Il progetto ha permesso il conseguimento di una serie di risultati per la realizzazione di dispositivi diagnostici altamente innovativi sia dal punto di vista industriale che dal punto di vista scientifico

ARRAY ANTICORPALI

Messa a punto di array anticorpali da utilizzare in saggi di screening di SCCA-IgM nel siero di pazienti affetti dal cancro al fegato

ARRAY CELLULARI

L'analisi degli array cellulari ha dimostrato la presenza di SCCA in singole cellule, evidenziando come questa metodica possa divenire un utile ausilio diagnostico per l’epatocarcinoma

AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE

Sintetizzati e caratterizzati composti lantanidici con leganti ditiocarbammici e derivati cumarinici ed effettuate prove di stabilità in ambiente fisiologico e test di luminescenza in differenti solventi.

Studiato da un punto di vista biochimico l’esatta sequenza e struttura dell’anticorpo monoclonale CA19-9

Sintetizzati due peptidi immunomimeticiattualmente in fase di bioconiugazione con i complessi ottenuti

REALIZZAZIONE DEL DISPOSITIVO OPTOELETTRONICO

Realizzato un prototipo di rilevatore portatile di biochip optolettronici con microarrays anticorpali con caratteristiche di:

miniaturizzazione

buona sensibilità

risoluzione elevata

Risultati

Prospettive future

REALIZZAZIONE DEL DISPOSITIVO OPTOELETTRONICO

Ulteriore sviluppo della miniaturizzazione del lettore optoelettronico di biochip e

integrazione di un modulo wireless per la trasmissione in tempo reale dei dati

per una diffusione il più possibile capillare della diagnostica sul

territorio.

L’ottimizzazione del dispositivo dipenderà dall'intensità del segnale

luminescente proveniente dal biochip, obiettivo di ricerche future.

AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE

Bioconiugazione dei complessi all’anticorpo a 37°C (CHIA)

Studio dei cambiamenti nelle proprietà di luminescenza dopo la reazione di bindingtra CA 19-9 e antigene (CHIA)

Sintesi e caratterizzazione di nuovi complessi con vari leganti all’ossigeno macrociclici dei seguenti lantanidi: Sm, Pr, Dy, Tb e Eu e loro bioconiugazione (CHIA & LIA)

Caratterizzazione: studi di stabilità in ambiente fisiologico mediante spettrofotometria UV-Vis e luminescenza (CHIA& LIA)

ARRAY ANTICORPALI E CELLULARI

Sviluppo di biochip per l’analisi multimarcatore per la diagnosi precoce, per il monitoraggio dello sviluppo della neoplasia e per il controllo dell’efficacia del trattamento terapeutico dei pazienti

oncologici.

Integrazione degli array anticorpali e cellulari in piattaforme microfluidiche

per una gestione automatizzata ed integrata delle varie fasi di analisi

SVILUPPO DI UN SISTEMA DI RIVELAZIONE PER LA LETTURA DI MICROARRAY ANTICORPALI E CELLULARI PER LA DIAGNOSI IN ONCOLOGIA

(PRODESYS)

Azione Biotech III

• Sensibilità diagnostica per usi clinici;

• Linearità degli intervalli di misurazione;

• Riproducibilità tra lotti;

• Tempo di stabilità;

• Facilità d’uso;

• Dispositivo di tipo usa e getta;

• Richiede piccoli volumi del campione da analizzare;

• Permette di implementare la rilevazione con fluorescenza o chemiluminescenza;

• Permette di realizzare il point of care per i dispositivi diagnostici;

• Riduzione dei costi di produzione;

• Riduzione dei costi per analisi

Vantaggi del Vantaggi del biochipbiochip

Array anticorpaliXeptagen S.p.A.

Test del BIOCHIP con siero HCC e siero di controlloTest del BIOCHIP con siero HCC e siero di controllo

Vetrino Anti-SCCAAnti-SCCAAnti-IgM

Campione

HCC

Campione di controllo

anti-S

CCA

anti-S

CCA

anti-IgM

anti-SCCA

anti-SCCA

anti-IgM

Problematiche: prestazioni dei vari componenti e difficoltà tecnologiche di realizzazione

Tipo di rivelatore: CCD o CMOS

Ottiche: pinhole, lenti asferiche, bundle di fibre ottiche

Elettronica di gestione e di visualizzazione delle immagini

Raffreddamento del sensore per aumentarne la sensibilità Sensore CMOS con risoluzione 2592 x 1944

Sensore ad alta risoluzione con lente asferica

Schema dell’elettronica realizzata per pilotare uno dei sensori

Il sensore a diretto contatto con una cella Peltier per il

raffreddamento

Sviluppo del dispositivo optoelettronicoPhoenix – Ricerca e Tecnologie Ottiche srl

Obiettivi del progetto

Sviluppare array di tipo cellulare e di tipo anticorpale (BIOCHIP) per la rilevazione di marker tumorali, associati alla realizzazione di lettori optoeletronici portatili di biochip per la diffusione il più possibile

capillare sul territorio della diagnostica di epatocarcinoma.

I partner coinvolti hanno perseguito l’obiettivo tramite tre strategie di ricerca strettamente connesse:

a)

messa a punto di kit diagnostici

basati su array anticorpali e/o

cellulari per la valutazione di

biomarcatori tumorali

b)

sviluppo di un sistema di

amplificazione e di lettura del

segnale luminescente per

potenziarne la sensibilità

c)

sviluppo di un prototipo di rivelatore

optolettronico portatile di biochip che

utilizzando i risultati delle precedenti due

strategie

consenta di eseguire test di screening

direttamente on site negli ambulatori di

medicina generale e/o specialistica

I Partner

Phoenix - Ricerca e Tecnologie Ottiche S.r.l. - Padova

Dr. Leonardo Placentino

Xeptagen S.p.A. - Marghera Venezia

Dr. Luca Beneduce

Dipartimento di Scienze Chimiche - Università di Padova

Prof. Dolores Fregona, Dr. Chiara Nardon

Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche - Università di Padova

Prof. Ignazio Castagliuolo

Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia - Università di Padova

Dr. Maria Cecilia Giron

Dipartimento di Principi e Impianti di Ingegneria Chimica - Università di Padova

Prof. Nicola Elvassore

Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale - Università di Padova

Dr. Patrizia Pontisso

CellsCellsCellsCells

Produzione di array cellulari mediantemicro-contact printing

Array cellulariDipartimento di Principi e Impianti di Ingegneria Chimica

Dipartimento di Medicina Clinica e SperimentaleAmplificazione del segnale di rilevazione di biomarcatori

Dipartimento di Scienze Chimiche Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche

Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia

esterasi

= Complesso lantanidico bioconiugato con legame estereo

C O SA D EVE AVVEN IRE?

Un cambiamento delle proprietà di luminescenza in seguito al bindingtra antigene e anticorpo per la

variazione dell’interazione tra Ln3+

e il partner amminoacidicodonatore nell’ET.

Da un punto di vista chimico-fisico questa interazione può

avvenire tramite due meccanismi (Förster o

Dexter) in base alla distanzatra D e A e alla mutua

orientazione dei momenti di dipolo di transizione.

Fa s i d e l l a r i c e r c a :

� Sintesi e caratterizzazione (IR, NMR, termogravimetrica, elementare) di nuovicomplessi con vari leganti sfruttando i seguenti lantanidi: Sm, Pr, Dy, Tb e Eu

� Studi UV-Vis e luminescenza

� Studio approfondito della stuttura e sequenza dell’anticorpo CA 19-9 a livellobiochimico

� Sintesi di un tetrapeptide e un decapeptide con una ben determinatasequenza riproducenti delle regioni specifiche dell’anticorpo CA 19-9

� Bioconiugazione dei complessi all’anticorpo a 37°C

� Studio dei cambiamenti nelle proprietà di luminescenza dopo la reazione di binding tra CA 19-9 e il corrispondente antigene

Conclusioni

Ci aspettiamo che o il primo approccio (LIA) o il secondo(CHIA) sia caratterizzato da:

�limite di rilevabilità inferiore a 1 U/mL

oppure

�limite di rilevabilità comunque basso ma ottenibiletramite una metodica più veloce che sfrutti un biosensore meno costoso e più facile da utilizzarerispetto a quelli attualmente in uso.

Perché i Lantanidi (Ln3+)?

Molti vantaggi rispetto alle sonde organiche fluorescenti

normalmente utilizzate:

•Grandi Stokes’ shift

•Tempi di decadimento della luminescenza lunghi (τ ~ms-µs)

Time-resolved immunoassays