cols 2000, 2001).
A combinação ESAT-6/CFP-10 estimulou produção média de IFN- mais
elevada em pacientes tratados há mais de 60 dias (92,8± 23,9) que os não tratados ou em
início de tratamento (63,8 21,9), porém sem diferença significativa, o que está de
acordo com a pequena expansão de células CD4+ e CD4CD62L+ aqui obtidas (Tabela
8). Esta diferença na reatividade média entre os pacientes, de acordo com o tempo de
tratamento,foi similar a de outros autores (ULRICHS e cols. 1998; AL-ATTIYAH e
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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cols. 2003) e a resultados obtidos anteriormente em pacientes brasileiros (TAVARES e
cols 2007a), porém estes autores encontraram diferença significativa. Isto pode ser
explicado pelo fato de apenas três pacientes tratados há mais de 6 meses terem sido
incluídos no presente estudo, tempo este a partir do qual há restauração de resposta
celular a estes antígenos (AL-ATTIYAH e cols. 2003). Portanto, estes resultados
sugerem que a resposta proliferativa é restaurada precocemente, enquanto produção de
IFN- é restaurada mais tarde ao longo da quimioterapia. Outros fatores que podem
explicar o aumento da resposta celular durante o tratamento, tais como: o seqüestro das
células T para o local da infecção e a conseqüente diminuição de seu número no sangue
periférico; a produção de citocinas antiinflamatórias como IL-10 e TGF-β e a inibição
da capacidade de ativação das células T na fase ativa da doença seriam facetas
importantes na modulação da resposta imune (WILKINSON e cols. 1998b). Isto pode
ser corroborado pelo fato de nos pacientes TBt>60d a média de reatividade de IL-10 estar
significativamente aumentada em relação aos TBi <60d, exceto para o PPD.
Para os outros antígenos, 38 kDa/CFP-10, AlaDH e PPD, ocorreu o inverso, isto
é, maior média de IFN- foi observada nos TBi <60d, resultados este similares aos obtidos
previamente no Brasil (TAVARES e cols. 2007a), e consequentemente IL-10
apresentou-se menos elevada (Figura 15). Recentemente, em trabalho realizado na Índia
avaliando a produção de IL-10 e IL-12 em pacientes tratados, estimulados com antígeno
85A recombinante do BCG, observou-se diminuição de IL-10 e aumento de IL-12,
sugerindo que o tratamento aumenta a resposta protetora (SAI PRIYE e cols. 2009).
Portanto, estas citocinas poderiam ser úteis na monitoração do tratamento, porém em
nosso estudo parece ocorrer um aumento da IL-10 em relação aos TBi <60d, mas este
diferença pode está relacionada ao pequeno número de pacientes TBt≥60d (n=3).
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
100
Os indivíduos TCT+ responderam para IL-10, em sua maioria, com níveis
médios abaixo do ponto de corte de 200pg/mL. Estes dados são corroborados por outros
autores que apresentam uma maior tendência de produção de IL-10 em pacientes TBa,
comparados com indivíduos TCT+ (HIRSCH e cols. 1999; AL-ATTIYAH e cols.
2006). No grupo de indivíduos não-TB/TCT-, os Cae apresentaram tendência de
aumento da liberação de IL-10 em relação aos outros indivíduos saudáveis, mas apenas
o estímulo com 16kDa aumentou significativamente esta produção, mas se contrapondo
a diminuída produção de IFN- (figura 14). A presença de IL-10 em TCT- não estaria,
em principio, refletindo regulação negativa da resposta imunitária destes indivíduos,
pois as quantidades médias e o número de respondedores estão menores que os
pacientes TBa. Estes resultados são consistentes com outros estudos em que células
estimuladas com antígenos micobacterianos são menos proliferativas nos indivíduos
sadios que nos pacientes (SALINA & MOROZOVA, 2004, DEMISSIE e cols 2004,
AL-ATTIYAH e cols. 2006).
A análise dos dados clínicos, epidemiológicos e demográficos dos sujeitos
arrolados no estudo, têm sido descrita relevante para identificar possíveis fatores de
risco de infecção por MTB ou reinfecção após tratamento (BUSKIN e cols. 1994;
SEVERO e cols. 2007; PICON e cols. 2007).
No presente estudo, os pacientes com TBa que utilizavam álcool regularmente,
apresentaram decréscimo na quantidade média de linfócitos Taux e na razão CD4/CD8
para as combinações de antígenos, além de maior reatividade média para o IFN- Já
entre os TBa/tabagistas, houve um declínio de linfócitos Taux de memória no estímulo
do 38kDa/CFP-10. Quando observamos a influência do tempo de tratamento, o grupo
TBt≥60d apresentou melhora significativa na média de linfócitos Taux e Tcit de memória,
principalmente para a estimulação com o antígeno 16kDa. Os pacientes deste grupo
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
101
responderam positivamente para a produção de IL-10 com todos os antígenos
micobacterianos e apenas para o antígeno PPD na produção de IFN-.
Os voluntários CTr/alcoolistas apresentaram redução significativa na média de
células NKT, mesmo nas PBMC não estimuladas, mostrando a influência negativa do
álcool na modulação do estado de saúde do indivíduo (FLEMING e cols. 2006; FISKE,
HAMILTON & STOUT, 2008). Esta redução foi mais acentuada na estimulação das
PBMC com os antígenos AlaDH, ESAT-6/CFP-10 e 16kDa para as células NKT;
AlaDH e 16kDa para células NK e células iTreg, sugerindo a capacidade do antígeno
16kDa em modificar o perfil celular, mesmo em pessoas apenas infectadas, que ainda
não apresentam quadro clínico para TB. O hábito tabagista no grupo CTr parece
interferir na redução de linfócitos Taux, que foi significativa na estimulação com os
antígenos combinados, enquanto os linfócitos Tcit foram diminuídos somente com os
antígenos AlaDH e 16Kda, refletindo também na menor razão CD4/CD8, resultados
estes similares a de outros autores (ALTET-GOMEZ, e cols. 2005).
Infelizmente, por problemas técnicos e metodológicos, a análise da expressão
dos genes para diversas citocinas importantes na infecção tuberculosa, não pode ser
realizada satisfatoriamente, sendo assim apenas 7 dos 14 genes previstos para serem
estudados puderam ser acessados e com um número amostral reduzido em cada grupo
de indivíduos.
A expressão de FoxP3 mostrou tendência de queda nos pacientes com TBa em
relação aos voluntários saudáveis, sendo significativa apenas para o antígeno 16kDa.
Quando comparamos os resultados dos indivíduos não-TB, houve aumento da expressão
de FoxP3 para os estímulos de PPD e 38kDa/CFP-10 em relação ao controle não
estimulado, sugerindo que esta resposta é específica para antígenos de MTB. Entretanto,
este dado contraria outros estudos onde foi observada maior produção de FoxP3 nos
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
102
pacientes TBa, porém estes trabalhos utilizaram outros tipos de antígenos, tal como o
BCG (ROBERTS e cols. 2007) ou ainda consideraram que a eficiência da metodologia
não altera os resultados obtidos, pois em nosso estudo a eficiência de amplificação dos
genes não foi assumida para o valor máximo (Eff=2,0), como no estudo WU e cols
(2007), mas ajustada para o mínimo erro médio entre as amostras e replicatas que variou
entre 1,55 e 1.95. Os dados de expressão de IFN- foram similares aos obtidos com o
teste de ELISA, pois nos pacientes TBa, principalmente para os antígenos 38/CFP-10,
ESAT-6/CFP-10 houve expressão de RNAm para IFN-. Wu e cols (2007) descreve
resultado similar, embora o autor tenha estimulado as células apenas com o ESAT-6. O
mesmo ocorreu para os indivíduos não-TB onde expressão de RNAm foi evidenciada
em diferentes magnitudes para os antígenos combinados, 16kDa e PPD, embora apenas
neste último com diferença significativa. Para esta citocina a expressão foi obtida nos
três indivíduos do grupo Cae/TCT+, o que permite uma análise mais fina. Os resultados
mostram que todos os três respondem ao 38kDa/CFP-10, ESAT-6/CFP-10 e PPD, mas
não responderam para 16kDa, portanto não corroboram os resultados obtidos com o
teste de ELISA para esta citocina. Este resultado pode conter um viés operacional ou
então os resultados de expressão gênica não refletem exatamente os obtidos com
ELISA. Como o número amostral é pequeno, outros estudos deverão ser realizados para
dirimir esta dúvida.
A expressão gênica verificada para TGF-, IL-6 e IL-8 mostrou tendência de
queda no grupo de pacientes, este resultado foi contrário ao obtido por Roberts e cols
(2007) que estimulou as células com BCG, mas isto pode ser explicado pelo pequeno
número de indivíduos testados em nosso estudo. A IL-6 e IL-8, entretanto, mostraram
expressão significativa para 38kDa/CFP-10 e apenas IL-6 para o PPD no grupo não-TB,
o que também foi observado por Wu e cols (2007) com o ESAT-6. Estes resultados
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
103
sugerem que diferentes antígenos podem estimular igualmente a expressão de citocinas,
porém como um número amostral pequeno, é necessário confirmar estes dados. Por
outro lado, a expressão de IL-10 em TBa, ao contrário do IFN-, não acompanhou os
resultados obtidos no teste de ELISA, mostrando maior expressão entre os não-TB,
porém sem diferença significativa. Estes resultados podem conter um viés pelo pequeno
número amostral testado. Por outro lado, esta citocina e a TGF-β, são citocinas
antiinflamatórias e a queda de sua expressão pode ter implicações na evolução da
doença. Higgins e cols (2009) mostraram ,em modelo murino, que a ausência de IL-10
não altera a capacidade de crescimento micobacteriano, apesar da forte resposta Th1
verificada nos 4 primeiros meses após a infecção. Entretanto, sem a regulação desta
resposta, o processo inflamatório é exacerbado, principalmente pela elevada produção
de TNF no local da infecção, levando à necrose pulmonar. Outra explicação é que a IL-
10 seria parte de um processo de regulação negativa (feedback), isto é, uma vez que a
célula produz a IL-10 esta exerce efeito regulador sobre a célula que a produziu levando
a diminuição da expressão gênica de diversas citocinas, inclusive a própria.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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66)) CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS
Antígenos brutos, caracterizados por cepas clínicas de diferentes padrões genotípicos
e fenotípicos de resistência às drogas, usadas para avaliar a resposta imune de
voluntários TCT+ e TCT- mostraram que existe variabilidade entre os indivíduos na
quantidade de células ativadas e na produção de IFN-γ, e esta variabilidade parece
estar relacionada a capacidade de resposta dos indivíduos, bem como a característica
da cepa infectante.
Indivíduos saudáveis TCT+, estimulados com cepas com perfil de resistentes às
drogas tuberculostáticas, apresentaram decréscimo na produção de IFN- quando
comparadas com as cepas sensíveis, porém sem diferença estatística. Estes resultados
sugerem que embora haja resposta proliferativa às cepas estudadas, as droga-
resistentes podem também estar suprimindo ligeiramente a resposta Th1, como
observado, em maior escala em pacientes MDR-TB.
Indivíduos TCT- de área endêmica reconhecem determinadas cepas micobacterianas,
principalmente cepas prevalentes (cluster). Estes achados podem ter relevância na
busca de alvos vacinais.
Verificou-se um decréscimo na expansão de células CD4+ e CD8+ nos pacientes
TBa para todos os antígenos em relação aos não-TB, porém com diferença
significativa para CD8+ estimuladas com o PPD, 16kDa e as combinações ESAT-
6/CFP-10, refletindo no decréscimo da média de INF- produzido e expresso, bem
como na freqüência de respondedores.
Entre os não-TB, os TCT+ mostraram redução significativa na expansão de células T
CD4+, CD8+ (efetores e de memória) e células NK e NKT para os antígenos
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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combinados 38 kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10. Isto não se refletiu no decréscimo de
IFN- secretado.
Os indivíduos não-TB contato recente com pacientes TBa (Ctr/TCT+) apresentaram
expansão de células NK e NKT, embora não significativa, para todos os antígenos
testados, quando comparados com o grupo Cae, o que possivelmente foi refletido no
aumento da produção de IFN- neste grupo.
Os estímulos de 16kDa e AlaDH provocaram significativo aumento de linfócitos
Tcit, chegando a diminuir a razão de células CD4+/CD8+, nos pacientes TBi<60d .
Níveis aumentados de linfócitos Taux de memória foram evidenciados apenas no
antígeno 16kDa para os TBt≥60d. Este aumento do número de linfócitos durante o
tratamento, pode ser atribuído á liberação das células reativas ao MTB, que estavam
seqüestradas no local de infecção, para o sangue periférico após o tratamento para
TB.
Nos pacientes TBt≥60d foi evidenciado aumento de IFN- para ESAT-6/CFP-10, mas
não para o 38kda/CFP-10, mostrando que a restauração da resposta imune está
associada ao sucesso do tratamento para aquele antígeno. Já a IL-10 foi
significativamente aumentada para todos os antígenos, exceto o PPD. Isto pode ser
reflexo da restauração do balanço Th1/Th2, que regula a resposta inflamatória e
antiinflamatória minimizando o dano tecidual.
Foi evidenciado em indivíduos Ctr ou Cae/TCT+ que a resposta de IFN- aos
antígenos 16kDa, 38 kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 pode estar associada a infecção
latente.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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O hábito alcoolista diminuiu significativamente a média de linfócitos Taux e a razão
CD4/CD8 nos TBa para os antígenos 38 kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10,
respectivamene, refletindo no decréscimo significativo da produção de IFN-.
A expressão gênica de IFN- refletiu os resultados obtidos no teste de ELISA para
TBa e não-TB, principalmente para 38kDa/CFP-10, ESAT-6/CFP-10, 16kDa e PPD,
porém o mesmo não ocorreu para IL-10. Entre outras, a explicação pode estar
relacionada à regulação (tipo feedback) exercida pelo IL-10 sobre a célula produtora.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
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77)) PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS
Os resultados deste trabalho abrem perspectivas quanto ao potencial dos
antígenos estudados como ferramentas para auxiliar no diagnóstico da TB latente.
Ajudaram a compreender que as diferenças de resposta imune a um mesmo antígeno
podem estar relacionadas às características da população testada ou às cepas infectantes.
Daí a importância da avaliar os antígenos, que se mostraram relevantes na estimulação
da resposta imunitária, em áreas endêmicas. Embora alguns dos antígenos avaliados não
tenham mostrado a mesma acurácia descrita na literatura internacional os
conhecimentos aqui adquiridos abrem novas perspectivas para formulação e concepção
para testes dignósticos futuros. Para tal, de imediato seria altamente importante realizar
um estudo comparativo dos antígenos 16kDa e ESAT-6/CFP-10 vs. 16kDa e 38
kDa/CFP-10 em indivíduos não-TB CTr e Cae para obter melhor conhecimento sobre a
potencialidades destes antígenos em proporcionar imunidade consitente com TB latente
ou infecção. Este trabalho deve ser prospetivo longitudinal, acompanhando os
indivíduos por um período entre 2 a 5 anos, pois a maioria dos trabalhos, inclusive o
nosso, estabeleceu estes parâmetros em estudo transversal e, portanto, tem o olhar do
momento temporal único. Outro aspecto decorrente deste estudo e que deve ser
abordado com metodologia específica é a relação do hábito alcoolista e tabagista como
fatores de risco ou não para o desenvolvimento da resposta imunitária na TB.
Recentemente, foi descrito associação de positividade de ELISA-IgG e IgA a antígenos
micobacterianos entre pacientes alcoolistas, por outro lado associação negativa foi
detectada entre aqueles com hábito do tabagismo. O presente estudo não foi desenhado
para investigar estes fatores, simplesmente foram analisados dados constante
oportunamente do questionário, já que estudos anteriores dão conta que o álcool pode
afetar a produção e citocinas e outros aspectos da resposta imune.
Vinicius Ribeiro Cabral
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
108
88)) RREEFFEERREENNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS
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ANEXO A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos Recombinantes no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.
Investigador principal: Maria Helena Féres Saad, Lab. Microbiologia Celular, IOC/FIOCRUZ
Objetivos:
O objetivo deste documento é fornecer informações sobre esta pesquisa. Nele estão os objetivos,
procedimentos, benefícios e riscos que podem ocorrer durante o estudo. Você pode não compreender
determinadas palavras. Se isto ocorrer, por favor, peça esclarecimentos ao médico responsável pelo
estudo. Sua participação neste trabalho é voluntária. Isto significa que você pode se recusar a participar
dele, ou deixar de fazer parte dele a qualquer momento, sem que isto modifique o atendimento médico
que você tem nesta unidade de saúde.
Introdução/Objetivos:
Você foi chamado para participar deste estudo porque seu médico diagnosticou que você com
suspeita de ter tuberculose. (ou porque você é contato de paciente com TB). Por isso, seu médico propôs
que você fizesse exame de sangue e no escarro para exames de rotina. Estes exames têm o objetivo de
fazer alguns testes diagnósticos (exames) que permitirão descobrir qual é o seu problema e tratá-lo. (Ou
sendo você um contactante de paciente com TB você pode estar infectado mas não doente com a bactéria
que causa a tuberculose) Mas nós ainda não compreendemos totalmente esta doença. Assim nós
pretendemos fazer alguns testes adicionais no material retirado, e para isto retiraremos sangue. Estes
testes ainda são experimentais. Partes do sangue serão congeladas para futuros testes, caso você permita.
Nós também pretendemos congelar uma parte do sangue que foi retirado para exames de rotina, para
futuros testes. Nenhum procedimento será feito apenas para a pesquisa. Nós apenas vamos utilizar uma
parte do material coletado (sangue) para testes adicionais, e congelar uma parte para futuros testes que
possam surgir.
Métodos:
Se você concordar em participar do estudo, você será submetido a retirada de sangue feitos de
rotina. Nós vamos submeter este material a exames experimentais e vamos congelar uma parte do
material. Alguns exames de sangue também serão feitos, em particular, o exame do HIV, caso você
autorize. Nós também pediremos que você responda a algumas perguntas e que nos autorize a olhar
alguns dados médicos no seu prontuário. Você também será submetido a uma prova tuberculínica, que é
um teste feito com uma injeção na pele que provoca uma pequena reação local. O tamanho desta reação
será medido e pode ter implicações no seu diagnóstico. Este também é um procedimento rotineiro e não
da pesquisa.
Riscos e desconfortos:
Os exames de sangue que você vai fazer podem causar algum incômodo como dor leve pela
introdução da agulha para a coleta ou infecção no local onde a agulha entra na veia, mas isto é raro. Estas
possíveis complicações e desconfortos não decorrem da pesquisa, e sim dos procedimentos aos quais você
precisa se submeter para saber mias sobre a sua doença.
Benefícios potenciais:
Sua participação nesta pesquisa pode nos ajudar a saber mais sobre mais sobre esta doença e
como a diagnosticar melhor. Se com este estudo obtivermos informações importantes sobre a sua saúde,
notificaremos você e seu médico. De qualquer forma, participar do estudo não traz benefícios diretos para
você no momento, apenas permite saber um pouco mais sobre esta doença.
Custos e /ou pagamento por participar do estudo:
Não há custos para você participar do estudo. Você não terá que pagar pelo tratamento ou por
qualquer consulta ou exame que façam parte do estudo. Você também não receberá qualquer quantia por
participar.
Confidencialidade (privacidade dos dados):
Seus dados poderão ser revistos por mais de 15 anos pela equipe envolvida no estudo, apenas
com o objetivo de recuperar informações relativas à pesquisa. O material congelado ficará armazenado
por mais de 5 anos. Os resultados do estudo serão publicados, mas seu nome não será revelado em
nenhuma publicação. Todas as informações são confidenciais.
As informações obtidas com os testes serão direcionadas à equipe envolvida na pesquisa, que vai
mantê-las trancadas em um armário com cadeado. No Brasil, as autoridades sanitárias devem ser
informadas (notificação compulsória) de todo o caso de tuberculose. Se o seu diagnóstico for tuberculose,
seu médico deverá informar isso às autoridades de saúde (mesmo que você não participe do estudo). O
comitê de ética em pesquisa também deverá ser informado caso você tenha algum problema com o
procedimento.
Participação voluntária:
Sua participação neste estudo é voluntária. Isto significa que é escolha sua participar ou não. Se
você optar por não participar, isto não vai influenciar em nada no seu tratamento ou no seu
acompanhamento médico. Seu médico vai tratar você com o tratamento padrão e acompanhar você no
futuro. Se você optar por participar, você poderá mudar de idéia a qualquer momento e sair do estudo sem
nenhum prejuízo para seu tratamento. Nesta situação, você também será tratado da forma usual. Seu
médico também pode tirar você do estudo caso considere que isto será melhor para você. Seu médico ou
eu discutiremos isso com você.
Direitos legais:
Se ocorrer qualquer problema você terá atendimento médico de emergência – você continua
tendo todos os seus direitos como qualquer outro paciente da unidade. Você não está abrindo mão de
nenhum dos seus direitos participando da pesquisa ou assinando este documento.
Pessoas que podem ser contatadas: Se você tiver qualquer dúvida a respeito desta pesquisa
pode contatar o seu médico que lhe atendeu. Os telefones (abaixo) estarão à sua disposição para casos de
emergência. Uma cópia deste termo de consentimento ficará anexada aos seus dados e você receberá uma
cópia para guardar.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1. Eu compreendi que este é um trabalho de pesquisa.
2. Eu li todas as páginas deste termo de consentimento. A equipe envolvida na pesquisa me deu todas as
informações a respeito dos procedimentos do trabalho. Tive a oportunidade de fazer perguntas, e minhas
perguntas foram respondidas de forma satisfatória. Foi-me dado tempo suficiente para considerar com
atenção as informações recebidas e decidir participar ou não do estudo.
3. Fui devidamente informado que minha participação neste estudo é inteiramente voluntária e que eu
posso me recusar a participar ou decidir deixar o estudo a qualquer momento, sem qualquer tipo de
prejuízo ao meu acompanhamento médico.
4. Eu autorizo que meus dados sejam revelados à equipe envolvida na pesquisa, bem como às autoridades
sanitárias e ao comitê de ética responsável pela aprovação deste projeto, apenas para finalidades relativas
ao estudo. Esta autorização é válida por um período de 15 anos.
5. Eu autorizo que o material coletado seja armazenado por um período de mais de 5 anos para fins de
pesquisa.
7. Eu compreendi que vou receber um a cópia deste termo para guardar comigo depois de assinada.
8. Eu compreendi que não estou abrindo mão de meus direitos legais ao assinar este termo.
Minha assinatura abaixo indica que, de forma voluntária, concordo em participar deste estudo.
Participante:
____________________________ __________________________________ _____________
(Assinatura) (Nome)Médico:
____________________________ __________________________________ _____________
(Assinatura) (Nome) Tel.
Data: ____________________
ANEXO B
ANEXO C
European Respiratory SocietyAnnual Congress 2009
Abstract Number: 255541
Abstract Categories: 10.2. Tuberculosis
ERS Young Scientist Sponsorship: No, do not consider me for sponsorship.
François Brenot Award: No, do not consider me for this award.
ERS Annual Inflammatory Airway Disease Award: No, do not consider me for this award.
ERS COPD Travel Grant: No, do not consider me for this grant.
Cell & Molecular Biology Young Scientist Travel Award: No, do not consider me for this award.
Travel Grant for Sleep Medicine: No, do not consider me for this grant.
ERS Paediatric Respiratory Epidemiology Abstract Award: No, do not consider me for this award.
Lung Transplantation Best Abstract Award: No, do not consider me for this award.
Keyword 1: tuberculosis Keyword 2: diagnosis Keyword 3: antigen Keyword 4: immune response Keyword 5: interferons
Target Audience: Scientists
General Conflicts of Interests: Authors have no, real or perceived conflicts of interest that relate to this abstract.
Tobacco-Industry related conflict of interests: No
Title: 38kDa/CFP-10 associated to 16 kDa recognized by asymptomatic contacts of endemic area for tuberculosisMr. Vinicius R. Cabral, [email protected];1, Ms. Fernanda Luiza P. Guimarães, [email protected], Ms. Isabela G. Sardella, [email protected], Dr. Fernanda C. Q. Mello, [email protected], MD2, Dr. Paulo Albuquerque, [email protected], MD3, Dr. Elyne M. Engstron, [email protected], Prof. Mahavir Singh, [email protected] and Dr. Maria Helena F. Saad, [email protected]. 1Microbiology Cellular Lab/IOC, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de |Janeiro, RJ, Brazil, 2045-360; 2Univ. Hospital, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 21941-913; 3Guadalupe Health Care, SES, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 20080-900; 44Germano Silval Farias School Health Care/ENSP, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 20045-360 and 5Lionex Diagnostic and Therapeutic, Lionex, Braunchweig, Germany, 38124. Body: For diagnosis of latent tuberculosis (TB) it has been used tuberculin skin test (TST) for decades. It is also well known that the majority of healthy individuals exposed to M. tuberculosis do not develop active TB. Recently, IFN-g based on ESAT-6/CFP-10 and 16 kDa antigens have been reported as good marker for latent TB. Inspired by recent finds that combination of 38kDa/CFP-10 offer similar IFN-g reactivity to ESAT-6/CFP-10 for Brazilians TB patients, we then compared the production of IFN-g to 38kDa/CFP-10 and 16 kDa, among contacts recent with TB patients (Ctr/TST+, n=8; Ctr/TST-, n= 7) and healthy individuals from endemic area (Cae/TST+, n= 3; Cae/TST-, n= 14 ). Positive IFN-g production induced by 38/CFP-10 and ESAT-6/CFP-10 associated to 16 kDa were found in 6/8 Ctr/TST+, 1/8 react only with 38/CFP-10 and 16 kDa and 1/8 did not recognized 16 kDa. For Cae/TST+, 2/3 reacted with 16 kDa, but one gave strong response for both combination and the other for 38/CFP-10. Although TST-, 2/7 CTr showed the same positive IFN-g pattern for both combined antigens and 16 kDa, but for Cae this pattern of antigens recognition was not observed. These preliminary results suggest that 38 kDa/CFP-10 and 16 kDa is also a good marker for latent TB. Financial support: FAPERJ, CNPq, Brazil/Germany Cooperation Program
ANEXO D
Lymphoproliferative and Interferon-gamma response to different Mycobacterium
tuberculosis Clinical Strains (Pilot study)
Vinicius R. Cabral1; Claudia F. de Souza1; Fernanda L.P. Guimarães1, Silvia
Maria Almeida Machado 1, Maria Helena F. Saad1
1Laboratório de Microbiologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de
janeiro, Brasil
Running title: Immune response to M.tuberculosis clinical strains
Corresponding author: Maria Helena Féres Saad, Laboratório de Microbiologia Celular,
Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, 21045-900, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil. Phone: +55-21-25-98-43-46. Fax: +55-21-22-70-99-97. E-mail:
Sending:
Accepted:
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is among the most successful human pathogens.
According to WHO (2006), based on positive hypersensitivity response to purified
protein derivative (PPD), about 2 million people are infected with Mtb worldwide.
Paradoxically, the human immune response is quite efficient in defeat the pathogen
growth but lack efficacy to eradicate it. The natural history of TB signed that only 10%
of infected individuals is at a lifetime risk to developed the disease, by the other side the
majority of infected individuals may be at a risk to reactivated the disease once the
immune system fail or to be reinfected with new strain. Some studies have been
demonstrated the correlation between Mtb virulence and lack of Th1 response in murine
models. Other studies suggest that several strains can show distinct interactions with the
host, according to potential transmission, inducing divergent immune responses. In this
pilot study, we propose the “in vitro” analysis of the cellular expansion and cytokine
production by healthy volunteers with positive or negative tuberculin skin test (TST) in
response to a panel of clinical isolates of Mtb with different genotypic and phenotypic
patterns. The clinical strains were isolated from immunocompetent patients with
pulmonary tuberculosis at the Pedro Ernesto University Hospital, Rio de Janeiro. M.
tuberculosis H37Rv, was obtained from American Type Culture Collection (Manassas,
VA) and purified protein derivative (PPD RT-23) was purchase from the Statens Serum
Institute (Copenhagen, Denmark) been used as positive controls. Strains characteristics
are described in Table 1. Susceptibility test was performed by Löwenstein-Jensen
Proportion Method (Caneti et al, 1963) and IS6110 pattern was obtained by restriction
fragment length polymorphism (RFPL) according to Van Embden et al, (1993) with
minor modification (Saad et al, 1999).
A total of 11 healthy volunteers were included, 6 individuals who tested positive for
TST (≥5mm) and 5 individuals TST negative. Peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) were prepared layering the heparinised blood on Ficoll-Hypaque according to
Tavares et al (2007). In vitro stimulation of 106 cells/well was done incubating, with a
suspension containing 105 bacilli/well, quantified by McFarland scale, for 48 hours.
Supernatants of cell culture free of bacteria were collected to quantify IFN- by ELISA
(R&D Systems). Leucocytes were harvested and stained with the specific antibodies α-
CD3_FITC; α-CD4_PE; α-CD8_APC (BD PharMingen, San Diego, CA) for evaluation
of expression of surface receptors by flow cytometry.
The mean of CD4+ and CD8+ cell number significantly decreased in TST+ stimulated
with strains of low IS6110 copies number (<4 bands) related to H37v, PPD (p=0,044
and p=0,021) and no stimulated cell (p=0,013 and p=0,005). None TST-negative
volunteer showed cell expansion. Higher IS6110 copy number strains (10-11bands), did
induce decrease of mean CD4+ and CD8+ cell number in TST+ and negative, although
without statistic significance. Of note, PBMC of the volunteer J/TST+ had a significant
decrease of T CD4+ expression after stimulation with two resistant strains (81, 282), but
IFN- production was detected. In contrast, the volunteer C/TST-negative displayed
lower expression of CD8+ only for a susceptible strain 270. This strain was isolated
from the same patient together with strain 274 (polyclonal infection because the strains
have different genotypic patterns), which showed cells expansion similar to H37Rv, but
both strains did not elicit IFN- production (Figure 1). Both strain were recognized by
all TST+, excepted volunteer H that did not produced IFN- upon stimulation with
strain 274 (Table 1). As expected the mean level of IFN- secretion by PBMC of TST+
donors was higher (448,9±209,0 vs. 569,7±194,5) although not significant, and
correlated positively with TST reaction size. Among TST-negative volunteers, three (A,
B and C) did not respond for none of the clinical strains. The MDR strain 046 with 10
IS6110 copies and belonged to a cluster was the most recognized by the volunteers,
including by 50 % (2/4) of the TST-negative. This may suggest that some healthy
subjects, although TST-negative, were not naive to M. tuberculosis strains. TST+
volunteers’ responder was lower than TST- for clustered strains. By the other side, the
resistant strain 238 harboring only two copies of IS6110, drug-resistant and belonged to
a cluster did not elicited IFN- secretion in none of the volunteers, except one with the
highest TST reaction (20mm, Table 1). It was observed, for TST+, that resistant strains
elicited lower mean level of IFN- production (448,9±209,0) compared with drug-
susceptible (569,7±194,5) strains, although difference was not significant.
The described results and those presented in table 1 show that there is variability in
activated cell count and IFN- production that seems to be related to the host immune
response capability associated with infected strains characteristic. Operation problem
for this variability is rulled out since each volunteers was tested for all strains in a same
series of experiments. The fact that some TST- individuals from endemic area recognize
mycobacterial strains, mainly those prevalent (cluster), may have relevance in vaccine
target search. BCG is a potent inducer of CD4+ T cells, which is important for
granuloma formation and bacterial containment, but is an insufficient stimulator of
CD8+ T cells that are additionally required for long term control of the microorganism.
Considering the variability of host immune response to different strains, a more
efficacious vaccine may contain molecules that induce CD4 T cells but also other T
cells population to improve the protection (Kaufmann, 2006). Zhang et al (1998),
reported that the limited information about Mtb interaction with human cell result in
difficult to analyze and eliminate contradictory factors in Tb immune response.
According to previous reports some prevalent endemic strains and those with low copies
of IS6110 may have higher virulence index and transmission and are associated with no
protective immune response suppressing IL-1β, IFN- and TNF production (VALWAY
et al, 1998; MANCA et al, 1999; SHARMA et al, 2003). In this study was observed that
cluster strains were less recognized by TCT+ volunteers.
Supression of the humoral and cells response has been reported to be associated to high
resistance of Mtb infecting strain of Tb patients in Russia (Probl Tuberk Bolezn Legk.
2008). In other study reduction of IFN- production was described in patients infected
with MDR strains, which PBMC were stimulated with PPD, ant it was associated to
CD4+ T cell count (LEE et al, 2002). Our study showed similar result for TST+
volunteers and thus corroborates that drug-resistant strains indeed contributed to down
regulate Th1 response.
In this pilot study, we observe heterogeneity of cellular and cytokine immune response
for a panel of clinical Mtb strains. In general effective immune response is more likely
dependent on the host than infected strains, however some particular response related to
strain feature was observed. Our results suggested that, in our set some TST- individuals
is not naïve to some strains tested By the other side TST+ do not recognized all strains
tested, suggesting that immune response is more likely dependent on the host as well as
characteristics of infected strains.
Table 1. Genotypic and phenotypic characteristics of clinical strains used to stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 11 volunteers and the positivity for interferon-gamma production.
Strains H37Rv 046 081 213 238 282 065 215 270 274
RFLP-IS6110 copy number
10 10 11 2 8 10 4 9 9
Cluster/Clone Name N Y Y Y Y Y N N N N
Drug Susceptibility S R (MDR)
R (INH/ETH
/PZA)
R (PZA)
R (INH)
R (MDR)
S S S S
Volunteers/TST(mm)1 ELISA Interferon-gamma results
A & B 0 - - - - - - - - - -
C 0 + + - - - - + - - -
D 0 - + + + - - - + - -
E 0 + - - - - - - - - -
F 5 + + - - - - - - - -
G 10 - + + + - + - + + +
H 13 + + - - - - + + + -
I 13 + + - - - + - + + +
J 15 + + + + - + + + + +
K 20 + + + + + + - + + +
Tuberculin Skin Test negative (TST-) or positive (TST+). IS6110: repetitive element insertion sequence 6110, which patterns were obtained by restriction fragment length polymorphism, N= no, Y= yes, S= sensitive, R= resistant, MDR= multidrug resistance (isoniazide - INH/rifampicin - RFM), ETH=ethionamide, PZA= pirazinamide. mm: milimeter
Figure 1: Representative histogram of CD4 and CD8 expression in PBMC from two volunteers obtained by double stain with a pair of monoclonal antibodies specific for T helper cells (CD3CD4+) and T citotoxic cells (CD3CD8+) A) volunteer C with Tuberculin Skin Test (TST) negative, showing that clinical strain 270 decreased expression of CD8+ cells, B) volunteer Jwith TST+, showing that the clinical strain 81 and 282 decreased expression of CD4+ cells. The number of cells is showed above.
A)
B)
Number of cells x 105/mLImmunophenotypeControl 270 strain
CD3+ 15,3 7,4
CD3CD4+ 4,4 2,3
CD3CD8+ 2,1 0,7
Number of Cells x 105/mLImmunophenotype
Control 81 Strain 282 Strain
CD3+ 21,3 14,9 10,7
CD3CD4+ 9,8 3,3 2,1
CD3CD8+ 4,9 3,3 2,4
R2
100 101 102 103 104
FL 2 Log
0
73
147
221
295
Cou
nts
Control: 43,35%
81 strain: 20,13%
CD4 PE Log Comp
R3
100 101 102 103 104
FL 4 Log
0
72
145
218
291
Cou
nts
Control: 22,56%
81 strain: 22,13%
CD8 APC Log Comp
R2
100 101 102 103 104
FL 2 Log
0
73
147
221
295
Cou
nts
Control: 43,35%
282 strain: 16,31%
CD4 PE Log Comp
R3
100 101 102 103 104
FL 4 Log
0
72
145
218
291
Cou
nts
CD8 APC Log Comp
Control: 22,56%
282 strain: 21,89%
REFERENCES
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