avaliaÇÃo dos efeitos de um extrato bruto de
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
AVALIACcedilAtildeO DOS EFEITOS DE UM EXTRATO BRUTO DE
CIANOBACTEacuteRIAS CONTENDO MICROCISTINAS SOBRE O
DESEMPENHO REPRODUTIVO E A EMBRIOFETOTOXICIDADE DE
RATOS
Aluno Cristhiano Sibaldo de Almeida
Natal2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
AVALIACcedilAtildeO DOS EFEITOS DE UM EXTRATO BRUTO DE
CIANOBACTEacuteRIAS CONTENDO MICROCISTINAS SOBRE O
DESEMPENHO REPRODUTIVO E A EMBRIOFETOTOXICIDADE DE
RATOS
Defesa apresentada ao Programa de
Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Farmacecircuticas do Centro de Ciecircncias
da Sauacutede da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre
em Ciecircncias Farmacecircuticas
Aluno Cristhiano Sibaldo de Almeida
Orientadora Profa Dra Paula da Silva Kujbida
Co-Orientadora Profa Dra Aline Schwarz
Natal2013
AGRADECIMENTOS
A DEUS por saber que sempre esteve estaacute e estaraacute ao meu lado me amando
protegendo amparando cuidando mesmo sabendo que sou imperfeito e pecador
Aos meus pais Gilson Candido e Rosilene Sibaldo pelo incondicional amor e por
saber que posso contar sempre que preciso
A minha irmatilde Thays Sibaldo sempre do meu lado em todos os momentos e
situaccedilotildees da vida
Aos meus sobrinhos Gabrielly Joatildeo e Thaiacutela ensinado a cada dia que a vida eacute
simples e bela dependendo do ponto de vista que vocecirc a vecirc
A Laiacutes Sibaldo e Pedro Natan pelos momentos de descontraccedilatildeo importantes para equilibrar os momentos de stress vividos durante todo o mestrado e pela calorosa recepccedilatildeo nesta cidade
Aos meus tios Joseacute Sibaldo e Rosa Maria Sibaldo pelo apoio paciecircncia e por conceder que durante todo o mestrado pudesse estaacute junto agrave eles no seio da sua famiacutelia proporcionando um verdadeiro lar
A todos meus familiares especialmente a Beth e Cristina pelas palavras de conforto em momentos difiacuteceis durante a caminhada
As minhas avoacutes Zeacutelia e Aurea pelas oraccedilotildees diaacuterias oferecidas a mim
A minha orientadora Professora Drordf Paula da Silva Kujbida por seu apoio amizade compreensatildeo companheirismo dedicaccedilatildeo competecircncia e por toda atenccedilatildeo e sugestotildees fundamentais para a conclusatildeo deste trabalho
Aos professores Aline Schwarz Dulce Lima Ivoneide Costa Claacuteudia Nunes Ernani Pinto que destinaram parte de seu precioso tempo para participarem desta pesquisa
Aos meus amigos que de uma forma ou de outra contribuiacuteram com sua amizade e com sugestotildees efetivas para a realizaccedilatildeo deste trabalho gostaria de expressar minha profunda gratidatildeo
Ao Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte ndash UFRN pelo apoio agrave minha participaccedilatildeo no
mestrado
A CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de curso
SUMAacuteRIO
LISTA DE TABELAS vii
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi
RESUMOxiii
ABSTRACT xiv
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16
21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16
211 Microcistinas 22
2111 Absorccedilatildeo 24
2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26
221 Produccedilatildeo de gametas 27
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27
212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28
222 O ciclo estral 31
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE 36
3 OBJETIVOS 39
31 OBJETIVO GERAL 39
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas 40
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41
42 ANIMAIS 41
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42
431 Acasalamento 42
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44
434 Coleta de sangue 45
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47
4371 Estudo visceral 47
4372 Estudo esqueleacutetico 47
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49
442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49
443 Acasalamento 49
444 Eutanaacutesia dos machos 50
445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos
machos tratados 50
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50
451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53
47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54
5 RESULTADOS 55
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75
6 DISCUSSAtildeO 77
7 CONCLUSAtildeO 84
REFEREcircNCIAS 85
ANEXO I101
ANEXO II103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
AVALIACcedilAtildeO DOS EFEITOS DE UM EXTRATO BRUTO DE
CIANOBACTEacuteRIAS CONTENDO MICROCISTINAS SOBRE O
DESEMPENHO REPRODUTIVO E A EMBRIOFETOTOXICIDADE DE
RATOS
Defesa apresentada ao Programa de
Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Farmacecircuticas do Centro de Ciecircncias
da Sauacutede da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre
em Ciecircncias Farmacecircuticas
Aluno Cristhiano Sibaldo de Almeida
Orientadora Profa Dra Paula da Silva Kujbida
Co-Orientadora Profa Dra Aline Schwarz
Natal2013
AGRADECIMENTOS
A DEUS por saber que sempre esteve estaacute e estaraacute ao meu lado me amando
protegendo amparando cuidando mesmo sabendo que sou imperfeito e pecador
Aos meus pais Gilson Candido e Rosilene Sibaldo pelo incondicional amor e por
saber que posso contar sempre que preciso
A minha irmatilde Thays Sibaldo sempre do meu lado em todos os momentos e
situaccedilotildees da vida
Aos meus sobrinhos Gabrielly Joatildeo e Thaiacutela ensinado a cada dia que a vida eacute
simples e bela dependendo do ponto de vista que vocecirc a vecirc
A Laiacutes Sibaldo e Pedro Natan pelos momentos de descontraccedilatildeo importantes para equilibrar os momentos de stress vividos durante todo o mestrado e pela calorosa recepccedilatildeo nesta cidade
Aos meus tios Joseacute Sibaldo e Rosa Maria Sibaldo pelo apoio paciecircncia e por conceder que durante todo o mestrado pudesse estaacute junto agrave eles no seio da sua famiacutelia proporcionando um verdadeiro lar
A todos meus familiares especialmente a Beth e Cristina pelas palavras de conforto em momentos difiacuteceis durante a caminhada
As minhas avoacutes Zeacutelia e Aurea pelas oraccedilotildees diaacuterias oferecidas a mim
A minha orientadora Professora Drordf Paula da Silva Kujbida por seu apoio amizade compreensatildeo companheirismo dedicaccedilatildeo competecircncia e por toda atenccedilatildeo e sugestotildees fundamentais para a conclusatildeo deste trabalho
Aos professores Aline Schwarz Dulce Lima Ivoneide Costa Claacuteudia Nunes Ernani Pinto que destinaram parte de seu precioso tempo para participarem desta pesquisa
Aos meus amigos que de uma forma ou de outra contribuiacuteram com sua amizade e com sugestotildees efetivas para a realizaccedilatildeo deste trabalho gostaria de expressar minha profunda gratidatildeo
Ao Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte ndash UFRN pelo apoio agrave minha participaccedilatildeo no
mestrado
A CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de curso
SUMAacuteRIO
LISTA DE TABELAS vii
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi
RESUMOxiii
ABSTRACT xiv
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16
21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16
211 Microcistinas 22
2111 Absorccedilatildeo 24
2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26
221 Produccedilatildeo de gametas 27
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27
212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28
222 O ciclo estral 31
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE 36
3 OBJETIVOS 39
31 OBJETIVO GERAL 39
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas 40
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41
42 ANIMAIS 41
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42
431 Acasalamento 42
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44
434 Coleta de sangue 45
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47
4371 Estudo visceral 47
4372 Estudo esqueleacutetico 47
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49
442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49
443 Acasalamento 49
444 Eutanaacutesia dos machos 50
445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos
machos tratados 50
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50
451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53
47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54
5 RESULTADOS 55
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75
6 DISCUSSAtildeO 77
7 CONCLUSAtildeO 84
REFEREcircNCIAS 85
ANEXO I101
ANEXO II103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
AGRADECIMENTOS
A DEUS por saber que sempre esteve estaacute e estaraacute ao meu lado me amando
protegendo amparando cuidando mesmo sabendo que sou imperfeito e pecador
Aos meus pais Gilson Candido e Rosilene Sibaldo pelo incondicional amor e por
saber que posso contar sempre que preciso
A minha irmatilde Thays Sibaldo sempre do meu lado em todos os momentos e
situaccedilotildees da vida
Aos meus sobrinhos Gabrielly Joatildeo e Thaiacutela ensinado a cada dia que a vida eacute
simples e bela dependendo do ponto de vista que vocecirc a vecirc
A Laiacutes Sibaldo e Pedro Natan pelos momentos de descontraccedilatildeo importantes para equilibrar os momentos de stress vividos durante todo o mestrado e pela calorosa recepccedilatildeo nesta cidade
Aos meus tios Joseacute Sibaldo e Rosa Maria Sibaldo pelo apoio paciecircncia e por conceder que durante todo o mestrado pudesse estaacute junto agrave eles no seio da sua famiacutelia proporcionando um verdadeiro lar
A todos meus familiares especialmente a Beth e Cristina pelas palavras de conforto em momentos difiacuteceis durante a caminhada
As minhas avoacutes Zeacutelia e Aurea pelas oraccedilotildees diaacuterias oferecidas a mim
A minha orientadora Professora Drordf Paula da Silva Kujbida por seu apoio amizade compreensatildeo companheirismo dedicaccedilatildeo competecircncia e por toda atenccedilatildeo e sugestotildees fundamentais para a conclusatildeo deste trabalho
Aos professores Aline Schwarz Dulce Lima Ivoneide Costa Claacuteudia Nunes Ernani Pinto que destinaram parte de seu precioso tempo para participarem desta pesquisa
Aos meus amigos que de uma forma ou de outra contribuiacuteram com sua amizade e com sugestotildees efetivas para a realizaccedilatildeo deste trabalho gostaria de expressar minha profunda gratidatildeo
Ao Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte ndash UFRN pelo apoio agrave minha participaccedilatildeo no
mestrado
A CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de curso
SUMAacuteRIO
LISTA DE TABELAS vii
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi
RESUMOxiii
ABSTRACT xiv
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16
21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16
211 Microcistinas 22
2111 Absorccedilatildeo 24
2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26
221 Produccedilatildeo de gametas 27
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27
212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28
222 O ciclo estral 31
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE 36
3 OBJETIVOS 39
31 OBJETIVO GERAL 39
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas 40
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41
42 ANIMAIS 41
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42
431 Acasalamento 42
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44
434 Coleta de sangue 45
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47
4371 Estudo visceral 47
4372 Estudo esqueleacutetico 47
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49
442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49
443 Acasalamento 49
444 Eutanaacutesia dos machos 50
445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos
machos tratados 50
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50
451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53
47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54
5 RESULTADOS 55
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75
6 DISCUSSAtildeO 77
7 CONCLUSAtildeO 84
REFEREcircNCIAS 85
ANEXO I101
ANEXO II103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
SUMAacuteRIO
LISTA DE TABELAS vii
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS xi
RESUMOxiii
ABSTRACT xiv
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEORICA 16
21CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS 16
211 Microcistinas 22
2111 Absorccedilatildeo 24
2112 Mecanismo toacutexico das microcistinas 25
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS 26
221 Produccedilatildeo de gametas 27
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos 27
212 Produccedilatildeo de gametas masculinos 28
222 O ciclo estral 31
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO 32
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE 36
3 OBJETIVOS 39
31 OBJETIVO GERAL 39
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 39
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 40
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS 40
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas 40
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria 41
42 ANIMAIS 41
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE 42
431 Acasalamento 42
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs 44
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras 44
434 Coleta de sangue 45
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47
4371 Estudo visceral 47
4372 Estudo esqueleacutetico 47
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49
442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49
443 Acasalamento 49
444 Eutanaacutesia dos machos 50
445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos
machos tratados 50
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50
451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53
47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54
5 RESULTADOS 55
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75
6 DISCUSSAtildeO 77
7 CONCLUSAtildeO 84
REFEREcircNCIAS 85
ANEXO I101
ANEXO II103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos 46
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo 46
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade 47
4371 Estudo visceral 47
4372 Estudo esqueleacutetico 47
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL 49
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs 49
442 Administraccedilatildeo de ciclofosfamida 49
443 Acasalamento 49
444 Eutanaacutesia dos machos 50
445 Estudo de desenvolvimento reprodutivo de ratas prenhes de ratos
machos tratados 50
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS 50
451 Coleta de amostras de medula oacutessea 51
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico 51
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea 52
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma 52
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico 52
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito 53
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOOacuteGICA 53
47 DOSAGEM BIOQUIacuteMICA 54
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 54
5 RESULTADOS 55
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS 55
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE 59
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA 62
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES 66
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICOS DAS RATAS PRENHES 67
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATAS MACHOS 69
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS 70
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS 73
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 74
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS 75
6 DISCUSSAtildeO 77
7 CONCLUSAtildeO 84
REFEREcircNCIAS 85
ANEXO I101
ANEXO II103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
6 DISCUSSAtildeO 77
7 CONCLUSAtildeO 84
REFEREcircNCIAS 85
ANEXO I101
ANEXO II103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
18
TABELA 2 Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de potabilidade da aacutegua para consumo humano
20
TABELA 3 Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
21
TABELA 4 Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
56
TABELA 5 Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
57
TABELA 6 Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
59
TABELA 7 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
60
TABELA 8 Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
61
TABELA 9
Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
62
TABELA 10 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
63
TABELA 11
Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
65
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
viii
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
TABELA 12 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
65
TABELA 13 Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos (ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
66
TABELA 14 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCskgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
67
TABELA 15 Ganho de peso dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia (grupos T) durante 52 dias
71
TABELA 16 Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
71
TABELA 17 Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
72
TABELA 18 Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo (POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
73
TABELA 19
Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
75
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura quiacutemica geral das MCs em que R1 e R2 representam duas posiccedilotildees hiper-variaacuteveis
24
FIGURA 2
Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
43
FIGURA 3 Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de espermatozoides
43
FIGURA 4 Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
44
FIGURA 5 Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um siacutetio de implantaccedilatildeo
45
FIGURA 6 Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
46
FIGURA 7 Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira de um rato Wistar
51
FIGURA 8 Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves microcistinas identificadas no extrato
58
FIGURA 9 Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
64
FIGURA 10 Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante 20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H) ng de MCskgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas (E-H)
68
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103
x
FIGURA 11 Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN) ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCskgdia durante 52 dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgkgdia) via ip por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
70
FIGURA 12 Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52 dias
74
FIGURA 13 Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados
com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As
setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular
Corte histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As
setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
Corte histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos
tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte
histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com
aacutegua destilada (G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras EFG e H
mostram as diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
76
xi
LISTA DE ABREVIACcedilOtildeES E SIGLAS
Adda Aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3amino-9metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco
ALT Aspartato aminotransferase
ANOVA
Analise de Variacircncia
ANVISA Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
AST Alanina aminotransferase
COBEA Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo Animal
CYNs Cilindrospermopsinas
D-ala D-alanina
DG Dia da gestaccedilatildeo
D-Glu Aacutecido glutacircmico
D- MeAsp Aacutecido D-eritro-β-metil-aspaacutertico
EDTA Aacutecido Etilenodiamenoteraceacutetico Disoacutedico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
FUNASA Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
GV Valor Diretriz
HbCO Caboxihemoglobina
Met-Hb Metehemoglobina
HiCN Cianometehemoglobina
HILIC-FD Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com Detector de Fluorescecircncia
ip Intraperitoneal
ICSH Conselho Internacional de Padronizaccedilatildeo em Hematologia
KOH Hidroacutexido de potaacutessio
LC-MSMS Cromatografia Liacutequida acoplada a um Espectrocircmetro de Massas em Tandem
xii
LR Leucina-Argenina
MC-LR Microcistina-LR
MCs Microcistinas
Mdha N-metil deidroalanina
min Minuto
MO Medula Oacutessea
MS Ministeacuterio da Sauacutede
ND Natildeo identificado
NOAEL Menor dose sem efeitos toacutexicos observados (No Observed Adverse Effect Level)
OMS Organizaccedilatildeo Mundial e Sauacutede
p Niacutevel de significacircncia estatiacutestica
RR Arginina-Arginina
SAX Saxitoxina
TDI TDI Ingestatildeo diaacuteria tolerada
vv VolumeVolume
YA Tirosina-Lanina
xiii
RESUMO
A presenccedila de floraccedilotildees de cianobacteacuterias em reservatoacuterios destinados ao
abastecimento agrave populaccedilatildeo pode gerar problemas de sauacutede puacuteblica em razatildeo de
muitas espeacutecies serem produtoras de compostos potencialmente toacutexicos e estes natildeo
serem eliminados nos procedimentos convencionais usados em estaccedilotildees de
tratamento de aacutegua Portanto mesmo que em quantidades inferiores ao limite
maacuteximo permitido imposto pelo Ministeacuterio da Sauacutede (MS) cianotoxinas podem estar
presentes na aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo criando uma exposiccedilatildeo crocircnica
Poucas satildeo as informaccedilotildees sobre os efeitos em longo prazo da exposiccedilatildeo oral agraves
cianotoxinas Esse trabalho teve como proposta a exposiccedilatildeo por via oral (vo) de
animais a um extrato bruto de cianobacteacuteria contendo cianotoxinas para avaliaccedilatildeo
do desempenho reprodutivo de ratas prenhes e de sua prole e da fertilidade de ratos
machos A presenccedila de microcistinas (MCs) nas amostras coletadas durante
processos de floraccedilatildeo em reservatoacuterios de aacutegua doce do Rio Grande do Norte foi
analisada por ensaio imunoenzimaacutetico e suas variantes foram identificadas e
quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos Foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
natildeo causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados Tambeacutem natildeo foi observado
nenhuma alteraccedilatildeo no estudo esqueleacutetico na prole de ratas prenhes tratadas com o
referido extrato Como as soluccedilotildees utilizadas continham MCs em concentraccedilatildeo igual
ou maior a da dose diaacuteria toleraacutevel para MCs os resultados obtidos sugerem
portanto que o desenvolvimento desse trabalho contribuiu para melhor avaliaccedilatildeo de
risco agrave sauacutede puacuteblica quanto agrave exposiccedilatildeo oral agraves cianotoxinas aumentando-se
assim a credibilidade no limite maacuteximo permitido (LMP) de MCs em aacutegua potaacutevel
distribuiacuteda agrave populaccedilatildeo de diversos paiacuteses que usam o LMP estabelecido pela OMS
em sua legislaccedilatildeo
xiv
ABSTRACT
The presence of cyanobacterial blooms in reservoirs intended for supply to the
population can create public health problems for many species could produce
potentially toxic compounds and these are not eliminated in the conventional
procedures used in water treatment plants So even in amounts less than the
maximum allowable limit imposed by MS cyanotoxins can be present in drinking
water distributed to the population creating a chronic exposure There is little
information about the long-term effects of oral exposure to cyanotoxins This work
aimed to show the exposure orally (vo) of animals to a crude extract of
cyanobacteria containing cyanotoxins to evaluate the reproductive performance of
pregnant rats and their offspring and fertility of male rats The presence of
microcystins (MCs) in samples collected during the flowering processes in freshwater
reservoirs in the Rio Grande do Norte was analyzed by enzyme immunoassay and
its variants have been identified and quantified by chromatographic methods It was
observed that by administration vo cyanobacterial extract containing MCs (40 100
or 250 ng of MCs kg day) did not cause systemic toxicity in adult rats or effect on
reproductive performance of male and female rats treated It was also not observed
any changes in skeletal study in the offspring of pregnant rats treated with the extract
above Because the solutions used contained MCs in a concentration equal to or
greater than the tolerable daily intake for MCs the results suggest therefore that the
development of this work contributed to better assess public health risk as the oral
exposure to cyanotoxins increasing thus the credibility of the maximum allowable
limit (LMP) of MCs in drinking water distributed to the population of several countries
that use the LMP established by WHO in its legislation
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A presenccedila de toxinas produzidas por cianobacteacuterias em reservatoacuterios de
aacutegua tem causado problemas de sauacutede puacuteblica em vaacuterios paiacuteses (FRISTACHI E
SINCLAIR 2008) sendo as microcistinas (MCs) as cianotoxinas mais encontradas
nessas floraccedilotildees toacutexicas (US EPA 2006)
Satildeo muitos os trabalhos que buscam esclarecer os efeitos dessas
cianotoxinas em modelos animas (BILLAM et al 2008 BU et al 2006 CHORUS E
BARTRAM1999 DING et al 2006 ROGERS et al2005) No entanto a via
intraperitoneal (ip) eacute a forma de exposiccedilatildeo mais utilizada a qual expotildee o animal a
toxinas isoladas com o intuito de se conhecer os efeitos de intoxicaccedilatildeo aguda
Pouco eacute relatado sobre os efeitos dessas toxinas em exposiccedilatildeo a meacutedio ou longo
prazo por via oral com extrato bruto de cianobacteacuteria semelhante a forma a qual a
populaccedilatildeo estaacute exposta
Em 1998 a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) publicou como orientaccedilatildeo
provisoacuteria a concentraccedilatildeo maacutexima permitida de MCs em aacutegua potaacutevel distribuiacuteda agrave
populaccedilatildeo (1 μgL) Para derivaccedilatildeo deste valor de referecircncia (VR) foi utilizado o
valor de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) de 40 ng de MC-LR kg de peso corpoacutereo
(pc)dia (VAN APELDOORN et al 2007) Esse paracircmetro de seguranccedila foi obtido
a partir de um uacutenico estudo de avaliaccedilatildeo de hepatotoxicidade realizado com
camundongos tratados com MC purificada por via oral (vo) por 13 semanas (Fawell
et al 1994)
Por ser crescente o interesse de conhecimento sobre a capacidade das
cianotoxinas em atravessar placentas e causar danos aos fetos (BU et al 2006
STOCKTON e PALLER 1990) e escasso os estudos sobre os efeitos dessas
cianotoxinas sobre a reproduccedilatildeo de animais incluindo os mamiacuteferos (CHERNOFF et
al 2002) o presente trabalho teve como proposta avaliar os efeitos da exposiccedilatildeo
oral a um extrato bruto de cianobacteacuterias contendo cianotoxinas sobre o
desempenho reprodutivo de ratos e agrave prole sendo que as toxinas identificadas
nesse extrato foram as MCs e para o tratamento dos animais foi utilizada a
concentraccedilatildeo de IDA a fim de avaliar se o VR imposto pela OMS protege natildeo
somente de hepatotoxicidade mas tambeacutem de toxicidade na reproduccedilatildeo de
mamiacuteferos
16
2 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA
21 CIANOBACTEacuteRIAS E CIANOTOXINAS
As cianobacteacuterias satildeo micro-organismos que possuem caracteriacutesticas
celulares de procariontes (ausecircncia de membrana nuclear) e sistema
fotossintetizante semelhante ao das algas (natildeo organizado em cloroplastos)
(SIRQUEIRA e OLIVEIRA-FILHO 2012) Tendo a capacidade de realizar
fotossiacutentese tanto aeroacutebica como anaerobicamente e participando do grupo dos
procariontes gram-negativos (LEE 1991) as cianobacteacuterias satildeo encontradas tanto
em aacutegua doce como salobra e marinha aleacutem de fontes termais geleiras e solos de
desertos (CODD et al 2005 WIEGAND E PFLUGMACHER 2005) Elas podem
estar organizadas estruturalmente em unicelular colocircnias ou filamentos (HAIDER et
al 2003)
Em ambientes natildeo impactados normalmente as cianobacteacuterias natildeo causam
problemas em razatildeo da dinacircmica dos ecossistemas Poreacutem a atividade
antropogecircnica pode promover a chamada eutrofizaccedilatildeo artificial que representa o
aumento das concentraccedilotildees de nutrientes - principalmente foacutesforo e nitrogecircnio - nas
bacias hidrograacuteficas provocando o crescimento acelerado de cianobacteacuterias
definido como floraccedilatildeo ou ldquobloomrdquo (CODD 2000 WIEGAND E PFLUGMACHER
2005) A floraccedilatildeo se caracteriza pelo intenso crescimento desses microrganismos na
superfiacutecie da aacutegua formando uma densa camada de ceacutelulas com vaacuterios centiacutemetros
de profundidade (FUNASA 2003)
A duraccedilatildeo e o periacuteodo da estaccedilatildeo da floraccedilatildeo de cianobacteacuterias dependem
muito das condiccedilotildees climaacuteticas da regiatildeo Em zonas temperadas as floraccedilotildees de
cianobacteacuteria satildeo mais proeminentes durante o final do veratildeo e iniacutecio do outono e
pode durar de 2 a 4 meses Em regiotildees com climas subtropical ou mediterracircneo os
periacuteodos de floraccedilatildeo podem iniciar mais cedo e persistir por mais tempo Na Franccedila
as floraccedilotildees podem ocorrer por 4 meses e no Japatildeo Portugal Espanha e Aacutefrica do
Sul por 6 meses ou mais Em anos de seca em aacutereas de clima tropical ou subtropical
da China Brasil e Austraacutelia as floraccedilotildees de cianobacteacuterias podem ocorrer quase o
ano todo (CHORUS E BARTRAM 2003 VAN APELDOORN et al 2007) A
toxicidade das floraccedilotildees de cianobacteacuterias varia principalmente em decorrecircncia das
17
alteraccedilotildees na proporccedilatildeo de cepas toacutexicas ou natildeo presentes no ecossistema
(FUNASA 2003)
A constante degradaccedilatildeo ambiental nas bacias hidrograacuteficas de intensa
ocupaccedilatildeo antroacutepica tem alterado significativamente a qualidade de seus corpos
daacutegua (AGUJARO e ISAAC 2002) Aleacutem de problemas que pode trazer ao meio
ambiente como morte de peixes por menor oxigenaccedilatildeo da aacutegua a floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias em reservatoacuterios de aacutegua pode trazer seacuterios problemas agrave sauacutede
puacuteblica (CODD et al 2005 BITTENCOUT-OLIVEIRA e MOLICA 2003 AZEVEDO
1998 BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) em virtude que algumas cianobacteacuterias
serem produtoras de toxinas denominadas de cianotoxinas e assim gerarem as
floraccedilotildees toacutexicas (SKULBERG 2000 SINCLAIR et al 2008)
Entre os principais gecircneros de cianobacteacuterias produtores de toxinas estatildeo
Dolichospermum Aphanizomenon Cylindrospermopsis Lyngbya Microcystis
Nodularia Nostoc e Oscillatoria (conhecida tambeacutem como Planktothrix)
(BITTENCOURT-OLIVEIRA et al 2005 BOTANA 2007 VASCONCELOS 2001)
As principais toxinas produzidas por esses gecircneros satildeo microcistinas (MCs)
cilindrospermopsinas (CYNs) saxitoxina (SAX) e seus anaacutelogos nodularinas
anatoxina-a homoanatoxina-a anatoxina-a(s) (CARNEIRO E LEITE 2008)
As cianotoxinas satildeo consideradas produtos do metabolismo secundaacuterio das
cianobacteacuterias e podem permanecer no interior da ceacutelula ficarem aderidas agrave parede
celular externa ou serem liberadas para o meio extracelular Devido algumas
cianobacteacuterias apresentarem as mesmas caracteriacutesticas ecoloacutegicas e fisioloacutegicas
elas se agrupam no ecossistema planctocircnico e desenvolvem as chamadas ldquoeco
estrateacutegiasrdquo (MUR SKULBERG E UTKILE 1999) Por isso alguns autores
acreditam que as cianotoxinas teriam a finalidade de conferir vantagens na
competiccedilatildeo (alelopatia) com outras cianobacteacuterias e microalgas (o que explicaria o
domiacutenio das espeacutecies toacutexicas em ambientes eutrofizados) ou na defesa jaacute que
essas toxinas inibem a predaccedilatildeo desses microrganismos pelo zooplacircncton (LEE
1991 CARMICHAEL 2008 CHORUS E BARTRAM 2003)
As cianotoxinas satildeo classificadas em trecircs diferentes grupos de acordo com a
sua estrutura quiacutemica podendo ser peptiacutedeos ciacuteclicos alcaloacuteides e
lipopolissacariacutedeos (BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) Essas variaccedilotildees satildeo
determinantes no tipo de mecanismo de accedilatildeo que satildeo descritos como
hepatotoacutexicos neurotoacutexicos e dermatotoacutexicos (QUILLIAM 1999 HUMPAGE 2008
18
VASCONCELOS 2001) Na tabela 1 satildeo apresentados as estruturas quiacutemicas e os
mecanismos de toxicidade das principais cianotoxinas
Tabela 1- Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra
Toxinas Estrutura molecular Modo de toxicidade
Hepatotoxinas
Microcistinas
(Heptapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases [Mackintosh et al 1990]
Nodularinas
(Pentapeptiacutedeo ciacuteclico)
Promotor de tumor inibidor de fosfatases
[Ueno et al 1996]
Cilindrospermopsinas
(Alcaloacuteide)
Inibidor de siacutentese proteica [Sverck e Smith
2004]
Neurotoxinas
Saxitoxina e seus anaacutelogos
(Alcaloacuteide)
Bloqueiam a geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo dos neurocircnios e fibras de muacutesculos esqueleacutetico e cardiacuteaco Esse bloqueio da transmissatildeo nervosa induz paralisia muscular [Humpage 2008]
Anatoxina-a
(Alcaloacuteide) Potentes agonistas nicotiacutenico da acetilcolina
[Osswald et al 2007]
Homoanatoxina
(Alcaloacuteide)
Anatoxina-a(s)
(Eacutester metiacutelico)
Organofosforado natural que age como inibidor
irreversiacutevel da acetilcolinesterase (ldquosrdquo
de salivaccedilatildeo) [Van
Apeldoorn et al 2007]
19
Toxinas
Estrutura molecular
Modo de toxicidade
Dermatotoxinas
Aplisiatoxina
(Bilactona fenoacutelica)
Causam dermatite [van
Apeldoorn et al 2007]
Lingbiatoxina-a
(Alcaloacuteide indoacutelico)
Causam dermatite e severa inflamaccedilatildeo
gastrintestinal [Osborne et
al 2001]
Em todo o mundo as constantes floraccedilotildees toacutexicas em reservatoacuterios tem se
tornado um grande problema para animais e seres humanos (AZEVEDO 1998
BRANDAtildeO E DOMINGOS 2006) O primeiro relato de morte de animais causada
por floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorreu em 1878 no sul da Austraacutelia onde ovelhas
cavalos e catildees foram intoxicados apoacutes beberem aacutegua de um lago contaminado
(SINCLAIR et al 2008) A partir de entatildeo muitos paiacuteses relataram intoxicaccedilotildees
provocadas pela exposiccedilatildeo a estas toxinas (CHORUS E BARTTAN 1999)
No Brasil o relato de intoxicaccedilatildeo letal atribuiacutedo a cianobacteacuteria em aacutegua
potaacutevel foi a mundialmente conhecida ldquoSiacutendrome de Caruarurdquo Aconteceu quando
um foco de insuficiecircncia hepaacutetica aguda ocorreu em um centro de hemodiaacutelise em
Caruaru Pernambuco em 1996 Na cliacutenica 116 dos 131 pacientes apresentaram
distuacuterbios visuais naacuteuseas e vocircmitos apoacutes rotina de tratamento de hemodiaacutelise
Posteriormente cerca de 100 pacientes desenvolveram insuficiecircncia hepaacutetica
aguda e destes 76 morreram (JOCHIMSEN et al 1998 POURIA et al 1998
CODD et al 1999 CARMICHAEL et al 2001 AZEVEDO et al 2002)
Tabela 1 - Toxinas de cianobacteacuterias de aacutegua doce ou salobra (Continuaccedilatildeo) (Continuaccedilatildeo da tabela 1 na proacutexima paacutegina)
20
Como medidas efetivas geralmente soacute satildeo acionadas quando ocorrem
graves incidentes esse caso fatal levou a criaccedilatildeo da portaria que estabelece o limite
maacuteximo de cianotoxinas na aacutegua para o consumo humano (PEREIRA BRASIL E
BRANDAtildeO 2005) A Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) por meio
da portaria no 146900 (dezembro2000) passou a exigir dos oacutergatildeos competentes e
responsaacuteveis pelo tratamento e fornecimento de aacutegua o monitoramento de
cianobacteacuterias e controle de cianotoxinas dando o prazo ateacute 2003 para que esses
oacutergatildeos se adequassem agrave essa portaria E em 2004 o Ministeacuterio da Sauacutede (MS) por
meio da portaria nordm 518 (250304) reformulou e revogou a portaria no 146900 e
passou a exigir procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilacircncia
da qualidade da aacutegua para consumo humano e seu padratildeo de potabilidade Tornou-
se obrigatoacuterio o monitoramento de cianobacteacuterias e anaacutelise de MCs e foram
recomendadas as anaacutelises de CYNs e SAX A tabela 2 mostra os valores maacuteximos
permitidos para toxinas de cianobacteacuterias em aacutegua potaacutevel
TABELA 2- Valores do limite maacuteximo permitido para toxinas de cianobacteacuterias em
aacutegua potaacutevel estabelecidos pela Portaria nordm 2914 (121211) do MS para padratildeo de
potabilidade da aacutegua para consumo humano
TOXINAS LIMITE MAacuteXIMO
PERMITIDO (microgL)
MICROCISTINAS 1
CILINDROSPERMOPSINAS 1
SAXITOXINA 3
Haacute apenas uma recomendaccedilatildeo pela Portaria nordm 2914
do MS para a determinaccedilatildeo de cilindrospermopsinas
observando os valores limites
Com o surgimento da portaria os setores responsaacuteveis pelo abastecimento
de aacutegua puacuteblica devem estar diariamente em alerta para agraves floraccedilotildees de
cianobacteacuterias (SANTOS e BRACARENSE 2008) que para a Funasa (Fundaccedilatildeo
Nacional de Sauacutede) eacute dividido em vaacuterios niacuteveis de acordo com o grau de
potabilidade da aacutegua distribuiacutedas pelas companhias de tratamento O niacutevel de
vigilacircncia caracteriza-se pela detecccedilatildeo dos estaacutegios iniciais do desenvolvimento
21
dessas floraccedilotildees a partir de monitoramento sistemaacutetico do manancial A confirmaccedilatildeo
para o iniacutecio do estabelecimento de uma floraccedilatildeo de cianobacteacuterias ocorre no niacutevel
de alerta 1 No Niacutevel de alerta 2 aleacutem da confirmaccedilatildeo de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias jaacute satildeo observados problemas na qualidade de aacutegua Por fim o niacutevel
de alerta 3 apresenta floraccedilatildeo toacutexica no manancial o qual traz riscos iminentes para
sauacutede da populaccedilatildeo (FUNASA 2003) Para cada niacutevel de vigilacircncia existem alguns
indicativos de confirmaccedilatildeo descritos na tabela 3
Tabela 3- Niacuteveis e valores indicativos para o grau de potabilidade da aacutegua
distribuiacuteda pelas companhias de tratamento
Niacutevel Valores indicativos
Vigilacircncia - uma colocircnia ou cinco filamentos de cianobacteacuterias por mililitro de aacutegua bruta ateacute 10000 ceacutelulasmL - 02 mm3 a 1 mm3L de biovolume
Niacutevel 1 - 10000 a 20000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 1 a 2 mm3 L de biovolume
Niacutevel 2 - 20000 a 100000 ceacutelulas de cianobacteacuterias por mililitro - 2 a 10 mm3L de biovolume
Niacutevel 3
- nuacutemero de ceacutelulas de cianobacteacuterias maior que 100000ml biovolume gt10 mm3L - presenccedila de cianotoxinas confirmada por anaacutelises quiacutemicas - bioensaios de toxicidade
(Adaptada de FUNASA 2003)
Segundo o Ministeacuterio da Sauacutede (2003) a principal via de exposiccedilatildeo que
resulta em intoxicaccedilatildeo se daacute pelo consumo oral da aacutegua contaminada com
cianobacteacuterias O contato de animais e humanos tambeacutem pode ocorrer em
atividades de recreaccedilatildeo no ambiente que apresente cianotoxinas ou ainda pelo
consumo de alimentos e medicamentos contaminados (BRANDAtildeO E DOMINGOS
2006 ESKINAZI-SANTrsquoANNA et al 2006 PEREIRA et al 2011 RELLAN et al
2009)
Em mamiacuteferos o efeito das toxinas depende do modo de accedilatildeo podendo
ocasionar efeitos agudos (irritaccedilatildeo de pele gastroenterites e ateacute parada respiratoacuteria)
ou crocircnicos (formaccedilatildeo de tumores devido agrave ingestatildeo de aacutegua contaminada com MCs
e CYN) (PANOSS et al 2007 NOVAacuteKOVAacute BLAacuteHA e BABICA 2012) Para Chorus
22
e Bratam (2003) em estudo com camundongos a exposiccedilatildeo aguda a cianotoxinas
hepatotoacutexicas ou neurotoacutexicas acarretaram numa morte raacutepida do animal por
hemorragia hepaacutetica e parada respiratoacuteria respectivamente
Estudos mostraram a persistecircncia de MC residual intacta em aacutegua submetida
ao tratamento convencional de potabilidade (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
Pesquisas revelam que as tecnologias de tratamento de aacutegua usuais envolvendo a
coagulaccedilatildeo quiacutemica floculaccedilatildeo sedimentaccedilatildeo ou flotaccedilatildeo e filtraccedilatildeo natildeo
apresentam eficiecircncia significativa na remoccedilatildeo de cianotoxinas dissolvidas na aacutegua
(VIANA-VERONEZI et al 2009) ou seja a populaccedilatildeo estaacute constantemente exposta
a niacuteveis de cianotoxinas que estatildeo abaixo dos valores de referecircncia determinados
pela legislaccedilatildeo Brasileira (Portaria nordm 2914) permitindo que natildeo seja evitado os
efeitos deleteacuterios no organismo Poreacutem poucos satildeo os estudos toxicoloacutegicos sobre
os efeitos da exposiccedilatildeo subcrocircnica e crocircnica a baixas concentraccedilotildees dessas
cianotoxinas (FUNARI E TESTAI 2008 SOARES 2009)
211 Microcistinas
As microcistinas (MCs) foram primariamente assim chamadas por terem sido
isoladas pela primeira vez da espeacutecie Microcystis aeruginosa (LAWTON e
EDWARDS 2001) poreacutem jaacute satildeo conhecidos outros gecircneros de cianobacteacuterias que
produzem as MCs como Dolichospermum Oscillatoria e Nostoc (CHORUS E
BARTRAM 2003 DAWSON 1998)
As MCs satildeo formadas por peptiacutedeos produzidos pela via natildeo-ribossomal
(ZILLIGES et al 2011) e as enzimas envolvidas nessa siacutentese satildeo classificadas
como modulares ou seja em cada moacutedulo possuem informaccedilotildees de uma uacutenica
unidade de peptiacutedeo (HAIDER et al 2003) Satildeo classificadas como hepatotoxina
(FALCONER e YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e
AZEVEDO 2009) e apresentam estrutura quiacutemica (figura 1) composta por sete
aminoaacutecidos unidos por ligaccedilotildees peptiacutedicas em uma configuraccedilatildeo ciacuteclica
(ANTONIOU et al 2008) Sua composiccedilatildeo estrutural geral apresenta uma D-alanina
(D-ala) na posiccedilatildeo 1 dois L-aminoaacutecidos varaacuteveis nas posiccedilotildees 2 e 4 o aacutecido
glutacircmico (D-Glu) na posiccedilatildeo 6 e por trecircs aminoaacutecidos incomuns um aacutecido D-eritro-
β-metil-aspaacutertico (D-MeAsp) na posiccedilatildeo3 um aacutecido (2S 3S 8S 9S)-3-amino-9-
metoxi-268-trimetil-10-fenildeca-46-dienoiacuteco (Adda) na posiccedilatildeo 5 e uma N-metil
deidroalanina (Mdha) na posiccedilatildeo 7 (APELDOORN et al 2007 DAWSON 1998) A
23
presenccedila do aminoaacutecido Adda eacute essencial para a atividade bioloacutegica das MCs
(DAWSON 1998 LAKSHMANA RAO et al 2004) e parece desempenhar papel de
destaque na hepatotoxicidade jaacute que sua remoccedilatildeo reduz drasticamente a toxicidade
das MCs (KOMAGAE e HIROOKA 2000)
A nomenclatura das MCs foi proposta por Carmichael et al (1988) e teve
como base a composiccedilatildeo dos L-aminoaacutecidos das MC (figura 1) como por exemplo a
MC-LR (leucina-arginina) MC-RR (arginina-arginina) e MC-YA (tirosina-alanina) A
combinaccedilatildeo das duas variaacuteveis L-aminoaacutecidos X e Z satildeo responsaacuteveis pelas
diferenccedilas encontradas entre as MCs (GUPATA et al 2003) Poreacutem o grau de
metilaccedilatildeo dos aminoaacutecidos bem como as variaccedilotildees isomeacutericas no aminoaacutecido
Adda tambeacutem satildeo usadas na classificaccedilatildeo dessas cianotoxinas (MERILOUTO e
CODD 2005) A MC mais comumente encontrada eacute a MC-LR (FALCONER e
HUMPAGE 2005 LAWTON e EDWARDS 2001) seguida de MC-RR e MC-YA
(JAYARAJ e LAKSHMANA RAO 2006) poreacutem atualmente jaacute foram descritas mais
de 70 variantes de MCs (VIA-ORDORIKA et al 2004 CHEN et al 2011)
24
R1 R2
MC-LR Leucina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YA Tirosina Alanina
MC-LA Leucina Alanina
MC-RA Arginina Alanina
MC-AR Alanina Arginina
MC-FR Fenilalanina Arginina
MC-FA Fenilalanina Alanina
FIGURA 1- Estrutura quiacutemica geral das MCs onde R1 e R2 representam duas
posiccedilotildees variaacuteveis
A dose letal (DL50) da MC pode variar de 50 -11000 microgkg dependendo do
anaacutelogo de MC a espeacutecie afetada e a via de administraccedilatildeo (PUSCHENER e
HUMBERT 2007) A menor dose sem apresentaccedilatildeo de efeitos toacutexicos (No
Observable Adverse Effect Level - NOAEL) foi estipulada para MC-LR apoacutes
resultados de um uacutenico experimento com camundongos tratados por via oral (vo)
com 40 microg de MC-LRkg de peso corpoacutereodia durante 13 semanas (FAWEEL et al
1994)
2111 Absorccedilatildeo
Apoacutes a ingestatildeo de aacutegua contaminada com Microcystis o ambiente aacutecido
estomacal gera lise celular fazendo com que as MCs sejam liberadas para o meio
extracelular (PUSCHENER e HUMBERT 2007) no entanto a liberaccedilatildeo natildeo soacute
25
ocorre no estocircmago mas tambeacutem pode ocorrer no iacuteleo (SANTOS e BRACARENSE
2008) A MC-LR e a maioria dos seus congecircneres satildeo hidrofiacutelicas e geralmente
natildeo satildeo capazes de penetrar na membrana celular (ZEGURA STRASER e FILIPIC
2011) requerendo uma via de transporte dependente de trifosfato de adenosina
(ATP) que ateacute agora foi descrito como sendo o mesmo transporte de aacutecidos biliares
(APELDOORN et al 2007) Como resultado disso a accedilatildeo toacutexica dessa cianotoxina
se concentra nos oacutergatildeos que apresentam esse tipo de transporte de membrana
como eacute o caso do fiacutegado que tem accedilatildeo toacutexica nos hepatoacutecitos (HAIDER et al 2003
ZEGURA STRASER e FILIPIC 2011) As ceacutelulas do intestino delgado tambeacutem
expressam estes receptores e satildeo estes os responsaacuteveis pela entrada das MCs
para corrente sanguiacutenea (APELDOORN et al 2007) Uma vez absorvida a MC
rapidamente chega ao fiacutegado pela circulaccedilatildeo sanguiacutenea portal (SANTOS e
BRACARENSE 2008)
2112 Mecanismo toacutexico das MCs
A toxicodinacircmica das MCs estaacute relacionada a disfunccedilotildees hepaacuteticas agudas e
crocircnicas com hemorragia e morte (FERRAtildeO FILHO 2009) Uma vez dentro do
hepatoacutecito as MCs inibem as proteiacutenas fosfatases 1 (PP-1) e 2A (PP-2A) causando
hiperfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas do citoesqueleto resultando na deformaccedilatildeo dos
hepatoacutecitos (APELDOORN et al 2007 MORODER e BOHNER 1998) A ruptura
dos componentes do citoesqueleto e o rearranjo da actina filamentosa
(PUSCHENER e HUMBERT 2007) satildeo mecanismos importantes pois levam agrave
retraccedilatildeo dos hepatoacutecitos provocando a perda do contato entre eles e os capilares
sinusoacuteides fazendo com que o fiacutegado perca sua arquitetura e desenvolva lesotildees
(PAPAIORDANOU FONTEBELLE E SAAD 2009)
Nas intoxicaccedilotildees agudas por MCs as lesotildees hepaacuteticas causam perda de
sangue intra-hepaacutetico e pode evoluir para o choque hemorraacutegico (FALCONE e
HUMPAGE 2005) Os efeitos toacutexicos das MCs natildeo ocorrem somente nos
hepatoacutecitos (SANTOS e BRACARENSE 2008) tecircm sido observados danos severos
tambeacutem em ceacutelulas renais pulmonares e cardiacuteacas em animais tratados com MCs
(FUNASA 2003)
As substacircncias que inibem as PP satildeo consideradas promotores de tumor as
quais tecircm funccedilatildeo reguladora importante na homeostase celular (APELDOORN et al
2007) em conjunto com as quinases proteicas a PP-1 e a PP-2 regulam o
26
mecanismo de fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo das proteiacutenas no processo de divisatildeo
celular (SANTOS e BRACARENSE 2008) Por isso alguns autores jaacute afirmam que a
MC-LR possui propriedade genotoacutexica e carcinogecircnica poreacutem essas publicaccedilotildees
ainda satildeo contraditoacuterias pois alguns trabalhos mostram que a MC-LR natildeo eacute
mutagecircnica (ABRAMSSON-ZETTERBERG SUNDH e MATTSSON 2010)
Recentemente alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos tambeacutem para esclarecer se
As cianotoxinas satildeo capazes de causar embriofetotoxicidade eou alteraccedilatildeo no
desempenho reprodutivo de mamiacuteferos (BU et al 2006) Este interesse se daacute por
existir relativamente poucos dados sobre seu potencial em induzir toxicidade no
desenvolvimento fetal (CHERNOFF et al 2002)
22 REPRODUCcedilAtildeO DE MAMIacuteFEROS
A reproduccedilatildeo eacute o mecanismo essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das
espeacutecies assim como para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Em
mamiacuteferos eacute um processo ciacuteclico que apresenta vaacuterias fases maturaccedilatildeo sexual
produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de gametas fertilizaccedilatildeo transporte implantaccedilatildeo
embriogecircnese desenvolvimento fetal parto lactaccedilatildeo e desenvolvimento poacutes-natal
crescimento e desenvolvimento e novamente a maturaccedilatildeo sexual fechando o ciclo
(LEMONICA 2008) Neste ciclo a produccedilatildeo de gametas (gametogecircnese) eacute o uacutenico
ponto que diverge para os indiviacuteduos de sexo feminino e masculino os quais seratildeo
discutidos no item 221
O hipotaacutelamo sintetiza o hormocircnio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
enquanto trecircs hormocircnios produzidos pela hipoacutefise anterior satildeo importantes para o
processo reprodutivo da fecircmea hormocircnio foliacuteculo estimulante (FSH) hormocircnio
luteinizante (LH) e prolactina (PRL) (MENDONCcedilA et al 2007) Todavia a partir de
resultados obtidos com roedores observou-se que estressores fiacutesicos ou
emocionais atuam sobre o hipotaacutelamo alterando a secreccedilatildeo de fatores liberadores
ou inibidores de hormocircnios hipofisaacuterios (MOREIRA et al 2005) resultando em
alteraccedilatildeo em todo o sistema reprodutivo
Os distuacuterbios que afetam o sistema reprodutor incluem reduccedilatildeo na fertilidade
impotecircncia distuacuterbios menstruais abortos espontacircneos menor peso no nascimento
entre outros efeitos sobre o desenvolvimento (EPA 1996) A gametogecircnese e a
fertilizaccedilatildeo envolvidos no processo de reproduccedilatildeo tambeacutem podem sofrer accedilotildees que
levam a distuacuterbios na reproduccedilatildeo De acordo com Rogers e Kavlock (2008) essas
27
fases satildeo vulneraacuteveis agraves accedilotildees de substacircncias toacutexicas durante o processo de
imprinting genocircmico Esse processo consiste em um mecanismo regulado
epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua
origem parental - paterna ou materna e pode estar sujeito agrave accedilatildeo de toxinas por
envolver o processo de metilaccedilatildeo da citosina e mudanccedila da conformaccedilatildeo da
cromatina (MURPHY E JIRTLE 2000)
Os erros mais comuns satildeo mutaccedilotildees em um gene que sofre imprinting Se a
mutaccedilatildeo incidir no alelo silenciado nenhum efeito pode ser obviamente esperado
mas se ocorrer no alelo ativo haveraacute ausecircncia de produccedilatildeo de uma determinada
proteiacutena (CITRIN 2012) A localizaccedilatildeo do erro tambeacutem pode variar Portanto o erro
pode ser no centro de imprinting no qual acometeraacute um nuacutemero maior de genes
devido agrave sua abrangecircncia ou ainda pode ser por dissomia uniparental (LEE et al
2002)
221 Produccedilatildeo de gametas
O processo de produccedilatildeo das ceacutelulas germinativas difere no macho e na
fecircmea O nuacutemero de ceacutelulas germinativas no macho eacute grandemente aumentado
durante a espermatogecircnese atraveacutes da mitose e o suprimento das ceacutelulas eacute
reabastecido durante a vida enquanto que na fecircmea a mitose cessa ao nascimento e
a ovogecircnese envolve o desenvolvimento de um nuacutemero limitado de ceacutelulas
germinativas preacute-formadas tendo o nuacutemero de ceacutelulas continuamente diminuiacutedo
durante a vida reprodutiva (SWENSON e REECE 1996)
2211 Produccedilatildeo de gametas femininos
A ovogecircnese eacute caracterizada pela produccedilatildeo de ovoacutecitos pelas ceacutelulas
germinativas primordiais (ovogonias) e pela proliferaccedilatildeo mitoacutetica de ceacutelulas epiteliais
internas originadas de uma interaccedilatildeo de diversos tipos celulares (DERRUSI e
LOPES 2009) A produccedilatildeo de gametas femininos eacute muito precoce e comeccedila ainda
na vida intrauterina no interior dos foliacuteculos ovarianos (ARAUacuteJO et al 2007
BEIGUELMAN 2008) Quando a ovogocircnia sofre vaacuterias divisotildees mitoacuteticas algumas
continuam a se dividir por mitose e outras param na proacutefase da meiose 1 e datildeo
origem aos ovoacutecitos primaacuterios (SADLER 2010) Apoacutes o nascimento nenhum ovoacutecito
primaacuterio eacute formado (MOORE 2008) e caso ocorra destruiccedilatildeo de gametas o animal
seraacute infeacutertil (SWENSON e REECE 1996)
28
Tatildeo logo o ovoacutecito primaacuterio eacute formado ele eacute circundado por uma uacutenica
camada de ceacutelulas foliculares achatadas e passa a ser chamado de foliacuteculo
primordial (MOORE 2008) Quando as ceacutelulas foliculares comeccedilam a se proliferar e
a mudar sua forma achatada para uma cuboide eacute estabelecido o foliacuteculo primaacuterio
(HYTTLE SINOWTZ e VEJLSTED 2010)
A meiose iniciada durante a vida intrauterina eacute interrompida e natildeo recomeccedila
antes da puberdade (SADLER 2010 SWENSON e REECE 1996) Acredita-se que
as ceacutelulas foliculares que circulam o ovoacutecito primaacuterio secretam uma substacircncia
inibidora de maturaccedilatildeo do ovoacutecito o que permite a parada no estaacutegio meioacutetico
(MOORE 2008) Soacute na puberdade eacute que os ovoacutecitos primaacuterios datildeo origem aos
ovoacutecitos secundaacuterios com a conclusatildeo da primeira meioacutetica (BRITO 1998) Na
ovulaccedilatildeo o nuacutecleo do ovoacutecito secundaacuterio inicia a segunda divisatildeo meioacutetica progride
ateacute a metaacutefase onde eacute novamente interrompida e soacute seraacute completado se ocorrer a
fecundaccedilatildeo (MOORE 2008)
Todo o processo de formaccedilatildeo dos ovoacutecitos maduros ocorre nos foliacuteculos ovarianos
que satildeo as unidades funcionais e fundamentais dos ovaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007)
O ovaacuterio eacute um oacutergatildeo composto por vaacuterios tipos celulares diferenciados e pode ser
dividido em duas regiotildees uma medular que na maioria das espeacutecies consiste na
porccedilatildeo interna do ovaacuterio e eacute constituiacuteda por tecido conjuntivo nervos arteacuterias e
veias e uma regiatildeo cortical que conteacutem corpos luacuteteos e foliacuteculos ovarianos em
diferentes estaacutegios de desenvolvimento (LEITAtildeO et al 2009) No sistema reprodutor
feminino o ovaacuterio eacute o oacutergatildeo sexual primaacuterio e secretor dos hormocircnios sexuais
femininos (ie progesterona estroacutegenos) onde se encontram os foliacuteculos que
contecircm em seu interior os ovoacutecitos (gameta feminino) (FONSECA 2005) Esse
oacutergatildeo eacute responsaacutevel tanto pela produccedilatildeo dos gametas quanto pela manutenccedilatildeo da
fertilidade (HASSUM FILHO SILVA e VERRESCH 2001)
2212 Produccedilatildeo de gametas masculinos
O testiacuteculo apresenta similaridades para quase todos os mamiacuteferos sendo
mais comum a variaccedilatildeo da proporccedilatildeo volumeacutetrica de seus componentes (SOARES
et al 2005) Por ser um oacutergatildeo de funccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas tem como
estrutura uma caacutepsula conjuntiva que o envolve e emite septos para seu interior
dividindo-o em compartimentos tubulares e intertubulares (BANKS 1992) No
primeiro localizam-se as ceacutelulas germinativas e as ceacutelulas de Sertoli e no segundo
29
estaacute todo o aporte de vasos sanguumliacuteneos e linfaacuteticos ceacutelulas de Leydig fibroblastos
macroacutefagos e mastoacutecitos (MASCARENHAS et al 2006)
Durante os estaacutegios iniciais da organogecircnese no testiacuteculo de ratos as ceacutelulas
de Sertoli satildeo as primeiras a sofrerem diferenciaccedilatildeo no primoacuterdio gonodal Isso
ocorre entre 135 e 145 dias apoacutes a concepccedilatildeo e depois da formaccedilatildeo dos cordotildees
testiculares ocorre um raacutepido aumento dessas ceacutelulas (ANGELOPOULOU et al
2007) Apesar de essa proliferaccedilatildeo ser mais intensa no periacuteodo preacute-natal ela
tambeacutem estaacute presente nos primeiros momentos poacutes-natal (PETERSEN et al 2001)
A proliferaccedilatildeo de ceacutelulas de Sertoli durante o desenvolvimento preacute-natal eacute criacutetico
para estabelecer o tamanho final dessas ceacutelulas necessaacuterias para uma quantidade
normal de espermatozoides (ANGELOPOULOU et al 2007)
As ceacutelulas de Sertoli revestem os tuacutebulos seminiacuteferos e geram uma barreira
sangue-testiacuteculo que atuam na proteccedilatildeo das ceacutelulas germinativas aleacutem de
desempenharem interaccedilotildees de transporte de nutrientes e de moleacuteculas reguladores
para as ceacutelulas germinativas (HYTTEL SINOWATZ e VEJLSTED 2010 SYED e
HECHT 2002 SWENSON e REECE 1993) Tambeacutem eacute atribuiacutedo a essas ceacutelulas
funccedilatildeo de regulaccedilatildeo da espermatogecircnese (RUSSEL e GRISWOLD 1993)
A espermatogecircnese na maioria dos mamiacuteferos tem uma duraccedilatildeo de 40 a 60
dias (FRANCcedilA e RUSSELL 1998) No rato esse ciclo tem duraccedilatildeo de 52 dias
(HILSCHER 1964) A espermatogecircnese eacute uma sequecircncia de eventos celulares que
resultam na formaccedilatildeo do espermatozoide maduro a partir de ceacutelulas precursoras
(OSHIO A GUERRA 2009) ou seja uma espermatogocircnia tronco eacute gradativamente
diferenciada numa ceacutelula haploacuteide altamente especializada (COSTA e PAULA
2003) Eacute um processo que ocorre com diferenciaccedilatildeo celular continua e que pode ser
divido em trecircs fases principais renovaccedilatildeo das espermatogocircnias e proliferaccedilatildeo
meiose e espermiogecircnese (LIU et al 2007)
Esse processo ocorre nos tuacutebulos seminiacuteferos onde as espermatogocircnias
seratildeo transformadas em espermatoacutecitos primaacuterios (MOORE 2008) Cada
espermatoacutecito primaacuterio ao sofrer a primeira divisatildeo da meiose daacute origem a dois
espermatoacutecitos secundaacuterios (ARAUacuteJO et al 2007) A meiose eacute um tipo especial de
divisatildeo celular que produz os gametas haploides a partir de ceacutelulas diploides
parentais (LIU et al 2007) ou seja na primeira divisatildeo da meiose eacute reducional
assim os espermatoacutecitos secundaacuterios passam a ter metade do nuacutemero de
cromossomos (ARAUacuteJO et al 2007) Em seguida os espermatoacutecitos secundaacuterios
30
sofrem a segunda divisatildeo meioacutetica formando quatro espermaacutetides com cerca da
metade do tamanho dos espermatoacutecitos secundaacuterios (MOORE 2008)
As espermaacutetides se diferenciam em espermatozoides atraveacutes de uma seacuterie de
modificaccedilotildees morfoloacutegicas progressivas em um processo conhecido como
espermiogecircnese que eacute parte da espermatogecircnese e ocorre predominantemente no
interior de cistos germinativos envolvidos por ceacutelulas de Sertoli onde se localizam
as espermaacutetides (AIRES STEFANINI e ORSI 2000 COSTA e PAULA 2003) Uma
vez formados os espermatozoides satildeo transportados dos tuacutebulos seminiacuteferos para o
epidiacutedimo onde se tornam funcionalmente maduros (MOORE 2008) No mamifeacutero a
maturaccedilatildeo das ceacutelulas germinativas para formaccedilatildeo dos espermatozoides ocorre ateacute
o final da vida do indiviacuteduo em que cada espermatogocircnia tronco daraacute origem a
quatro espermatozoides (ARAUacuteJO et al 2007)
A atenccedilatildeo para os mecanismos de toxicidade afetando o controle da
espermatogecircnese tem demonstrado que existe uma vasta gama de compostos que
eacute relacionada com accedilotildees toacutexicas a alguma ceacutelula envolvida nesse processo
(MANTOVANI e MARGANGHI 2005) A infertilidade pode ocorrer por vaacuterias causas
relacionadas ao meio ambiente (DIB et al 2007) Alteraccedilotildees afetando as ceacutelulas de
Sertoli durante o periacuteodo criacutetico de multiplicaccedilatildeo pode levar a uma potencial
reduccedilatildeo no nuacutemero final dessas ceacutelulas (PETERSEN et al 2001) Aleacutem do calor
agentes citotoacutexicos e doenccedilas podem conduzir a um colapso na espermatogecircnese e
levar a infertilidade (SYED e HECHT 2002) As substacircncias podem agir por efeito
citotoacutexico direto nas ceacutelulas germinativas masculinas no entanto existe uma
crescente preocupaccedilatildeo com as substacircncias que atuam por efeitos mais sutis
(PETRELLI e MANTOVANI 2002) Satildeo muitas as substacircncias que podem atuar
promovendo essas alteraccedilotildees citotoacutexicas tais como metais pesados
antimetaboacutelicos praguicidas herbicidas antibioacuteticos anticanceriacutegenos
(STEINBERGE e KLINEFELTER 1993) Para as toxinas a avaliaccedilatildeo de danos
testiculares pode ser realizada por anaacutelises de paracircmetros tais como a fertilidade
iacutendice de prenhez morfologia celular testicular e mortalidade do espermatozoide
(SUTER et al 1997)
31
222 O ciclo estral
Estro ou cio comumente referido como dia zero do ciclo estral eacute o periacuteodo da
fase reprodutiva do animal no qual a fecircmea apresenta sinais de receptividade
sexual seguida de ovulaccedilatildeo (VALLE 1991) Nas ratas normalmente esse ciclo
ocorre a cada 4 ou 5 dias (ADLER E BELL 1968 ANDRADE PINTO e OLIVEIRA
2002 BERTAN et al 2006) e eacute divido em quatro fases ou periacuteodos proestro estro
diestro I ou metaestro e diestro II (ANDRADE PINTO e OLIVEIRA 2002)
Essas fases do ciclo estral podem ser caracterizadas pela presenccedila
diferenciada de ceacutelulas que cada fase apresenta No proestro predominam-se as
ceacutelulas nucleadas no estro as ceacutelulas cornificadas com intensa descamaccedilatildeo e
anucleadas no metaestro poucas ceacutelulas nucleadas moderadas ceacutelulas anucleadas
e grande quantidade de leucoacutecitos e no diestro excesso de leucoacutecitos (ARAUJO et
al 2009) Aleacutem da diferenciaccedilatildeo celular essas fases apresentam atividade
hormonal diferente para o estroacutegeno e a progesterona Satildeo observados que as fases
de atuaccedilatildeo do estroacutegeno satildeo proestro e estro enquanto que a progesterona atua no
metaestro e diestro (CONCEICcedilAtildeO et al 2005) As variaccedilotildees nos niacuteveis hormonais
estatildeo intimamente ligadas ao comportamento sexual da rata
As fases do ciclo estral proestro e estro tecircm duraccedilatildeo de 12 horas enquanto
metaestro e diestro tem duraccedilatildeo de 15 e 57 horas respectivamente (ANDRADE
PINTO e OLIVEIRA 2002 ARAUJO et al 2009) O ciclo estral eacute vulneraacutevel agraves
influecircncias externas que levam ao seu desregulamento Segundo Santos et al
(2003) a ausecircncia de luz influecircncia diretamente na frequecircncia das fases do ciclo
estral de ratas provocando reduccedilatildeo na incidecircncia da fase de estro fazendo com
que ocorra o alongamento do ciclo estral nesses animais
Para Beach (1976) trecircs conceitos representam as caracteriacutesticas das fecircmeas
quando estatildeo na fase estro atratividade proceptividade e receptividade Eacute no
periacuteodo da receptividade que as fecircmeas aceitam os machos para a coacutepula Existem
diferentes opiniotildees quanto ao periacuteodo de maior receptividade das ratas Para alguns
autores na noite do proestro eacute que a fecircmea apresenta a receptividade e portanto
estaacute pronta para o coito (ARANDA 2011) Jaacute para Lucion et al (2003) o periacuteodo
mais receptivo das ratas ocorre durante a fase estro concordando assim com Beach
(1976) A regulaccedilatildeo hormonal da receptividade tambeacutem eacute um ponto de divergecircncias
entre os pesquisadores Para Powers (1970) em resultados de experimentos
32
durante o ciclo estral de ratas o comeccedilo do comportamento sexual requer a
facilitaccedilatildeo da accedilatildeo da progesterona poreacutem esse hormocircnio natildeo atua na
determinaccedilatildeo da receptividade Seguindo a mesma linha em 1976 Powers e
Moreines publicaram que a duraccedilatildeo da receptividade eacute determinada pela quantidade
e duraccedilatildeo de secreccedilatildeo de estroacutegeno e natildeo pela accedilatildeo inibitoacuteria da progesterona
Poreacutem para Luttge e Hughes (1976) a progesterona modula influecircncias na
receptividade sexual
O periacuteodo em que a rata estaacute pronta para o coito denomina-se de estro
comportamental Eacute nessa fase que a rata apresenta a lordose uma curvatura
espinhal assumida como postura para a coacutepula e eacute a caracteriacutestica mais
proeminente da receptividade da fecircmea (SAGAE 2010) A apresentaccedilatildeo da lordose
eacute muito importante para o sucesso reprodutivo em ratos pois eacute ela que permite a
inserccedilatildeo peniana pelo macho (GOMES 2005) A identificaccedilatildeo e reconhecimento do
indiviacuteduo ocorrem pelo cheiro inato de cada espeacutecie resultante da liberaccedilatildeo de
substacircncias quiacutemicas denominadas de feromocircnios (MATTARAIA et al 2009)
Geralmente nos roedores satildeo secretados por glacircndulas localizadas em diferentes
locais do corpo principalmente na regiatildeo anogenital (MOURA e XAVIER 2010)
A ovulaccedilatildeo no ciclo estral ocorre durante o estro ou logo apoacutes seu final
(FONSECA 2005) e eacute nesta fase que a progesterona encontra-se em seu niacutevel
maacuteximo (ARAUJO et al 2009) Imediatamente apoacutes a ovulaccedilatildeo o corpo luacuteteo uma
estrutura glandular transitoacuteria inicia seu desenvolvimento no ovaacuterio com a
capacidade de sintetizar vaacuterios hormocircnios sendo a progesterona o principal
(BERTAN et al 2006) A principal funccedilatildeo da progesterona nessa fase do ciclo eacute de
impedir a maturaccedilatildeo de novos foliacuteculos e assim permitir a manutenccedilatildeo da gestaccedilatildeo
(WEBB WOAR e ARMSTRONG 2002) Caso natildeo ocorra fertilizaccedilatildeo o corpo luacuteteo
entra em regressatildeo cessa-se a produccedilatildeo de progesterona e o ciclo estral eacute
retomado (SANTOS 2002)
23 TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
A teratologia eacute uma ciecircncia que estuda as anormalidades do desenvolvimento
durante o periacuteodo gestacional e as malformaccedilotildees resultantes (LEME MARTINS e
PORTUGAL 2003) No entanto o conceito de teratogecircnese natildeo se restringe apenas
agraves malformaccedilotildees estruturais logo apoacutes o nascimento tambeacutem satildeo consideradas
alteraccedilotildees funcionais (DIPE 2009) A palavra teratologia vem do termo grego
33
ldquoteratordquo que etimologicamente significa ldquoestudo de monstrosrdquo Aristoacuteteles
recomendava que as mulheres graacutevidas olhassem para bonitas estaacutetuas para que a
beleza dos seus filhos fosse aumentada (ROGERS E KAVLOCK 2008) Atualmente
o sentido original da palavra que referencia somente a malformaccedilotildees anatocircmicas
macroscoacutepicas vem sendo expandido para uma definiccedilatildeo que engloba anomalias
mais sutis (LIMA FRAGA e BARREIRO 2001)
A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos sobre o
organismo em desenvolvimento ocorrendo em qualquer momento do ciclo de vida
do organismo que pode resultar da exposiccedilatildeo a agentes quiacutemicos ou fiacutesicos antes
da concepccedilatildeo (atraveacutes do comprometimento de gametas dos pais) durante o
desenvolvimento preacute-natal ou no periacuteodo poacutes-natal ateacute o periacuteodo de puberdade
(NIHI E LOURENCcedilO 2011)
Muitos fatores contribuiacuteram para o atraso no estudo da toxicologia do
desenvolvimento um deles estaacute relacionado agrave ideia de que o embriatildeofeto estaria
protegido das agressotildees pelas membranas extraembrionaacuteria e fetais (WEIS 2007)
Hoje jaacute se sabe que a membrana placentaacuteria trata-se de uma bicamada de
moleacuteculas fosfolipiacutedicas ordenadamente dispostas Ela eacute impermeaacutevel a
determinados elementos mas promove a difusatildeo para outros (BROLIO et al 2010)
O transporte atraveacutes da placenta envolve o movimento de moleacuteculas entre trecircs
compartimentos sangue materno citoplasma do sinciciotrofoblasto e sangue fetal e
esse movimento pode ocorrer pelos mecanismos de difusatildeo simples difusatildeo
facilitada transporte ativo aleacutem de outras formas de transporte (CAVALLI BARALDI
e CUNHA 2006)
Todos os atrasos relacionados agraves pesquisas nessa aacuterea da toxicologia foram
questionados na trageacutedia mundial do faacutermaco talidomida Soacute apoacutes desse episoacutedio eacute
que a toxicologia do desenvolvimento avanccedilou (SILVA 2000) A talidomida foi
sintetizada em 1954 na Alemanha ocidental pelos pesquisadores da Chemi
Gruenhenthal (H Wirth e N Mueckler) e introduzida no mercado deste paiacutes em 1956
(SALDANHA 1994) O faacutermaco foi utilizado como um seguro sedativo e sendo
verificada que ela poderia ser tambeacutem usada como anti-emeacutetico durante a gravidez
resultou no uso generalizado na Europa (RADOMSKY E LEVINE 2001) Entre 1958
e 1962 foi observado principalmente na Alemanha e Inglaterra o nascimento de
milhares de crianccedilas que apresentavam graves deformidades congecircnitas
caracterizadas pelo encurtamento dos ossos longos dos membros superiores eou
34
inferiores com ausecircncia total ou parcial das matildeos peacutes eou dos dedos (OLIVEIRA
BERMUDEZ e SOUZA1999)
Quando o uso da talidomida foi aprovado natildeo existiam testes em animais
para saber os efeitos teratogecircnicos (MCBRIDE 1961) A partir de entatildeo que ocorreu
a padronizaccedilatildeo de protocolos para os testes sobre a reproduccedilatildeo Os novos
protocolos propostos vieram normatizar e dar ecircnfase a aspectos referentes ao
periacuteodo da exposiccedilatildeo agraves espeacutecies utilizadas nos estudos agraves doses a serem
testadas e principalmente aos paracircmetros que devem ser avaliados na
interpretaccedilatildeo dos dados (LEMONICA 2008)
Os estudos de toxicidade no desenvolvimento satildeo usualmente realizados
expondo a progenitora a substacircncias durante o desenvolvimento fetal para certificar
se a substacircncia tem a capacidade de gerar toxicidade para a prole (CHAHOUD et
al 1999) Poreacutem em muitos casos as doses muito altas geram alta mortalidade
materna ou abortos prejudicando a avaliaccedilatildeo do estudo e necessitando que seja
repetido com doses mais baixas (GIAVINI e MENEGOLA 2012)
Entre os mamiacuteferos a reproduccedilatildeo constitui um processo complexo
prolongado e que envolve vaacuterias etapas e dessa forma estaacute vulneraacutevel a
interferecircncias ambientes eou a vaacuterios agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Como
consequecircncia dessa vulnerabilidade muitos dos resultados gestacionais terminam
em alteraccedilotildees nos conceptos que pode ser resultante de fatores geneacuteticos ou
ambientais Para Rogers e Kavlock (2008) o resultado da gestaccedilatildeo bem sucedida
na populaccedilatildeo em geral supreendentemente ocorre com baixa frequecircncia A
etiologia de aproximadamente 65 das malformaccedilotildees espontacircneas eacute desconhecida
existindo uma discussatildeo sobre a contribuiccedilatildeo de agentes ambientais como
causadores dessas malformaccedilotildees (BRENT E BECKMAN 1990)
Quando comparados aos indiviacuteduos adultos os organismos em
desenvolvimento sofrem raacutepidas e complexas mudanccedilas dentro de um periacuteodo de
tempo relativamente curto (SPINOSA e BERNARDI 2008) Por causa das
mudanccedilas raacutepidas que ocorrem durante o desenvolvimento fetal o alvo para a
toxicidade no embriatildeofeto muda constantemente (ROGERS E KAVLOCK 2008)
Isso ocorre porque cada fase relacionada ao desenvolvimento estaacute relacionada
tambeacutem a vaacuterios eventos e cada uma delas pode ser modificada pela exposiccedilatildeo de
diferentes agentes quiacutemicos (LEMONICA 2008) Poreacutem natildeo soacute a exposiccedilatildeo a
agentes quiacutemicos ou ambientais que podem levar agraves alteraccedilotildees do concepto em
35
desenvolvimento outros fatores tambeacutem satildeo relacionados Por exemplo os efeitos
da desnutriccedilatildeo intrauterina que segundo Medeiros et al (2005) dependem da fase
de desenvolvimento em que estaacute o feto sendo os efeitos tanto mais intensos e
permanentes quanto mais precocemente ocorrer agrave desnutriccedilatildeo e mais tarde for
iniciada a recuperaccedilatildeo nutricional
Nos trabalhos de toxicidade fetal muitas vezes as doses escolhidas satildeo
capazes de gerar toxicidade sistecircmica generalizada na matildee denominada de
toxicidade materna na qual eacute significante a reduccedilatildeo da ingestatildeo de alimento eou
aacutegua reduccedilatildeo no ganho de peso letalidade e outros sinais durante a gestaccedilatildeo
(CHERNOFF et al 1989 NEUBERT e CHAHOUD 1995) Para Chahouda et al
(1999) a reduccedilatildeo no ganho de peso materno deve ser associado com a meacutedia do
peso fetal nuacutemeros de implantaccedilotildees taxa de reabsorccedilotildees e nuacutemero de anomalias
nos fetos No entanto o achado de malformaccedilotildees concomitantemente com a
toxicidade materna pode induzir a realizaccedilatildeo de mais experimentos para esclarecer
os resultados levando um gasto de tempo dinheiro e sacrifiacutecio de mais animais
(GIAVINI e MENEGOLA 2001)
A exposiccedilatildeo materna e paterna a agentes que podem afetar os processos
reprodutivos visa agrave avaliaccedilatildeo de problemas de fertilidade sendo fundamental a
exposiccedilatildeo durante os periacuteodos criacuteticos de desenvolvimento embrioloacutegico e fetal que
compreendem o periacuteodo de implantaccedilatildeo organogecircnese e desenvolvimento fetal
(HOLLENBACH et al 2010) Portanto eacute importante saber que o periacuteodo que cada
fase corresponde dentro do periacuteodo de gestaccedilatildeo A preacute-implantaccedilatildeo corresponde do
dia da concepccedilatildeo ateacute o 5ordm dia implantaccedilatildeo do 5ordm e 6ordm dia organogecircnese do 6ordm ao
15ordm dia e desenvolvimento fetal do 16ordm ao 21ordm dia (BERNARDI 1999) Existe uma
grande discussatildeo na descriccedilatildeo temporal da organogecircnese uma vez que muitos
autores adotam diferentes periacuteodos de iniacutecio e termino para essa que eacute uma das
mais importantes fases do desenvolvimento embrioloacutegico Em pesquisa Carmo
Peter e Guerra (2004) observaram que a organogecircnese pode ter iniacutecio entre o sexto
e oitavo dia e teacutermino entre o deacutecimo quinto e o deacutecimo oitavo dia de acordo com
diferentes autores o que dificulta a comparaccedilatildeo dos dados relacionados agrave data
exata em que determinados oacutergatildeos estatildeo se desenvolvendo
A toxicidade para o desenvolvimento em fetos eacute observada com a ocorrecircncia
de morte teratologia reduccedilatildeo do peso fetal alteraccedilatildeo no crescimento e deficiecircncias
funcionais (EPA 1996) Cada efeito depende muito da fase do desenvolvimento que
36
o concepto foi exposto aos fatores capazes de gerar a alteraccedilotildees no
desenvolvimento Para a OMS (WHO 1984) as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) podem em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo Os efeitos teratogecircnicos satildeo
observaacuteveis particularmente no periacuteodo de organogecircnese (CARMO PETER
GUERRA 2004)
Os efeitos teratogecircnicos podem ser vistos com diferentes graus de alteraccedilotildees
estruturais Satildeo descritos quatro tipos de anomalias estruturais malformaccedilatildeo
(defeitos morfoloacutegicos de um oacutergatildeo ou parte de um corpo resultante de um processo
de desempenho intrinsicamente anormal) ruptura (defeito morfoloacutegico de um oacutergatildeo
parte do corpo ou regiatildeo maior do corpo resultante do desarranjo de um
desenvolvimento originalmente normal ou de uma interferecircncia sobre ele)
deformaccedilatildeo (forma ou posiccedilatildeo anormal de uma parte do corpo) e displasia
(anormalidade de organizaccedilatildeo das ceacutelulas ou formarem tecidos eacute um processo de
desistogecircnese) (BRUNONI 2002 COSTA 2005) As alteraccedilotildees que ocorrem em
periacuteodos mais tardios do desenvolvimento satildeo determinadas de alteraccedilotildees
toxicoloacutegicas e satildeo caracterizadas por degeneraccedilotildees retardo no crescimento ou no
desenvolvimento de determinados oacutergatildeos (BERNARDI 1996)
A exposiccedilatildeo agrave xenobioacuteticos durante a gravidez pode afetar adversamente o
desenvolvimento normal dos fetos (CHAHOUD et al 1999) O baixo peso molecular
de algumas substacircncias facilita a ultrapassarem a barreira placentaacuteria invalidando o
seu conceito (STOCKTON e PALLER 1990) Os ensaios realizados em animais
podem ter resultados significantes para predizer os potenciais riscos para a sauacutede
dos fetos humanos (JELOVSEK MATTISON e CHEN 1989) Nos mamiacuteferos esses
ensaios satildeo realizados em roedores e neles satildeo investigados os resultados
reprodutivos do acasalamento de machos e fecircmeas (FALCONER 2007)
24 EFEITOS DAS CIANOTOXINAS NO DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Alguns trabalhos tecircm sido desenvolvidos visando avaliar os efeitos de
cianotoxinas sobre o desempenho reprodutivo de mamiacuteferos eou a prole de animais
expostos (BU et al 2006)
Segundo a OMS (WHO 1998) nenhum efeito sobre a fertilidade peso ou
distribuiccedilatildeo do sexo dos fetos foi observado para o ensaio em que camundongos
37
machos e fecircmeas foram expostos ao extrato de M aeruginosa por vo na
concentraccedilatildeo de 750 μg de MCkg do desmame ateacute o acasalamento e durante toda
a gestaccedilatildeo para as fecircmeas No ano seguinte um grupo de pesquisadores publicou
que tambeacutem natildeo foi constatado nenhum efeito de embrioletalidade
teratogenicidade alteraccedilatildeo na taxa de perda preacute-implanaccedilatildeo ou distribuiccedilatildeo do sexo
para os fetos cujas progenitoras foram expostas por vo agrave MC-LR purificada (200
600 ou 2000 μgkg) entre os dias 6-15 de gestaccedilatildeo (FAWELL et al1999) Chernorff
e colaboradores (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhum efeito sobre a toxicidade
do desenvolvimento na prole de camundongos quando expostos a MC-LR
purificada A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por via ip como por via subcutacircneo em doses
que variaram de 16-160 μgkg e 128 μgkg respectivamente entre os dias 7 e 12 da
gestaccedilatildeo
Os resultados encontrados por Zhang e colaboradores (2002) discordam com
aqueles jaacute relatados Estes pesquisadores relataram a presenccedila de hemorragia
petequial e degeneraccedilatildeo hidroacutepica grave no fiacutegado aleacutem de malformaccedilotildees nos
glomeacuterulos e medula renal de fetos cujas progenitoras foram expostas a MC-LR por
via ip durante 10 dias da gestaccedilatildeo em dose diaacuteria de 62 μgkg Os resultados
encontrados foram tatildeo significativos que eles propuseram que a MC-LR teria accedilatildeo
danosa direta na barreira placentaacuteria e no feto afetando a sua formaccedilatildeo e
desenvolvimento No entanto Zhang e colaboradores (2002) natildeo estatildeo sozinhos
para os achados no desenvolvimento fetal de camundongos Em resultado publicado
tambeacutem em 2002 Wei e colaboradores sugeriam que em doses elevadas de MC foi
possiacutevel visualizar accedilatildeo toacutexica materna e fetal (apud Bu et al 2006) Quanto agraves
anaacutelises realizadas em ratos fecircmeas Bu et al (2006) relataram alteraccedilotildees nos
filhotes das progenitoras expostas a MCs por via ip nas concentraccedilotildees de 3 6 ou
12 μgkgdia
Tambeacutem jaacute foi relatado accedilatildeo toacutexica das MCs no sistema reprodutivo de
camundongos machos Ding et al (2006) observaram alteraccedilotildees no testiacuteculo e no
epidiacutedimo de animais tratos com extrato de M aeruginosa (333 ou 667 μg de
MCskg pcdia) ip durante 14 dias Jaacute Chen e colaboradores (2011) observaram
que o tratamento crocircnico por vo utilizando doses baixas (1 32 ou 10 microg) de MC-
LR kgdia) resultou em toxicidade reprodutiva causando decliacutenio na qualidade do
espermatozoide queda nos niacuteveis de testosterona no soro e danos no testiacuteculos
38
Para a avaliaccedilatildeo do desenvolvimento reprodutivo de animais quando
expostos a outras cianotoxinas que natildeo as MCs podem ser citados os resultados
dos ensaios de Rogers e colaboradores (2005) que observaram intoxicaccedilatildeo
materna e nenhum efeito significativo na vitalidade e peso para os filhotes Nos
experimentos foram utilizados camundongos fecircmeas e administrados anatoxina-a
(125 ou 200 μgkg via ip) entre os dias 8-12 e 13-17 do periacuteodo gestacional O
resultado foi semelhante para exposiccedilatildeo de CYN que apresentou ausecircncia de
toxicidade fetal ou teratogenicidade A exposiccedilatildeo ocorreu no estaacutegio inicial da
gestaccedilatildeo em camundongos fecircmeas por via ip com doses que variaram de 8-128
gkg de CYN Os filhotes apresentaram normalidade no peso corpoacutereo viabilidade
morfologia (externa e de tecidos internos) e esqueleto poreacutem as doses
administradas por via ip causaram letalidade nas fecircmeas prenhas Numa recente
investigaccedilatildeo envolvendo a mesma cianotoxina (CYN) Chernoff e colaboradores
(2011) observaram que a toxicidade materna foi maior nos camundongos que se
encontravam nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo (8-12) com significativa reduccedilatildeo no
ganho de peso sangramento vaginal e mortalidade quando comparados com os
animais do estaacutegio tardio (13-17)
Por existir relativamente poucos dados sobre os efeitos das cianotoxinas na
reproduccedilatildeo de mamiacuteferos (PEGRAM et al 2012) o presente trabalho foi proposto e
os resultados apresentados aqui mostram os efeitos de uma floraccedilatildeo de
cianobacteacuterias contendo MCs sobre o desempenho reprodutivo de ratos expostos
por vo e um estudo de embriofetotoxicidade da prole
39
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse trabalho foi estudar a accedilatildeo da exposiccedilatildeo oral a um
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs no desempenho reprodutivo de ratos
machos e fecircmeas e na prole
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Realizar coletas de aacutegua nos reservatoacuterios do Rio Grande do Norte com
floraccedilotildees de cianobacteacuterias
Identificar e quantificar as cianotoxinas (MCs ANA CYN SAX e seus
congecircneres como tambeacutem cianotoxinas ineacuteditas) das amostras coletadas por
LC-MSMS e HILIC-FD
Estudar os efeitos da exposiccedilatildeo preacute-natal por vo a uma soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs na reproduccedilatildeo nos progenitores e na
prole originada
Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratos fecircmeas e de
embriofetotoxicidade da sua prole
Avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos (Ensaio do Dominate Letal)
Avaliaccedilatildeo diaacuteria do consumo de aacutegua raccedilatildeo e mensuraccedilatildeo do peso
corpoacutereo dos progenitores e do peso relativo de seus oacutergatildeos
Avaliaccedilatildeo hematoloacutegica (somente ratos machos) histopatoloacutegica e de
dosagens bioquiacutemicas dos progenitores
40
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 SELECcedilAtildeO DO EXTRATO DE FLORACcedilAtildeO DE CIANOBACTEacuteRIAS
411 Coleta das amostras de aacutegua e identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias e
cianotoxinas
Entre julho de 2009 e setembro de 2010 foram coletadas 37 amostras de
aacutegua pelo grupo de pesquisa da Profa Dra Ivaneide Alves Soares da Costa (Centro
de BiociecircnciasUFRN) nos seguintes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte
Armando Ribeiro Gonccedilalves (Itajaacute) Satildeo Rafael (Satildeo Rafael) Passagem das Traiacuteras
(entre Caicoacute Satildeo Joseacute do Seridoacute e Jardim do Seridoacute) e Gargalheiras (Acari) Foram
realizadas anaacutelises microscoacutepicas para a identificaccedilatildeo das espeacutecies de
cianobacteacuterias presentes em cada amostra e anaacutelises de detecccedilatildeo de cianotoxinas
(SAX CYN MCs) por ensaios imunoenzimaacuteticos (ELISA) foram realizadas conforme
especificaccedilotildees do fabricante dos kits (Abraxisreg) As 13 amostras que apresentaram
positividade para cianotoxinas no ELISA foram encaminhadas ao laboratoacuterio do
Professor Dr Ernani Pinto (Faculdade de Ciecircncias FarmacecircuticasUSP) onde as
cianotoxinas foram identificadas e quantificadas por meacutetodos cromatograacuteficos
(Cromatografia Liacutequida acoplada agrave Espectrocircmetria de Massas em Tandem (LC-
MSMS) e Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia de Interaccedilatildeo Hidrofiacutelica com
Detector de Fluorescecircncia (HILIC-FD))
Foi utilizada a teacutecnica de HILIC-FD para isolar e quantificar SAX e seus
anaacutelogos Essas anaacutelises foram realizadas com a formaccedilatildeo de gradiente de fases
moacuteveis sendo os eluentes compostos por aacutecido octanossulfocircnico fosfato de amocircnio
e tetrahidrofurano em aacutegua e acetonitrila e o fluxo foi de 1 mLmin Apoacutes oxidaccedilatildeo
poacutes-coluna com um gradiente de tampatildeo de par iocircnico o qual foi composto de uma
soluccedilatildeo de aacutecido perioacutedico e fosfato de amocircnia em aacutegua pH 69 em uma
derivatizaccedilatildeo aquecida a 50degC os produtos resultantes foram detectados com um
detector de fluorescecircncia (λEX 330 nm e λEM 395 nm) A SAX e seus anaacutelogos foram
identificados por comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos dos extratos das amostras
com aqueles resultantes apoacutes injeccedilatildeo de soluccedilotildees dos padrotildees A quantificaccedilatildeo
dessas toxinas foi realizada com o fator de resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da
41
toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades certificadas dos padrotildees das toxinas
(GALVAtildeO et al 2009)
Jaacute para a anaacutelise de microcistinas (MC-LR -RR -LA -LF -LW e -YR)
nodularina (NOD) anatoxina-a (ANA) e cilindrospermopsinas (CYN) foi utilizado um
sistema de LC-MSMS triplo quadrupolo equipado com uma coluna Phenomenex
Synergi Polar RP 80A 250 x 460 mm 4 μm Para a eluiccedilatildeo de gradiente da fase
moacutevel foram considerados dois eluentes O eluente A foi o tampatildeo de formiato de
amocircnio 53 mM preparado em aacutegua deionizada e o eluente B foi uma mistura de
acetonitrila com tampatildeo formiato de amocircnio 53 mM (1090) Ambos eluentes
incluiacuteram aacutecido foacutermico 5 mM O fluxo foi na razatildeo de 1 mLmin (split 03 mlmin em
MS 07 mlmin descarte) A quantificaccedilatildeo dessas toxinas foi feita com o fator de
resposta (aacuterea do pico concentraccedilatildeo da toxina) obtida com a injeccedilatildeo de quantidades
certificadas dos padrotildees das toxinas (ANJOS et al 2006 FRIAS et al 2006)
412 Preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuteria
Foi selecionada para o preparo das soluccedilotildees de extrato de cianobacteacuterias a
amostra que apresentou maior concentraccedilatildeo de cianotoxinas coletadas no
reservatoacuterio de Gargalheiras (amostra nordm 5) O extrato foi obtido conforme Galvatildeo et
al (2009) A amostra foi agitada em voacutertex (Logenreg LSM56-II-VM) por 20 s e
submetida ao banho de ultrassom (UniqueregUSC-1800A) durante 15 min Em
seguida a amostra foi separada em fraccedilotildees de 15 mL e as ceacutelulas foram rompidas
com o auxiacutelio de um sonicador ultrassocircnico (Heat systemsreg XL2020) por um periacuteodo
de 5 min Apoacutes o processo de extraccedilatildeo foram preparadas as soluccedilotildees do extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs utilizando aacutegua destilada como veiacuteculo As
diluiccedilotildees foram realizadas semanalmente estocadas em recipiente de vidro acircmbar
sendo a soluccedilatildeo estoque armazenada em freezer (- 20 ordmC) e as soluccedilotildees de uso em
refrigerador (2 ordmC a 8 ordmC)
42 ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar fecircmeas e machos com idade meacutedia
entre 90 e 100 dias portanto na fase adulta e massa corporal inicial de 180 plusmn 20g
provenientes do bioteacuterio do Centro de Ciecircncias da Sauacutede da UFRN Os animais
foram alojados em gaiolas de polipropileno com tampa de metal medindo 40 x 50 x
42
20 cm por um periacuteodo natildeo inferior a cinco dias antes de serem colocados nas
diferentes situaccedilotildees experimentais mantidos em sala com temperatura ambiente
variando entre (23 ndash 26 ordmC) num ciclo de 12 horas de claroescuro sendo a luz
acesa agraves 600 horas da manhatilde Os animais receberam raccedilatildeo comercial (Labinareg) e
aacutegua ad libitum durante todo o procedimento experimental Os procedimentos
experimentais obedeceram agraves normas do Conselho Brasileiro de Experimentaccedilatildeo
Animal (COBEA) e da Lei nordm 11794 referente agrave eacutetica no uso cientiacutefico de animais em
experimentos Cabe ressaltar que esse projeto foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica
no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (Protocolo nordm 0282010 ANEXO I)
Foram utilizados 40 ratos Wistar fecircmeas para o estudo de desempenho
reprodutivo e embriofetotoxicidade e os machos utilizados para o acasalamento
foram do estoque do bioteacuterio No estudo de dominante letal foram utilizados 36 ratos
Wistar machos no quais foram tratados e 36 ratos fecircmeas para o acasalamento
43 DESEMPENHO REPRODUTIVO E EMBRIOFETOTOXICIDADE
As fecircmeas foram divididas em quatro grupos compostos por 10 animais cada
um Os procedimentos adotados foram acasalamento administraccedilatildeo de aacutegua
destilada ou do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) eutanaacutesia e cesariana das progenitoras coleta de sangue avaliaccedilatildeo dos
fetos avaliaccedilatildeo de desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole
431 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro (duas ratas
fecircmeas com um rato macho em cada caixa) O sucesso do acasalamento foi
avaliado nas primeiras horas do ciclo claro quando as fecircmeas foram removidas das
caixas dos machos e o lavado vaginal foi realizado utilizando soluccedilatildeo salina 09
(figura 2)
43
FIGURA 2- Coleta de lavado vaginal de rata Wistar apoacutes o animal ter ficado durante
uma noite na mesma caixa com um rato macho para acasalamento para obtenccedilatildeo
de esfregaccedilo em lacircmina de microscopia
Para avaliaccedilatildeo da presenccedila de espermatozoides (figura 3) na vagina das
ratas esfregaccedilos vaginais foram analisados por microscopia oacuteptica (Olympus
CX21reg CX21FS1) em objetiva de 40x Outro fator positivo para o sucesso do
acasalamento foi a visualizaccedilatildeo do tampatildeo copulatoacuterio na vagina da fecircmea Esse
tampatildeo eacute uma estrutura formada a partir dos liacutequidos seminais que pode ser visto
macroscopicamente entre 3 e 24 horas apoacutes a copula (SANTOS 2002)
FIGURA 3- Anaacutelise de microscopia oacuteptica (40x) de esfregaccedilo vaginal de ratas
Wistar apoacutes noite de acasalamento As setas indicam os enovelados de
espermatozoides
44
O esfregaccedilo positivo para a presenccedila de espermatozoides ou a visualizaccedilatildeo
do tampatildeo copulatoacuterio indicaram que a fecircmea estava prenha sendo esta separada
em caixa individual e considerado este dia como o dia 0 da gestaccedilatildeo (DG 0) As
fecircmeas que apresentavam esfregaccedilo negativo retornavam para o acasalamento
durante o ciclo escuro ateacute que fosse suficiente o nuacutemero de fecircmeas prenhas por
grupo
432 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
As ratas prenhes foram distribuiacutedas de forma randomizada em 4 diferentes
grupos (10 animaisgrupo) No DG 0 as ratas foram tratadas com 1 mL de aacutegua
destilada (grupo controle) ou com extrato de cianobacteacuterias contendo as seguintes
concentraccedilotildees de MCs 40 100 ou 250 ngkg de peso corpoacutereo (pc)dia Os
tratamentos foram realizados por gavage ou seja por via oral (vo) (Figura 4) com
auxiacutelio de sonda flexiacutevel nordm6 (Embramedreg) A cada 2 dias do DG 0 ao DG 20 o peso
corpoacutereo de cada animal foi mensurado e avaliados os sinais de toxicidade materna
e o consumo de aacutegua e de raccedilatildeo
FIGURA 4- Administraccedilatildeo de aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskg de pcdia) por gavage em ratos Wistar
433 Eutanaacutesia e cesariana das progenitoras
As fecircmeas prenhes de ambos os grupos testes e controle foram submetidas
agrave eutanaacutesia no DG 20 A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada e o
anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via ip (70 mgkg de
pc) Quando o animal apresentou total ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos foi coletada
amostra de sangue por punccedilatildeo cardiacuteaca para as anaacutelises bioquiacutemicas (item 434)
45
Apoacutes a realizaccedilatildeo de destroncamento cervical os cornos uterinos e os ovaacuterios foram
exteriorizados e seus pesos mensurados Dando continuidade o nuacutemero de corpos
luacuteteos referente a cada ovaacuterio foi contado Com uma incisatildeo lateral em toda sua
extensatildeo o uacutetero foi aberto e os fetos foram removidos individualmente Com a
remoccedilatildeo de toda a prole do uacutetero os cornos uterinos direito e esquerdo foram
expostos e os siacutetios de implantaccedilotildees e de reabsorccedilotildees foram contados (Figura 5)
Das progenitoras foram retirados os seguintes oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado e baccedilo Todos foram pesados individualmente Somente o rim
esquerdo e o fiacutegado foram submersos em soluccedilatildeo de formaldeiacutedo a 10 para
posterior anaacutelise histopatoloacutegica
FIGURA 5- Uacutetero graacutevido apoacutes a remoccedilatildeo de todos os fetos A seta da esquerda
indica a presenccedila de uma reabsorccedilatildeo A seta da direita mostra a presenccedila de um
siacutetio de implantaccedilatildeo
434 Coleta de sangue
No iniacutecio da cesariana foi realizado um corte na regiatildeo toraacutecica ateacute que o
coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida a punccedilatildeo cardiacuteaca foi conduzida com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta o sangue foi cuidadosamente transferido para um
tubo tipo falcon de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg
Q222T216) por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das
anaacutelises bioquiacutemicas
46
435 Avaliaccedilatildeo dos fetos
A retirada dos fetos do uacutetero descrito no item 433 foi realizada respeitando
a ordem de cada um deles no uacutetero Na inspeccedilatildeo individual foi mensurada a massa
corpoacuterea do feto e da correspondente placenta Posteriormente foi avaliada
presenccedila ou ausecircncia de alteraccedilotildees macroscoacutepicas como anomalias e
malformaccedilotildees seguindo os paracircmetros conformaccedilatildeo craniana implantaccedilatildeo de
orelhas palato conformaccedilatildeo de cauda e das patas perfuraccedilatildeo anal aleacutem dos sinais
vitais determinando se o feto era nativivo ou natimorto (Figura 6) Tambeacutem foi
mensurado o peso de todos os fetos (peso da ninhada) para cada progenitora
FIGURA 6- Fetos de ratos Wistar nascidos apoacutes 20 dias de gestaccedilatildeo de ratas que
foram tratadas nos experimentos desse trabalho A natimorto e B nativivo
436 Avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo
Durante a realizaccedilatildeo da cesariana (item 433) o desempenho reprodutivo
das ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada ou extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ngkg de pcdia) do DG 0 ao DG 20 foi avaliado de
acordo com nuacutemero de implantaccedilotildees nuacutemero de corpos luacuteteos nuacutemero de
reabsorccedilotildees nuacutemero de fetos vivos e mortos peso fetal peso do uacutetero graviacutedico
peso da placenta peso corporal materno e ganho de peso Com base nesses dados
foram calculados os seguintes paracircmetros para avaliaccedilatildeo do desempenho
reprodutivo
47
Taxa de prenhez = nordm fecircmeas prenhes nordm fecircmeas acasaladas
Taxa de fertilidade = nordm de machos feacuterteis nordm de machos acasalados
Taxa de perdas preacute-implantacionais = (nordm corpos luacuteteos - nordm de implantaccedilotildees)
x 100 nordm de corpos luacuteteos
Taxa de reabsorccedilatildeo = (nordm de reabsorccedilotildees x 100) nordm de implantaccedilotildees
Taxa de perdas poacutes-implantacionais = (nordm de implantaccedilotildees - nordm de fetos vivos)
x 100 nordm de implantaccedilotildees
437 Avaliaccedilatildeo da Embriofetotoxicidade
Apoacutes os estudos do desempenho reprodutivo os fetos de cada progenitora
foram separados em dois grupos para os estudos visceral e esqueleacutetico
4371 Estudo visceral
A metade dos filhotes referentes ao estudo visceral foram acondicionados
em coletor universal previamente identificado contendo soluccedilatildeo de Bouin (150 mL
de soluccedilatildeo saturada de aacutecido piacutecrico 50 mL de aldeiacutedo foacutermico e 10 mL de aacutecido
aceacutetico glacial) por um periacuteodo de 4 dias Apoacutes a fixaccedilatildeo em Bouin os fetos foram
imersos em aacutelcool etiacutelico a 80 por um periacuteodo de 2 dias seguido de aacutelcool etiacutelico a
90 ateacute a realizaccedilatildeo do estudo visceral
O estudo visceral foi realizado conforme o meacutetodo da secccedilatildeo de Wilson
(1965) Assim cada animal seraacute seccionado em cortes finos para que seja possiacutevel
a passagem da luz e portanto a identificaccedilatildeo das estruturas em estudo Os
paracircmetros a serem analisados nesse estudo foram dilataccedilatildeo do ventriacuteculo
anencefalia ausecircncia de medula capilar super numeraacuterio hidrocefalia hemorragia
cerebral palatosquese lingual biacutefida alteraccedilotildees no septo nasal retinocele
microftalmia anoftalmia catarata degeneraccedilatildeo do cristalino arco aoacutertico duplo arco
aoacutertico voltado para o lado direito cardiomegalia comunicaccedilatildeo intra-atrial
comunicaccedilatildeo intra-ventricular destrocardia sinistrocardia ausecircncia de septos
hemorragia em vasos sanguiacuteneos proacuteximos do coraccedilatildeo hemorragia renal e
hemorragia peritoneal no fiacutegado
4372 Estudo esqueleacutetico
Os fetos foram examinados quanto agraves alteraccedilotildees esqueleacuteticas seguindo o
meacutetodo de coloraccedilatildeo proposto por Taylor (1986) Neste meacutetodo metade dos filhotes
48
foram acondicionados em coletor universal previamente identificado contendo
acetona absoluta durante uma noite Na manhatilde seguinte os fetos foram submetidos
ao processo de evisceraccedilatildeo no qual com o auxiacutelio de bisturi (nordm3) foi realizada uma
incisatildeo abdominal perto da cartilagem xifoacuteide por onde foram retirados todos os
oacutergatildeos toraacutecicos e abdominais com o auxiacutelio de pinccedila Apoacutes a evisceraccedilatildeo os
filhotes foram submetidos ao processo de diafanizaccedilatildeo que consistiu em adicionar
os fetos em soluccedilatildeo de hidroacutexido de potaacutessio (KOH) a 08 com o corante alizarina
A finalidade da soluccedilatildeo de KOH 08 eacute de dissolver as estruturas musculares
tornando-as maleaacuteveis e transparentes enquanto a alizarina cora as estruturas
calcificadas Para o preparo desta soluccedilatildeo foi mensurado em balanccedila analiacutetica 08
gramas do hidroacutexido de potaacutessio e posteriormente dissolvido em 100 mL de aacutegua
destilada A adiccedilatildeo da alizarina foi realizada de forma gradativa ateacute que se fosse
obtida uma coloraccedilatildeo roxa bem leve A permanecircncia dos fetos nessa soluccedilatildeo foi por
um periacuteodo natildeo inferior a 4 dias poreacutem a soluccedilatildeo era preparada e trocada
diariamente Logo em seguida os fetos foram imersos em soluccedilatildeo clareadora (aacutelcool
benziacutelicoglicerinaaacutelcool etiacutelico (122)) para a realizaccedilatildeo do estudo esqueleacutetico
Os esqueletos foram examinados sistematicamente da cabeccedila ateacute a cauda
As anaacutelises foram nos seguintes ossos cracircnio esterno veacutertebras costelas
claviacutecula bacia metacarpos e metatarsos falanges anteriores e posteriores
Os ossos da cabeccedila (nasal frontal pariental interpariental occipital
zigomaacutetico fontanelas anteriores e posteriores) foram analisados quanto agrave fusatildeo e agrave
ossificaccedilatildeo reduzida O esterno que normalmente apresenta 6 pontos de
ossificaccedilatildeo (1 manuacutebrio 4 centros esternais e 1 processo xifoide) foi estudado para
as seguintes visualizaccedilotildees esterno biacutefido atrofiado bipartido supranumeraacuterio
rudimentar assimeacutetrico
Apoacutes a anaacutelise do esterno foram analisadas as veacutertebras (7 cervicais 13
toraacutecicas 6 lombares 5 sacrais e 4 ou 5 caudais) e em seguida foram analisados
agenesia vertebral fusatildeo atrofia vertebra bipartida assimetria Com relaccedilatildeo agraves
costelas que nos roedores correspondem ao mesmo nuacutemero de vertebras toraacutecicas
foi verificada a presenccedila de agenesia de costela duplicaccedilatildeo fusatildeo hipoplasia
ondulaccedilatildeo costela extra uni ou bilateral 13ordf costela reduzida
As presenccedilas de hipoplasia eou ossificaccedilatildeo reduzida foram avaliadas nos
ossos da bacia (iliacuteaco iacutesquio e puacutebico) A claviacutecula que deve apresentar-se de
forma simeacutetrica foi analisada quanto a presenccedila de agenesia Para os ossos
49
metacarpos metatarsos e falanges dos membros foram inspecionados quanto
agenesia de falanges fusatildeo de falanges hiperfalangia fusatildeo de metacarpo e de
metatarso
44 ENSAIO DO DOMINANTE LETAL
Neste experimento somente os ratos machos foram tratados administraccedilatildeo
por vo de aacutegua destilada ou de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40
ng de MCskg pcdia) por 52 dias administraccedilatildeo ip por 3 dias de ciclofosfamida
(50 mgkg pcdia) a dois grupos de animais acasalamento com ratas virgens e
eutanaacutesia e cesariana das ratas prenhes para estudo de desempenho reprodutivo
441 Administraccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
Os machos foram divididos em quatro grupos de forma randomizada
contendo 9 animais em cada grupo O grupo 1 (controle negativo CN) foram
expostos a um volume constante de 1 mL de aacutegua destilada por vo (gavage) O
grupo 2 (controle positivo CP) aleacutem da exposiccedilatildeo agrave aacutegua destilada por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg) Aos animais do grupo 3 (teste T) foram
administrados tambeacutem por gavage extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 ng de MCskg de pcdia) e aos animais do grupo 4 (teste e ciclofosfamida TC)
aleacutem da administraccedilatildeo do extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs por vo foi
administrado a ciclofosfamida (Sigmareg)
As administraccedilotildees por gavage ocorreram durante 52 dias (periacuteodo da
gametogecircnese) e durante esse periacuteodo a cada 2 dias o peso corpoacutereo de cada
animal foi mensurado e os sinais cliacutenicos de toxicidade e consumo de aacutegua e raccedilatildeo
avaliados
442 Administraccedilatildeo da ciclofosfamida
A ciclofosfamida (50 mgkg de pcdia) foi administrada aos animais dos
grupos CP e TC por via ip com o auxiacutelio de seringa de 5 mL entre os dias de
tratamento 49-51
443 Acasalamento
O periacuteodo de coacutepula ocorreu entre 10 e 12 horas do ciclo escuro do uacuteltimo dia
de tratamento por gavage dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
50
cianobacteacuterias contendo MCs apoacutes 24 horas da uacuteltima administraccedilatildeo ip da dose de
ciclofosfamida (a somente dois grupos de animais) Cada macho permaneceu com
uma fecircmea virgem em uma mesma caixa durante toda a noite Para a avaliaccedilatildeo do
sucesso copulatoacuterio foi utilizado o mesmo procedimento descrito do item 431
444 Eutanaacutesia dos machos
A massa corpoacuterea de cada animal foi mensurada em balanccedila analiacutetica (HZTreg
MAX 3100G) e o anesteacutesico Tiopental soacutedico (Thiopentasereg) foi administrado por via
ip (70 mgkg de pc) com o auxiacutelio de seringa de 1 mL A eutanaacutesia foi iniciada
somente quando o animal apresentou ausecircncia de estiacutemulos fiacutesicos Com o sucesso
da anestesia e apoacutes realizaccedilatildeo de deslocamento cervical foi realizada uma incisatildeo
na regiatildeo abdominal para que fossem retirados os oacutergatildeos rim esquerdo coraccedilatildeo
pacircncreas fiacutegado baccedilo testiacuteculo e epidiacutedimo esquerdo Durante a eutanaacutesia
tambeacutem foi realizada a coleta de amostras de medula oacutessea (item 451) e de
sangue (item 452)
445 Estudo de desempenho reprodutivo de ratas prenhes de ratos machos
tratados
As fecircmeas prenhes de ratos machos dos grupos CN CP T TC foram
submetidas agrave eutanaacutesia no 20ordm dia de gestaccedilatildeo conforme descrito no item 433
(exceto a descriccedilatildeo da coleta de sangue e retirada de oacutergatildeos pois natildeo foi realizado
esse procedimento)
A avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo de ratas acasaladas com ratos
machos dos grupos CN CP T TC foi realizada segundo paracircmetros descritos no
item 436
45 ENSAIOS HEMATOLOacuteGICOS
Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com amostras de sangue
perifeacuterico e de medula oacutessea (MO) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkg pcdia) por 52
dias Os ensaios hematoloacutegicos foram realizados com a colaboraccedilatildeo da Profa Dra
Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas Lima (DACTUFRN)
51
451 Coleta de amostras de medula oacutessea
A pele da regiatildeo coxofemoral da pata traseira esquerda de cada rato macho
foi removida e o fecircmur exteriorizado para a coleta da MO Antes da coleta foi
retirado todo o tecido muscular adjacente ao fecircmur e com o auxiacutelio de uma tesoura
as duas epiacutefises (superior e inferior) foram removidas com o propoacutesito de expor o
canal da MO A medula oacutessea foi coletada por fricccedilatildeo mecacircnica e lavagem da
cavidade femoral com 1mL de meio de cultura Iscoversquos (Vitrocell Embriolifereg) e a
suspensatildeo celular obtida foi acondicionada em tubo de ensaio previamente
identificado para posteriores anaacutelises (Figura 7)
FIGURA 7- Coleta de amostra de medula oacutessea do fecircmur esquerdo da pata traseira
de um rato Wistar
452 Coleta de amostras de sangue perifeacuterico
No iniacutecio da eutanaacutesia dos machos um corte na regiatildeo toraacutecica foi realizado
ateacute que o coraccedilatildeo fosse visualizado e em seguida conduzida a punccedilatildeo cardiacuteaca com
seringa de 5 mL Apoacutes a coleta aproximadamente 1 mL do sangue foi
cuidadosamente transferido para um frasco contendo aacutecido etilenodiamenoteraceacutetico
disoacutedico (EDTA 15 mgmL [Vertekreg]) O restante do sangue foi adicionado a um
tubo de 15 mL (sem adiccedilatildeo de anticoagulante) e centrifugado (Quimisreg Q222T216)
por 10 min a 15000 rpm para obtenccedilatildeo do soro e realizaccedilatildeo das anaacutelises
bioquiacutemicas
52
Para a contagem de leucoacutecitos e hemaacutecias foi utilizado o meacutetodo manual de
contagem com auxiacutelio de uma cacircmara de Neubauer (Optik Laborreg) e microscoacutepio
oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) Para a determinaccedilatildeo da hemoglobina foi
utilizado o meacutetodo de cianometemoglobina e para anaacutelise de hematoacutecrito a teacutecnica
do micro-hematoacutecrito
453 Contagem dos leucoacutecitos totais da medula oacutessea
A partir da suspensatildeo celular da MO (item 451) do fecircmur esquerdo do rato
macho foi realizada a contagem absoluta das ceacutelulas totais da medula oacutessea com
liacutequido diluidor em hemocitocircmetro de Neubauer Uma aliacutequota de 20microL da
suspensatildeo celular foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL (diluiccedilatildeo
120 vv) de liacutequido de Turk que tem a funccedilatildeo de destruir as hemaacutecias e preservar
as ceacutelulas nucleadas O material foi suavemente homogeneizado e a contagem foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer com o auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico
(400x) O resultado foi expresso em nuacutemero de ceacutelulas x 106 celmL (ceacutelulasmililitro)
454 Preparo do citocentrifugado e realizaccedilatildeo do mielograma
Uma aliacutequota de 20microL da suspensatildeo de ceacutelulas da medula oacutessea foi
empregada para confecccedilatildeo do citocentrifugado e posterior anaacutelise do mielograma
As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm em citocentriacutefuga
secadas ao ar e coradas pelo meacutetodo de Leishmann (Lewis 2006) Apoacutes a
coloraccedilatildeo foi realizado o mielograma que consistiu na contagem diferencial de 500
ceacutelulas por lacircmina de citocentrifugado
455 Contagem dos leucoacutecitos totais e eritroacutecitos do sangue perifeacuterico
Apoacutes a coleta do sangue perifeacuterico (item 452) uma aliacutequota de 20microL do
sangue com EDTA foi adicionada em um tubo de ensaio contendo 400microL de liacutequido
de Turk (diluiccedilatildeo 120 vv) O material foi homogeneizado levemente durante e foi
realizada em hemocitocircmetro de Neubauer em microscoacutepio oacuteptico (400x) A teacutecnica
consiste em determinar o nuacutemero de leucoacutecitos em 1microL de sangue perifeacuterico
A contagem dos eritroacutecitos consistiu na determinaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas
por microlitro (microL) de sangue Para tanto foi pipetado 4 mL de liacutequido diluidor
(formal-citrato) em tubo de ensaio previamente identificado e adicionado 20 microl do
sangue coletado com EDTA (diluiccedilatildeo 1200 vv) O material foi suavemente
53
homogeneizado e sendo preenchida a cacircmara de Neubauer foi realizada a
contagem dos eritroacutecitos no microscoacutepio oacuteptico (Olympus CX21reg CX21FS1) no
aumento de 400x
456 Dosagem de hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito
Para a dosagem de hemoglobina foi utilizado o meacutetodo de
cianometemoglobina o qual tem como base a diluiccedilatildeo do sangue colhido com EDTA
em soluccedilatildeo contendo cianeto e ferricianeto de potaacutessio Em um tubo de ensaio foi
pipetado 5 mL de soluccedilatildeo de Drabkin e adicionado 20 microL do sangue perifeacuterico
coletado com EDTA O tubo foi levemente homogeneizado e ficou em repouso
durante 10 minutos em temperatura ambiente Durante o periacuteodo de repouso
ocorreu a conversatildeo da hemoglobina metehemoglobina (Met-Hb) e
caboxihemoglobina (HbCO) em cianometehemoglobina (HiCN) Apoacutes tal periacuteodo foi
realizada a leitura da absorbacircncia das amostras em espectrofotocircmetro (540 nm)
(Bioespectroreg PS22)
A determinaccedilatildeo do hematoacutecrito consiste em medir o volume de eritroacutecitos em
relaccedilatildeo ao volume total de sangue A teacutecnica utilizada foi a de micro-hematoacutecrito em
que um tubo capilar foi preenchido ateacute 23 de seu volume com sangue perifeacuterico
coletado com EDTA selado e colocado em centriacutefuga de micro-hematoacutecrito
(AAKERreg SPIN1000) durante 5 min a 11500 rpm A leitura foi realizada em cartatildeo
de leitura de hematoacutecrito
46 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA
Como descrito no item 433 foram coletado rim esquerdo fiacutegado coraccedilatildeo
baccedilo pacircncreas durante a eutanaacutesia das progenitoras Durante a eutanaacutesia dos
machos aleacutem desses oacutergatildeos citados foram coletados tambeacutem o epidiacutedimo
esquerdo e o testiacuteculo (item 444) A avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica foi realizada em
colaboraccedilatildeo com a Profa Claacuteudia Nunes de Oliveira (Departamento de
PatologiaUFRN) Os oacutergatildeos fiacutegado e rim esquerdo (progenitoras tratadas ou natildeo) e
fiacutegado rim esquerdo testiacuteculo e epidiacutedimo (machos tratados ou natildeo) foram
cuidadosamente removidos durante o processo de eutanaacutesia e individualmente
aferido o peso em balanccedila analiacutetica (HVTreg) O peso de cada oacutergatildeo foi relacionado
com o peso corpoacutereo de cada rato no dia da eutanaacutesia e assim foi determinado a
razatildeo do peso do oacutergatildeo (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no dia da eutanaacutesia) Os
54
fragmentos dos oacutergatildeos coletados foram acondicionadas em recipiente plaacutestico
(coletor universal esteacuteril) com formaldeiacutedo a 10 Os fragmentos foram incluiacutedos em
parafina laminados a 45 micra e corados em hematoxilina-eosina Os criteacuterios
analisados para avaliar as possiacuteveis lesotildees toacutexicas no fiacutegado foram apoptose
necrose esteatose hematopoiese e corpuacutesculo Mallory Para o rim esquerdo foi
avaliado a presenccedila ou ausecircncia de congestatildeo nefrite intersticial crocircnica necrose
tubular aguda No testiacuteculo foram analisados fibrose e espermatogecircnese e no
epidiacutedimo apenas a sua estrutura geral
47 DOSAGENS BIOQUIacuteMICAS
As anaacutelises bioquiacutemicas foram realizadas em colaboraccedilatildeo com a Profa Dra
Telma Maria Arauacutejo Moura Lemos (DACTUFRN) Como descrito no item 434 e
452 o sangue foi coletado por punccedilatildeo cardiacuteaca e apoacutes a formaccedilatildeo do coaacutegulo foi
centrifugado a 15000 rpm O soro entatildeo foi aliacutequotado e refrigerado em freezer (- 20
ordmC) Para as dosagens bioquiacutemicas os paracircmetros analisados foram ureia
creatinina AST e ALT Para a anaacutelise da ureia AST e ALT o kit utilizado foi da
Biosistemsreg A metodologia utilizada para essas anaacutelises foi por meacutetodo cineacutetico em
que o reagente de trabalho foi preacute-aquecido a 37degC em banho maria
(Hemoquiacutemicareg HM1003) e 1 mL deste reagente foi adicionado a 50 microl da amostra
(AST e ALT) e 10 microl (ureia) Apoacutes 1 minuto foi realizada a leitura da absorbacircncia das
amostras em espectrocircmetro (Bioplusreg Bio2000) com comprimento de onda de 340
nm (AST e ALT) e 500 nm (ureia) Para a anaacutelise da creatinina o kit utilizado foi o Bio
Liquidreg (LaborClin) adicionando-se 1 mL de reagente de trabalho para 1 microL de soro
A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrocircmetro com comprimento de onda
de 340 nm Com os valores das absorbacircncias obtidos para cada amostra foram
obtidos os valores para cada paracircmetro seguindo as recomendaccedilotildees de cada
fabricante dos kits
48 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Para realizar a anaacutelise dos resultados parciais foi utilizada a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) para testar se existiam diferenccedilas estatiacutesticas significativas entre
os grupos de animais tratados com aacutegua destilada e os dos animais tratados com o
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs considerando o valor de plt005
Como meacutetodo complementar foi aplicado o teste de comparaccedilotildees muacuteltiplas Tukey-
Kramer para avaliar a existecircncia de diferenccedila estatiacutestica entre as meacutedias
55
5 RESULTADOS
51 IDENTIFICACcedilAtildeO DE CIANOTOXINAS
Foram coletadas trinta e sete amostras de aacutegua de reservatoacuterios do Rio
Grande do Norte Somente 13 amostras apresentaram positividade para
cianotoxinas no ELISA as quais foram submetidas a anaacutelises de
identificaccedilatildeoquantificaccedilatildeo de cianotoxinas (MCs CYN SAX NOD e ANA) por LC-
MSMS e de HILIC-FD (Tabela 4) Tambeacutem foi realizada anaacutelise microscoacutepica para
identificaccedilatildeo das cianobacteacuterias predominantes dessas 13 amostras (Tabela 5)
A amostra selecionada para preparo do extrato bruto de cianobacteacuterias foi a
de nordm 5 por ter apresentado a maior concentraccedilatildeo total de MCs (5186 ngmL) Foi
observada a presenccedila das seguintes variantes de MCs nesse extrato -RR (1415) -
LR (1247) -YR (108) -LA (322) -RA ou AR (164) -FR (1641) -FA (289) (Tabela
4) Cabe salientar que cada variante de MC possui um grau de toxicidade diferente
sendo a mais toacutexica dessas a variante MC-LR
A Figura 8 apresenta um cromatograma da anaacutelise de LC-MS do extrato de
cianobacteacuterias utilizado na exposiccedilatildeo dos animais nesse trabalho e os espectros de
massas obtidos nessas anaacutelises de acordo com a relaccedilatildeo massacarga (MZ)
caracteriacutestica de cada MC identificada
56
TABELA 4- Resultados das anaacutelises de MCs (-RR -LR -YR -LA -RA -AR -FR -FA) cilindrospermopsina anatoxina-a e
noduralina nas amostras coletadas em diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte analisadas por LC-MSMS e por HILIC-FD
Nordm da Amostra
(ng de cianotoxinamL de aacutegua)
MC-RR MC-LR MC-YR MC-LA MC-RA ou AR
MC-FR MC-FA CYN NOD ANA Total
4 067 040 028 ND ND ND ND ND ND ND 135 5 1415 1247 108 322 164 1641 289 ND ND ND 5186 6 059 059 ND ND ND ND ND ND ND ND 117 14 ND 054 037 ND ND ND ND ND ND ND 091 16 ND 118 ND ND ND ND ND ND ND ND 118 17 ND 056 ND D ND ND ND ND ND ND 056 20 060 026 018 ND ND ND ND ND ND ND 105 26 ND 028 ND ND ND ND ND ND ND ND 028 27 ND 022 ND ND ND ND ND ND ND ND 022 28 ND 082 ND ND ND ND ND ND ND ND 082 29 ND 027 ND ND ND ND ND ND ND ND 027 32 ND 134 ND ND ND ND ND ND ND ND 134 33 ND 145 ND ND ND ND ND ND ND ND 145
equivalentes a LR equivalentes a LA MC-RR Arginina Arginina MC-LR Leucina-Arginina MC-YR Tirosina-Arginina MC-LALeucina-Alanina MC-RA Argenina-Alanina MC-AR Alanina-Arginina MC-FR Fenilalanina-Arginina MC-FA Fenilalanina-Alanina CYN Cilindrospermopsina NOD Nodularinas ANA Anatoxina ND natildeo detectado
57
TABELA 5- Resultados da identificaccedilatildeo das espeacutecies de cianobacteacuterias predominantes nas amostras de aacutegua coletadas em
diferentes reservatoacuterios do Rio Grande do Norte por anaacutelise de microscopia oacuteptica
Nordm DA AMOSTRA LOCAL E DATA DE COLETA ESPEacuteCIES DE CIANOBACTEacuteRIAS
4 Gargalheiras (Julho2009) Microcystis novacekii Sphaerocavum brasiliense Aphanocapsa
delicatiacutessima
5 Gargalheiras (Setembro2009) S brasiliense Coelosphaerium evid Margin A delicatiacutessima
6 Gargalheiras (Novembro2009) M aeruginosa S brasiliense A delicatiacutessima
14 Itajaacute (Julho2009) M aeruginosa S brasiliense
16 Itajaacute (Junho2010) Cylindrospermopsis raciborskii Planktotrix agardhii S brasiliense
17 Itajaacute (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
20 Itajaacute (Setembro2009) C raciborskii Planktolyngbya minor M aeruginosa M panniformis
26 Satildeo Rafael (Maio2010) C raciborskii S brasiliense Merismopedia tenuiacutessima
27 Satildeo Rafael (Junho2010) C raciborskii P agardhii M aeruginosa
28 Satildeo Rafael (Agosto2010) C raciborskii P agardhii
29 Passagem das Traiacuteras
(Agosto2010)
C raciborskii M aeruginosa
32 Itajaacute (Setembro2010) C raciborskii P agardhii S brasiliense
33 Satildeo Rafael (Setembro2010) C raciborskii S brasiliense P agardhii
58
00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min]0
1
2
3
6x10
Intens
5_1-7_01_181d EIC 5200 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9955 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10455 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9105 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 9445 +All MS Smoothed (0943GA) 5_1-7_01_181d EIC 9535 +All MS Smoothed (0943GA)
5_1-7_01_181d EIC 10295 +All MS Smoothed (0943GA)
RR LR
FR
AR
RA LA FAYR
A
9958
11007
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 mz
4544
5201
5314
5424 5701 6081 6394 67386897
+MS
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
400 450 500 550 600 650 mz
9519
9798
10057
10457
10757 11380 11848
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
10098
10297
10687
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
900 950 1000 1050 1100 1150 1200 mz
9107
9327
9486 9697
+MS -Spectral Bkgrnd
0
10
20
30
Intens
[]
840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 mz
9537
9878
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
700 800 900 1000 1100 1200 mz
9107 9247
9447
9667
9837
10057
10243
+MS -Spectral Bkgrnd
0
20
40
60
80
100
Intens
[]
880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 mz
MC-FA
[M+H]+ 9447
[M+Na]+ 9667
MC-LA
[M+H]+ 9107
[M+Na]+ 9327
MC-FR
[M+H]+ 10297
MC-AR ou RA
[M+H]+ 9537
MC-RR
[M+2H]2+ 5201
MC-YR
[M+H]+ 10457
MC-LR
[M+H]+ 9958
B C
D E
GF
H
FIGURA 8- Anaacutelise por LC-MS do extrato bruto de cianobacteacuterias utilizado nos
ensaios A Cromatograma B-H Espectros de massas especiacuteficos referentes agraves
microcistinas identificadas no extrato
59
52 AVALIACcedilAtildeO DO DESEMPENHO REPRODUTIVO DE RATAS PRENHES E DA
EMBRIOFETOTOXICIDADE DE SUA PROLE
Ratas prenhes foram tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia)
durante 20 dias de gestaccedilatildeo No DG 20 esses animais foram sacrificados e seu
desempenho reprodutivo foi avaliado
A tabela 6 mostra iacutendices reprodutivos (meacutedia plusmn erro padratildeo) dos corpos
luacuteteos implantaccedilotildees reabsorccedilotildees e nuacutemero de fetos vivos avaliados durante a
cesariana nas progenitoras no DG 20 Os dados estatiacutesticos mostraram que natildeo
houve alteraccedilatildeo significativas entre os iacutendices reprodutivos de ratas prenhes
tratadas por vo com aacutegua destilada e ratas prenhes expostas ao extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo
TABELA 6- Iacutendices reprodutivos de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Iacutendices reprodutivos Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Nordm de corpos luacuteteos 1120 plusmn 083 960 plusmn 151 980 plusmn 060 1150 plusmn 109
Nordm de implantaccedilotildees 1020 plusmn 091 940 plusmn 063 970 plusmn 052 1050 plusmn 178
Nordm de reabsorccedilatildeo 060 plusmn 026 020 plusmn 015 028 plusmn 018 050 plusmn 033
Nordm de fetos vivos 962 plusmn 097 880 plusmn 081 828 plusmn 068 975 plusmn 179 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
As taxas de preacute-implantaccedilatildeo de poacutes-implantaccedilatildeo e de reabsorccedilatildeo foram
obtidas com base nos valores dos iacutendices reprodutivos os quais estatildeo apresentados
na tabela 7 Esta tabela mostra que os resultados estatiacutesticos apresentaram valores
similares quando comparados o grupo de animais que soacute receberam aacutegua destilada
(controle) com os diferentes grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) O p value para a
taxa de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo foi de 049 063 e
040 respectivamente por ANOVA
60
TABELA 7- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo de ratas
prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20
dias de gestaccedilatildeo
Taxa () Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Preacute-implantaccedilatildeo 970 plusmn 353 1320 plusmn 1039 11 plusmn 197 25 plusmn 246
Reabsorccedilatildeo 650 plusmn 279 448 plusmn 255 331 plusmn 221 18 plusmn 17
Poacutes-implantaccedilatildeo 715 plusmn 245 67 plusmn 387 151 plusmn 120 930 plusmn 518 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
Na anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo natildeo foi observada malformaccedilatildeo
esqueleacutetica nesses fetos quando comparados com a avaliaccedilatildeo do esqueleto dos
fetos gerados pelas ratas do grupo controle (aacutegua destilada) (tabela 8)
61
TABELA 8- Anaacutelise esqueleacutetica da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
Na anaacutelise visceral tambeacutem natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo dos oacutergatildeos
analisados dos fetos cujas progenitoras foram tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias
quando comparados com a anaacutelise visceral dos fetos gerados pelas ratas do grupo
controle (aacutegua destilada) (tabela 9)
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia 40 100 250
Fusatildeo ossos cracircnio 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo frontalparietal reduzida 016 027 024 018 Esterno ossificaccedilatildeo reduzida 016 027 024 018 Esterno bipartido 016 027 024 018 Esterno atrofiado 016 027 024 018 Esterno supranumeraacuterio 016 027 024 018 Esterno rudimentar 016 027 024 018 Esterno assimeacutetrico 016 027 024 018 Agenesia de veacutertebra 016 027 024 018 Fusatildeo de veacutertebra 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida d e veacutertebra 016 027 024 018 Veacutertebra bipartida 016 027 024 018 Veacutertebra assimeacutetrica 016 027 024 018 Agenesia de costela 016 027 024 018 Fusatildeo de costela 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida de costela 016 027 024 018 Duplicaccedilatildeo de costela 016 027 024 018 Hipoplasia de costela 016 027 024 018 13ordf costela reduzida 016 027 024 018 Agenesia de falange 016 027 024 018 Fusatildeo de falanges 016 027 024 018 Hiperfalangia 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metacarpo 016 027 024 018 Ossificaccedilatildeo reduzida do metatarso 016 027 024 018 Fusatildeo do metatarso 016 027 024 018 Hipoplasia de bacia 016 027 024 018 Agenesia de claviacutecula 016 027 024 018
62
TABELA 9- Anaacutelise visceral da prole de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
53 AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE MATERNA
A Tabela 10 apresenta a mensuraccedilatildeo diaacuteria (meacutedia plusmn erro padratildeo) do peso
corpoacutereo das ratas prenhes pertencentes aos diferentes grupos avaliados Foram
comparados o ganho de peso corpoacutereo de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) e com o das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) do DG2 ao DG20
em intervalos de 2 dias Os resultados mostraram que a administraccedilatildeo da soluccedilatildeo
Paracircmetros esqβ Nordm de fetosɵ
Controle
ng de MCskg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Dilataccedilatildeo do ventriacuteculo 033 036 054 024 Anencefalia 033 036 054 024 Ausecircncia de medula 033 036 054 024 Capilar super numeraacuterio 033 036 054 024 Hidrocefalia 033 036 154 024 Hemorragia cerebral 033 036 054 024 Palatosquese 033 036 054 024 Lingual biacutefida 033 036 054 024 Alteraccedilotildees no septo nasal 033 036 054 024 Retinocele 033 036 054 024 Microftalmia 033 036 054 324 Anoftalmia 033 036 054 024 Catarata 033 036 054 024 Degeneraccedilatildeo do cristalino 033 036 054 124 Arco aortico duplo 033 036 054 024 Arco aortico voltado para o lado direito 033 036 054 024 Cardiomegalia 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-atrial 033 036 054 024 Comunicaccedilatildeo intra-ventricular 033 036 054 024 Destrocardia 033 036 054 024 Sinistrocardia 033 036 054 024 Ausecircncia de septos 033 036 054 024 Hemor vasos sang proacuteximos do corα 033 136 154 124 Hemorragia renal 033 036 054 024 Hemorragia peritoneal (fiacutegado) 033 036 054 024 Assimetria entre os globos oculares 033 036 154 214 Hidropsia corporal 033 036 154 024 βParacircmetros esqueleacuteticos
ɵ Nuacutemero de fetos analisados
α Hemorragia em vasos sanguiacuteneos do
coraccedilatildeo
63
de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
durante a gestaccedilatildeo natildeo causou diferenccedila estatiacutestica de ganho de peso corporal
(pgt005 ANOVA) quando comparado com o ganho de peso das ratas prenhes do
grupo controle
TABELA 10- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Dia Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
2ordm 225 plusmn 110 72 plusmn 186 585 plusmn 141 350 plusmn 167
4ordm 900 plusmn 130 1020 plusmn 092 1200 plusmn 133 950 plusmn 161
6ordm 1175 plusmn 130 1100 plusmn 120 13 85 plusmn 132 1100 plusmn 192
8ordm 1425 plusmn 211 1460 plusmn 130 1500 plusmn 127 1562 plusmn 156
10ordm 2000 plusmn 205 2040 plusmn 137 1542 plusmn 211 2050 plusmn 201
12ordm 2325 plusmn 187 2440 plusmn 110 2514 plusmn 207 2587 plusmn 254
14ordm 3137 plusmn 254 3080 plusmn 187 3085 plusmn 381 3275 plusmn 308
16ordm 3912 plusmn 325 3480 plusmn 187 3957 plusmn 309 4037 plusmn 227
18ordm 5237 plusmn 381 4900 plusmn 372 5700 plusmn 695 5162 plusmn 393
20ordm 6912 plusmn 417 6600 plusmn 463 6871 plusmn 400 6987 plusmn 576 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
A figura 9 mostra um aumento do peso corporal ao longo dos dias
gestacionais para as ratas prenhes de todos os grupos estudados mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa quando comparados o ganho de peso durante 20
dias de gestaccedilatildeo das ratas prenhes do grupo controle (aacutegua destilada) com o das
ratas prenhes tratadas por vo com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs
(40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
64
FIGURA 9- Ganho de massa corporal (g) de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os
valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de intervalos de 2 dias para 8 animais
por grupo P gt005 como indicado por ANOVA
O estudo do consumo relativo de aacutegua e raccedilatildeo (tabela 11) tambeacutem natildeo
mostrou diferenccedilas estatiacutesticas significantes (p= 04 e p= 008 respectivamente
ANOVA) entre o consumo das ratas prenhes dos grupos tratados com soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia)
quando comparados com o das ratas prenhes do grupo controle Os valores (meacutedia
plusmn EP) foram obtidos a partir da mensuraccedilatildeo diaacuteria do consumo de raccedilatildeo (g) e
ingestatildeo de aacutegua (mL) durante o periacuteodo gestacional (20 dias)
65
TABELA 11- Ingestatildeo hiacutedrica e consumo de raccedilatildeo de ratas prenhes tratadas por vo
com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Consumo de aacutegua (mL) 607 plusmn 262 652 plusmn 512 575 plusmn 309 568 plusmn 295
Consumo de raccedilatildeo (g) 331 plusmn 067 362 plusmn 275 305 plusmn 079 306 plusmn 093 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo foram avaliados os valores do peso relativo de alguns
oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas
por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de
gestaccedilatildeo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica para o peso relativo dos oacutergatildeos das ratas prenhes tratadas com essa
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias (p gt005 ANOVA) quando comparado
com o dos animais do grupo controle (tabela 11) Os valores da Tabela 12 foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo de cada oacutergatildeo e dividindo o peso do oacutergatildeo pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe no DG 20
TABELA 12- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo no 20ordm dia
de gestaccedilatildeo) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Razatildeo (POPC)β
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Fiacutegado 0039 plusmn 0001 0038 plusmn 00014 0038 plusmn 00009 0044 plusmn 00024
Rim esqɵ 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00003 0002 plusmn 00004 00003 plusmn 00002
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0001 plusmn00001 0001 plusmn 00001 00014 plusmn 00001
Baccedilo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0001 plusmn 00001 00022 plusmn 00001 Coraccedilatildeo 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 0002 plusmn 00001 00027 plusmn 00001
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo β
Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
ɵ Rim esquerdo
A tabela 13 apresenta os valores da massa absoluta dos ovaacuterios e o peso
relativo do uacutetero graviacutedico oacutergatildeos do sistema reprodutivo feminino das ratas
prenhes em estudo Ao comparar esses resultados foi observado que natildeo houve
66
diferenccedila estatiacutestica para a massa absoluta dos ovaacuterios e o peso relativo do uacutetero
graviacutedico das ratas prenhes tratadas com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) (p= 04 e p= 02 respectivamente ANOVA)
quando comparado com os dos animais do grupo controle (tabela 13) A razatildeo do
peso do uacutetero graviacutedico foi obtida a partir da divisatildeo do seu peso absoluto pelo peso
corpoacutereo da rata prenhe apresentado no 20ordm dia de gestaccedilatildeo
TABELA 13- Massa absoluta e peso relativo dos oacutergatildeos reprodutores femininos
(ovaacuterio e uacutetero respectivamente) de ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua
destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo
MCs (40 100 ou 250 ng de MCsKgdia) durante 20 dias de gestaccedilatildeo
Oacutergatildeo Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Uacutetero graviacutedico 0011 plusmn 00005 0011 plusmn 0001 0013 plusmn 00008 0012 plusmn 00007
Ovaacuterios (g) 011 plusmn 00100 013 plusmn 00371 014 plusmn 00264 018 plusmn 00176 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA
54 AVALIACcedilAtildeO DE PARAcircMETROS BIOQUIacuteMICOS DAS RATAS PRENHES
A tabela 14 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas no DG 20 de ratas prenhes tratadas com aacutegua destilada (grupo
controle) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 100 ou 250 ng de
MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados
foram ureia creatinina ALT e AST Foi observada diferenccedila estatiacutestica na dosagem
da ureia das ratas prenhes tratadas com 40 e 100 ng de MCsKgdia e da creatinina
de todos os grupos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs quando comparados com as ratas prenhes do grupo controle
67
TABELA 14- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos (ureia creatinina ALT e AST) de
ratas prenhes tratadas por vo com aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de
extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante
20 dias de gestaccedilatildeo
Paracircmetros Bioquiacutemicos
Controle
ng de MCsKg de peso corpoacutereodia
40 100 250
Ureia 678 plusmn 350 442 plusmn 205 520 plusmn 260 610 plusmn 438 Creatinina 06 plusmn 048 03 plusmn 002 03 plusmn 001 04 plusmn 001 AST 1351 plusmn 140 870 plusmn 106 1318 plusmn 166 1458 plusmn 264 ALT 515 plusmn 15 530 plusmn 20 508 plusmn 32 480 plusmn 18
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 8 animais por grupoplt001
plt00001quando
comparados com o grupo controle como indicado por ANOVA
55 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DAS RATAS PRENHES
A figura 10 mostra fotos de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com
porccedilotildees teciduais de fiacutegado e rim coletados de ratas prenhes tratadas por vo com
aacutegua destilada (grupo controle) ou soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo 40 100 ou 250 ng de MCsKgdia durante 20 dias de gestaccedilatildeo
68
]]]
FIGURA 10- Cortes histopatoloacutegicos (10 X) de amostras de fiacutegado (A-D) e de rim (E-H) de ratas prenhes tratadas por vo durante
20 dias de gestaccedilatildeo com aacutegua destilada (A e E) ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo 40 (B e F) 100 (C e G) ou 250 (D e H)
ng de MCsKgdia As setas indicam focos de hematopoese extramedular (A-D) e as ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
(E-H)
69
56 AVALIACcedilAtildeO DA FERTILIDADE DE RATOS MACHOS
Na avaliaccedilatildeo da fertilidade de ratos machos esses animais foram tratados por
vo com aacutegua destilada (grupo controle negativo (grupo CN)) ou soluccedilatildeo de extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia (grupo Teste (grupo T))
durante 52 dias (fase da espermatogecircnese) O grupo controle positivo (grupo CP)
recebeu ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Jaacute o grupo teste e ciclofosfamida (grupo TC) recebeu por vo
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia
durante 52 dias e ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip por 3 dias da fase de
espermatogecircnese Apoacutes cada rato macho tratado emprenhar uma rata fecircmea ele
foi submetido agrave eutanaacutesia e amostras foram coletadas para anaacutelises
Cada fecircmea prenha de um rato macho tratado com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias com ou sem tratamento com ciclofosfamida foi submetida agrave
eutanaacutesia no DG 20 e o desempenho reprodutivo foi avaliado (figura 11)
Os resultados apresentados na figura 11 mostram diferenccedilas estatiacutesticas
significativas nas taxas de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo das fecircmeas prenhes de
ratos machos do grupo CP e do grupo TC quando comparadas com as taxas das
fecircmeas prenhes de ratos machos do grupo CN e do grupo T Jaacute a taxa de preacute-
implantaccedilatildeo apresentou valores estatiacutesticos similares (p= 08 ANOVA seguido do
teste de Tukey-Kramer) quando comparado entre os grupos estudados
70
FIGURA 11- Taxas de preacute-implantaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo e de poacutes-implantaccedilatildeo dos
ratos fecircmeas acasalados com ratos machos expostos a aacutegua destilada (grupo CN)
ou ao extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de MCsKgdia durante 52
dias Alguns animais machos ainda receberam ciclofosfamida (50 mgKgdia) via ip
por 3 dias (grupos CP e TC) Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9
animais por grupo plt005 quando comparados com o grupo controle negativo CN
grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) CP grupo Controle Positivo (aacutegua
destilada e ciclofosfamida) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias) TC grupo Teste e Ciclofosfamida (soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias e ciclofosfamida)
57 AVALIACcedilAtildeO DE TOXICIDADE DOS RATOS MACHOS
A Tabela 15 mostra o aumento do peso corporal durante os 52 dias de
tratamento dos ratos machos para todos os grupos estudados (CN e T) mas sem
diferenccedila estatiacutestica significativa (pgt005 ANOVA) quando comparados o aumento
do peso corporal dos animais do grupo teste com os animais do grupo controle
Os valores da tabela 15 representam as meacutedias (plusmn erro padratildeo) e foram
obtidos a partir da mensuraccedilatildeo a cada 4 dias entre o D4 e o D52
71
TABELA 15- Ganho de peso (g) dos ratos machos tratados por vo com aacutegua
destilada (grupos CN) ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo 40 ng de
MCsKgdia (grupos T durante 52 dias
Dia Grupo CN Grupo T
4ordm 15 plusmn 24 51 plusmn 11
8ordm 06 plusmn 24 56 plusmn 12
12ordm 22 plusmn 26 100 plusmn 15
16ordm 74 plusmn 30 146 plusmn 21
20ordm 105 plusmn 31 181 plusmn 21
24ordm 161 plusmn 32 267 plusmn 21
28ordm 254 plusmn 36 302 plusmn 25
32ordm 265 plusmn 35 334 plusmn 21
36ordm 308 plusmn 65 373 plusmn 23
40ordm 355 plusmn 41 403 plusmn 29
44ordm 345 plusmn 37 442 plusmn 19
48ordm 413 plusmn 36 485 plusmn 23
52ordm 412 plusmn 37 482 plusmn 29 Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo p gt005 como indicado por ANOVA CN grupo Controle Negativo (aacutegua destilada) T grupo Teste (soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias)
A ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo ao longo do periacuteodo de exposiccedilatildeo
nos diferentes grupos de ratos machos estudados estatildeo apresentados na tabela 16
Foi observada que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt 005 ANOVA) entre a
ingestatildeo hiacutedrica dos animais do grupo teste (grupo T) quando comparado com os
animais do grupo controle negativo (grupo CN)
TABELA 16- Ingestatildeo hiacutedrica e o consumo de raccedilatildeo durante os 52 dias de
tratamento por vo dos ratos machos com aacutegua destilada (grupo controle) ou com
uma soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCsKgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo
No 52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCsKgdia) tratados ou natildeo com
Consumo Controle 40 ng de MCsKgdia
Aacutegua (mL) 1339 plusmn 32 1190 plusmn 06
Raccedilatildeo (g) 747 plusmn 31 712 plusmn 14
72
ciclofosfamida (50 mgKgdia) por 5 dias esses animais foram mantidos com ratas
fecircmeas virgens natildeo tratadas Apoacutes o periacuteodo de coacutepula os ratos machos foram
submetidos agrave eutanaacutesia e a razatildeo do peso de alguns oacutergatildeos (fiacutegado rim esquerdo
pacircncreas baccedilo e coraccedilatildeo) pelo peso corpoacutereo no 52ordm dia foi avaliada A Tabela 17
mostra que a razatildeo do peso dos oacutergatildeospeso corpoacutereo dos ratos machos tratados
com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria (40 ng de MCsKgdia) quando
comparado com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) natildeo apresentou
diferenccedila significante estatisticamente (pgt005 ANOVA)
TABELA 17- Peso relativo dos oacutergatildeos (peso do oacutergatildeo peso corpoacutereo do macho) no
52ordm dia de tratamento dos ratos machos com aacutegua destilada ou extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
Rim esquerdo
A tabela 18 apresenta os valores do peso relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo
oacutergatildeos do sistema reprodutivo masculino dos ratos machos tratados nesse estudo
Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica (pgt005 ANOVA) para o peso
relativo do testiacuteculo e do epidiacutedimo dos ratos machos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparado com os dos
animais do grupo controle (tabela 17) A razatildeo do peso desses oacutergatildeos foi obtida a
partir da divisatildeo do peso absoluto de cada tipo de oacutergatildeo pelo peso corpoacutereo do rato
macho apresentado no 52ordm dia de tratamento
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Fiacutegado 003 plusmn 00003 003 plusmn 0001
Rim esq 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00001
Pacircncreas 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Baccedilo 0001 plusmn 00001 0002 plusmn 00001
Coraccedilatildeo 0003 plusmn 00001 0003 plusmn 00002
73
TABELA 18- Razatildeo do peso dos oacutergatildeos reprodutivos masculinospeso corpoacutereo
(POPC) dos ratos machos apoacutes 52 dias de tratamento com aacutegua destilada (grupo
controle) ou com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de
MCskgdia)
Os valores estatildeo apresentados como meacutedia plusmn EP de 9 animais por grupo Razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo do rato
58 AVALIACcedilAtildeO BIOQUIacuteMICA DOS RATOS MACHOS
A figura 12 mostra os resultados das dosagens bioquiacutemicas de amostras de
soro obtidas de ratos machos tratados por vo com aacutegua destilada (grupo controle)
ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) durante 52
dias Os paracircmetros bioquiacutemicos avaliados foram ureia creatinina ALT e AST No
entanto a figura 12 mostra apenas os valores obtidos para os marcadores
hepaacuteticos uma vez que os marcadores renais seratildeo refeitos Podemos entatildeo
observar que natildeo existiu alteraccedilatildeo estatiacutestica entre os animais tratados com extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) quando comparados
com os animais do grupo controle (aacutegua destilada) (figura12)
Razatildeo (POPC) Controle 40 ng de MCskgdia
Testiacuteculo 0004 plusmn 00001 0004 plusmn 00002
Epidiacutedimo 0001 plusmn 00001 0001 plusmn 00001
74
FIGURA 12- Avaliaccedilatildeo de paracircmetros bioquiacutemicos dos ratos machos tratados por
vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng de
MCskgdia) durante 52 dias
59 AVALIACcedilAtildeO HEMATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
Foram coletadas tambeacutem amostras de medula oacutessea de fecircmur e de sangue
cardiacuteaco dos ratos machos apoacutes tratamento por 52 dias com aacutegua destilada ou com
extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia) para avaliaccedilatildeo
hematoloacutegica A tabela 19 mostra os resultados dos paracircmetros hematoloacutegicos
(concentraccedilatildeo de leucoacutecitos na medula oacutessea e no sangue perifeacuterico hematoacutecrito
hemoglobina eritroacutecitos) analisados em amostras de medula oacutessea ou de sangue
cardiacuteaco coletados durante a eutanaacutesia dos ratos machos utilizados no ensaio do
dominante letal Foi observado que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica entre os grupos
estudados
75
TABELA 19- Avaliaccedilatildeo dos paracircmetros hematoloacutegicos dos ratos machos tratados
por vo com aacutegua destilada ou extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 ng
de MCskgdia) durante 52 dias
Leucoacutecito da medula oacutessea
Leucoacutecitos de sangue perifeacuterico
510 AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DOS RATOS MACHOS
A figura 13 obtidas de lacircminas histopatoloacutegicas confeccionadas com porccedilotildees
teciduais de fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo coletados durante a eutanaacutesia dos
ratos machos apoacutes o periacuteodo de coacutepula tratados durante 52 dias por vo com aacutegua
destilada ou extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)
Paracircmetros Hematoloacutegicos Controle 40 ng de MCskgdia
Leucoacutecito MO (x106 celmL) 3100 plusmn 030 2600 plusmn 026
Leucoacutecito SP (nordm de cel microL) 1028 plusmn 19863 2188 plusmn 59833
Hematoacutecrito () 1028 plusmn 136 2188 plusmn 090
Hemoglobina (gdL) 321 plusmn 040 315 plusmn 026
Eritroacutecitos (x106microL) 321 plusmn 020 315 plusmn 006
76
FIGURA 13- Corte histopatoloacutegico (10X) do fiacutegado de ratos machos tratados com aacutegua destilada (A) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(B) As setas mostram pequenos focos de hematopoese extramedular Corte
histopatoloacutegico (10X) do rim esquerdo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (C) soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(D) As setas mostram ceacutelulas tubulares sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas Corte
histopatoloacutegico (10X) do epidiacutedimo de ratos machos tratados com aacutegua destilada (E) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(F) Corte histopatoloacutegico (10X) do testiacuteculo de ratos machos tratados com aacutegua destilada
(G) soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 ng de MCskgdia)(H) As figuras E F G e H mostram as
diferentes ceacutelulas sem alteraccedilotildees morfoloacutegicas
77
6 DISCUSSAtildeO
As principais vias de exposiccedilatildeo agrave cianotoxinas satildeo por via oral e deacutermica pela
ingestatildeo de aacutegua potaacutevel e atividades em aacutegua recreacional respectivamente (VAN
APELDOORN et al 2007) Os protocolos para qualidade da aacutegua potaacutevel da OMS
representa um consenso cientiacutefico de risco agrave sauacutede apresentado por
microorganismos e substacircncias quiacutemicas em aacutegua potaacutevel e eacute usado para
derivaccedilatildeo de valores de referecircncias (VRs) os quais satildeo associados com aspectos
de orientaccedilatildeo e gerenciamento Para obtenccedilatildeo do VR primeiro eacute necessaacuterio
determinar a concentraccedilatildeo da substacircncia quiacutemica em estudo que natildeo cause efeitos
adversos em humanos quando ingerida diariamente ao longo da vida a qual eacute
conhecida como a dose de ingestatildeo diaacuteria aceitaacutevel (IDA) Idealmente esse valor eacute
derivado de estudos em humanos mas por muitas vezes serem inadequados eou
inexistentes utiliza-se dados derivados de estudos realizados com animais de
experimentaccedilatildeo e para extrapolar esses dados obtidos para a situaccedilatildeo humana
satildeo aplicados fatores de incerteza ao NOAEL (FALCONER et al 1994) No caso
para a MC-LR 40 microgkgdia foi o NOAEL obtido em um estudo realizado com
camundongos expostos por gavage durante 13 semanas (KUIPER-GOODMAN
FALCONER E FITZGERALD 2003) Nessa concentraccedilatildeo nenhum efeito adverso foi
observado quanto aos paracircmetros de concentraccedilotildees de enzimas seacutericas e
histopatologia hepaacutetica (FAWELL et al 1999) Apoacutes a determinaccedilatildeo do NOAEL o
valor de IDA foi obtido e um VR provisoacuterio (1 microgL) tem sido adotado pela OMS para
MC em aacutegua potaacutevel (FALCONER et al 1994) Eacute importante lembrar que tanto o
IDA quanto o VR obtidos para o grau de toxicidade da MC-LR poreacutem outras MCs
podem estar presentes em reservatoacuterios de aacutegua e pessoas podem estar expostas a
longo prazo agrave concentraccedilotildees menores do que a do VR proposto jaacute que o tratamento
convencional em estaccedilotildees de tratamento de aacutegua natildeo eliminam cianotoxinas
Por essas razotildees satildeo necessaacuterios que se conheccedilam melhor os efeitos a
longo prazo da exposiccedilatildeo agraves MCs com a realizaccedilatildeo de experimentos que
mimetizem as condiccedilotildees e concentraccedilotildees a qual a populaccedilatildeo pode estar exposta
Dentre os novos interesses a avaliaccedilatildeo no processo reprodutivo de mamiacuteferos tem
destaque pelo importante valor que esse processo exerce sobre os animais jaacute que a
reproduccedilatildeo eacute essencial para perpetuaccedilatildeo e diversidade das espeacutecies assim como
para a continuidade da vida (ARAUacuteJO et al 2007) Aleacutem de que distuacuterbios
reprodutivos tecircm se tornado um problema de sauacutede puacuteblica (NIHI E LOURENCcedilO
78
2011) Baseado no que foi exposto o presente trabalho tratou ratos Wistar machos e
fecircmeas com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs para
avaliaccedilatildeo do desempenho reprodutivo e de embriofetotoxicidade da prole A
administraccedilatildeo do extrato de cianobacteacuterias contendo MCs ocorreu por via oral
(gavage) e um dos grupos foi tratado com concentraccedilatildeo de MCs igual ao do IDA
provisoacuterio estabelecido pela OMS (40 ng de MC-LRkgdia) no entanto cabe
salientar que a toxicidade do extrato bruto de cianobacteacuterias usado neste estudo
possui grau de toxicidade menor uma vez que neste extrato foi identificado natildeo soacute
MC-LR mas tambeacutem outros anaacutelogos (item 51)
Nos estudos de desempenho reprodutivo e dominante letal eacute fundamental que
seja realizado a avaliaccedilatildeo da toxicidade no animal antes que sejam analisados os
resultados pois os achados de malformaccedilotildees concomitantemente com a toxicidade
materna podem induzir a erros de interpretaccedilatildeo (GIAVINI e MENEGOLA 2001)
Assim a matildee deve ser considerada a unidade experimental para a anaacutelise preacute-natal
ou seja suas condiccedilotildees fisioloacutegicas satildeo importantes para que possa haver uma
correta interpretaccedilatildeo dos resultados observados (CHAHOUD et al 1999) Os sinais
de intoxicaccedilatildeo no animal adulto o qual foi exposto agraves substacircncias estudadas eacute
observado atraveacutes da perda de peso diminuiccedilatildeo na ingestatildeo hiacutedrica e consumo de
raccedilatildeo sinais cliacutenicos e mortalidade (CHAHOUD et al 1999) Neste trabalho esses
paracircmetros foram utilizados para avaliar a toxicidade do extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs em ratos machos e fecircmeas adultos
Os resultados obtidos indicaram que natildeo houve alteraccedilatildeo no ganho de massa
corpoacuterea das fecircmeas prenhes tratadas com o extrato bruto de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 100 ou 250 ng de MCskgdia) quando comparado com os
animais do grupo controle que receberam aacutegua destilada ou seja todos os grupos
apresentaram o aumento de peso esperado durante o periacuteodo de gestaccedilatildeo O
mesmo foi observado para a ingestatildeo hiacutedrica consumo de raccedilatildeo sinal cliacutenico de
intoxicaccedilatildeo e mortalidade Fawell et al (1999) tambeacutem natildeo constataram diferenccedila
de peso corpoacutereo nos animais que sobreviveram agrave administraccedilatildeo de MC-LR
(purificada) durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo por vo (200 600 ou 2000 microgkgdia)
Jaacute Bu et al (2009) utilizaram extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (3 6 ou 12 microg
de MCskgdia) para avaliar a embriofetotoxicidade em camundongos No entanto
nesse experimento foram administradas concentraccedilotildees de MCs muito mais elevadas
que no presente trabalho e a administraccedilatildeo foi por via ip Nesse estudo (BU et al
79
2009) foi observada alteraccedilatildeo no ganho de peso de ratas prenhes tratadas durante
os dias 6-15 da gestaccedilatildeo quando comparado com as ratas do grupo controle Em
um estudo com administraccedilatildeo de CYN (8-128 microgkg por peso corpoacutereodia) durante
os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo por via ip foram observadas alteraccedilotildees no
ganho de peso das ratas tratadas quando comparadas com as ratas do grupo
controle (ROGERS et al 2007)
Os ratos machos tratados com a soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ngkgdia) durante 52 dias antes da coacutepula tambeacutem natildeo
apresentaram nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo Resultado semelhante foi encontrado
por Chen et al (2010) que natildeo observaram nenhuma diferenccedila no peso corpoacutereo
ingestatildeo de aacutegua e sinais de intoxicaccedilatildeo em camundongos machos que foram
expostos agrave MC-LR (1 32 ou 10 microgkgdia) durante 3 ou 6 meses por vo Esses
resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes injetar no
peritocircnio extrato de M aeruginosa contendo 333 ou 667 μg de MCskgdia durante
14 dias observaram que os camundongos que receberam o extrato de M
aeruginosa reduziram a meacutedia do peso corpoacutereo quando comparados com os do
grupo controle (soluccedilatildeo salina agrave 09 por via ip)
A alteraccedilatildeo do peso relativo de oacutergatildeos vitais tambeacutem eacute um importante
indicativo de toxicidade de substacircncias quiacutemicas sobre os oacutergatildeos alvos (CARVALHO
et al 2008) A razatildeo do peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo dos animais dos grupos
testes de ambos os estudo (desempenho reprodutivo e dominante letal) foram
semelhantes aos resultados encontrados nos animais do grupo controle sendo um
fator adicional de demonstraccedilatildeo de que natildeo existiu intoxicaccedilatildeo sistecircmica nos ratos
fecircmeas tratados com extrato bruto de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250
ngkgdia) Esse resultado foi diferente ao encontrado por Rogers et al (2007) que
administraram por via ip doses entre 8-128 microg de CYN kg por peso corpoacutereodia
durante os dias 8-12 e 13-17 da gestaccedilatildeo e relataram alteraccedilatildeo (dose dependente)
na relaccedilatildeo peso do fiacutegadopeso corpoacutereo de ratas prenhes Jaacute para a relaccedilatildeo peso
do rimpeso corpoacutereo natildeo existiu alteraccedilatildeo alguma Chernoff et al (2011) tambeacutem
tratou ratas prenhes com CYN (50 microgkgdia) por via ip durante o mesmo periacuteodo
da gestaccedilatildeo e observaram um aumento na relaccedilatildeo do peso do fiacutegadopeso
corpoacutereo nas ratas que receberam o tratamento entre os dias 13-17 da gestaccedilatildeo e
nenhuma alteraccedilatildeo para a relaccedilatildeo peso do rimpeso corpoacutereo
80
Aleacutem das alteraccedilotildees nos pesos dos oacutergatildeos vitais os efeitos toacutexicos das
substacircncias quiacutemicas podem tambeacutem ser avaliados pelas alteraccedilotildees no peso de
oacutergatildeos natildeo vitais como por exemplo oacutergatildeos reprodutores (REBORENDO et al
2006) A avaliaccedilatildeo de dados relacionados aos pesos absolutos dos oacutergatildeos eacute
importante pois uma diminuiccedilatildeo do peso de um oacutergatildeo reprodutivo pode ocorrer sem
que esteja relacionado com a reduccedilatildeo no ganho do peso corporal (OECD 1998)
Mudanccedilas significativas no peso relativo ou absoluto dos oacutergatildeos reprodutivos
femininos (ovaacuterio uacutetero vagina hipoacutefise) ou masculinos (testiacuteculos epidiacutedimo
vesiacutecula seminal hipoacutefise e proacutestata) podem caracterizar efeitos adversos na
reproduccedilatildeo Tais alteraccedilotildees podem proporcionar informaccedilotildees adicionais sobre a
toxicidade reprodutiva do agente quiacutemico estudado (EPA 1996) Os oacutergatildeos
reprodutivos femininos avaliados neste estudo (uacutetero e ovaacuterio) natildeo apresentaram
diferenccedilas estatiacutesticas na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo entre os animais
tratados com extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ng de
MCskgdia) quando comparados com os animais do grupo controle (aacutegua destilada)
Os oacutergatildeos reprodutivos masculinos (testiacuteculos e epidiacutedimo) tambeacutem natildeo
apresentaram alteraccedilotildees na relaccedilatildeo peso do oacutergatildeopeso corpoacutereo quando
comparado os machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) com os do grupo controle (aacutegua destilada)
Esses resultados satildeo diferentes dos encontrados por Ding et al (2006) que apoacutes
administrar por via ip as doses de 333 ou 667 μgkgdia do extrato de M
aeruginosa durante 14 dias observaram que ocorreu uma reduccedilatildeo na meacutedia relativa
do epidiacutedimo e um aumento na meacutedia relativa do testiacuteculo nos animais tratados com
a maior dose
Outra forma de anaacutelise a toxicidade em oacutergatildeo alvos eacute atraveacutes da dosagem
seacuterica de marcadores bioquiacutemicos especiacuteficos Esta dosagem permite por exemplo
a avaliaccedilatildeo da toxicidade em oacutergatildeos como o fiacutegado e o rim A avaliaccedilatildeo de
hepatotoxicidade pode ser avaliada atraveacutes do aumento das enzimas ALT e AST o
que indica que houve lesatildeo hepatocelular (RUSSO e JACOBSON 2002) Jaacute o
aumento dos niacuteveis seacutericos de ureia e creatinina estaacute relacionado com a reduccedilatildeo da
filtraccedilatildeo glomerular (KOHLMANN JR et al 1999) Como jaacute eacute conhecido as MCs satildeo
hepatotoxinas ou seja suas lesotildees estatildeo concentradas no fiacutegado (FALCONER e
YEUNG 1991 FALCONER e HUMPAGE 2005 MOLICA e AZEVEDO 2009) No
entanto Nobre e colaboradores (2002) relataram que a administraccedilatildeo de MC-LR em
81
ratos tambeacutem alterou a funccedilatildeo renal e sugeriram que essa alteraccedilatildeo estava
relacionada com a lesatildeo vascular e glomerular (NOBRE et al 2002)
Nas dosagens bioquiacutemicas no presente estudo foi possiacutevel observar uma
diminuiccedilatildeo para os marcadores renais nos grupos de ratas prenhes tratadas com
soluccedilatildeo de extrato bruto de cianobacteacuteria contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia)
quando comparados com as dosagens dos animais do grupo controle (aacutegua
destilada) A creatinina diminuiu em todos os grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuteria enquanto que a ureia reduziu nos grupos tratados com 40 ou 100 ng
de MCskgdia Na gravidez a taxa de filtraccedilatildeo glomerular (TFG) e fluxo plasmaacutetico
renal aumentam (PERRONE MADIAS e LEVEY 1992) Os mecanismos
relacionados a esses eventos ainda natildeo satildeo bem conhecidos mas provavelmente
satildeo ligados agrave alteraccedilatildeo hormonal e ao aumento da demanda metaboacutelica na
gravidez Como consequecircncia desse aumento da TFG ocorre diminuiccedilatildeo dos niacuteveis
seacutericos de creatinina e ureia durante a gravidez (DUFOR 2008 PERRONE
MADIAS e LEVEY 1992)
Jaacute no grupo dos machos tratados com soluccedilatildeo de extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs (40 ngkgdia) natildeo foi observada nenhuma alteraccedilatildeo
nos paracircmetros bioquiacutemicos quando comparado com os resultados das dosagens
bioquiacutemicas das amostras dos animais do grupo controle Diferente de Lakshmana
Rao et al (2005) que encontram elevaccedilatildeo nas dosagens de AST e ALT em
camundongos tratados vo com extratos contendo MCs (35 g de MC-LRkg) no
experimento de toxicidade aguda
O resultado dos exames histopatoloacutegicos confirmou a ausecircncia de toxicidade
nos oacutergatildeos avaliados uma vez que natildeo foi encontrado nenhum sinal de intoxicaccedilatildeo
nas amostras coletadas das fecircmeas prenhes (fiacutegado e rim) e nem nas dos machos
(fiacutegado rim testiacuteculo e epidiacutedimo) dos grupos tratados com extrato bruto de
cianobacteacuterias contendo MCs quando comparado com os do grupo controle (aacutegua
destilada)
Os paracircmetros hematoloacutegicos tambeacutem fornecem informaccedilotildees importantes
sobre a sauacutede e o estado fisioloacutegico destes animais (LOPES 2009) e alguns
pesquisadores jaacute relataram a correlaccedilatildeo entre a administraccedilatildeo de substacircncias
quiacutemicas com alteraccedilotildees de paracircmetros hematoloacutegicos Foi relatado por Takahashi
et al (1995) apoacutes uma hora da exposiccedilatildeo ip uma reduccedilatildeo (dose-dependente) na
contagem de eritroacutecitos e leucoacutecitos concentraccedilatildeo de hemoglobina e no hematoacutecrito
82
de amostras de sangue perifeacuterico de ratos que receberam MC-LR (100 e 200 μgkg)
Os ensaios hematoloacutegicos analisados nesse trabalho (contagem de leucoacutecitos na
medula oacutessea e no sangue perifeacuterico contagem de eritroacutecitos dosagem de
hemoglobina e determinaccedilatildeo do hematoacutecrito) a partir de amostras de sangue e de
medula oacutessea de animais machos tratados por vo com extrato de cianobacteacuterias
contendo MCs (40 ng de MCskgdia) por 52 dias natildeo apresentaram nenhuma
alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando comparado aos resultados obtidos
das anaacutelises das amostras dos animais do grupo controle (aacutegua destilada)
No estudo do desempenho reprodutivo a exposiccedilatildeo agrave substacircncia estudada
ocorre in uacutetero ou seja o animal eacute exposto durante o desenvolvimento preacute-natal
permitindo avaliar possiacuteveis accedilotildees da substacircncia quiacutemica estudada sobre o
desenvolvimento do concepto (NIHI E LOURENCcedilO 2011) Nessa avaliaccedilatildeo satildeo
calculados os iacutendices de prenhez fertilidade perdas preacute-implantacionais
reabsorccedilatildeo e perdas poacutes-implantacionais Baseado nesses dados natildeo foi observado
alteraccedilotildees nos iacutendices do desempenho reprodutivo em ambos os ensaios no que
fecircmeas prenhes foram tratadas com extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nem no
ensaio do dominante letal em que os machos foram tratados com o mesmo extrato
antes do acasalamento sugerindo assim que as MCs nas concentraccedilotildees presentes
nas soluccedilotildees do extrato bruto de cianobacteacuteria utilizado nos ensaios natildeo foram
capazes de interferir na reproduccedilatildeo desses animais expostos por vo
A embriofetotoxicidade pode ser constatada por alteraccedilotildees no
desenvolvimento normal do feto podendo resultar em desde alteraccedilotildees estruturais
ateacute a morte do concepto Tudo depende da fase em que o animal foi exposto a
substacircncia quiacutemica estudada jaacute que as exposiccedilotildees que acontecem entre a
concepccedilatildeo e a implantaccedilatildeo (preacute-implantaccedilatildeo e implantaccedilatildeo) pode em ambos
resultar em nenhum efeito ou morte do embriatildeo poreacutem se ocorrer no periacuteodo da
organogecircnese os efeitos teratogecircnicos poderatildeo ser vistos em diferentes graus de
alteraccedilotildees estruturais como malformaccedilatildeo ruptura deformaccedilatildeo e displasia
(BRUNONI 2002 COSTA 2005 CARMO PETER GUERRA 2004 EPA 1996
WHO 1984) Para evidenciar todas essas possiacuteveis alteraccedilotildees eacute necessaacuterio que se
avalie as viacutesceras e o esqueleto dos filhotes cujos pais foram expostos agrave substacircncia
estudada Em nosso estudo foi observado que o tratamento com extrato de
cianobacteacuterias contendo MCs natildeo causou efeitos de embriototoxicidade uma vez
que tanto no estudo esqueleacutetico quanto no estudo visceral da prole cujas
83
progenitoras foram expostas ao extrato bruto de cianobacteacuteria apresentaram
resultados semelhantes aos fetos dos animais do grupo controle Resultado
semelhante ao encontrado por Fawell et al1999 (apud Hawkins et al 2006) que
trataram camundongos fecircmeas por vo com MC-LR purificada (200 600 ou 2000
μgkg) durante 6-15 de gestaccedilatildeo e tambeacutem natildeo encontram nenhuma alteraccedilatildeo
nesses paracircmetros Chernorff et al (2002) tambeacutem natildeo constataram nenhuma
malformaccedilatildeo visceral ou esqueleacutetica na prole de camundongos tratados com MC-LR
purificada quando comparado com o grupo controle A exposiccedilatildeo ocorreu tanto por
via ip como por via subcutacircneo em doses que variaram de 16-160 μgkg e 128
μgkg respectivamente entre o dia 7-12 da gestaccedilatildeo Rogers et al (2007) tambeacutem
natildeo encontraram alteraccedilotildees no estudo esqueleacutetico e visceral na prole de
camundongos fecircmeas expostos na fase inicial da gestaccedilatildeo por via ip a doses de
CYN (8-128 gkg) quando comparados com a prole dos animais do grupo controle
Bu et al (2006) trataram ratos fecircmeas por via ip durante os dias 6-15 de gestaccedilatildeo
a MCs presentes em extratos de cianobacteacuterias (3 6 ou 12 μg de MCskgdia) e natildeo
foi observado nenhuma alteraccedilatildeo para o estudo esqueleacutetico da prole poreacutem foram
encontradas alteraccedilotildees hepaacuteticas nos filhotes das ratas do grupo que receberam
extrato de cianobacteacuteria contendo MCs nas concentraccedilotildees de 6 e 12 μg de
MCskgdia quando comparado com a prole das fecircmeas do grupo controle
Tomando-se esses dados em conjunto foi observado que a administraccedilatildeo por
vo de extrato de cianobacteacuterias contendo MCs (40 100 ou 250 ngkgdia) natildeo
causa toxicidade sistecircmica em ratos adultos nem efeitos no desempenho
reprodutivo de ratos machos e fecircmeas tratados ou na prole de ratas prenhes
tratadas
84
7 CONCLUSAtildeO
Os dados obtidos nesse trabalho natildeo evidenciaram nenhuma alteraccedilatildeo nos
paracircmetros reprodutivos de ratos avaliados frente agrave exposiccedilatildeo diaacuteria a um extrato
bruto de cianobacteacuterias contendo MCs Portanto sugere-se que a exposiccedilatildeo diaacuteria
de aacutegua contendo variantes de MCs em concentraccedilatildeo proacutexima ao da IDA eacute segura
para mamiacuteferos natildeo somente quanto agrave hepatotoxicidade mas tambeacutem para
paracircmetros de reproduccedilatildeo e teratogenicidade
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABRAMSSON-ZETTERBERGA L SUNDHA UB e MATTSSON R Cyanobacterial extracts and microcystin-LR are inactive in the micronucleus assay in vivo and in vitro Mutation Research v699 p 5ndash10 2010 ADLER N TBELL D Constant Estrus in Rats vaginal reflexive and behavioral Changes Physiology and Behmior Gratilde-Bretanha v 4 p 151-31969 AGUJARO LF e ISAAC RL Ocorrecircncia de cianobacteacuterias potencialmente toacutexicas nas bacias dos rios Piracicaba Capivari e Jundiaiacute ndash estado de Satildeo Paulo Brasil ndash e avaliaccedilatildeo de seus corpos daacutegua em relaccedilatildeo agrave eutrofizaccedilatildeo In Cogreso Interamericano de Ingenieriacutea Sanitaria y Ambiental 28 2002 Cancuacuten Gestioacuten inteligente de los recusos naturalesde desarrollo y salud Meacutexico AIDS 2002 p1-7 AIRES ED STEFANINI MA ORSI AM Caracteriacutesticas ultra-estruturais e diferenciativas das espermaacutetides de piracanjuba (Brycon orbignyanus) durante a espermiogecircnese Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v37 n3 2000 ANDRADE A PINTO S C OLIVEIRA R S Animais de laboratoacuterio criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2002 388p ANGELOPOULOU R BALLA M LAVRANOS G CHALIKIAS M C KITSOS C BAKA S e KITTAS C Sertoli cell proliferation in the fetal and neonatal rat testis A continuous phenomenon Acta histochemica v 110 p 341mdash347 2008 ANJOS FMD OLIVEIRA MCB ZAJAC MP HILLER S CHRISTIAN B ERLER K LUCKAS B PINTO E Detection of harmful cyanobacteria and their toxins by both PCR amplification and LC-MS during a bloom event Toxicon v 48 n 3 p 239-245 2006 ANTONIOU MG SHOEMAKER JA DE LA CRUZ AA e DIONYSIOU DD LCMSMS structure elucidation of reaction intermediates formed during the TiO2 photocatalysis of microcystin-LR Toxicon v 51 p 1103-1118 2008 ARANDA B C C Influecircncia de feromocircnio de urina de ratos machos no comportamento sexual de ratas Wistar adultas manipuladas no periacuteodo neonatal 2011 54f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2011 ARAUacuteJO C H M ARAUacuteJO M C P M MARTINS W P FERRIANI R A REIS RM Gametogecircnese estaacutegio fundamental do desenvolvimento para reproduccedilatildeo humana Medicina Ribeiratildeo Preto v 40 n4 p 551-8 2007 ARAUJO C S SCALZER L P SINISCALCHI V SILVA A G ENDRINGER D C GARCIA JR R P Avaliaccedilatildeo do efeito da ldquoessecircncia de hormocircnio natural almeiratildeo-roxordquo produzido pela Pastoral da Sauacutede de Domingos Martins ES em ratas com menopausa ciruacutergica Natureza on line v7 n1 p12-18 2009
86
AZEVEDO S M F O Toxinas de Cianobacteacuterias causas e consequumlecircncias para a Sauacutede Puacuteblica Revista Virtual de Medicina v1 n3 1998 AZEVEDO SMFO CARMICHAEL WW JOCHIMSEN EM RINEHART KL LAU S SHAW GR EAGLESHAM GK Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brasil Toxicology v 181 p 441-446 2002 BANKS WJ Histologia veterinaacuteria aplicada 2 ed Satildeo Paulo Manoel LTAD 1992 629p BEACH F A Sexual attractivity proceptivity and receptivity in female mammals Hormones and Behavior n 7 p105-138 1976 BEIGUELMAN B O estudo de gecircmeos Ribeiratildeo Preto SBG 2008 90p BERNARDI M M Exposiccedilatildeo aos medicamentos durante o periacuteodo perinatal In SPINOSA HD GOacuteRNIAK S L PALERMO-NETO J Farmacologia aplicada a medicina veterinaacuteria 2 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1999 p 566-574 BERTAN C M BINELLI M MADUREIRA E H TRALDI A S Mecanismos endoacutecrinos e moleculares envolvidos na formaccedilatildeo do corpo luacuteteo e na luteoacutelise - revisatildeo de literatura Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v43 n6 2006 BILLAM M MUKHI S TANG L GAO W WANG J Toxic response indicators of microcystin-LR in F344 rats following a single-dose treatment Toxicon v51 p 1068ndash1080 2008 BITTENCOURT-OLIVEIRA MC KUJBIDA P CARDOZO KHM CARVALHO VM MOURA AN COLEPICOLO P PINTO E A novel rhythm of microcystin biosynthesis is
described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komaacuterek et al Biochemical and Biophysical Research Communications v 326 p 687-694 2005
BITTENCOUT-OLIVEIRA MC MOLICA R Cianobacteacuteria invasora aspectos moleculares e toxicoloacutegicos de Cylindrospermopsis raciborskii no Brasil Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento n 30 p 82-90 2003 BOTANA LM ed Phycotoxins Chemistry and biochemistry Oxford Blackwelll Publishing 2007 345p BRANDAtildeO L H DOMINGOS P Fatores ambientais para a floraccedilatildeo de cianobacteacuterias toacutexicas Sauacutede amp Ambiente em Revista Duque de Caxias v1 n2 p40-50 2006 BRENT R L BECKMAN D A Environmental teratogens Bulletin of the New York Academy of Medicinev Nova York v 66 n 2 1990 BRITO JHM Fundamentos de embriologia bucodentaacuteria Porto AlegreEdipucrs 1998 p 103
87
BROLIO MP AMBROacuteSIO CE FRANCIOLLI1 AR MORINI1 AC GUERRA1 RR
MIGLINO MA A barreira placentaacuteria e sua funccedilatildeo de transferecircncia nutricional Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo Animimal Belo Horizonte v34 n4 p222-232 2010 BRUNONI P Epidemiologia e etiologia das anomalias fetais In GUARIENTO A MAMEDE J A V Medicamentos materno-fetal v2 Satildeo Paulo Atheneu 2002 p1157-1168 BU Y LI U ZHANG B CHUNG I LEE J Microcystins cause embryonic toxicity in mice Toxicon n 48 p 966ndash972 2006 CARMICHAEL WW A world overview -One-hundred-twenty-seven years of
research on toxic cyanobacteria Where do we go from here Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 105-120 2008
CARMICHAEL WW Toxins of freshwater algae In Handbook of natural product toxins New York Marcel Dekker 1988 p 121-147 CARMICHAEL WW AZEVEDO SMFO AN JS MOLICA RJR
JOCHIMSEN EM LAU S RINEHART KL SHAW GR EAGLESHAM GK
Human Fatalities from Cyanobacteria Chemical and Biological Evidence for
Cyanotoxins Environmental Health Perspectives v 109 p 663ndash668 2001
CARMO J D do PETER V M GUERRA M O Cronologia do desenvolvimento embrionaacuterio e fetal de ratos conforme a dataccedilatildeo do iniacutecio da prenhez Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo Juiz de Fora v 23p5-16 2004 CARNEIROT G LEITE F Cianobacteacuterias e suas toxinas Revista Analytica v 1 n32 p 36-41 2008 CARVALHO RR Avaliaccedilatildeo da mangiferina na periodontite induzida em ratos 2008 f 84 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Bioloacutegicas) Instituto de Biociecircncias da Universidade Estadual Paulista Botucatu 2008 CASARETT L J e DOULLS J Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nova York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p135-140 CAVALLI R C BARALDI C O CUNHA S P Transferencia placentaria de drogas Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetriacutecia v28 n9 p 557-64 2006 CHAHOUD I LIGENSA A DIETZEL L e FAQI AS Correlation between maternal toxicity and embryofetal effects Reproductive Toxicology v13 p 375-381 1999
88
CHAHOULD I LIGENSA A DIETZEL L FAQI A S Correlation between maternal toxixity and embryofetal effects Reproductive Toxicology n 13 p 375-381 1999 CHEN X YANG X YANG L XIAO B WU X WANG J WAN H An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments Water Research v 44 p 1884-1892 2010 CHEN Y XU J LI Y e HAN X Decline of spern quality and testicular function in male mice during chronic low-dose exposure to microcystin-LR Reproductive Toxicology v31 p551-557 2011 CHERNOFF N HUNTER ES HALL LL ROSEN MB BROWNIE CF
MALARKEY D MARR M e HERKOVITS J Lack of Teratogenicity of Microcystin-
LR in the Mouse and Toad Journal of Applied Toxicology v 22 p 13ndash17 2002
CHERNOFF N ROGERS A E H ZEHR A R D GAGE A M I MALARKEY A
D E BRADFIELD BC A LIU C Y SCHMID C J E JASKOT A R H
RICHARDS A J H WOODA ACR e ROSENA M B Toxicity and recovery in the
pregnant mouse after gestational exposure to the cyanobacterial toxin
cylindrospermopsin Journal of Applied Toxicology v 31 p 242ndash254 2011
CHERNOFF N ROGERS EH GAGE MI FRANCIS BM The relationship of maternal and fetal toxicity in developmental toxicology bioassays with notes on the biological significance of the ldquono observed adverse effect levelrdquo Reproductive Toxicology v25 p 192ndash202 2007 CHORUS I amp BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water a guide to their public
health consequences monitoring and management E amp FN Spon Londres 1999
CHORUS I BARTRAM J eds Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management Spon Press 416 p London 2003 CITRIN M M Imprinting genocircmico Disponiacutevel emlt httpgeneticaufcspaedubrseminarios20monitoresImprintingpdfgt Acesso em12032012 CODD GA Cyanobacterial toxins the perception of water quality and the
prioritization of eutrophication control Ecological Engineering v 16 p 51-60 2000
89
CODD GA BELL SG KAYA K WARD CJ BEATTIE KA METCALF JS
Cyanobacterial toxins exposure routes and human health European
Journal of Phycology v 34 p405-415 1999
CODD GA MORRISON LF METCALF JS Cyanobacterial toxins management
for health protection Toxicology and Applied Pharmacology v 203 p 264-272
2005
CONCEICcedilAtildeO APM BATISTA APC ARAUacuteJO ACC DE SILVA FCA DA
WANDERLEY-TEIXEIRA V TEIXEIRA AAC Anaacutelise histoloacutegica da endometriose
em ratas durante as fases do ciclo estral Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v72 n4 p439-443 2005
COSTA DS e PAULA TAR Espermatogecircnese em mamiacuteferos Scientia Vila Velha v 4 n 12 p 53-72 2003 DAWSON RM The toxicology of microcystins Toxicon v 36 n 7 p 953-962 1998 DIB MA OLIVEIRALRZ DIAS OA TORRES ARR e SILVEIRA NA Avaliaccedilatildeo da qualidade do secircmen e do estado geral de sauacutede de frentistas de postos de gasolina da cidade de Goiacircnia Goiacircnia v 34 n1112 p 957-977 2007 DING XS LI XY DUAN HY CHUNG IK e LEE JA Toxic effects of microcystis cell extracts on the reproductive system of male mice Toxicon v 48 p 973ndash979 2006 DIPE V V Efeitos da restriccedilatildeo alimentar materna sobre a prole de ratas Wistar Avaliaccedilotildees teratogecircnicas claacutessicas e de imunoteratologia 2009 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada)-Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2009 DUFOR DR Avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo renal aacutegua eletroacutelitos equiacutelibrio aacutecido-base e gases sanguiacuteneos In Diagnoacutesticos Cliacutenicos e Tratamento por Meacutetodos Laboratoriais Satildeo Paulo Manole Ltda 2008 p185 ndash 244 EPA-Environmental Protection Agency Guidelines for reproduce toxicity risk assesment ndash EPA630R-96009 Washington Sept 1996 ESKINAZI-SANTrsquoANNA E M PANOSSO R F ATTAYDE J L D COSTA I A S SANTOS C M ARAUacuteJO M F F MELO J L S Aacuteguas potiguares oaacutesis ameaccedilados Ciecircncia Hoje vol 39 n 233 p 68-71 2006
90
FALCONER I R e HUMPAGE A R Health risk assessment of cyanobacterial
(Blue-Green Algal) toxins in drinking water International Journal of
Environmental Research and Public Health v 2 n 1 p 43-50 2005
FALCONER I R e YEUNG D S K Cytoskeletal changes in hepatocytes induced
by microcystis toxins and their relation to hyperphosphorylation of cell proteins
Chemico-Biological Interactions v 81 p 181-196 1992
FALCONER I BARTRAM J CHORUS I KUIPER-GOODMAN T UTKILEN H BURCH M e COOD GA Safe levels and safe practices In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1994 p 155-178 FALCONER IR Cyanobacterial toxins present in Microcystis aeruginosa extracts - More than microcystins Toxicon v 50 p 585ndash588 2007
FAWELL JK MITCHELL RE EVERETT DJ e HILL RE The toxicity of cyanobacterial toxins in the mouse I Microcystin-LR Human amp experimental toxicology v18 n3 p162-1671999 FERRAtildeO FILHO A S Bioacumulaccedilatildeo de cianotoxinas e seus efeitos em organismos aquaacuteticos Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 272-312 2009 FRANCcedilA LR e RUSSEL LD The testis of domestic animls In MARTIacuteNEZ F e REGADERA J Male Reproduction Madri Churchill Levingstone 1998 v1 p 197-219 FRIAS HV MENDES MA CARDOZO KHM CARVALHO VM TOMAZELI D COLEPICOLO P PINTO E Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event Biochemical and Biophysical Research Communications v 344 n 3 p 741-746 2006 FRISTACHI A e SINCLAIR JL Occurrence of harmful cyanobacterial blooms In
Cyanobacterial harmful algal blooms state of the science and research needs
Editado por H Kenneth Hudnell Advances in Experimental Medicine and Biology v
619 p45ndash104 2008
FUNARI E E TESTAI E Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure Reviews in Toxicology v 38 n 2 p 97-125 2008
GALVAtildeO J A OETTERER M BITTENCOURT-OLIVEIRA M D C GOUVEcircA-BARROS S HILLER S ERLER K LUCKAS B PINTO E e KUJBIDA P (2009) Saxitoxins accumulation by freshwater tilapia (Oreochromis niloticus) for human consumption Toxicon v 54 n 6 p 891ndash894 2009
91
GIAVINI E e MENEGOLA E The problem of maternal toxicity in developmental toxicity studies Regulatory Toxicology and Pharmacology v62 p 568-570 2012 GOMES C M Efeito da manipulaccedilatildeo neonatal sobre a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de hormocircnios da reproduccedilatildeo e da densidade de receptores da angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas 2005 87f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Neurociecircncias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2005 GRISWOLD MD The central role of Sertoli cells in spermatogenesis Cell amp Developmental Biology v 9 p 411-416 1998 GUPTA N PANT S C VIJAYARAGHAVAN R RAO LAKSHMANA P V Comparative toxicity evacuation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin vriants (LR RR YR) in mice Toxicology v 188 p 285-296 2003 HAIDER S NAITHANI V VISWANATHAN PN e KAKKA P Cyanobacterial toxins a growing environmental concern Chemosphere v 52 p1ndash21 2003 HASSUM FILHO P A SILVA I DC VERRESCH ITN O Espectro das
Falecircncias Ovarianas Ligadas ao Cromossomo X Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia amp Metabologia Satildeo Paulo v45 n4 2001
HAWKINS B CARLSON-LYNCH H ODIN M e STICKNEY J Toxicological reviews of cyanobacterial toxins Microcystin LR RR Yr e LA 2006 HOOSER S B BEASLEY V R BASGALL E JCARMICHAEL W W HASCHEK W M MicrocystinLR-induced ultrastructural changes in rats Veterinary Pathology Washington v27 n1 p9-15 1990 HUMPAGE A Toxin types toxicokinetics and toxicodynamics Advances in
Experimental Medicine and Biology v 619 p 383-415 2008
HYTTEL P SINOWATZ F e VEJLSTED M Essentials of domestic animal embryology Canada Saunders Elsevier 2010 p 40-53 JAYARAJ R e LAKSHMANA RAO P V Protein phosphorylation profile and adduct formation in liver and kidney of microcystin-LR-treated mice Toxicon v 48 p 272-277 2006 JELOVSEK FR MATTISON DR CHEN JJ Prediction of risk for human developmental toxicity How important are animal studies for hazard identification Obstetrics and Gynecology v74 n4 p624-636 1989 JOCHIMSEN EM CARMICHAEL WW AN JS CARDO DM COOKSON
ST HOLMES CEM de C ANTUNES M B de MELO FILHO DA LYRA TM
92
BARRETO VST AZEVEDO SMFO JARVIS WR Liver failure and death after
exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil The New England
Journal of Medicine v 338 n 13 p 873-878 1998
KOHLMANN JR O GUIMARAtildeES AC CARVALHO MHC CHAVES JR HC MACHADOCA PRAXEDES JN SANTELLO JL MION JRFND III Consenso Brasileiro de Hipertensatildeo Arterial Arquivos Brasileiros de Endocrinologia amp Metabologia v43 n4 1999 KUIPER-GOODMAN T FALCONER I e FITZGERALD J Human health aspects In CHORUS I BARTRAM J Toxic Cyanobacteria in Water ndash A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 2003 p 113-153 LAKSHMANA RAO PV GUPTA N JAYARAJ R BHASKAR ASB JATAV PC Age-dependent effects on biochemical varibles and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin-LR in mice Comparative Biochemistry and Physiology Part C v 140 p 11-19 2005 LANDIS W G Introduction to environmental toxicoogy impactsmof chemicals upon ecological systems 3 ed Estados Unidos CRC Press LLC 2004 p 117 LARINI L e CECCHINI R A intoxicaccedilatildeo como fenocircmeno bioloacutegico In Toxicologia 1 ed Satildeo Paulo Manoel LTDA 1987 p 1-10 LAWRENCE JF NIEDZWIADEK B MENARD C LAU BP LEWIS D KUPER-
GOODMAN T CARBONE S HOLMES C Comparison of liquid
chromatographymass spectrometry ELISA and phosphatase assay for the
determination of microcystins in blue-green algae products Journal of AOAC
International v 84 n 4 p 1035-1044 2001
LAWTON LA e EDWARDS C Purification of microcystins Journal of Chromatography A v 912 p 191-209 2001 LEE J INOUE K ONO R OGONUKI N KOHDA T KANEKO-ISHINO T OGURA A ISHINO F Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 115 primordial germ cells Development v 129 p 1807-1817 2012 LEE RE Phycology Cambridge Cambridge University Press p 44-5 1991 LEITAtildeO C C F BRITO I R FROTA I M A SILVA J R V Importacircncia dos fatores de crescimento locais na regulaccedilatildeo da foliculogecircnese ovariana em mamiacuteferos Acta Scientiae Veterinariae v 37n 3 p 215-224 2009
93
LEME MCM MARTINS AMCRF PORTUGAL MASC Ocorrecircncia de
abraquia em um potro - relato de caso Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo
v70 n2 p213-214 2003
LEMONICA I P Toxicologia da Reproduccedilatildeo In OGA S et al Fundamentos de Toxicologia 3ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 103 ndash 113 LEWIS SM BAIN BJ BATES I Hematologia Praacutetica de Dacie e Lewis 9ed
Satildeo Paulo Artmed Editora 2006
LI XY CHUNG IK KIM JI e LEE JA Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L) exposed to Microcystis under laboratory conditionsToxicon v 44 p 821ndash827 2004 LIMA L M FRAGA C A M BARREIRO E J O renascimento de um faacutermaco talidomida Quiacutemica Nova v 24 n 5 p 683-688 2001 LIU ML PEI KY SHI XQ LIU DY e JIA MC Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis Biochemical and Biophysical Research Communications v356 p 576ndash581 2007 LOPES AMAL Avaliaccedilatildeo do risco da contaminaccedilatildeo ambiental utilizando como bioindicador o ratinho-caseiro(MUS MUSCULUS) 2009 f24 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biologia Humana e Ambiental) Universidade de Lisboa Faculdade De Ciecircncias Lisboa 2009 LUTTGE W G e HUGHES J R Intracerebral implantation of progesterone re-examination of the brain sites responsible for facilitation of sexual receptivity in estrogen-primed ovariectomized rats Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 771-775 1976 MACKINTOSH C BEATTIE KA KLMPP S COHEN P CODD GA Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants Federation European Biochemical Societies v 264 n 2 p 187-192 1990 MALBROUCK C TRAUSCH G DEVOS P KESTEMONT P Hepatic accumulation and effects of microcystin-LR on juvenile goldfish Carassius auratus L Comp Biochemistry and Physiology Part C v 135 p 39-48 2003 MANTOVANIT AMARANGHI F Risk assessment of chemicals potentially affecting male fertility Contraception v 72 p 308 ndash 313 2005 MASCARENHAS RM PAULA TAR CARRETA JUacuteNIOR M RIBEIRO ECS BORBOLETA LR MATTA SLP Efeitos da bioacutepsia incisional testicular sobre o rendimento intriacutenseco da espermatogecircnese e iacutendices de ceacutelulas de sertoli em catildees Ceres v 53 n305 p107-112 2006
94
MATTARIA V G M SILVA A P R SARTORI D R S TAacuteVORA M F C L F RODRIGUES V P MOREIRA V B MOURA A S A M T Efeito macho na induccedilatildeo do estro em ratos Wistar Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 16 n 4 p 669-677 2009 McBRIDE W G Thalidomide and congenital abnormalities Lancet v2 n1 p358 1961 MEDEIROS JP ESTEVAtildeO L R M BARATELLA-EVEcircNCIO L SANTOS JM SIMOtildeES R S SIMOtildeES M J EVEcircNCIO NOTO J Efeito da ivermectina sobre a ciclicidade gestccedilatildeo e desenvolvimento neonatal em ratos Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science Satildeo Paulo v45 n6 2008 MENDONCcedilA FS EVEcircNCIO-NETO J SIMOtildeES M J CAMARGO L M de BARATELLA-EVEcircNCIO L Aspectos citopatoloacutegicos da mucosa vaginal de camundongas tratadas com progesterona Ciecircncia Animal Brasileira v 8 n 2 p 313-318 2007 MERILUOTO J CODD GA Toxic Cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis Aringbo Akademi University Press 2005 149p MILUTINOVICacute A ZIVIN M ZORC-PLESKOVIC R SEDMAK B SUPUT D Nephrotoxic effects of chronic administration of microcystins -LR and ndashYR Toxicon v42 p 281ndash288 2003 MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE 2004 Portaria nordm 518 25 de marccedilo de 2004 Brasil MINISTEacuteRIO DA SAUacuteDE Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede 2003 Cianobacteacuterias toacutexicas na aacutegua para consumo humano na saacuteude puacuteblica e processos de remoccedilatildeo em aacutegua para consumo humano Brasil MOLICA R e AZEVEDO S Ecofisiologia de cianobcateacuterias produtoras de
cianotoxinas Oecologia Brasiliensis v 13 n 2 p 229-246 2009
MOORE KL Embriologia cliacutenica Traduccedilatildeo Andrea MA costa et al Rio de Janeiro Elsevier 2008 p 521 MOREIRA S N T LIMA J G SOUSA M B C AZEVEDO G D Estresse e
funccedilatildeo reprodutiva feminina Revista Brasileira de Sauacutede Materno Infantil Recife
v5 n1 p119-125 2005
MORENO I PICHARDO S JOS A GOacuteMEZ-AMORES L MATE A VAZQUEZ C M CAMEAacuteN A M Antioxidant enzume activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally Toxicon v45 p 395-402 2005
95
MORODER L e RUDOLPH-BOHNER S Microcystins and noduralins hepatotoxic cyclic peptides of cyanobacterial origin Studies in Natral Products Chemistry v 20 p 887-919 1998 MOURA P J XAVIER G F Memoacuteria de reconhecimento social em ratos Psicologia USP Satildeo Paulo v21 n2 2010 MUumlLLER C C RAYA-RODRIGUEZ M T CYBIS L F Adsorccedilatildeo em carvatildeo ativado em poacute para remoccedilatildeo de microcistina de aacutegua de abastecimento puacuteblico Engenharia Ambiental e Sanitaria v14 n1 p 29-38 2009 MURLR SKULBERG OM e UTKILEN H Cianobacterail in the environmemnt In Toxic Cyanobacteria in Water A guide to their public health consequences monitoring and management London Spon Press 1999 p 416 MURPHY S K E JIRTLE R L Imprinted Genes as Potential Genetic and Epigenetic Toxicologic Targets Environmental Health Perspectives v 108 2000 NEUBERT D CHAHOUD I Possible consequences of pre- or early postnatal exposure to substances with estrogenic or androgenic properties Endocrine Chemical Environmental v3 p 24-53 1995 NIHI F e LOURENCcedilO AC Toxicologia Reprodutiva 3 curso de farmacologia Universidade Federal do Paranaacute 2011 Acesso em 200312 Disponiacutevel emlt httpinsightltdacombrimagesdinamicapdf_7fe1310c8e894324299fcfd3b8f760efpdfpage=107gt NOBREA ACL COEcircLHOA GR COUTINHOA MCM SILVA MMM ANGELIMA EV MENEZESB DB FONTELESC MC e MONTEIRO HSA The role of phospholipase A2 and cyclooxygenase in renal toxicity induced by microcystin-LR Toxicon v 39 p721ndash724 2001 NOVAacuteKOVAacuteK BLAacuteHA L e BABICA P Tumor promoting effects of cyanobacterial extracts are potentiated by anthropogenic contaminants ndash Evidence from in vitro study Chemosphere 2012 OGA S Fundamentos de Toxicologia 2ed Satildeo Paulo Editora Atheneu 2008 p 10-14 OLIVEIRA M A BERMUDEZ J A Z SOUZA A C M Talidomida no Brasil vigilacircncia com responsabilidade compartilhada Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v15n1 p99-112 1999 ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT The validation of the methods considered for adoption as OECD test guidelines Paris 1998
96
OSBORNE NJT WEBB PM SHAW GR The toxins of Lyngbya majuscula and
their human and ecological health effects Environment International v 27 p 381-
392 2001
OSHIO L T GUERRA M O Meacutetodos em toxicologia do sistema reprodutor masculino e feminino em roedores Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais v1 n3 p148-152 2009 OSSWALD J RELLAacuteN S GAGO A VASCONCELOS V Toxicology and
detection methods of the alkaloid neurotoxin produced by cyanobacteria anatoxin-a
Environment International v 33 p 1070-1089 2007
PANOSSO R COSTA IAS SOUZA NR ATTAYDE JA CUNHA SRS e
GOMES FCF Cianobacteacuterias e cianotoxinas em reservatoacuterios do estado de Rio
Grande do Norte e o potencial conrole das floraccedilotildees pela Tilaacutepia do Nilo
(Oreochromis niloticus) Oecologia Brasiliensis v 11 n 3 p 433-449 2007
PATRIacuteCIO F R S NOacuteBREGA F J TONETE S S Q Desnutriccedilaumlo intra-uterina em diferentes periacuteodos de gestaccedilaumlo em ratas estudo do intestino delgado proximal ao nascimento e durante a recuperaccedilaumlo nutricional Revista Paulista de Pediatria v2 n8 p43-52 1984 PEGRAM A HUMPAGE A R NEILAN B A RUNNEGAR M T NICHOLS T THACKER R W PFLUGMACHER S ETHERIDGE S M LOVE A H Cyanotoxins workgroup report capiacutetulo 15 p318-370 2012 Disponiacutevel em lthttpwwwepagovcyano_habs_symposiummonographCh15pdfgt Acesso em 03032012 PEREIRA BRASIL C BRANDAtildeO C C S Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de microcistina em aacutegua de abastecimento puacuteblico por diferentes carvotildees ativados em poacute produzidos no Brasil In Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitaacuteria e Ambiental 23 2005 Campo Grande Meus Artigos Campo Grande 2005 p 1-9 PEREIRA A P S NASCIMENTO DO VASCO A BRITTO F B MELLO JUacuteNIOR A V NOGUEIRA L C Identificaccedilatildeo de cianobacteacuterias na sub-bacia hidrograacutefica do Rio Poxim Sergipe In Encontro de Recursos Hiacutedricos em Sergipe 42011 Aracaju Disponiacutevel emlt httpwwwcpatcembrapabrpublicacoes_2011anais_4enrehseResumos_expandidosIdentificaC3A7C3A3o20de20cianobactC3A9rias20na20sub-bacia20hidrogrC3A1fica20do20Rio20Poxim20Sergipepdfgt Acesso em03032012 PERRONE RD MADIAS NE e LEVEY AS Serum creatinine as na index od renal function new insights into old concepsts Clinical Chemistry v 38 n 10 p 1933-1953 1992
97
PETERSENC BOITANI C FROYSA B e SODER O Transforming growth factor-alpha stimulates proliferation of rat sertoli Molecular and Cellular Endocrinology v 181 p 221ndash227 2001 PETRELLIA G e MANTOVANI A Environmental risk factors and male fertility and reproduction Contraception v65 p 297ndash300 2002 POURIA S DE ANDRADE A BARBOSA J CAVALCANTI RL BARRETO VTS WARD CJ PREISER W POON GK NEILD GH CODD GA Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru Brazil Lancet v 352 n 9121 p 21-26 1998 POWERS J B e MOREINES J Progesterone examination of its postulated inhibitory actions on lordosis during the rat estrous cycle Physiology amp Behavior Estados Unidos v 17 p 493-498 1976 POWERS J B Hormonal Control of Sexual Receptivity during the Estrous Cycle of the Rat Physiology and Behavior Gratilde-Bretenha v 5 p 831-835 1970 PUSCHNER B e HUMBERT JF Cyanobacterial (blue-green algae) toxins Veterinary Toxicology 2007 QUILLIAM M A Phycotoxins Journal of AOAC International v 82 n 3 p 773-781
1999
RADOMSKY C L LEVINE N Thalidomide Dermatologic Clinics v19 n 1 2001 RAO R POWELL MW Application Report Analysis of environmental toxins in drinking water by LCMS - ThermoQuest LCMS 2001 REBOREDO MM LUCINDA LMF ROCHA CB QUEIROZ GT FARIA VC VIEIRA VA SAacute RCS e CARVALHO JCT Avaliaccedilatildeo da toxicidade do extrato aquoso de Caesalpinia ferrea em oacutergatildeos vitais no sistema reprodutor e na produccedilatildeo de espermatozoacuteides de ratos Wistar submetidos a tratamento subagudo Boletim do Centro de Biologia da Reproduccedilatildeo v 25 p 17-29 2006 RELLAacuteN S OSSWALD J SAKER M GAGO-MARTINEZ A e VASCONCELOS V First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria Food and Chemical Toxicology n 47 p 2189ndash2195 2009 ROBINSON N A MIURA G A MATSON C F DINTERMAN R E PACE J G Characterization of chemically tritiated microcystin-LR and its distribution in mice Toxicon Gratilde-Bretanha v 27 n 9 p 1035-1042 1989 ROGERS EH HUNTER ES MOSERVC PHILLIPS PM HERKOVITS J
MUNtildeOZ L HALL LL e CHERNOFF N Potential developmental toxicity of
98
anatoxin-a a cyanobacterial toxin Journal of Applied Toxicology v 25 p 527ndash534
2005
ROGERS EH ZEHR RD GAGE MI HUMPAGE AR FALCONER IR MARR M e CHERNOFF N The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestacion Toxicon v49 p855-864 2007 ROGERS JM e KAVLOCK RJ Developmental toxicity In Casarett amp Doulls Toxicology The Basic Science of Poisons 7 ed CD Klaassen editor Nov York McGraw-Hill 2007 Cap 10 p415-451 RUSSO MW e JACOBSON IM How to use statins in patients with chronic liver disease Cleveland Clinc Journal of Medicine v 71 n 1 p 58-62 2004 SADLER T W Embriologia Meacutedica 11 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan LTDA2010 p 20-25 SAGAE S C Obesidade e reproduccedilatildeo em fecircmeas modulaccedilatildeo pela angiotensina II 2010 124f Dissertaccedilatildeo (Doutorado em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre 2010 SALDANHA P H A trageacutedia da talidomida e o advento da teratologia experimental Revista Brasileira de Geneacutetica Satildeo Paulo v 17 n 4 p 449-464 1994 SANTOS A P M E BRACARENSE A P F R L Hepatotoxicidade associada agrave microcistina Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v 29 n 2 p 417-430 2008 SANTOS BF Criaccedilatildeo e Manejo de ratos In ANDRADE A PINTO JC e OLIVEIRA RS Animais de laboratoacuterios criaccedilatildeo e experimentaccedilatildeo Rio de Janeiro Fiocruz 2020 p 119-121 SANTOS K R P MENDONCcedilA JS TEIXEIRA VW TEIXEIRA AAC Influecircncia
da ausecircncia de luz sobre o ciclo estral de ratas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo
Paulo v70 n1 p21-23 2003
SATLI M AL e ARON CL Role played by serotonin in the control of estrous receptivity ovarian activity and ovulation in the cyclic female rat Psychoneuroendocrinology Gratilde-Bretanha v 6 n 2 p 121 - 129 1981 SILVA V A Ambiente e desenvolvimento efeitos do aacutelcool etiacutelico e da desnutriccedilatildeo Mundo amp Vida v 2 n 1 p 21-27 2000 SINCLAIR JL HALL S BERKMAN JAH BOYER G BURKHOLDER J
BURNS J CARMICHAEL W DUFOUR A FRAZIER W MORTON SL
OrsquoBRIEN E WALKER S Occurrence of cyanobacterial harmful algal blooms
99
workgroup report Advances in Experimental Medicine and Biology v 619 p45-103
2008
SIRQUEIRA DB e OLIVEIRA-FILHO EC Cianobacteacuterias de aacutegua doce e sauacutede puacuteblida uma revisatildeo Universitas Ciecircncias e Sauacutede v 3 n 1 p 109-127 2012 SKULBERG OM Microalgae as a source of bioactive molecules ndash experience from
cyanophyte research Journal of Applied Toxicology v 12 n 3-5 p 341-348 2000
SOARES JM BELETTI ME MACHADO ER e SILVA MHistomorfometria de
testiacuteculos de gatos (felis domestica) utilizando-se trecircs diferentes fixadores
Bioscience Journal v 22 n 1 p 175-181 2006
SOARES R M Toxicologia de cianotoxinas microcistinas as estrelas do tema
Oecologia Brasiliensis v13 n2 p 259-271 2009
SPOOF L MERILUOTO J Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column Journal of Chromatography A v 947 p 237-245 2002 STEINBERGER A e KLINEFELTER G Sensitivity of sertoli and leyding cells to xenobiotics in vitro models Reproductive Toxicology v 7 p 23-37 1993 STOCKTONDL e PALLER AS Drug administration to the pregnant or lactating woman A reference guide for dermatologists Journal of the American Academy of Dermatology v 23 n 1 p 87-103 1990 SUTERL BOBADILLA M KOCHE e BECHTER R Flow cytometric evaluation of the effects of doxorubicin on rat spermatogenesis Reproductive Toxicology v 2 n 4 p5311997
SVERCK C SMITH DW Cyanobacteria toxins and the current state of knowledge
on water treatment options a review Journal of Environmental
Engineering and Sciencev 3 p 155 2004
SWENSON M J e REECE W O Dukes fisiologia dos animais domeacutesticos Rio de Janeiro Guanabara Koogan SA1993 p 603-619 SYED V e HECHT NB Disruption of germ cell-sertoli interactions leads to spermatogenic defects Molecular and Cellular Endocrinology v186 p155ndash157 2002
100
TAKAHASHI O OISHI S e WATANABE MF Defective blood coagulation is not causative of hepatic haemorrahage induced by microcystin-LR Pharmacology amp Toxicology v 76 n 4 p 250-254 1995 TAYLOR S Skeletal examination In Pratical Teratology Gratilde Bretanha 1986 TOPASHKA-ANCHEVAM METCHEVA R e TEODOROVA S A comparative analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II chromosomal aberrations and blood pathology Ecotoxicology and Environmental Safety v 54 p 188ndash193 2003 UENO Y NAGATA S TSUTSUMI T HASEGAWA A WATANABE MF PARK HD CHEN GC CHEN G YU SZ Detection of microcystins a blue-green algal hepatotoxin in drinking water sampled in Haimen and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by highly sensitive immunoassay Carcinogenesis v 17 n 6 p 1317-1321 1996 US EPA Toxicological Reviews of Cyanobacterial Toxins Microcystins LR RR YR and LA (External Review Draft) US Environmental Protection Agency Washington DC EPA600R-06139 2006 VAN APELDOORN ME VAN EDMOND HP SPEIJERS GJA BAKKER GJI
Toxins of cyanobacteria Molecular Nutrition amp Food Research v 51 p 7-60 2007
VASCONCELOS V Cyanobacteria toxins diversity and ecological effects Limnetica Madri v 20 n 1 p45-58 2001 VIANA-VERONEZI M GIANI A MELO C S GOMES L L LIBAcircNIO M Avaliaccedilatildeo da remoccedilatildeo de saxitoxinas por meio de teacutecnicas de tratamento das aacuteguas de abastecimento Engenharia Ambental e Sanitaria v14 n2 p 193-204 2009 VIA-ORDORIKA L FASTNER J KURMAYER R HISBERGUES M DITTMAN E KOMAREK J ERHARD M e CHORUS I Distribution of microcystin-producing and non-microscystin-producing Microcystis sp In European freshwater bodies detection of microcystin and microcystin genes in individual colonies Systematic and Applied Microbiology v 27 p 592-602 2004 WEBB R WOAR K J ARMSTRONG DG Corpus luteum (CL) function local control mechanisms Domestic Animal Endocrinology n23 p 277ndash285 2002 WEIS S N Efeitos de compostos orgacircnicos de selecircnio sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas Wistar 2007 70f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Bioquiacutemica Toxicoloacutegica) Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2007 WENG d LU Y WEI Y LIU Y e SHEN P The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice Toxicology v 232 p 15ndash23 2007
101
WIEGAND C PFLUGMACHER S Ecotoxicological effects of selected
cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicology and Applied
Pharmacology v 203 p 201-218 2005
WILSON J C Methods for administering agents and detecting malformations in experimental animal In WILSON J C e WARKANY J Teratology principles and techniques Chicago Univ of Chicago Press 1985 WORLD HEALTH ORGANIZATIONGuidelines for drinking-water quality (electronic resource) incorporating first addendum v 1 Recommendations 3 ed 1998 ZEGURA B STRASER A e FILIPIC M Genotoxicity and potentialcarcinogni-city of cyanobacterialtoxins ndash a review Mutation ResearchReviews in Mutation Research v 727 p16-41 2011 ZHANG Z LIAN M LIU Y WEI G YU S KANQ S ZHANG Y e CHEN C Teratosis and damage of viscera induced by microcystin in SD rat fetuses Zhonghua Yi Xue Za Zhi v 82 n 5 p345-7 2002 ZILLIGES Y KEHR JC MEISSNER S ISHIDA K MIKKAT S HAGEMANN M KAPLAN A BORNER T e DITTMANN E The cyanobacterial hepatotoxin microcystin binds to proteins and increases the fitness of microcystis under oxidative stress conditions Plos One v 6 p1-11 2011
102
ANEXO I
103